Pokaż caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy
Pokaż caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy
Pokaż caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
<strong>Farmaceutyczny</strong><br />
www.fpn.info.pl<br />
Cena 24,50 zł<br />
PISMO POD PATRONATEM<br />
Przegląd<br />
WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU<br />
<strong>Naukowy</strong><br />
MEDYCZNEGO W KATOWICACH IC Value - Current 3.66<br />
MNiSW 4<br />
ROK VI (X)<br />
Nr 8/2009 (55)<br />
Miesięcznik<br />
Scientific Review in Pharmacy<br />
Badanie zależności pomiędzy strukturą<br />
i działaniem pochodnych benzodiazepiny.<br />
Część III. Pochodne benzodiazepiny działające<br />
na receptor benzodiazepinowy (BDZ-R)0<br />
Ekspresja żelatynaz A i B oraz inwazyjność<br />
komórek raka płuc i raka pęcherza moczowego<br />
w hodowlach in vitro 0traktowanych<br />
wybranymi tetracyklinami<br />
Przeciwbakteryjne działanie galanginy<br />
zawartej w propolisie<br />
w stosunku do bakterii Gram-dodatnich0<br />
Wpływ wodnego ekstraktu<br />
z kłączy Iris dichotoma Pall<br />
na aktywność mitotyczną<br />
ocenianą testem allium<br />
Białko ORP150 zapobiega degradacji kolagenu<br />
w hodowlach fibroblastów skóry ludzkiej<br />
w przebiegu głodzenia<br />
Rola cynku w zaburzeniach smaku<br />
Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (AMD)<br />
– czynniki ryzyka i profilaktyka<br />
0<br />
ISSN 1425-5073<br />
1
<strong>Farmaceutyczny</strong><br />
PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH<br />
Miesięcznik<br />
Przegląd <strong>Naukowy</strong><br />
Scientific Review in Pharmacy<br />
Index Copernicus 3,66<br />
MNiSW 4<br />
Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief:<br />
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk<br />
Adres redakcji / Editorial Adress:<br />
ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / Poland<br />
Tel. +48 32 364 11 50, +48 514 342 345<br />
Fax. + 48 32 364 11 58<br />
E-mail: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl<br />
Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board<br />
Przewodniczący / Head:<br />
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec<br />
Członkowie / Members:<br />
Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok<br />
Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja<br />
Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków<br />
Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa<br />
Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź<br />
Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania<br />
Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja<br />
Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin<br />
Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań<br />
Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja<br />
Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia<br />
Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria<br />
Sekretarz <strong>Naukowy</strong> / Scientific Board Secretary:<br />
Dr n. med. Robert D. Wojtyczka<br />
E-mail: fpn@kwiecinski.pl<br />
Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków<br />
Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin<br />
Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec<br />
Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice<br />
Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia<br />
Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa<br />
Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok<br />
Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław<br />
Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin<br />
Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia<br />
Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja<br />
Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk<br />
Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia<br />
Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board:<br />
Dr n. farm. Paweł Olczyk<br />
Dr n. biol. Małgorzata Kępa<br />
Mgr Anna Szeremeta<br />
Mgr Agnieszka Jura – Półtorak<br />
Dr n. hum. Anna Kierczak<br />
Wydawca / Publisher:<br />
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego<br />
Adres Wydawcy / Publisher Adress:<br />
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego<br />
ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Poland<br />
tel. +48 33 817 28 79, fax +48 33 817 36 31<br />
Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.)<br />
Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Skład / Technical Editor:<br />
Agnieszka Romańska Robert Cyganik Jerzy Partyka<br />
E-mail: agnieszka.romanska@kwiecinski.pl<br />
Nakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copies<br />
<strong>Farmaceutyczny</strong> Przegląd <strong>Naukowy</strong> jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.<br />
Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education.<br />
Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego.<br />
Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach<br />
z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania<br />
nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą<br />
wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja<br />
nie odpowiada.<br />
All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright<br />
laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the<br />
rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints<br />
are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for<br />
advertisements and reader letters.
Zdj. Zygmunt Wieczorek<br />
Szanowni Państwo,<br />
Koleżanki i Koledzy,<br />
Drodzy Czytelnicy<br />
I znowu parę słów do Państwa, i tym razem także z dobrymi<br />
dla naszego środowiska wieściami.<br />
Zaczynamy lekturę bieżącego <strong>numer</strong>u Farmaceutycznego<br />
Przeglądu Naukowego od zapowiedzi znaczącego wydarzenia<br />
w świecie młodych farmaceutów, jakie będzie miało<br />
miejsce wiosną przyszłego roku, tj. Dorocznego Kongresu<br />
Europejskiego Stowarzyszenia Studentów Farmacji – EPSA<br />
(European Pharmaceutical Students’ Association). EPSA<br />
reprezentuje 120 tys. studentów farmacji w 32 krajach europejskich.<br />
Celem EPSA jest rozwój interesów europejskich<br />
studentów farmacji oraz zachęcanie do kontaktów i do wzajemnej<br />
współpracy.<br />
33 rd EPSA Annual Congress odbędzie się w Krakowie,<br />
w dniach 22 kwiecień – 2 maj 2010 r. Motto nadchodzącego<br />
Kongresu to: Patients, generics and counterfeiting<br />
– facing the pharmaceutical challenges of today. Tym razem<br />
środowisko studentów farmacji z innych krajów Europy<br />
powierzyło studentom z Polski zaszczytny obowiązek zorganizowania<br />
najbliższego Kongresu. Tegoroczny Kongres<br />
EPSA organizowany jest przy współpracy z Zespołem Sekcji<br />
Studenckich Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego<br />
– Młodą Farmacją.<br />
Pełniąc z ramienia Prezydium Zarządu Głównego Polskiego<br />
Towarzystwa Farmaceutycznego funkcję Opiekuna<br />
Młodej Farmacji, staram się wspomóc Organizatorów Kongresu<br />
w pozyskiwaniu funduszy na zabezpieczenie coraz<br />
wyższych kosztów konferencyjnych. Co najważniejsze,<br />
Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne wspiera, i finansowo<br />
i logistycznie, nadchodzące Przedsięwzięcie.<br />
Sami studenci pracują niezwykle intensywnie, wykazując<br />
ogrom samodzielności, inwencji i zasługującego na<br />
uznanie – zaangażowania. Życzymy studentom powodzenia,<br />
wielu inspirujących przeżyć naukowych oraz udanych<br />
spotkań towarzyskich. Nadchodzący Kongres przyczyni się<br />
z pewnością do dalszego zacieśnienia wakacyjnych wymian<br />
studenckich, poszerzenia zakresu odbywania praktyk zawodowych<br />
oraz do zintensyfikowania mobilności studentów<br />
w ramach realizacji programu studiów.<br />
Wracając do naszego bieżącego <strong>numer</strong>u – zapraszam<br />
do lektury kolejnych artykułów. Cieszy niezmiernie coraz<br />
większe zainteresowanie czasopismem ze strony wybitnych<br />
Profesorów i Autorów Prac, którzy powierzają swoje prace<br />
Farmaceutycznemu Przeglądowi Naukowemu.<br />
W bieżącym <strong>numer</strong>ze, obok prac, które powstały<br />
w Śląskim Uniwersytecie Medycznym w Katowicach, publikujemy<br />
prace z Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku<br />
i Łodzi, a także w Lublinie – w kooperacji z Uniwersytetem<br />
Medycznym w Warszawie i ośrodkami zagranicznymi.<br />
Szanowni Państwo. Nieustająco zapraszam na łamy Farmaceutycznego<br />
Przeglądu Naukowego. Uzupełniamy zaległości<br />
wydawnicze. Musimy zdążyć uporać się z zaległościami<br />
do końca bieżącego roku. Mam nadzieję, iż prac nam<br />
nie zabraknie, a Państwo dostrzegą korzyści, wypływające<br />
z umieszczania prac w naszym wspólnym czasopiśmie. Jeszcze<br />
trochę cierpliwości i może uda nam się publikować prace<br />
