PokaÅ¼ caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄd Naukowy

More documents

Recommendations

Info

Farm Przegl Nauk, 2009,8 Wykaz skrótów: DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline) – sól fizjologiczna buforowana fosforanami, EGF (epidermal growth factor) – naskórkowy czynnik wzrostu, FBS (fetal bovine serum) – bydlęca surowica płodowa, MMP (matrix metalloproteinases) – metaloproteazy macierzy pozakomórkowej, MTT - bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, RNAi (RNA interference) – interferencja RNA, TIMP (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases) – tkankowe inhibitory metaloproteaz macierzy pozakomórkowej. Wstęp Badania nad białkami z grupy metaloproteaz macierzy pozakomórkowej (MMPs – matrix metalloproteinases) prowadzone są od ponad dwudziestu lat. Na ich podstawie wykazano, iż podstawowa funkcja tych enzymów, jaką jest proteolityczna degradacja i przebudowa białek macierzy zewnątrzkomórkowej, wpływa zarówno na przebieg procesów fizjologicznych, takich jak gojenie ran, przebudowa i wzrost kości, apoptoza, jak i zjawisk patologicznych, z których szczególnie ważnym jest proces nowotworzenia. Udział MMP w rozwoju nowotworu jest szczególnie ważny, gdyż uczestniczą one we wszystkich jego etapach począwszy od wzrostu guza pierwotnego, angiogenezy, poprzez etap związany z przerwaniem integralności bariery błony podstawnej, naciekaniem okolicznych tkanek i przerzutowaniem – mechanizmy związane z inwazyjnością komórek nowotworowych - aż po rozwój guzów wtórnych [1, 2, 3]. Równocześnie prowadzone są badania dotyczące inhibitorów MMP, mające na celu wprowadzenie ich do lecznictwa w terapii chorób nowotworowych. Istotą działania terapeutycznego inhibitorów MMP ma być zahamowanie funkcji enzymatycznej docelowych metaloproteaz, a w rezultacie zahamowanie rozwoju nowotworów [4, 5, 6]. Ekspresję i aktywność MMP reguluje wiele czynników o charakterze endogennym, jak też coraz liczniej opisywane czynniki zewnętrzne [7]. Badania nad inhibitorami MMP o zastosowaniu terapeutycznym dotyczą małocząsteczkowych związków niebiałkowych, w tym bifosfonianów i tetracyklin, naturalnych inhibitorów o budowie peptydowej (np. TIMP – tissue inhibitors of matrix metalloproteinases), jak też prób wykorzystania metod terapii genowej (np. interferencyjnego RNA – RNAi, czy też aptamerów). Ponieważ prowadzone do tej pory próby wprowadzenia do lecznictwa leków z grupy białkowych, niebiałkowych inhibitorów oraz bifosfonianów zakończyły się niepowodzeniem, głównie z powodu poważnych działań niepożądanych występujących po zastosowaniu tych preparatów, w ostatnich latach szczególną uwagę skupiono na tetracyklinach, zarówno naturalnych, jak i ich półsyntetycznych pochodnych [8, 9]. Podstawową zaletą tej grupy leków jest szerokie spektrum działania inhibitorowego - odpowiadają za hamowanie aktywności zarówno kolagenaz, jak i żelatynaz – oraz działanie na poziomie zarówno ekspresji genów, jak i aktywacji latentnych form MMPs. Istotną cechą tej grupy modulatorów jest też wysoka biodostępność po podaniu doustnym (wchłaniają się z przewodu pokarmowego w około 80%) oraz dobra penetracja tkanek - tetracykliny przenikają przez