Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073
w pożywce zawierającej odpowiedni modulator w badanym
stężeniu, pożywkę usuwano, przepłukiwano hodowle roztworem
DPBS, po czym dodawano do każdego dołka po 100
μl RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej zawierające substrat
bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy
(MTT) w stężeniu 0,5 mg/ml. Płytki inkubowano przez 2 godziny,
a następnie dodawano po 100 μl mieszaniny etanol-
DMSO (1:1) w celu rozpuszczenia barwnych kryształów produktu
redukcji MTT (formazanów). Po 2-godzinnej inkubacji
dokonywano pomiarów spektralnych w czytniku mikropłytek
Triad LT (Dynex) przy fali długości 570 nm.
Oznaczanie ekspresji mRNA żelatynaz techniką Real-Time
RT-PCR
Ekspresję genów kodujących żelatynazy: MMP-2
i MMP-9 na poziomie mRNA określono stosując ilościową
technikę RT-PCR z detekcją w czasie rzeczywistym (Real-Time
RT-PCR) z użyciem barwnika fluorescencyjnego
SYBR Green I. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziło:
2 μl 10x buforu A, 2 μl (4 μl w przypadku MMP-2) 25 mM
MgCl 2
, po 1,35 μl 3 μM roztworów starterów F i R, 0,7 μl
1x SYBR Green I, 0,1 μl odwrotnej transkryptazy Multiscribe
RT (50 U/μl), 0,1 μl polimerazy DNA Ampli TaqGold
(5 U/μl), 160 ng matrycowego RNA oraz wodę do 20 μl.
Wszystkie odczynniki zakupiono w Applied Biosystems,
z wyjątkiem starterów (IBB PAN, Warszawa) oraz SYBR
Green I (Invitrogen). Skład mieszaniny reakcyjnej dla każdego
badanego transkryptu był identyczny z wyjątkiem
starterów, których sekwencje były specyficzne dla danego
mRNA badanego genu. Zastosowano następujące sekwencje
starterów: do detekcji mRNA MMP-2 starter F (forward,
sensowy): 5’CAGGGAGCGCTACGATGGAG3’,
starter R (reverse, antysensowy): 5’TCCTTGGGGCAGC-
CATAGAA 3’ (sekwencje zaprojektowane w programie
EMBOSS); dla mRNA MMP-9 starter F: 5’GCTCAC-
CTTCACTCGCGTG3’, starter R: 5’CGCGACACCA-
AACTGGATG3’ [11]. Równocześnie, w każdej próbce
prowadzono detekcję mRNA genu kontrolnego - β-aktyny
stosując dostępny komercyjnie zestaw starterów o sekwencjach:
F: 5’TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA3’,
R: 5’CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3’. Matrycę
w reakcjach RT-PCR stanowiły ekstrakty RNA z komórek
badanych hodowli in vitro uzyskane metodą fenolowo-chloroformową
przy użyciu odczynnika Tri-Reagent (Sigma-Aldrich).
Profil termiczny reakcji był następujący: 48ºC przez
30 minut (RT), 95ºC 10 min., następnie 40 cykli złożonych
z 30-sekundowej inkubacji w 95ºC i 1-minutowej inkubacji
w 60ºC, po czym przeprowadzano końcową elongację
przez 10 min., w 72ºC. Wszystkie analizy przeprowadzono
w aparacie Mx3000P (Stratagene). Zmianę ekspresji MMP-2
i MMP-9 określano metodą ΔΔCt w odniesieniu do poziomu
mRNA genu β-aktyny jako kontroli endogennej. Jako kalibrator
w metodzie ΔΔCt posłużyły hodowle kontrolne (nie
traktowane żadnym z modulatorów).