z zagranicy. Odpowiednie kroki zostały już przedsięwzięte.<br />
Życzmy sobie sukcesu, a na razie, pracujmy na niego<br />
sami, by stał się on także i naszym udziałem i zasługą.<br />
Z serdecznymi pozdrowieniami,<br />
Redaktor Naczelny<br />
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
<strong>Farmaceutyczny</strong><br />
PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH<br />
Miesięcznik<br />
Przegląd <strong>Naukowy</strong><br />
Scientific Review in Pharmacy<br />
Nr 8 / 2009<br />
Index Copernicus 3,66<br />
MNiSW 4<br />
Spis treści<br />
Badanie zależności pomiędzy strukturą<br />
i działaniem pochodnych benzodiazepiny.<br />
Część III. Pochodne benzodiazepiny działające<br />
na receptor benzodiazepinowy (BDZ-R)0 8<br />
Structure-Activity Relationship of Benzodiazepine Derivatives. Part III.<br />
Benzodiazepine Derivatives with Benzodiazepine-Receptor Affinities<br />
Ekspresja żelatynaz A i B oraz inwazyjność komórek raka płuc i raka pęcherza moczowego<br />
w hodowlach in vitro 0traktowanych wybranymi tetracyklinami 17<br />
Expression of Gelatinases A and B and The Invasiveness 0<br />
of in vitro Cultured Lung Cancer and Bladder Cancer Cells 0<br />
Treated with Selected Tetracyclines<br />
Przeciwbakteryjne działanie galanginy zawartej w propolisie<br />
w stosunku do bakterii Gram-dodatnich0 24<br />
The antibacterial activity of galangin in propolis<br />
against Gram-possitive bacteria<br />
Wpływ wodnego ekstraktu z kłączy Iris dichotoma Pall<br />
na aktywność mitotyczną ocenianą testem allium0 27<br />
Influence of the water extract from rhizome of Iris dichotoma Pall<br />
on the mitotic activity of allium test cells0<br />
Białko ORP150 zapobiega degradacji kolagenu<br />
w hodowlach fibroblastów skóry ludzkiej w przebiegu głodzenia 0 32<br />
Oxygen regulated protein 150 prevents collagen degradation<br />
in glucose-deprived fibroblasts0<br />
Rola cynku w zaburzeniach smaku0 39<br />
The Role of Zinc in Taste Disorders<br />
Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (AMD)<br />
– czynniki ryzyka i profilaktyka 43<br />
Age-related macular degeneration (AMD)<br />
– risk factors and prophylaxis0
Farm Przegl Nauk, 2009,8, 7-11<br />
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
33 rd European Pharmaceutical Students’ Association<br />
Annual Congress,<br />
April 26 th – May 2 nd 2010, Krakow, Poland<br />
European Pharmaceutical Students’ Association (EPSA) represents over 120,000 Pharmacy students<br />
in 32 European countries.<br />
The original objectives of EPSA were established in 1982, and were expanded and updated at the 21st EPSA<br />
congress in Alcala de Henares and Madrid, Spain in 1998, when the whole structure of EPSA was revised.<br />
The main aim of EPSA is to:<br />
“Develop the interests and opinions of European Pharmacy students<br />
and to encourage contact and co-operation between them”<br />
There are several ways in which EPSA acts in order to fulfill this aim:z<br />
- Maintenance of a permanent web of contact and exchange of information for and between Pharmacy students<br />
and their representative organizations<br />
- Development of a campaign to increase the mobility of European Pharmacy students particularly for periods<br />
of academic, practical or research work abroad<br />
- Development of a consensus of opinion between European Pharmacy students on Pharmacy Education and on<br />
other<br />
issues relevant to their interests and the profession of Pharmacy<br />
- Development and organization of activities supported by the above opinions which serve to increase the profile<br />
of Pharmacy students and the profession<br />
- Organization of events in accordance with the specification of the Regulations, Standing Orders and Handbook<br />
of the Association<br />
- Support and/or organization of any other activities deemed to be in keeping with the EPSA’s aims<br />
Annual Congress<br />
The EPSA Annual Congress is the biggest and most important event in the EPSA calendar. This is an opportunity for<br />
all the EPSA members to meet and discuss EPSA and the Pharmacy profession in general. The EPSA Annual Congress<br />
consists of an educational program, General Assemblies and a social program. The event lasts for a week. The EPSA<br />
Annual Congress is also a chance for the delegates from all the Member Organizations to come together to refuel their<br />
spirit and enthusiasm for the upcoming year.<br />
EPSA organizes workshops and trainings during this event, covering these fields: Humanitarian, Pharmacy Education,<br />
Pharmacy Awareness, Professional Development, Public Health, Mobility and Pharmaceutical Sciences<br />
During the Annual Congress the new team of EPSA is elected for a one-year mandate by the Ordinary Members of<br />
EPSA. A yearly report from each mandate in EPSA is presented and voted upon by the officials.<br />
The Social Program consists of different things from congress to congress, and it is always exciting and fun.<br />
The 33 rd EPSA Annual Congress is held by Students’ Section of Polish Pharmaceutical Society “Young Pharmacy”<br />
in Krakow, Poland from April 26 th to May 2 nd 2010. The topic of the event is Patents, generics and counterfeiting<br />
- facing the pharmaceutical challenges oftoday.<br />
More information about EPSA and its projects you can find on the website: www.epsa-online.org<br />
Krzysztof Nesterowicz<br />
EPSA Annual Congress 2010 Organizing Committee Chairperson<br />
Contact: krzysztof.nesterowicz@gmail.com<br />
7
Farm Przegl Nauk, 2009,8, 8-16<br />
Badanie zależności pomiędzy strukturą<br />
i działaniem pochodnych benzodiazepiny.<br />
Część III. Pochodne benzodiazepiny działające<br />
na receptor benzodiazepinowy (BDZ-R)*<br />
Structure-Activity Relationship of Benzodiazepine Derivatives. Part III.<br />
Benzodiazepine Derivatives with Benzodiazepine-Receptor Affinities.<br />
Elżbieta Brzezińska, Piotr Włodno<br />
Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Medycznej,<br />
Wydział <strong>Farmaceutyczny</strong> Uniwersytetu Medycznego w Łodzi<br />
Streszczenie<br />
Przeprowadzono analizę ilościowej zależności pomiędzy<br />
strukturą i działaniem (QSAR) 69 pochodnych 5-fenylo-<br />
1,4-benzodiazepin-2-on działających na receptor benzodiazepinowy<br />
(BDZ-R). W analizie zastosowano parametry<br />
fizykochemiczne badanych związków obliczone z zastosowaniem<br />
metody pół-empirycznej PM3. Zastosowano<br />
analizę regresji wielokrotnej (MR), analizę skupień (CA)<br />
i analizę funkcji dyskryminacyjnej (DFA) w celu wyłonienia<br />
grupy zmiennych klasyfikujących pochodne benzodiazepiny<br />
zgodnie z poziomem ich aktywności biologicznej.<br />
Dzięki zastosowaniu analizy MR ustalono istotną rolę<br />
parametrów: V (objętość cząsteczki), HA (liczba wiązań<br />
wodorowych), Md (moment dipolowy), halo, Cl, I (liczba<br />
podstawników halogenowych) i %PSA (powierzchnia<br />
polarna cząsteczki) dla aktywności biologicznej badanych<br />
związków. Istotne równanie regresji wieloczynnikowej<br />
uzyskane w MR zawiera parametry użyte w metodach CA<br />
i DFA. Analizy DFA i CA wykazały, że parametry: V, HA<br />
i %PSA są odpowiedzialne za klasyfikację związków jako<br />
silnie i słabo działające. Zdolność przekraczania bariery<br />
krew-mózg odgrywa ważną rolę w tej klasyfikacji.<br />
Słowa kluczowe: ilościowa zależność pomiędzy struktura<br />
i aktywnością; analiza regresji; analiza funkcji dyskryminacyjnej;<br />
analiza skupień; pochodne benzodiazepiny<br />
Wstęp<br />
Podstawowe działanie benzodiazepin jest związane<br />
z centralnym układem nerwowym, a najliczniejszą grupę<br />
stanowią pochodne 1,4-benzodiazepiny. Stanowią one najważniejszą<br />
grupę leków uspokajających. Podstawowy mechanizm<br />
działania tych leków związany jest z istnieniem<br />
specyficznych miejsc wiązania w obrębie receptorów GA-<br />
BA A<br />
-ergicznych. Określenie tych miejsc jako receptorów<br />
benzodiazepinowych (BDZ-R) ma raczej charakter umowny<br />
Abstract<br />
A quantitative structure-activity relationship (QSAR)<br />
analysis of 69 5-fenyl-1,4-benzodiazepin-2-one derivatives<br />
with benzodiazepine-receptor affinities was carried<br />
out. The semi-empirical method PM3 was employed to<br />
calculate a set of physicochemical parameters for investigated<br />
compounds. The Multiple Regression analysis<br />
(MR), Cluster Analysis (CA), and Discriminant Function<br />
Analysis (DFA) were employed to reduce dimensionality<br />
and investigate which subset of variables is effective for<br />
classifying the benzodiazepine derivatives according to<br />
their biological activity degree. By using the MR we have<br />
found the important role of the parameters: V (molecular<br />
volume), HA (number of hydrogen bounds), Md (dipole<br />
moment), halo, Cl, I (number of halogen substituents)<br />
and %PSA (polar surface area) of investigated benzodiazepines<br />
for their activity. The relationship involved the<br />