barierę krew-mózg, przez łożysko, do dróg oddechowych, moczowo-płciowych, wątroby, a nawet zębów i kości [10]. Z uwagi na wielokierunkowy udział MMP w procesach nowotworzenia istnieje konieczność dokładnej charakterystyki mechanizmów ich roli w wyżej wymienionych procesach. Celem badań przedstawionych w pracy była analiza udziału metaloproteaz macierzy pozakomórkowej w inwazyjności i progresji nowotworów w modelu in vitro. W tym celu zaprojektowano schemat badań służących ocenie wpływu wybranych modulatorów z grupy tetracyklin, hamujących aktywność metaloproteaz macierzy pozakomórkowej, na efekty fenotypowe związane z inwazyjnością komórek nowotworowych niedrobnokomórkowego raka płuc (linia A549) i raka pęcherza (linia T24). Materiał i metody Warunki hodowli in vitro Badania przeprowadzono na hodowlach in vitro ludzkich linii nowotworowych A549 (ATCC: CCL-185) oraz T24 (ATCC: HTB-4) wywodzących się odpowiednio z raka płuc oraz raka pęcherza. Hodowle prowadzone były w standardowych warunkach (37°C, 5% wysycenie atmosfery CO 2 ), w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (PAA) z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS) (PAA) oraz gentamycyny (2 μg/ml) (PAA), w inkubatorze Hera-Cell (Heraeus). Monitoring prowadzonych hodowli (liczba komórek żywych i martwych, morfologia komórek) prowadzono metodą mikroskopii świetlnej z użyciem 0,4% roztworu błękitu trypanu w soli fizjologicznej (Sigma-Aldrich) w komorze hemocytometrycznej Neubauera przy użyciu mikroskopu odwróconego Axiovert 40CFL (Zeiss). Warunki traktowania hodowli komórkowych badanymi modulatorami ekspresji żelatynaz Komórki nowotworowe w prowadzonych hodowlach in vitro poddawano działaniu wybranych modulatorów ekspresji MMP z grupy tetracyklin: hyklatu doksycykliny (Sigma- Aldrich), chlorowodorku oksytetracykliny (Sigma-Aldrich), chlorowodorku tetracykliny (Polfa Tarchomin) i limecykliny (Galderma). Odpowiednią liczbę komórek wysiewano na płytki hodowlane 96-dołkowe lub 24-dołkowe i inkubowano przez noc. Następnego dnia usuwano pożywkę, przepłukiwano płytki 2-krotnie roztworem Dulbecco PBS (DPBS), po czym dodawano świeżo przygotowaną pożywkę bez surowicy zawierającą odpowiednie stężenia badanych modulatorów. Zastosowano następujące stężenia badanych tetracyklin w kolejnych procedurach badawczych: testy MTT - 200µM, 100µM, 50µM, 25µM, 12,5µM, 6µM, 3µM; zymografia, RT-PCR - 50µM, 12,5µM, 3µM; badanie adhezji komórek do matriżelu, wound healing assay - 50µM, 25µM, 12,5µM, 6µM, 3µM. Czas traktowania hodowli w teście cytotoksyczności (MTT) wynosił 6h, 12h i 24h; dla pozostałych badań - 24 godziny. Wyniki badań odnoszono do odpowiednich hodowli kontrolnych prowadzonych w identycznych warunkach jak hodowle badane, jednak bez dodatku żadnego z badanych modulatorów. Badanie cytotoksyczności testem MTT Liczbę żywych komórek w badanych hodowlach oceniano za pomocą testu cytotoksyczności MTT (Sigma-Aldrich). Komórki badanych linii wysiewano na płytki hodowlane 96- dołkowe (20 tys. kom./dołek). Po przeprowadzeniu inkubacji 18