Zymograficzna detekcja żelatynaz
Ekspresję żelatynaz MMP-2 i MMP-9 na poziomie białka
określono wykorzystując elektroforezę w żelu poliakrylamidowym
z dodatkiem żelatyny. Do studzienek 10% żeli
poliakrylamidowych z SDS i żelatyną (2 mg/ml) nakładano
po 30 μl mieszaniny złożonej z równych ilości 2x roztworu
obciążającego (0,125 M Tris-HCl, pH=6,8; 20% glicerol;
4% SDS; 0,01% błękit bromofenolowy) i supernatantów
z badanych hodowli uprzednio zagęszczonych za pomocą
kolumienek chromatograficznych Vivaspin 500 (Sigma-Aldrich).
Po przeprowadzeniu rozdziału elektroforetycznego
w buforze elektroforetycznym (1% SDS, 20 mM Tris, 190
mM glicyna; pH=8,3), żele 3-krotnie płukano w buforze renaturującym
(2,5% Triton X-100), a następnie żele te inkubowano
w buforze rozwijającym (50 mM Tris-HCl, pH=7,5;
200 mM NaCl; 5 mM CaCl 2
; 2 μM ZnSO 4
; 0,02% Brij-35)
w temp. 37°C przez 48 godzin. Po inkubacji żele barwiono
przez noc w 0,5% roztworze błękitu Coomassie. Następnego
dnia żele odbarwiano w mieszaninie metanolu, kwasu octowego
i wody (5:4:1). Zymogramy rejestrowano w systemie
dokumentacji żelowej LabWorks 4.0 (Cambridge, UK).
Badanie adhezji komórek nowotworowych do podłoża matrigel
Do badania adhezji wykorzystano płytki hodowlane 96-
dołkowe pokryte matriżelem (BD Matrigel Cellware Basement
Membrane, Becton-Dickinson). Warstwa macierzy pozakomórkowej
wynosiła 100µg/cm 2 . Po 24 h stymulacji modulatorami
w podanym zakresie stężeń (od 50µM do 3µM), komórki
odklejano, wirowano, a następnie zawieszano w 2% RPMI.
Do każdej studzienki dodawano po 0,1 ml zawiesiny komórek
(w stężeniu 200 tys/100µl). Płytki inkubowano przez 2 godziny
w temp. 37°C. Po inkubacji 2 razy przepłukiwano studzienki
roztworem DPBS. Komórki utrwalano w roztworze Cytofix
(0,05 ml 4% paraformaldehydu w DPBS na każdą studzienkę)
przez 30 min. Następnie usuwano utrwalacz i przeprowadzano
barwienie (0,05 ml 0,1% roztworu fioletu krystalicznego
w DPBS) przez 30 min. Po wybarwieniu przepłukiwano każdą
studzienkę dwukrotnie roztworem DPBS. Płytki analizowano
w mikroskopie odwróconym Axiovert 40CFL (Zeiss).
Badanie migracji i ruchliwości komórek nowotworowych
testem Wound Healing Assay
Komórki badanych linii wysiewano na 24-dołkowe płytki
i prowadzono hodowlę przez około 48 godzin do uzyskania
konfluentnych hodowli. Następnie w każdej studzience
wykonywano rysę o szerokości 1 mm, po czym dwukrotnie
intensywnie przepłukiwano płytkę roztworem PBS. Bezpośrednio
po wykonaniu rysy rozpoczęto traktowanie komórek
badanymi modulatorami w podanym zakresie stężeń
(50-3 μM). Po 24 godzinach usuwano pożywkę i dodawano
świeże, pełne medium. Obserwacje prowadzono przez kolejne
24 godziny prowadząc dokumentację za pomocą mikroskopu
odwróconego Axiovert 40CFL (Zeiss).
Analiza statystyczna
Dane ilościowe porównano za pomocą analizy wariancji
(ANOVA). Do obliczeń wykorzystano program STATISTI-
CA 6,0.
Wyniki badań
Po przeanalizowaniu wyników testów MTT dla badanych
tetracyklin w zakresie stężeń 200 µM - 3 µM, nie prowadzono
dalszych badań z zastosowaniem stężenia 200 µM
19