parameters used in CA and DFA methods. The DFA and<br />
CA methods showed that the parameters V, HA and %PSA<br />
are responsible for separation between compounds with<br />
higher and lower activity. The blood-brain barrier permeability<br />
plays very important role in this classification.<br />
Key words: quantitative structure-activity relationship;<br />
regression, discriminant and cluster analysis, benzodiazepine<br />
derivatives<br />
i może być uważana za błędną [1]. Działanie tych związków<br />
polega na nasileniu hamujących funkcji GABA-ergicznych<br />
neuronów. BDZ-R jest częścią receptora GABA A<br />
[2,3]. Ligandy<br />
tych miejsc wiążących mogą się różnić zdolnością do<br />
aktywacji receptora. Do uzyskania działania przeciwlękowego<br />
potrzebna jest mniejsza całkowita aktywacja receptora<br />
w porównaniu do aktywacji całkowitej receptora potrzebnej<br />
do wywołania działania uspokajającego i miorelaksującego<br />
[4]. Budowa chemiczna tych benzodiazepin charakteryzuje<br />
się obecnością pierścienia heterocyklicznego skondensowa-<br />
*Badania wykonano w ramach tematu badawczego finansowanego przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi<br />
Nr 502-13-626<br />
8
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
nego jest z pierścieniem benzenowym podstawionym chlorem<br />
w położeniu C7. Pierwowzorem struktury jest pochodna<br />
typu amidyny – chlordiazepoksyd. Natomiast wprowadzenie<br />
w miejsce ugrupowania amidynowego struktury laktamowej<br />
dało najbardziej reprezentatywne leki tej grupy, które można<br />
traktować, jako analogi diazepamu. Obecność ugrupowania<br />
N-metylowego w położeniu C2 chlordiazepoksydu prowadzi<br />
do powstania rozpuszczalnego w wodzie chlorowodorku.<br />
Grupę metylową przy atomie azotu ugrupowania laktamowego<br />
diazepamu, która warunkuje zwiększoną aktywność<br />
w porównaniu z analogami niepodstawionymi, można<br />
zastąpić ugrupowaniem o podwyższonej lipofilowości, np.<br />
cyklopropylometylowym (prazepam) lub trifluorometylowym<br />
(halazepam) [5]. Atom chloru w położeniu C7 w istotny<br />
sposób decyduje o właściwościach przeciwlękowych<br />
i uspokajających. Jego zamiana na atom bromu nie wpływa<br />
znacząco na profil aktywności farmakologicznej. Zamiana<br />
atomu chloru w położeniu C7 na grupę nitrową powoduje<br />
zasadniczą zmianę aktywności ośrodkowej. Leki pochodne<br />
7-nitrodemetylodiazepamu: nitrazepam, klonazepam i flunitrazepam<br />
stosowane są jako środki o działaniu nasennym<br />
i przeciwdrgawkowym. Do układu benzodiazepiny może<br />
być dołączony trzeci pierścień heterocykliczny. Najczęściej<br />
skutkuje to nasileniem działania nasennego. Mimo różnej<br />
od pochodnych 1,4-benzodiazepiny budowy chemicznej,<br />
1,5-benzodiazepiny wykazują podobny profil aktywności<br />
biologicznej. Zwraca się uwagę na ich podobieństwo we<br />
fragmencie N1, C2 i C3 do diazepamu (klobazam, triflubazam).<br />
Preparaty te działają silnie przeciwlękowo Jedynym<br />
lekiem z grupy 2,3-benzodiazepiny jest tofizopam, który odbiega<br />
strukturalnie od pochodnych 1,4- i 1,5-benzodiazepin,<br />
jego działanie farmakologiczne jest jednak zbliżone.<br />
Przeprowadzono wiele analiz QSAR dotyczących pochodnych<br />
1,4-benzodiazepiny o działaniu diazepamo-podobnym.<br />
Na podstawie analiz [6,7] stwierdzono zależność<br />
wprost proporcjonalną aktywności od lipofilowości (log P).<br />
Podsumowaniem przeglądu analiz QSAR [8] może być potwierdzenie<br />
znaczenia cech hydrofobowych, które ujawnia<br />
się zarówno w analizie in virto jak i in vivo. Znaczenie oddziaływań<br />
hydrofobowych dotyczy tradycyjnie podstawnika<br />
w pozycji C7. Ustalono również wartość optymalną log P<br />
całych struktur (log P = 2,91(±0,38)). Równocześnie stwierdzono,<br />
że dla podstawników przy C7 i C2’(w pierścieniu<br />
aromatycznym przy C5) istotniejsze są efekty steryczne niż<br />
elektronowe wynikające z ich rodzaju. Można stwierdzić, że<br />
największą rolę w oddziaływaniu z receptorem odgrywają<br />
parametry steryczne oraz hydrofobowe. Widoczne są jednak<br />
również wpływy parametrów elektronowych [9]. Niejednoznaczność<br />
wyników w zakresie aktywności może być<br />
spowodowana olbrzymią liczbą receptorów znajdujących<br />
się w komórkach mózgowych stosowanych w pomiarach<br />
aktywności benzodiazepin. Badania toksyczności benzodiazepin<br />
[10] wykazały, iż wzrastająca liczba podstawników<br />
chlorowych powoduje spadek toksyczności, zwiększenie<br />
liczby donorów wiązań wodorowych powoduje wzrost toksyczności.<br />
Niniejsza praca dotyczy badania grupy 69 pochodnych<br />
5-fenylo-1,4-benzodiazepin-2-onu dla ustalenia charakterystyki<br />
wymagań strukturalnych BDZ o działaniu diazepamopodobnym.<br />
Dane strukturalne i o aktywności biologicznej<br />
związków zgromadzono na podstawie bibliografii [8].<br />
Materiały i metody<br />
Analizowane w pracy BDZ należą do grupy pochodnych<br />
5-fenylo-1,4-benzodiazepin-2-onu. Do badań przyjęto<br />
69 związków (G1-G69) pochodzących z bibliografii [8].<br />
Strukturę pochodnych i aktywność podano w Tabeli 1.<br />
Tabela 1. Struktura badanych pochodnych 1,4-benzodiazepin-2-onu G1-G69 [8]<br />
R 7 R 1<br />
O<br />
N<br />
R 6<br />
R 2<br />
R 5<br />
N<br />
R 4<br />
R 3<br />
związki R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 log1/C<br />
G1 CH 3<br />
OCON(CH 3<br />
) 2<br />
Cl 6,05<br />
G2 C(CH 3<br />
) 3<br />
Cl 6,21<br />
G3 CH 3<br />
NH 2<br />
6,34<br />
G4 CH 3<br />
F NHCONHCH 3<br />
6,34<br />
G5 CH 2<br />
OCH 3<br />
NO 2<br />
6,37<br />
G6 NH 2<br />
6,41<br />
G7 CH 3<br />
CN 6,42<br />
G8 NHOH 6,45<br />
G9 Cl 6,49<br />
G10 C(CH 3<br />
) 3<br />
Cl NO 2<br />
6,52<br />
G11 CH 3<br />
F Cl Cl 6,52<br />
G12 CH 3<br />
CH 3<br />
6,77<br />
G13 CH 3<br />
F Cl 6,82<br />
G14 CH 2<br />
CHOHCH 2<br />
OH F Cl 6,85<br />
G15 CH 2<br />
C 3<br />
H 5<br />
Cl 6,96<br />
G16 CH 3<br />
F NHOH 7,02<br />
G17 CH 2<br />
CCH Cl 7,03<br />
9
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
G18 CH 2<br />
CF 3<br />
Cl 7,04<br />
G19 NH 2<br />
7,12<br />
G20 CH 3<br />
F Cl 7,14<br />
G21 Cl 7,15<br />
G22 CH 3<br />
F NH 2<br />
7,19<br />
G23 CH 3<br />
CH 3<br />
Cl 7,31<br />
G24 CHO 7,37<br />
G25 (CH 2<br />
) 2<br />
OCH 2<br />
CONH 2<br />
F Cl 7,37<br />
G26 F 7,40<br />
G27 CH 3<br />
F Cl Cl 7,40<br />
G28 Cl Cl 7,43<br />
G29 Cl 7,43<br />
G30 C 2<br />
H 5<br />
7,44<br />
G31 CH 3<br />
F CN 7,52<br />
G32 F F 7,55<br />
G33 CH 2<br />
CH 2<br />
OH F Cl 7,61<br />
G34 CHCH 2<br />
7,62<br />
G35 F 7,68<br />
G36 F F 7,72<br />
G37 F CH 3<br />
7,72<br />
G38 F COCH 3<br />
7,74<br />
G39 OH Cl 7,74<br />
G40 CH 3<br />
F 7,77<br />
G41 CH 3<br />
OH Cl 7,79<br />
G42 CH 3<br />
F 7,85<br />
G43 NO 2<br />
7,99<br />
G44 Cl 8,03<br />
G45 CH 3<br />
Cl 8,09<br />
G46 F F 8,13<br />
G47 Cl Cl Cl 8,15<br />
G48 CH 3<br />
CH 3<br />
F NO 2<br />
8,15<br />
G49 CH 3<br />
Cl Cl Cl 8,26<br />
G50 F N 3<br />
8,27<br />
G51 CH 3<br />
F F 8,29<br />
G52 CH 3<br />
F F Cl 8,39<br />
G53 H Cl CH 3<br />
8,41<br />
G54 Cl Cl 8,41<br />
G55 CH 3<br />
F NO 2<br />
8,42<br />
G56 CH 3<br />
Cl 8,42<br />
G57 F Cl Cl 8,44<br />
G58 CF3 NO 2<br />
8,45<br />
G59 CH 3<br />
F Cl 8,46<br />
G60 Cl F Cl 8,52<br />
G61 CH 3<br />
F I 8,54<br />
G62 CH 3<br />
F F Br 8,62<br />
G63 CH 3<br />
Cl NO 2<br />
8,66<br />
G64 F Cl 8,70<br />
G65 Cl Cl 8,74<br />
G66 Cl NO 2<br />
8,74<br />
G67 F F Cl 8,79<br />
G68 F NO 2<br />
8,82<br />
G69 CH 3<br />
Cl NO 2<br />
8,92<br />
Dane o właściwościach fizykochemicznych związków<br />
G1-G69 ustalono metodami obliczeniowymi z zastosowaniem<br />
metod pół-empirycznych. Podstawą badania właściwości<br />
były struktury związków w minimum energetycznym<br />
(po optymalizacji geometrycznej metodą PM3 bez przeglądu<br />
konformacji). Związki opisano zbiorem zmiennych zgromadzonych<br />
za pomocą programów HyperChem 7.1, ACD-<br />
Labs 8.0 (logD i pK): log P - lipofilowość, %PSA – odsetek<br />
powierzchni o charakterze polarnym, N-N – odległość pomiędzy<br />
atomami azotu BDZ, HD i HA – liczba donorów<br />
i akceptorów wiązań wodorowych, Q1 i Q2 – ładunek elektryczny<br />
na N1 i N4 BDZ, V – objętość cząsteczki, Cl, F,<br />
I – liczba atomów chlorowca, P – polaryzowalność objętościowa,<br />
S – pole powierzchni, M – masa cząsteczkowa,<br />
Md – moment dipolowy, eH i eL – energia orbitali HOMO<br />
i LUMO, B1 i B2 – wskaźnik przenikania BBB, log D<br />
– współczynnik dystrybucji We wszystkich poniższych analizach<br />
wykorzystano dane o aktywności biologicznej w po-<br />
10
staci zahamowania przyłączenia [ 3 H]diazepamu do BDZ-R<br />
(log 1/C), pochodzące z pracy źródłowej [8] (dane surowe<br />
przedstawiono w Tabeli 2.).<br />
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
Analizę statystyczną przeprowadzono z zastosowaniem<br />
programu STATISTICA 7.1, metodami: regresji wielokrotnej<br />