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 w pożywce zawierającej odpowiedni modulator w badanym stężeniu, pożywkę usuwano, przepłukiwano hodowle roztworem DPBS, po czym dodawano do każdego dołka po 100 μl RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej zawierające substrat bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy (MTT) w stężeniu 0,5 mg/ml. Płytki inkubowano przez 2 godziny, a następnie dodawano po 100 μl mieszaniny etanol- DMSO (1:1) w celu rozpuszczenia barwnych kryształów produktu redukcji MTT (formazanów). Po 2-godzinnej inkubacji dokonywano pomiarów spektralnych w czytniku mikropłytek Triad LT (Dynex) przy fali długości 570 nm. Oznaczanie ekspresji mRNA żelatynaz techniką Real-Time RT-PCR Ekspresję genów kodujących żelatynazy: MMP-2 i MMP-9 na poziomie mRNA określono stosując ilościową technikę RT-PCR z detekcją w czasie rzeczywistym (Real-Time RT-PCR) z użyciem barwnika fluorescencyjnego SYBR Green I. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziło: 2 μl 10x buforu A, 2 μl (4 μl w przypadku MMP-2) 25 mM MgCl 2 , po 1,35 μl 3 μM roztworów starterów F i R, 0,7 μl 1x SYBR Green I, 0,1 μl odwrotnej transkryptazy Multiscribe RT (50 U/μl), 0,1 μl polimerazy DNA Ampli TaqGold (5 U/μl), 160 ng matrycowego RNA oraz wodę do 20 μl. Wszystkie odczynniki zakupiono w Applied Biosystems, z wyjątkiem starterów (IBB PAN, Warszawa) oraz SYBR Green I (Invitrogen). Skład mieszaniny reakcyjnej dla każdego badanego transkryptu był identyczny z wyjątkiem starterów, których sekwencje były specyficzne dla danego mRNA badanego genu. Zastosowano następujące sekwencje starterów: do detekcji mRNA MMP-2 starter F (forward, sensowy): 5’CAGGGAGCGCTACGATGGAG3’, starter R (reverse, antysensowy): 5’TCCTTGGGGCAGC- CATAGAA 3’ (sekwencje zaprojektowane w programie EMBOSS); dla mRNA MMP-9 starter F: 5’GCTCAC- CTTCACTCGCGTG3’, starter R: 5’CGCGACACCA- AACTGGATG3’ [11]. Równocześnie, w każdej próbce prowadzono detekcję mRNA genu kontrolnego - β-aktyny stosując dostępny komercyjnie zestaw starterów o sekwencjach: F: 5’TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA3’, R: 5’CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3’. Matrycę w reakcjach RT-PCR stanowiły ekstrakty RNA z komórek badanych hodowli in vitro uzyskane metodą fenolowo-chloroformową przy użyciu odczynnika Tri-Reagent (Sigma-Aldrich). Profil termiczny reakcji był następujący: 48ºC przez 30 minut (RT), 95ºC 10 min., następnie 40 cykli złożonych z 30-sekundowej inkubacji w 95ºC i 1-minutowej inkubacji w 60ºC, po czym przeprowadzano końcową elongację przez 10 min., w 72ºC. Wszystkie analizy przeprowadzono w aparacie Mx3000P (Stratagene). Zmianę ekspresji MMP-2 i MMP-9 określano metodą ΔΔCt w odniesieniu do poziomu mRNA genu β-aktyny jako kontroli endogennej. Jako kalibrator w metodzie ΔΔCt posłużyły hodowle kontrolne (nie traktowane żadnym z modulatorów). Zymograficzna detekcja żelatynaz Ekspresję żelatynaz MMP-2 i MMP-9 na poziomie białka określono wykorzystując elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem żelatyny. Do studzienek 10% żeli poliakrylamidowych z SDS i żelatyną (2 mg/ml) nakładano po 30 μl mieszaniny złożonej z równych ilości 2x roztworu obciążającego (0,125 M Tris-HCl, pH=6,8; 20% glicerol; 4% SDS; 0,01% błękit bromofenolowy) i supernatantów z badanych hodowli uprzednio