PokaÅ¼ caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄd Naukowy

More documents

Recommendations

Info

Farm Przegl Nauk, 2009,8 Ryc. 1. Wykres zależności absorbancji od stężenia doksycykliny, oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny po 24 godzinach w hodowlach komórek linii A549 i T24. przedstawiono wartości średnie +/- odchylenie standardowe. * - istotna statystycznie różnica w odniesieniu do hodowli kontrolnej. i 100 µM, ponieważ stężenia te powodowały zbyt silny efekt cytotoksyczny w stosunku do hodowli komórkowych linii A549 i T24, co uniemożliwiałoby wiarygodną analizę badań inwazyjności. Wybrano także optymalny czas traktowania hodowli badanymi tetracyklinami (24 godziny). Zakres działania cytotoksycznego obserwowany w testach MTT dość istotnie różnił się pomiędzy poszczególnymi badanymi modulatorami (Ryc. 1). Badania poziomu ekspresji genów MMP-2 i MMP-9 na poziomie mRNA dokonano za pomocą ilościowej techniki RT-PCR z detekcją w czasie rzeczywistym. Zastosowano metodę relatywnej oceny ekspresji genów (ΔΔCt) w odniesieniu do ekspresji genu β-aktyny. W przypadku linii A549 wykazano spadek poziomu ekspresji genu MMP-2 po stymulacji wszystkimi z zastosowanych tetracyklin przy niemal wszystkich stężeniach (Ryc. 2). Obniżenie ekspresji genu MMP-9 na poziomie istotnym statystycznie wykazano po zastosowaniu limecykliny w stężeniu 3 µM (p
Ryc. 3. Zymogramy przedstawiające aktywność proteolityczną żelatynaz MMP-2 i MMP-9 w supernatantach z hodowli komórkowych linii A549 (ryc. A) i T24 (ryc. B) po 24 godzinach traktowania doksycykliną, oksytetracykliną, tetracykliną i limecykliną. Ryc. 4. Wykres zależności ilości komórek ulegających adhezji po podłoża matriżel od stężenia doksycykliny, oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny po 24 godzinach hodowli komórek linii A549 i T24 (* - istotna statystycznie różnica w odniesieniu do hodowli kontrolnej). wieństwie do linii A549, w komórkach linii T24 obie metaloproteazy wykazywały podobną aktywność. W przypadku obu badanych linii komórkowych obserwowano obniżenie intensywności prążków wraz ze wzrostem stężenia zastosowanych modulatorów. Opisana zależność miała charakter krokowy (gradacyjny), co wskazuje na zmiany aktywności MMP w sposób zależny od dawki stosowanego modulatora. Bardzo słabo widoczne były prążki odpowiadające metaloproteazom MMP-2 i MMP-9 przy 50 µM stężeniu doksycykliny. Wskazuje to bądź na działanie cytotoksyczne doksycykliny w stosowanym stężeniu - co dodatkowo znalazło odzwierciedlenie w badaniach za pomocą testu MTT - lub bardzo wysokie zahamowanie ekspresji MMP. Do oceny wpływu badanych modulatorów na fenotyp komórek linii A459 i T24 posłużono się badaniem adhezji komórek nowotworowych do podłoża matriżel – testu copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 stosowanego w badaniach adhezji, propagacji, wzrostu oraz podziałów komórkowych - oraz testem Wound Healing Assay – stosowanego w analizie migracji i ruchliwości komórek nowotworowych. Badanie adhezji komórek do podłoża matriżel po traktowaniu komórek oksytetracykliną wykazało, że nie ma ona wpływu na adhezję komórek linii A549 (p=0,078) i T24 (p=0,196) do podłoża, bądź różnica w stopniu adhezji w porównaniu z kontrolą jest na granicy istotnych statystycznie różnic; jedynie w stężeniu 3 μM wykazano spadek adhezyjności komórek linii A549 (p=0,016). Doksycyklina indukowała wzrost adhezyjności w stężeniu 3 μM w hodowlach komórek linii T24 (p=0,040). Limecyklina w największym użytym stężeniu (50 μM) indukowała istotne obniżenie adhezyjności komórek linii A549 (p=0,003), natomiast w pozostałych stężeniach nie wykazano istotnego wpływu na komórki obu badanych linii. Co ciekawe, zaobserwowano wzrost stopnia przylegania komórek linii T24 do powierzchni matrigelu po stymulacji tetracykliną w najniższych użytych w badaniu stężeniach, tj. 6 μM i 3 μM. Natomiast w stosunku do komórek linii A549 wykazano istotne obniżenie adhezyjności w stężeniach 12,5 μM (p=0,028), 6 μM (p=0,022) i 3 μM (p=0,008) (Ryc. 4). Badanie za pomocą Wound Healing Assay wykazało zmiany, jakie zaszły w adherentnych hodowlach komórek linii A549 i T24 po stymulacji zastosowanymi modulatorami. W trakcie prowadzonego badania zaobserwowano brak całkowitego zarastania rysy przez komórki linii A549 o niskim potencjale migracyjnym, a po 24 godzinach obumieranie hodowanych komórek tworzących zbyt gęste skupiska (Ryc. 5). W hodowlach obu linii komórkowych zaobserwowano cytotoksyczne działanie doksycykliny w stężeniu 50 μM (obserwacje mikroskopowe). W przypadku pozostałych antybiotyków zauważono wyraźną zależność stopnia zarastania rysy od stężenia badanego modulatora - im większe stężenie tetracyklin, tym mniejszy stopień zarastania rysy. Zauważono również różnicę w potencjale migracyjnym i inwazyjności komórek linii A549, które nie zarastały całkowicie rysy, a po 24 godzinach hodowli obumierały, a komórkami linii T24, które po prowadzeniu hodowli przez 72 godziny całkowicie zarastały rysę. Dyskusja Rak płuc i rak pęcherza moczowego są jednymi z najczęściej występujących nowotworów charakteryzującymi się wysokim potencjałem przerzutowym oraz inwazyjnością [12, 13]. Stąd też do badań opisanych w pracy wykorzystano ustalone linie komórkowe A549 i T24 stanowiące modele eksperymentalne in vitro wymienionych nowotworów. Hodowle badanych linii posłużyły do oceny wpływu wybranych tetracyklin na procesy związane z inwazyjnością komórek nowotworowych. W pierwszej kolejności przeprowadzono testy cytotoksyczności (MTT), pozwalające na wyznacze- 21
Page 1: copyright © 2009 Grupa dr. A. R. K
Page 4 and 5: Zdj. Zygmunt Wieczorek Szanowni Pa
Page 7 and 8: Farm Przegl Nauk, 2009,8, 7-11 copy
Page 9 and 10: copyright © 2009 Grupa dr. A. R. K
Page 11 and 12: staci zahamowania przyłączenia [
Page 17 and 18: Farm Przegl Nauk, 2009,8, 17-23 cop
Page 19: copyright © 2009 Grupa dr. A. R. K
Page 35 and 36: Time dependent increase of proline

PokaÅ¼ caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?

PokaÅ¼ caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄd Naukowy