(MR); analizy skupień (CA) metodą grupowania<br />
k-średnich; analizy funkcji dyskryminacyjnej (DFA).<br />
Tabela 2. Wartości parametrów fizykochemicznych (dane surowe) dla związków G1-G69<br />
związki log1/C S V logP P M HD HA Q1 Q2<br />
G1 6,05 360,25 321,83 3,50 38,54 371,82 0 6 0,01 -0,20<br />
G2 6,21 333,52 299,87 3,84 34,46 326,83 0 3 -0,01 -0,11<br />
G3 6,34 282,60 247,66 1,71 30,38 265,31 2 4 0,01 -0,11<br />
G4 6,34 338,04 297,08 1,45 35,40 340,36 0 3 0,02 -0,11<br />
G5 6,37 319,28 279,85 -1,22 33,34 325,32 0 7 0,03 -0,07<br />
G6 6,41 260,77 229,95 1,46 28,55 251,29 3 4 0,04 -0,12<br />
G7 6,42 283,71 253,83 2,53 30,88 275,31 0 4 0,02 -0,12<br />
G8 6,45 246,85 218,82 2,24 27,20 236,27 1 3 0,04 -0,12<br />
G9 6,49 258,95 232,46 2,76 29,12 270,72 1 3 0,04 -0,12<br />
G10 6,52 354,19 318,09 -0,07 38,31 371,82 0 6 -0,02 -0,11<br />
G11 6,52 296,03 266,40 3,67 32,80 337,18 0 3 0,02 -0,11<br />
G12 6,77 279,06 251,23 3,18 30,87 264,33 1 3 0,04 -0,12<br />
G13 6,82 279,18 252,33 3,15 30,87 302,74 0 3 0,01 -0,11<br />
G14 6,85 338,49 300,08 2,33 39,91 362,79 2 5 -0,01 -0,11<br />
G15 6,96 332,51 295,26 4,10 36,27 324,81 0 3 0,01 -0,12<br />
G16 7,02 293,22 257,64 2,44 30,93 299,30 2 5 0,02 -0,12<br />
G17 7,03 304,44 273,87 3,28 33,52 308,77 0 3 0,01 -0,12<br />
G18 7,04 307,17 274,24 3,98 32,52 352,74 0 3 0,01 -0,11<br />
G19 7,12 273,50 243,09 1,98 30,47 285,73 3 4 0,05 -0,20<br />
G20 7,14 282,49 252,88 3,15 30,87 302,74 0 3 0,01 -0,12<br />
G21 7,15 262,77 232,97 2,76 29,12 270,72 1 3 0,04 -0,12<br />
G22 7,19 282,62 249,89 1,85 30,29 283,31 2 4 0,03 -0,12<br />
G23 7,28 279,35 249,11 3,23 30,96 284,74 1 3 0,03 -0,12<br />
G24 7,31 295,29 266,74 3,55 32,79 298,77 0 3 0,02 -0,13<br />
G25 7,37 267,35 236,79 1,92 29,12 264,28 1 4 0,04 -0,12<br />
G26 7,37 369,78 323,56 1,66 38,45 389,81 2 6 0,00 -0,11<br />
G27 7,40 249,98 221,39 2,38 27,10 254,26 1 3 0,04 -0,12<br />
G28 7,40 294,11 263,90 3,53 32,89 219,19 0 3 0,01 -0,12<br />
G29 7,43 276,86 246,85 3,28 21,05 305,16 1 3 0,04 -0,18<br />
G30 7,43 259,20 231,94 2,76 29,12 270,72 1 3 0,04 -0,12<br />
G31 7,44 285,78 252,16 3,11 30,87 264,33 1 3 0,04 -0,12<br />
G32 7,52 287,91 256,69 2,67 30,79 293,30 0 4 0,02 -0,12<br />
G33 7,55 270,63 238,22 3,04 28,94 306,70 1 3 0,04 -0,10<br />
G34 7,61 312,13 276,33 2,71 33,34 332,76 1 4 0,00 -0,12<br />
G35 7,62 277,31 247,08 2,89 30,67 262,31 1 3 0,04 -0,12<br />
G36 7,68 251,25 221,55 2,38 27,10 254,26 1 3 0,04 -0,12<br />
G37 7,72 254,02 224,04 2,52 27,01 272,25 1 3 0,04 -0,10<br />
G38 7,72 272,37 238,14 2,85 28,94 268,29 1 3 0,04 -0,13<br />
G39 7,74 290,88 256,12 1,69 30,86 296,30 1 4 0,04 -0,12<br />
G40 7,74 269,70 240,04 2,91 29,76 286,72 2 4 0,05 -0,20<br />
G41 7,77 266,51 238,44 2,63 28,94 268,29 0 3 0,02 -0,12<br />
G42 7,79 288,59 256,96 3,15 31,60 300,74 1 4 0,03 -0,20<br />
G43 7,85 268,24 238,83 2,63 28,94 268,29 0 3 0,02 -0,12<br />
G44 7,99 271,12 238,07 -1,67 29,04 281,27 1 6 0,04 -0,12<br />
G45 8,03 262,77 232,97 2,76 29,12 270,72 1 3 0,04 0,04<br />
11
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
G46 8,09 279,88 250,06 3,01 30,96 284,74 0 3 0,02 -0,12<br />
G47 8,13 255,34 224,13 2,52 27,01 272,25 1 3 0,04 -0,12<br />
G48 8,15 287,78 259,49 3,80 32,98 339,61 1 3 0,04 -0,11<br />
G49 8,15 308,57 274,55 -0,74 32,62 327,31 0 6 0,02 -0,12<br />
G50 8,26 305,12 276,50 4,05 34,82 353,64 0 3 0,01 -0,11<br />
G51 8,27 278,28 245,01 2,22 30,29 295,28 1 6 0,02 -0,13<br />
G52 8,29 272,11 241,34 2,77 28,85 286,28 0 3 0,02 -0,11<br />
G53 8,39 287,25 255,21 3,29 30,78 320,73 0 3 0,01 -0,09<br />
G54 8,41 275,65 246,22 3,28 31,05 305,16 1 3 0,04 -0,12<br />
G55 8,42 293,39 258,20 -1,28 30,78 313,29 0 6 0,01 -0,11<br />
G56 8,42 275,61 249,10 3,01 30,96 288,75 1 3 0,02 -0,12<br />
G57 8,44 282,76 249,54 3,42 30,96 323,15 1 3 0,04 -0,12<br />
G58 8,45 297,32 261,48 -0,78 30,60 349,27 1 6 0,03 -0,09<br />
G59 8,46 282,94 252,30 3,44 30,87 302,74 1 3 0,04 -0,13<br />
G60 8,52 280,66 249,20 3,42 30,96 323,15 1 3 0,04 -0,12<br />
G61 8,54 297,46 267,20 3,89 33,97 394,19 0 3 0,01 -0,12<br />
G62 8,62 293,86 262,42 3,56 31,47 365,18 0 3 0,01 -0,09<br />
G63 8,66 301,05 268,59 -0,90 32,80 329,74 0 6 -0,01 -0,11<br />
G64 8,70 268,12 235,71 2,90 29,03 288,71 1 3 0,04 -0,12<br />
G65 8,74 275,51 246,03 3,28 31,05 305,16 1 3 0,04 -0,12<br />
G66 8,74 284,21 251,30 -1,15 30,96 315,72 1 6 0,03 -0,11<br />
G67 8,79 270,96 238,27 3,04 29,94 306,70 1 3 0,03 -0,10<br />
G68 8,82 274,82 240,71 -1,53 28,95 299,27 1 6 0,03 -0,10<br />
G69 8,92 294,58 259,99 2,75 32,31 299,76 1 6 0,04 -0,11<br />
związki Md N-N eH eL B1 B2 logD Cl F I Halo %PSA<br />
G1 3,62 2,89 -9,21 -0,92 -0,26 -0,45 3,37 1 0 0 1 17,38<br />
12<br />
G2 3,19 2,97 -9,19 -0,77 0,24 0,02 4,19 1 0 0 1 9,80<br />
G3 4,83 2,95 -8,70 -0,59 -0,47 -0,39 1,39 0 0 0 0 20,77<br />
G4 1,25 2,96 -8,94 -0,96 -0,12 0,02 1,16 0 1 0 1 9,66<br />
G5 3,50 2,97 -9,67 -1,44 -1,34 -0,86 1,40 0 0 0 0 27,47<br />
G6 5,20 2,97 -8,70 -0,67 -0,64 -0,53 0,76 0 0 0 0 25,88<br />
G7 1,34 2,98 -9,48 -1,13 -0,31 -0,36 2,10 0 0 0 0 19,90<br />
G8 4,29 2,97 -9,33 -0,71 -0,13 -0,12 2,08 0 0 0 0 16,80<br />
G9 4,00 2,95 -9,40 -0,81 -0,06 -0,12 3,66 1 0 0 1 16,01<br />
G10 2,58 2,98 -9,16 -1,45 -1,03 -0,71 2,77 1 0 0 1 22,16<br />
G11 2,50 2,95 -9,36 -0,96 0,21 0,02 3,85 2 1 0 3 11,04<br />
G12 4,83 2,93 -9,16 -0,64 0,01 -0,12 3,00 0 0 0 0 14,86<br />
G13 3,00 2,94 -9,27 -0,81 0,13 0,02 2,18 1 1 0 2 11,70<br />
G14 4,56 3,06 -9,37 -1,06 -0,59 -0,62 1,58 1 1 0 2 21,60<br />
G15 3,45 2,99 -9,14 -0,77 0,28 0,02 4,35 1 0 0 1 9,83<br />
G16 3,61 2,96 -8,82 -0,78 -0,45 -0,49 0,78 0 1 0 1 22,14<br />
G17 3,36 3,01 -9,18 -0,80 0,15 0,02 3,44 1 0 0 1 10,73<br />
G18 5,51 2,96 -9,54 -1,01 0,26 0,02 4,27 1 3 0 4 10,64<br />
G19 4,96 2,96 -8,66 -0,73 -0,56 -0,53 1,55 1 0 0 1 24,67<br />
G20 3,97 2,95 -9,18 -0,87 0,13 0,02 3,70 1 1 0 2 11,57<br />
G21 3,37 2,97 -9,25 -0,84 -0,06 -0,12 3,15 2 0 0 2 15,78<br />
G22 4,47 2,98 -8,59 -0,72 -0,45 -0,39 0,62 0 1 0 1 20,77<br />
G23 3,44 2,96 -9,21 -0,81 0,02 -0,12 3,61 1 0 0 1 14,84<br />
G24 3,12 2,97 -9,15 -0,77 0,20 0,02 3,46 1 0 0 1 11,06<br />
G25 2,02 2,98 -9,53 -1,05 -0,44 -0,39 2,53 0 0 0 0 21,89<br />
G26 4,41 2,98 -9,31 -0,98 -0,87 -0,81 1,72 1 1 0 2 22,98<br />
G27 2,64 2,97 -9,43 -0,92 -0,11 -0,12 2,67 0 1 0 1 16,59<br />
G28 2,82 2,96 -9,21 -0,95 0,19 0,02 3,49 2 0 0 2 11,11<br />
G29 3,48 2,96 -9,28 -0,96 0,02 -0,12 3,46 2 0 0 2 14,98<br />
G30 3,90 2,96 -9,28 -0,77 -0,06 -0,12 2,24 1 0 0 1 16,00<br />
G31 4,63 2,97 -9,21 -0,69 0,00 -0,12 3,08 0 0 0 0 14,51<br />
G32 0,36 2,97 -9,43 -1,08 -0,29 -0,36 1,96 0 1 0 1 19,61<br />
G33 4,23 2,94 -9,38 -1,03 -0,01 -0,12 2,79 1 2 0 3 15,32
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
G34 3,78 3,00 -9,12 -0,89 -0,23 -0,30 2,20 1 1 0 2 16,95<br />
G35 4,42 2,97 -9,06 -0,78 -0,04 -0,12 2,57 0 0 0 0 14,95<br />
G36 3,74 2,96 -9,28 -0,79 -0,11 -0,12 1,95 0 1 0 1 16,50<br />
G37 4,71 2,94 -9,31 -0,93 -0,09 -0,12 1,85 0 2 0 2 16,32<br />
G38 3,94 2,96 -9,22 -0,77 -0,04 -0,12 2,41 0 1 0 1 15,22<br />
G39 3,06 2,97 -9,46 -0,98 -0,35 -0,26 1,69 0 1 0 1 17,43<br />
G40 2,83 2,98 -9,16 -0,83 -0,33 -0,44 3,31 1 0 0 1 22,87<br />
G41 2,61 2,97 -9,33 -0,88 0,06 0,02 2,52 0 1 0 1 12,26<br />
G42 2,54 2,98 -9,10 -0,78 -0,17 -0,30 2,20 1 0 0 1 18,33<br />
G43 3,46 2,96 -9,18 -0,76 0,06 0,02 1,89 0 1 0 1 12,18<br />
G44 1,71 2,98 -9,72 -1,59 -1,41 -0,85 2,18 0 0 0 0 32,19<br />
G45 3,37 2,94 -9,25 -0,84 -0,06 -0,12 3,15 1 0 0 1 15,78<br />
G46 3,29 2,97 -9,18 0,80 0,11 0,02 2,96 1 0 0 1 11,67<br />
G47 2,06 2,96 -9,37 -0,96 -0,09 -0,12 2,54 0 2 0 2 16,24<br />
G48 3,41 2,99 -9,22 -0,93 0,10 -0,12 3,48 3 0 0 3 14,41<br />
G49 2,38 2,96 -9,75 -1,45 -1,14 -0,71 1,74 0 1 0 1 25,44<br />
G50 3,24 2,94 -9,16 -0,89 0,27 0,02 3,30 3 0 0 3 10,71<br />
G51 2,83 3,17 -8,72 -1,22 -0,55 -0,56 0,65 0 1 0 1 24,95<br />
G52 1,78 2,95 -9,29 -0,92 0,08 0,02 2,38 0 2 0 2 12,01<br />
G53 3,63 2,95 -9,15 -0,98 0,16 0,02 2,73 1 2 0 3 11,37<br />
G54 3,00 2,96 -9,20 -0,88 0,02 -0,12 3,31 2 0 0 2 15,04<br />
G55 2,27 2,97 -9,77 -1,47 -1,22 -0,71 1,25 0 1 0 1 26,75<br />
G56 3,73 2,96 -9,19 -0,74 0,11 0,02 3,19 1 0 0 1 11,85<br />
G57 2,72 2,97 -9,20 -1,01 0,05 -0,12 3,83 2 1 0 3 14,66<br />
G58 2,63 2,96 -10,08 -1,73 -1,27 -0,85 2,43 0 3 0 3 29,36<br />
G59 2,78 2,95 -9,16 -0,86 0,05 -0,12 3,80 2 0 0 2 14,65<br />
G60 3,17 2,94 -9,19 -0,96 0,05 -0,12 2,73 2 1 0 3 14,77<br />
G61 2,86 2,95 -9,00 -0,85 0,25 0,02 3,36 0 1 1 2 10,98<br />
G62 3,46 2,94 -9,33 -1,00 0,20 0,02 2,65 0 2 1 3 11,12<br />
G63 2,06 2,95 -9,34 -1,57 -1,16 -0,71 1,55 1 0 0 1 26,07<br />
G64 2,84 2,96 -9,18 -0,89 -0,03 -0,12 3,01 1 1 0 2 15,46<br />
G65 3,01 2,96 -9,19 -0,88 0,02 -0,12 3,31 2 0 0 2 15,05<br />
G66 1,86 2,97 -9,63 -1,53 -1,33 -0,85 2,31 1 0 0 1 30,71<br />
G67 3,76 2,94 -9,21 -1,01 -0,01 -0,12 2,92 1 2 0 3 15,30<br />
G68 1,53 2,97 -9,82 -1,64 -1,39 -0,85 2,04 0 1 0 1 31,76<br />
G69 4,86 2,95 -8,63 -0,70 -0,73 -0,85 2,83 1 0 0 1 29,63<br />
Wyniki badań<br />