zagęszczonych za pomocą kolumienek chromatograficznych Vivaspin 500 (Sigma-Aldrich). Po przeprowadzeniu rozdziału elektroforetycznego w buforze elektroforetycznym (1% SDS, 20 mM Tris, 190 mM glicyna; pH=8,3), żele 3-krotnie płukano w buforze renaturującym (2,5% Triton X-100), a następnie żele te inkubowano w buforze rozwijającym (50 mM Tris-HCl, pH=7,5; 200 mM NaCl; 5 mM CaCl 2 ; 2 μM ZnSO 4 ; 0,02% Brij-35) w temp. 37°C przez 48 godzin. Po inkubacji żele barwiono przez noc w 0,5% roztworze błękitu Coomassie. Następnego dnia żele odbarwiano w mieszaninie metanolu, kwasu octowego i wody (5:4:1). Zymogramy rejestrowano w systemie dokumentacji żelowej LabWorks 4.0 (Cambridge, UK). Badanie adhezji komórek nowotworowych do podłoża matrigel Do badania adhezji wykorzystano płytki hodowlane 96- dołkowe pokryte matriżelem (BD Matrigel Cellware Basement Membrane, Becton-Dickinson). Warstwa macierzy pozakomórkowej wynosiła 100µg/cm 2 . Po 24 h stymulacji modulatorami w podanym zakresie stężeń (od 50µM do 3µM), komórki odklejano, wirowano, a następnie zawieszano w 2% RPMI. Do każdej studzienki dodawano po 0,1 ml zawiesiny komórek (w stężeniu 200 tys/100µl). Płytki inkubowano przez 2 godziny w temp. 37°C. Po inkubacji 2 razy przepłukiwano studzienki roztworem DPBS. Komórki utrwalano w roztworze Cytofix (0,05 ml 4% paraformaldehydu w DPBS na każdą studzienkę) przez 30 min. Następnie usuwano utrwalacz i przeprowadzano barwienie (0,05 ml 0,1% roztworu fioletu krystalicznego w DPBS) przez 30 min. Po wybarwieniu przepłukiwano każdą studzienkę dwukrotnie roztworem DPBS. Płytki analizowano w mikroskopie odwróconym Axiovert 40CFL (Zeiss). Badanie migracji i ruchliwości komórek nowotworowych testem Wound Healing Assay Komórki badanych linii wysiewano na 24-dołkowe płytki i prowadzono hodowlę przez około 48 godzin do uzyskania konfluentnych hodowli. Następnie w każdej studzience wykonywano rysę o szerokości 1 mm, po czym dwukrotnie intensywnie przepłukiwano płytkę roztworem PBS. Bezpośrednio po wykonaniu rysy rozpoczęto traktowanie komórek badanymi modulatorami w podanym zakresie stężeń (50-3 μM). Po 24 godzinach usuwano pożywkę i dodawano świeże, pełne medium. Obserwacje prowadzono przez kolejne 24 godziny prowadząc dokumentację za pomocą mikroskopu odwróconego Axiovert 40CFL (Zeiss). Analiza statystyczna Dane ilościowe porównano za pomocą analizy wariancji (ANOVA). Do obliczeń wykorzystano program STATISTI- CA 6,0. Wyniki badań Po przeanalizowaniu wyników testów MTT dla badanych tetracyklin w zakresie stężeń 200 µM - 3 µM, nie prowadzono dalszych badań z zastosowaniem stężenia 200 µM 19
Page 1: copyright © 2009 Grupa dr. A. R. K
Page 4 and 5: Zdj. Zygmunt Wieczorek Szanowni Pa
Page 7 and 8: Farm Przegl Nauk, 2009,8, 7-11 copy
Page 9 and 10: copyright © 2009 Grupa dr. A. R. K
Page 11 and 12: staci zahamowania przyłączenia [
Page 17: Farm Przegl Nauk, 2009,8, 17-23 cop
Page 21 and 22: Ryc. 3. Zymogramy przedstawiające
Page 27 and 28: Farm Przegl Nauk, 2009,8, 27-31 cop
Page 35 and 36: Time dependent increase of proline

PokaÅ¼ caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?

PokaÅ¼ caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄd Naukowy