Analiza Regresji Wielokrotnej (MR – Multiple Regression)<br />
Przeprowadzono pełną analizę regresji z zastosowaniem<br />
parametrów fizykochemicznych, obliczonych metodami<br />
pół-empirycznymi, dla związków G1–G69. Wyznaczono<br />
macierz korelacji w poszukiwania ścisłych zależności pomiędzy<br />
zmiennymi niezależnymi. Następnie prowadzono<br />
systematyczną analizę krokową dla zmiennej zależnej<br />
– aktywności biologicznej log 1/C z użyciem wszystkich<br />
zgromadzonych danych fizykochemicznych – zmiennych<br />
niezależnych. Przeprowadzenie pełnej analizy krokowej dla<br />
zmiennej zależnej log 1/C wprowadziło do modelu regresji<br />
7 zmiennych niezależnych. Model ten opisuje ok. 47%<br />
zmienności całkowitej w badanej grupie przypadków aktywnych<br />
i wyrażony jest równaniem:<br />
log 1/C = 12,98(±1,40)<br />
– 2,50(±0,62) V – 0,23(±0,07) Md + 0,24(±0,08) halo<br />
+ 1,59(±0,46) I + 0,62(±0,24) HA<br />
– 0,08(±0,04) %PSA<br />
+ 0,27(±0,12) Cl<br />
r = 0,70; R 2 = 0,47; F = 7,616; p
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
3,0<br />
2,5<br />
2,0<br />
1,5<br />
1,0<br />
0,5<br />
0,0<br />
-0,5<br />
-1,0<br />
-1,5<br />
-2,0<br />
-2,5<br />
Wykr. średnich każd. skupienia<br />
V HA Md Cl I halo log1/C %PSA<br />
Z mienne<br />
Skupien. 1<br />
Skupien. 2<br />
Skupien. 3<br />
Skupien. 4<br />
Skupien. 5<br />
Wykres średnich wartości standaryzowanych zmiennych grupujących dla<br />
skupień 1-5<br />
podobnym na podstawie cech różnicujących poziom<br />
ich aktywności biologicznej log 1/C. Założono uzyskanie<br />
podziału na skupienia przypadków reprezentujące<br />
poziom ich aktywności. Analizę przeprowadzono<br />
po wprowadzeniu zmiennych wpływających<br />
na poziom aktywności biologicznej G1-G69 wskazanych<br />
równaniem analizy MR.<br />
Fizykochemiczna zmienność struktur związków<br />
o podobnym poziomie ustalonej aktywności biologicznej<br />
powoduje, że odpowiednie zróżnicowanie<br />
średnich log 1/C uzyskano dopiero dla pięciu skupień.<br />
Poniżej przedstawiono wykres średnich wartości<br />
zmiennych dla każdego skupienia (Ryc.1.)<br />
i istotne elementy wyniku analizy wariancji dla tych<br />
zmiennych (Tabela 3.):<br />
Związki G1-G69 stanowią bardzo niejednolity<br />
zbiór przypadków. Nic nie stoi jednak na przeszkodzie<br />
rozpatrywania wydzielonych skupień 2 i 4<br />
– o średnich standaryzowanych wartościach<br />
Tabela 3. Wyniki analizy wariancji dla zmiennych w modelu i wartości średnich dla każdego skupienia<br />
zmienna F p Średnia sk. 1 Średnia sk. 5 Średnia sk. 3 Średnia sk. 2 Średnia sk. 4<br />
V 11,37486 0,000000 1,52693 0,510860 -0,486050 -0,233958 0,005949<br />
HA 41,47506 0,000000 0,58208 0,444058 -0,568075 -0,608330 1,824240<br />
Md 10,61056 0,000001 -0,84336 1,292506 0,141052 -0,095509 -0,796216<br />
Cl 19,71681 0,000000 -0,31964 -0,249625 -0,436336 1,334502 -0,529691<br />
I 0,77913 0,542877 -0,17152 -0,171517 0,266804 -0,171517 -0,171517<br />
halo 31,47516 0,000000 -1,27383 1,060981 -0,445350 0,985665 -0,344928<br />
log1/C 18,83766 0,000000 -1,36500 -0,793768 -0,029988 0,547090 1,124464<br />
%PSA 29,46171 0,000000 -0,07148 0,550713 -0,497044 -0,478594 1,854786<br />
Tabela 4. Elementy każdego skupienia i ich odległość od środka skupienia<br />
Działanie słabe Działanie średnie Działanie silne<br />
Elementy sk. 1 Elementy sk. 5 Elementy sk. 3 Elementy sk. 2 Elementy sk. 4<br />
związek odległość związek odległość związek odległość związek odległość związek odległość<br />
G1 0,842202 G3 0,659445 G8 0,794592 G11 0,806527 G44 0,565000<br />
G2 0,738718 G6 0,782537 G9 0,660225 G21 0,503454 G49 0,478727<br />
G4 0,784632 G14 0,623942 G12 0,703081 G28 0,594809 G51 0,351507<br />
G5 1,095353 G16 0,505082 G13 0,539234 G29 0,322794 G55 0,319643<br />
G7 0,783189 G18 0,838613 G17 0,680411 G33 0,636949 G58 0,735809<br />
G10 0,726611 G19 0,549904 G20 0,481160 G40 0,713746 G63 0,487478<br />
G15 0,772192 G22 0,400536 G23 0,364363 G48 0,607518 G66 0,411300<br />
G32 1,032677 G26 1,063385 G24 0,572739 G50 0,718464 G68 0,489031<br />
G34 0,535570 G25 0,787136 G53 0,478816 G69 0,911877<br />
G27 0,534806 G54 0,222005<br />
G30 0,427176 G57 0,349754<br />
G31 0,548183 G59 0,264537<br />
G35 0,477141 G60 0,334998<br />
G36 0,466582 G64 0,538871<br />
G37 0,741906 G65 0,348793<br />
G38 0,340726 G67 0,615411<br />
G39 0,470981<br />
G41 0,459837<br />
G42 0,604673<br />
G43 0,375830<br />
G45 0,425694<br />
G46 0,477715<br />
G47 0,790243<br />
G52 0,715998<br />
G56 0,536943<br />
G61 2,054794<br />
G62 2,033153<br />
14
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
Tabela 5. Funkcje klasyfikacyjne charakteryzujące grupy 1-5 badanych pochodnych benzodiazepiny<br />
Funkcje klasyfikacyjne; grupujące dla poziomów działania benzodiazepin o działaniu na GABA-BDZ<br />
Zmienne w modelu G_1 G_2 G_3 G_4 G_5<br />
HA -3,86251 1,43126 0,23277 4,26819 -4,07763<br />
halo -3,39085 2,36836 -1,08100 -0,68897 2,73563<br />
Cl -2,85011 3,92116 -0,58029 -0,27641 -2,42023<br />
V 6,16762 -3,23597 -1,35730 0,18701 4,15538<br />
Md -1,28996 -0,51276 0,41210 -1,09433 1,91621<br />
%PSA 4,08421 -2,54994 -2,23461 2,35848 5,24816<br />
I -1,25289 0,53663 0,19698 0,01838 -0,44964<br />
Stała -8,85989 -5,77698 -2,18001 -8,74389 -6,66827<br />
log 1/C 0,55 i 1,13, jako grupę o działaniu silnym,<br />
skupienia 3 – o średniej standaryzowanej wartości<br />
log 1/C -0,03, jako grupę o działaniu średnim oraz<br />
skupienia 1 i 5 – o średnich standaryzowanych wartościach<br />
log 1/C -1,37 i -0,8, jako grupę o działaniu<br />
słabym. Wyniki analizy wariancji wskazują na parametry<br />
HA, halo i %PSA, jako najsilniejsze kryteria<br />
przypisania obiektów do skupień 1-5. Struktura danych<br />
jest jednak bardzo niejednolita. Obserwacja zamieszczonego<br />
powyżej wykresu wyraźnie rozróżnia<br />
grupę pochodnych najsłabiej (skupienie 1) i najsilniej<br />
(skupienie 4) działających średnimi wartościami<br />
parametrów V, HA i %PSA. Wartości średnie parametrów<br />
V i %PSA nie są jednak zgodne z trendem<br />
ustalonym w analizie MR. Obserwowane odstępstwa<br />
wynikać mogą z niekorzystnej reprezentacji strukturalnej<br />
badanej grupy, co uwidoczniło się już na etapie<br />
analizy MR. Poniżej (w Tabeli 4) przestawiono<br />
elementy każdego skupienia i ich odległość od środka<br />
skupienia. Dla większej czytelności uzyskanych<br />
wyników należy dodać, że kolejność przypadków<br />
G1-G69 odpowiada wzrastającej sile działania. Wyłonione<br />
w przebiegu CA, z użyciem wszystkich zmiennych,<br />
skupienia 1+5, 3 i 2+4 – grupy działania słabego, średniego<br />
i silnego są podstawą analizy dyskryminacyjnej.<br />
Analiza Funkcji Dyskryminacyjnej (DFA – Discriminant<br />
Function Analysis)<br />
Analiza funkcji dyskryminacyjnej służyła wyznaczeniu<br />
funkcji klasyfikacyjnych badania przynależności nowych<br />
pochodnych do grupy słabo, średnio i silnie działających pochodnych<br />
benzodiazepiny o działaniu klasycznym. Prowadzona<br />
tu DFA ma charakter ilościowy. Sposób wyznaczenia<br />
zmiennej grupującej oparty został na wynikach analizy skupień<br />
z zastosowaniem zmiennych niezależnych, jako kryteriów<br />
klasyfikacji. Badane pochodne G1-G69 opisano kodami<br />
grupowymi: 1 i 5 – słabo działające; 3 – średnio działające<br />
oraz 2 i 4 – silnie działające w stosunku do receptorów<br />
GABA-BDZ. Do analizy wprowadzono jedynie zmiennych<br />
niezależne (standaryzowane) ustalonych równaniem analizy<br />
MR. Jako zmiennej grupującej użyto kodów grupowych 1-5<br />
wyznaczonych uprzednio w analizie grupowania metodą<br />
k-średnich CA. Analizę prowadzono przy użyciu krokowej<br />
metody postępującej wyznaczającej zmienne dyskryminujące<br />
spośród wprowadzonych do analizy. Po wprowadzeniu<br />
do modelu 7 zmiennych dyskryminujących uzyskano cztery<br />
funkcje dyskryminacyjne i na ich podstawie obliczono odpowiednie<br />
funkcje klasyfikacyjne dla grup 1-5.<br />
Pierw2<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
-1<br />
-2<br />
-3<br />
Pierw1 wz . pierw2<br />
-4<br />
-6 -4 -2 0 2 4 6<br />
Pierw1<br />
G_1:1<br />
G_2:2<br />
G_3:3<br />
G_4:4<br />
G_5:5<br />
Wykres rozrzutu przypadków G1-G69 na podstawie średnich zmiennych kanonicznych<br />
funkcji dyskryminacyjnej 1 (pierwiastek 1) w stosunku do funkcji<br />
dyskryminacyjnej 2 (pierwiastek 2)<br />
Na podstawie wartości podanych w Tabeli 5 możliwe<br />
jest zaproponowanie pięciu równań funkcji klasyfikacyjnych<br />
charakteryzujących grupy 1-5. Z ustalonych funkcji<br />
dyskryminacyjnych stworzono wykres rozrzutu w celu obserwacji<br />
dyskryminacji:<br />
Jak widać, związki najsilniej działające (grupa 2 i 4)<br />
są wyraźnie rozdzielone pierwszą funkcją dyskryminacyjną.<br />
Można również stwierdzić, że grupy 2 i 3 są wyraźnie<br />
skupione, co zgodne jest, pod względem obserwowanych<br />
wartości log 1/C, z przyporządkowaniem przypadków do<br />
tych grup. Mimo obserwowanego rozproszenia kontrola<br />
prawdopodobieństwa a posteriori klasyfikacji związków nie<br />
wykazuje wielu błędów w przyporządkowaniu przypadków.<br />
Jedynie dwa przypadki G5 i G53 zostały zakwalifikowane<br />
nieprawidłowo. Z macierzy struktury czynnikowej wywnioskowano,<br />
że zmienną o największej mocy dyskryminującej<br />
jest tu liczba akceptorów wiązań wodorowych, a w drugim<br />
rzędzie liczba atomów chlorowca w cząsteczce i odsetek powierzchni<br />
cząsteczki zajęty przez atomy azotu i tlenu połączone<br />
z atomami wodoru. Wprowadzone do modelu zmienne<br />
dyskryminujące mają wyraźny związek z dostępnością<br />
biologiczną i są również wskaźnikami zdolności związków<br />
do przekraczania BBB. Ustalona macierz klasyfikacji (Tabela<br />
6) wskazuje na dopasowanie modelu do założonego<br />
podziału na grupy:<br />
15
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
Tabela 6. Macierz obserwowanych i przewidywanych klasyfikacji<br />
przypadków w grupach z zastosowaniem modelu<br />
Macierz klasyfikacji. Wiersze: obserwowana klasyfikacja<br />
Kolumny: Przewidywana klasyfikacja<br />
Procent poprawnie G_1 G_2 G_3 G_4 G_5<br />
G_1 87,5000 7 0 0 1 0<br />
G_2 93,7500 0 15 1 0 0<br />
G_3 100,0000 0 0 27 0 0<br />
G_4 100,0000 0 0 0 9 0<br />
G_5 100,0000 0 0 0 0 9<br />
Razem 97,1015 7 15 28 10 9<br />
Wnioski<br />
Na podstawie przeprowadzonej analizy zaproponowano<br />
charakterystykę strukturalną pochodnych BDZ o działaniu<br />
klasycznym na receptor benzodiazepinowy w kompleksie<br />
GABA-ergicznym. Analiza MR pozwala na ustalenie, że<br />
wyższa aktywność log 1/C pochodnych G1-G69 zależna<br />
jest od następujących czynników: objętości van der Waalsa<br />
V poniżej 255 Å 3 ; momentu dipolowego Md poniżej 3,27D;<br />
ilości podstawników halogenowych w cząsteczce halo powyżej<br />
2; obecności atomu jodu I; liczby akceptorów wiązań<br />
wodorowych HA powyżej 3,79; odsetka powierzchni związanego<br />
z atomami elektroujemnymi O i N %PSA poniżej<br />
17,41% oraz; liczby atomów chloru Cl więcej niż 1. Analiza<br />
ta nie przedstawia jednak silnych zależności. Większość<br />
tych parametrów wpływa na możliwość przenikania związków<br />
przez barierę krew-mózg. Przeprowadzona analiza MR<br />
wskazuje na preferencję dla czynników sprzyjających pokonywaniu<br />
BBB przez te pochodne benzodiazepiny. Analiza<br />
skupień pokazuje, że zmienność niektórych parametrów nie<br />
zachowuje trendu zgodnego z wynikiem analizy regresji.<br />
Różnice te dają możliwość obserwacji struktury zmienności<br />
kolejnych parametrów w mniejszych zakresach przypadków<br />
o bardziej sprecyzowanych właściwościach (np. biologicznych).<br />
Skupienia te, które podobne są pod względem<br />
strukturalnym, mogą charakteryzować się nawet trendem<br />
przeciwnym, co nie ujawnia się w badaniu łącznie całej grupy.<br />
Jest to najczęściej spowodowane zbyt małym wpływem<br />
średniej wartości zmiennej dla danego skupienia. Ujawniona<br />
struktura zmienności całkowitej oraz wyniki analizy<br />
funkcji dyskryminacyjnej potwierdzają założenie, że zróżnicowanie<br />
odpowiedzi biologicznej, w grupie pochodnych<br />
benzodiazepiny o działaniu diazepamo-podobnym, ma podłoże<br />
farmakodynamiczne, ale również farmakokinetyczne<br />
i zależy w dużej mierze od ich zdolności przenikania bariery<br />
krew-mózg.<br />
Piśmiennictwo<br />
1. Mutschler E i wsp. Kompendium farmakologii i toksykologii<br />
Mutschlera, wydanie I polskie, Med Pharm Polska<br />
2008, Wrocław.<br />
2. Schofield PR i wsp. Sequence and functional expression<br />
of the GABA A<br />
receptor shows a ligand-gated receptor<br />
superfamily. Nature1988; 328: 221-227.<br />
3. Stephenson FA. Understanding the GABA A<br />
receptor: A<br />
chemically gated ion channel. Biochem J 1988; 249:<br />
21-32.<br />
4. Gardner CR. Interpretation of behavioral effects of benzodiazepine<br />
receptor ligands. Drugs Future 1989; 14:<br />
51-67.<br />
5. Wong G i wsp. Synthetic and Computer-Assisted Analysis<br />
of the Structural Requirements for Selective, High<br />
Affinity Ligand Binding to Diazepam Insensitive Benzodiazepine<br />
Receptors. J Med Chem 1993; 36:1820-1830.<br />
6. Haefely W i wsp. Recent Advances in the Molecular<br />
Pharmacology of Benzodiazepine Receptors and the<br />
Structure-Activity Relationships of their Agonists and<br />
Antagonists. Adv Drug Res 1985; 14: 165-222.<br />
7. Villar HO, Loew GH. Molecular modulators of benzodiazepine<br />
receptor ligand binding. J Quantum Chem<br />
QBS 1989; 6: 261-271.<br />
8. Hadjipavlou-Litina D, Hansch C. Quantitative Structure-Activity<br />
Relationship of the Benzodiazpienes.<br />
A Review and Reevaluation. Chem Rev 1994; 94:<br />
1483-1505.<br />
9. Kim K H i wsp. Use of the hydrogen bond potential function<br />
in a comparative molecular field analysis (CoMFA)<br />
on a set of benzodiazepines. Comp Mol Des 1993; 7:<br />
263-280.<br />
10. Funar-Timofei S, Ionescu D. Structure-Toxicity Study<br />
Of Benzodiazepines By Computational Studies. Annals<br />
Of West University Timisoara Series Chemistry 2005;<br />
14: 221-230.<br />
Adres do korespondencji:<br />
Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska,<br />
Zakład Chemii Analitycznej UM w Łodzi,<br />
ul. Muszyńskiego 1,<br />
90-151 Łódź,<br />
tel. 42 677-92-11;<br />
e-mail: elzbieta.brzezinska@umed.lodz.pl<br />
16
Farm Przegl Nauk, 2009,8, 17-23<br />
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
Ekspresja żelatynaz A i B oraz inwazyjność komórek raka płuc<br />
i raka pęcherza moczowego w hodowlach in vitro<br />
traktowanych wybranymi tetracyklinami*<br />
Expression of Gelatinases A and B and The Invasiveness<br />
of in vitro Cultured Lung Cancer and Bladder Cancer Cells<br />
Treated with Selected Tetracyclines<br />
Daniel Sypniewski, Ilona Bednarek, Sabina Gałka, Anna Bryła, Grzegorz Machnik,<br />
Tomasz Loch, Dagna Sołtysik, Daria Błaszczyk<br />
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach<br />
Streszczenie<br />
Metaloproteazy macierzy pozakomórkowej (MMP) należą<br />
do enzymów biorących udział w licznych procesach zarówno<br />
o charakterze fizjologicznym (np. jak gojenie się ran), jak<br />
również patologicznym, w tym przede wszystkim w onkogenezie.<br />
Ze względu na swój wielostronny wpływ na rozwój<br />
i progresję nowotworów złośliwych, nadekspresja genów<br />
kodujących MMP - zwłaszcza żelatynazę A i B (MMP-2<br />
i MMP-9) - jest uważana za jeden z głównych czynników<br />
prognozujących nasiloną inwazyjność nowotworu. W pracy<br />
przedstawiono wyniki analizy wpływu wybranych tetracyklin<br />
(doksycykliny, oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny),<br />
które wykazują zdolność do modulacji ekspresji i aktywności<br />
MMP, na inwazyjność komórek nowotworowych raka płuc<br />
oraz raka pęcherza in vitro (linie komórkowe A549 i T24).<br />
Do wyznaczenia optymalnych stężeń i czasu traktowania zastosowano<br />
test MTT. Następnie zbadano wpływ tetracyklin<br />
na ekspresję żelatynazy A i B na poziomie mRNA i białka.<br />
Wykazano zależność ekspresji mRNA genów kodujących<br />
żelatynazy od stężenia badanych modulatorów, choć różnice<br />
w zależności od użytego związku oraz linii komórkowej były<br />
dość istotne. Na poziomie białka, za pomocą zymografii, wykazano<br />
zależny od dawki spadek ekspresji obu żelatynaz we<br />
wszystkich badanych hodowlach. W kolejnym etapie badań<br />
analizowano wpływ badanych modulatorów MMP na efekty<br />
fenotypowe w hodowlach komórek nowotworowych. Wykazano<br />
istotny spadek potencjału inwazyjnego komórek obu<br />
linii po traktowaniu tetracyklinami - ruchliwość i migracja<br />
komórek nowotworowych w teście wound healing assay malała<br />
wraz ze wzrostem stężenia danego modulatora. Badanie<br />
adhezji komórek do białek matriżelu wykazało, iż proces ten<br />
jest silnie hamowany głównie przez tetracyklinę, jednak tylko w<br />
przypadku komórek raka płuc. Ogólnie najsilniejszy wpływ modulacyjny,<br />
zarówno na ekspresję żelatynaz, jak i na inwazyjność<br />
komórek nowotworowych, wykazała doksycyklina, co znajduje<br />
odzwierciedlenie w doniesieniach innych autorów.<br />
Słowa kluczowe: metaloproteazy macierzy pozakomórkowej<br />
(MMP), żelatynaza A i B (MMP-2 i MMP-9), tetracykliny, inwazyjność<br />
nowotworów, rak płuca, rak pęcherza.<br />
Abstract<br />
Matrix metalloproteinases (MMPs) are enzymes involved<br />
in <strong>numer</strong>ous physiological (e.g. wound healing), as well as<br />
pathological processes where oncogenesis is the most significant<br />
one. Due to their multifunctionality in tumour promotion<br />
and progression, MMPs - especially gelatinase A and B<br />
(MMP-2, MMP-9) - overexpression is considered to be the<br />
major prognostic factor in cancer invasiveness. In this study<br />
we performed analysis of the influence of selected tetracyclines<br />
(doxycycline, oxytetracycline, tetracycline, and limecycline),<br />
which were postulated to be capable of modulating<br />
MMPs expression, on the lung cancer and bladder cancer<br />
cells invasiveness in vitro (A549 and T24 cell lines). MTT<br />
test was used to determine optimal concentrations and treatment<br />
intervals in the experiments. Then, we analysed the<br />
influence of the tetracyclines on gelatinase A and B expression<br />
both at mRNA, and protein level. Generally, mRNA expression<br />
depended on the concentration of the modulators,<br />
although there were significant differences depending on the<br />
cell line or modulator type. At the protein level there was a<br />
concentration-dependent decrease in the gelatinases expression<br />
in all studied cultures, as was ascertained zymographically.<br />
Further research was focused on the problem how<br />
MMP modulators effected cancer cells phenotype. Obtained<br />
results indicate there was a decrease in invasive potential of<br />
both cell lines after tetracyclines treatment; cell motility and<br />
migration decreased as the concentration of the certain modulator<br />
increased, as was shown in wound healing assay. Cell<br />
adhesion to matrigel proteins showed that only tetracycline<br />
performed significant inhibitory effect on that process in lung<br />
cancer cell cultures. Taken together our results indicated that<br />
the strongest inhibition on both gelatinases expression, and on<br />
cancer invasiveness was performed by doxycycline. These results<br />
are in concordance with other papers.<br />
Key words: matrix metalloproteinases (MMPs), gelatinase A<br />
and B (MMP-2 and MMP-9), tetracyclines, cancer invasiveness,<br />
lung cancer, bladder cancer.<br />
* Praca sfinansowana częściowo ze środków na badania własne (KNW-2-133/08) oraz statutowe ŚUM (KNW-1-145/08).<br />
17
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
Wykaz skrótów: DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered<br />
saline) – sól fizjologiczna buforowana fosforanami,<br />
EGF (epidermal growth factor) – naskórkowy czynnik<br />
wzrostu, FBS (fetal bovine serum) – bydlęca surowica<br />
płodowa, MMP (matrix metalloproteinases) – metaloproteazy<br />
macierzy pozakomórkowej, MTT - bromek<br />
3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy,<br />
RNAi (RNA interference) – interferencja RNA, TIMP (tissue<br />
inhibitors of matrix metalloproteinases) – tkankowe<br />
inhibitory metaloproteaz macierzy pozakomórkowej.<br />
Wstęp<br />
Badania nad białkami z grupy metaloproteaz macierzy<br />
pozakomórkowej (MMPs – matrix metalloproteinases) prowadzone<br />
są od ponad dwudziestu lat. Na ich podstawie wykazano,<br />
iż podstawowa funkcja tych enzymów, jaką jest proteolityczna<br />
degradacja i przebudowa białek macierzy zewnątrzkomórkowej,<br />
wpływa zarówno na przebieg procesów fizjologicznych,<br />
takich jak gojenie ran, przebudowa i wzrost kości,<br />
apoptoza, jak i zjawisk patologicznych, z których szczególnie<br />
ważnym jest proces nowotworzenia. Udział MMP w rozwoju<br />
nowotworu jest szczególnie ważny, gdyż uczestniczą one we<br />
wszystkich jego etapach począwszy od wzrostu guza pierwotnego,<br />
angiogenezy, poprzez etap związany z przerwaniem<br />
integralności bariery błony podstawnej, naciekaniem okolicznych<br />
tkanek i przerzutowaniem – mechanizmy związane z inwazyjnością<br />
komórek nowotworowych - aż po rozwój guzów<br />
wtórnych [1, 2, 3]. Równocześnie prowadzone są badania<br />
dotyczące inhibitorów MMP, mające na celu wprowadzenie<br />
ich do lecznictwa w terapii chorób nowotworowych. Istotą<br />
działania terapeutycznego inhibitorów MMP ma być zahamowanie<br />
funkcji enzymatycznej docelowych metaloproteaz,<br />
a w rezultacie zahamowanie rozwoju nowotworów [4, 5, 6].<br />
Ekspresję i aktywność MMP reguluje wiele czynników<br />
o charakterze endogennym, jak też coraz liczniej opisywane<br />
czynniki zewnętrzne [7]. Badania nad inhibitorami MMP<br />
o zastosowaniu terapeutycznym dotyczą małocząsteczkowych<br />
związków niebiałkowych, w tym bifosfonianów i tetracyklin,<br />
naturalnych inhibitorów o budowie peptydowej<br />
(np. TIMP – tissue inhibitors of matrix metalloproteinases),<br />
jak też prób wykorzystania metod terapii genowej (np. interferencyjnego<br />
RNA – RNAi, czy też aptamerów). Ponieważ<br />
prowadzone do tej pory próby wprowadzenia do lecznictwa<br />
leków z grupy białkowych, niebiałkowych inhibitorów oraz<br />
bifosfonianów zakończyły się niepowodzeniem, głównie<br />
z powodu poważnych działań niepożądanych występujących<br />
po zastosowaniu tych preparatów, w ostatnich latach<br />
szczególną uwagę skupiono na tetracyklinach, zarówno<br />
naturalnych, jak i ich półsyntetycznych pochodnych [8, 9].<br />
Podstawową zaletą tej grupy leków jest szerokie spektrum<br />
działania inhibitorowego - odpowiadają za hamowanie aktywności<br />
zarówno kolagenaz, jak i żelatynaz – oraz działanie<br />
na poziomie zarówno ekspresji genów, jak i aktywacji<br />
latentnych form MMPs. Istotną cechą tej grupy modulatorów<br />
jest też wysoka biodostępność po podaniu doustnym<br />
(wchłaniają się z przewodu pokarmowego w około 80%)<br />
oraz dobra penetracja tkanek - tetracykliny przenikają przez<br />
barierę krew-mózg, przez łożysko, do dróg oddechowych,<br />
moczowo-płciowych, wątroby, a nawet zębów i kości [10].<br />
Z uwagi na wielokierunkowy udział MMP w procesach<br />
nowotworzenia istnieje konieczność dokładnej charakterystyki<br />
mechanizmów ich roli w wyżej wymienionych procesach.<br />
Celem badań przedstawionych w pracy była analiza<br />
udziału metaloproteaz macierzy pozakomórkowej w inwazyjności<br />
i progresji nowotworów w modelu in vitro. W tym<br />
celu zaprojektowano schemat badań służących ocenie wpływu<br />
wybranych modulatorów z grupy tetracyklin, hamujących<br />
aktywność metaloproteaz macierzy pozakomórkowej,<br />
na efekty fenotypowe związane z inwazyjnością komórek<br />
nowotworowych niedrobnokomórkowego raka płuc (linia<br />
A549) i raka pęcherza (linia T24).<br />
Materiał i metody<br />
Warunki hodowli in vitro<br />
Badania przeprowadzono na hodowlach in vitro ludzkich<br />
linii nowotworowych A549 (ATCC: CCL-185) oraz T24<br />
(ATCC: HTB-4) wywodzących się odpowiednio z raka płuc<br />
oraz raka pęcherza. Hodowle prowadzone były w standardowych<br />
warunkach (37°C, 5% wysycenie atmosfery CO 2<br />
),<br />
w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (PAA) z dodatkiem<br />
10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS) (PAA) oraz gentamycyny<br />
(2 μg/ml) (PAA), w inkubatorze Hera-Cell (Heraeus).<br />
Monitoring prowadzonych hodowli (liczba komórek<br />
żywych i martwych, morfologia komórek) prowadzono metodą<br />
mikroskopii świetlnej z użyciem 0,4% roztworu błękitu<br />
trypanu w soli fizjologicznej (Sigma-Aldrich) w komorze<br />
hemocytometrycznej Neubauera przy użyciu mikroskopu<br />
odwróconego Axiovert 40CFL (Zeiss).<br />
Warunki traktowania hodowli komórkowych badanymi modulatorami<br />
ekspresji żelatynaz<br />
Komórki nowotworowe w prowadzonych hodowlach in<br />
vitro poddawano działaniu wybranych modulatorów ekspresji<br />
MMP z grupy tetracyklin: hyklatu doksycykliny (Sigma-<br />
Aldrich), chlorowodorku oksytetracykliny (Sigma-Aldrich),<br />
chlorowodorku tetracykliny (Polfa Tarchomin) i limecykliny<br />
(Galderma). Odpowiednią liczbę komórek wysiewano na płytki<br />
hodowlane 96-dołkowe lub 24-dołkowe i inkubowano przez<br />
noc. Następnego dnia usuwano pożywkę, przepłukiwano płytki<br />
2-krotnie roztworem Dulbecco PBS (DPBS), po czym dodawano<br />
świeżo przygotowaną pożywkę bez surowicy zawierającą<br />
odpowiednie stężenia badanych modulatorów. Zastosowano<br />
następujące stężenia badanych tetracyklin w kolejnych procedurach<br />
badawczych: testy MTT - 200µM, 100µM, 50µM,<br />
25µM, 12,5µM, 6µM, 3µM; zymografia, RT-PCR - 50µM,<br />
12,5µM, 3µM; badanie adhezji komórek do matriżelu, wound<br />
healing assay - 50µM, 25µM, 12,5µM, 6µM, 3µM. Czas traktowania<br />
hodowli w teście cytotoksyczności (MTT) wynosił 6h,<br />
12h i 24h; dla pozostałych badań - 24 godziny. Wyniki badań<br />
odnoszono do odpowiednich hodowli kontrolnych prowadzonych<br />
w identycznych warunkach jak hodowle badane, jednak<br />
bez dodatku żadnego z badanych modulatorów.<br />
Badanie cytotoksyczności testem MTT<br />
Liczbę żywych komórek w badanych hodowlach oceniano<br />
za pomocą testu cytotoksyczności MTT (Sigma-Aldrich).<br />
Komórki badanych linii wysiewano na płytki hodowlane 96-<br />
dołkowe (20 tys. kom./dołek). Po przeprowadzeniu inkubacji<br />
18
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
w pożywce zawierającej odpowiedni modulator w badanym<br />
stężeniu, pożywkę usuwano, przepłukiwano hodowle roztworem<br />
DPBS, po czym dodawano do każdego dołka po 100<br />
μl RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej zawierające substrat<br />
bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy<br />
(MTT) w stężeniu 0,5 mg/ml. Płytki inkubowano przez 2 godziny,<br />
a następnie dodawano po 100 μl mieszaniny etanol-<br />
DMSO (1:1) w celu rozpuszczenia barwnych kryształów produktu<br />
redukcji MTT (formazanów). Po 2-godzinnej inkubacji<br />
dokonywano pomiarów spektralnych w czytniku mikropłytek<br />
Triad LT (Dynex) przy fali długości 570 nm.<br />
Oznaczanie ekspresji mRNA żelatynaz techniką Real-Time<br />
RT-PCR<br />
Ekspresję genów kodujących żelatynazy: MMP-2<br />
i MMP-9 na poziomie mRNA określono stosując ilościową<br />
technikę RT-PCR z detekcją w czasie rzeczywistym (Real-Time<br />
RT-PCR) z użyciem barwnika fluorescencyjnego<br />
SYBR Green I. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziło:<br />
2 μl 10x buforu A, 2 μl (4 μl w przypadku MMP-2) 25 mM<br />
MgCl 2<br />
, po 1,35 μl 3 μM roztworów starterów F i R, 0,7 μl<br />
1x SYBR Green I, 0,1 μl odwrotnej transkryptazy Multiscribe<br />
RT (50 U/μl), 0,1 μl polimerazy DNA Ampli TaqGold<br />
(5 U/μl), 160 ng matrycowego RNA oraz wodę do 20 μl.<br />
Wszystkie odczynniki zakupiono w Applied Biosystems,<br />
z wyjątkiem starterów (IBB PAN, Warszawa) oraz SYBR<br />
Green I (Invitrogen). Skład mieszaniny reakcyjnej dla każdego<br />
badanego transkryptu był identyczny z wyjątkiem<br />
starterów, których sekwencje były specyficzne dla danego<br />
mRNA badanego genu. Zastosowano następujące sekwencje<br />
starterów: do detekcji mRNA MMP-2 starter F (forward,<br />
sensowy): 5’CAGGGAGCGCTACGATGGAG3’,<br />
starter R (reverse, antysensowy): 5’TCCTTGGGGCAGC-<br />
CATAGAA 3’ (sekwencje zaprojektowane w programie<br />
EMBOSS); dla mRNA MMP-9 starter F: 5’GCTCAC-<br />
CTTCACTCGCGTG3’, starter R: 5’CGCGACACCA-<br />
AACTGGATG3’ [11]. Równocześnie, w każdej próbce<br />
prowadzono detekcję mRNA genu kontrolnego - β-aktyny<br />
stosując dostępny komercyjnie zestaw starterów o sekwencjach:<br />
F: 5’TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA3’,<br />
R: 5’CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3’. Matrycę<br />
w reakcjach RT-PCR stanowiły ekstrakty RNA z komórek<br />
badanych hodowli in vitro uzyskane metodą fenolowo-chloroformową<br />
przy użyciu odczynnika Tri-Reagent (Sigma-Aldrich).<br />
Profil termiczny reakcji był następujący: 48ºC przez<br />
30 minut (RT), 95ºC 10 min., następnie 40 cykli złożonych<br />
z 30-sekundowej inkubacji w 95ºC i 1-minutowej inkubacji<br />
w 60ºC, po czym przeprowadzano końcową elongację<br />
przez 10 min., w 72ºC. Wszystkie analizy przeprowadzono<br />
w aparacie Mx3000P (Stratagene). Zmianę ekspresji MMP-2<br />
i MMP-9 określano metodą ΔΔCt w odniesieniu do poziomu<br />
mRNA genu β-aktyny jako kontroli endogennej. Jako kalibrator<br />
w metodzie ΔΔCt posłużyły hodowle kontrolne (nie<br />
traktowane żadnym z modulatorów).<br />
Zymograficzna detekcja żelatynaz<br />
Ekspresję żelatynaz MMP-2 i MMP-9 na poziomie białka<br />
określono wykorzystując elektroforezę w żelu poliakrylamidowym<br />
z dodatkiem żelatyny. Do studzienek 10% żeli<br />
poliakrylamidowych z SDS i żelatyną (2 mg/ml) nakładano<br />
po 30 μl mieszaniny złożonej z równych ilości 2x roztworu<br />
obciążającego (0,125 M Tris-HCl, pH=6,8; 20% glicerol;<br />
4% SDS; 0,01% błękit bromofenolowy) i supernatantów<br />
z badanych hodowli uprzednio zagęszczonych za pomocą<br />
kolumienek chromatograficznych Vivaspin 500 (Sigma-Aldrich).<br />
Po przeprowadzeniu rozdziału elektroforetycznego<br />
w buforze elektroforetycznym (1% SDS, 20 mM Tris, 190<br />
mM glicyna; pH=8,3), żele 3-krotnie płukano w buforze renaturującym<br />
(2,5% Triton X-100), a następnie żele te inkubowano<br />
w buforze rozwijającym (50 mM Tris-HCl, pH=7,5;<br />
200 mM NaCl; 5 mM CaCl 2<br />
; 2 μM ZnSO 4<br />
; 0,02% Brij-35)<br />
w temp. 37°C przez 48 godzin. Po inkubacji żele barwiono<br />
przez noc w 0,5% roztworze błękitu Coomassie. Następnego<br />
dnia żele odbarwiano w mieszaninie metanolu, kwasu octowego<br />
i wody (5:4:1). Zymogramy rejestrowano w systemie<br />
dokumentacji żelowej LabWorks 4.0 (Cambridge, UK).<br />
Badanie adhezji komórek nowotworowych do podłoża matrigel<br />
Do badania adhezji wykorzystano płytki hodowlane 96-<br />
dołkowe pokryte matriżelem (BD Matrigel Cellware Basement<br />
Membrane, Becton-Dickinson). Warstwa macierzy pozakomórkowej<br />
wynosiła 100µg/cm 2 . Po 24 h stymulacji modulatorami<br />
w podanym zakresie stężeń (od 50µM do 3µM), komórki<br />
odklejano, wirowano, a następnie zawieszano w 2% RPMI.<br />
Do każdej studzienki dodawano po 0,1 ml zawiesiny komórek<br />
(w stężeniu 200 tys/100µl). Płytki inkubowano przez 2 godziny<br />
w temp. 37°C. Po inkubacji 2 razy przepłukiwano studzienki<br />
roztworem DPBS. Komórki utrwalano w roztworze Cytofix<br />
(0,05 ml 4% paraformaldehydu w DPBS na każdą studzienkę)<br />
przez 30 min. Następnie usuwano utrwalacz i przeprowadzano<br />
barwienie (0,05 ml 0,1% roztworu fioletu krystalicznego<br />
w DPBS) przez 30 min. Po wybarwieniu przepłukiwano każdą<br />
studzienkę dwukrotnie roztworem DPBS. Płytki analizowano<br />
w mikroskopie odwróconym Axiovert 40CFL (Zeiss).<br />
Badanie migracji i ruchliwości komórek nowotworowych<br />
testem Wound Healing Assay<br />
Komórki badanych linii wysiewano na 24-dołkowe płytki<br />
i prowadzono hodowlę przez około 48 godzin do uzyskania<br />
konfluentnych hodowli. Następnie w każdej studzience<br />
wykonywano rysę o szerokości 1 mm, po czym dwukrotnie<br />
intensywnie przepłukiwano płytkę roztworem PBS. Bezpośrednio<br />
po wykonaniu rysy rozpoczęto traktowanie komórek<br />
badanymi modulatorami w podanym zakresie stężeń<br />
(50-3 μM). Po 24 godzinach usuwano pożywkę i dodawano<br />
świeże, pełne medium. Obserwacje prowadzono przez kolejne<br />
24 godziny prowadząc dokumentację za pomocą mikroskopu<br />
odwróconego Axiovert 40CFL (Zeiss).<br />
Analiza statystyczna<br />
Dane ilościowe porównano za pomocą analizy wariancji<br />
(ANOVA). Do obliczeń wykorzystano program STATISTI-<br />
CA 6,0.<br />
Wyniki badań<br />
Po przeanalizowaniu wyników testów MTT dla badanych<br />
tetracyklin w zakresie stężeń 200 µM - 3 µM, nie prowadzono<br />
dalszych badań z zastosowaniem stężenia 200 µM<br />
19
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
Ryc. 1. Wykres zależności absorbancji od stężenia doksycykliny,<br />
oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny po<br />
24 godzinach w hodowlach komórek linii A549<br />
i T24. przedstawiono wartości średnie +/- odchylenie<br />
standardowe. * - istotna statystycznie różnica w odniesieniu<br />
do hodowli kontrolnej.<br />
i 100 µM, ponieważ stężenia te powodowały zbyt<br />
silny efekt cytotoksyczny w stosunku do hodowli<br />
komórkowych linii A549 i T24, co uniemożliwiałoby<br />
wiarygodną analizę badań inwazyjności.<br />
Wybrano także optymalny czas traktowania<br />
hodowli badanymi tetracyklinami (24 godziny).<br />
Zakres działania cytotoksycznego obserwowany<br />
w testach MTT dość istotnie różnił się pomiędzy<br />
poszczególnymi badanymi modulatorami (Ryc.<br />
1).<br />
Badania poziomu ekspresji genów MMP-2<br />
i MMP-9 na poziomie mRNA dokonano za pomocą<br />
ilościowej techniki RT-PCR z detekcją w czasie<br />
rzeczywistym. Zastosowano metodę relatywnej<br />
oceny ekspresji genów (ΔΔCt) w odniesieniu do<br />
ekspresji genu β-aktyny. W przypadku linii A549<br />
wykazano spadek poziomu ekspresji genu MMP-2<br />
po stymulacji wszystkimi z zastosowanych tetracyklin<br />
przy niemal wszystkich stężeniach<br />
(Ryc. 2). Obniżenie ekspresji genu MMP-9 na poziomie<br />
istotnym statystycznie wykazano po zastosowaniu<br />
limecykliny w stężeniu 3 µM (p
Ryc. 3. Zymogramy przedstawiające aktywność proteolityczną żelatynaz MMP-2<br />
i MMP-9 w supernatantach z hodowli komórkowych linii A549 (ryc. A) i T24 (ryc.<br />
B) po 24 godzinach traktowania doksycykliną, oksytetracykliną, tetracykliną<br />
i limecykliną.<br />
Ryc. 4. Wykres zależności ilości komórek ulegających adhezji po podłoża<br />
matriżel od stężenia doksycykliny, oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny po<br />
24 godzinach hodowli komórek linii A549 i T24 (* - istotna statystycznie różnica<br />
w odniesieniu do hodowli kontrolnej).<br />
wieństwie do linii A549, w komórkach linii T24 obie metaloproteazy<br />
wykazywały podobną aktywność. W przypadku obu<br />
badanych linii komórkowych obserwowano obniżenie intensywności<br />
prążków wraz ze wzrostem stężenia zastosowanych<br />
modulatorów. Opisana zależność miała charakter krokowy<br />
(gradacyjny), co wskazuje na zmiany aktywności MMP<br />
w sposób zależny od dawki stosowanego modulatora. Bardzo<br />
słabo widoczne były prążki odpowiadające metaloproteazom<br />
MMP-2 i MMP-9 przy 50 µM stężeniu doksycykliny.<br />
Wskazuje to bądź na działanie cytotoksyczne doksycykliny<br />
w stosowanym stężeniu - co dodatkowo znalazło odzwierciedlenie<br />
w badaniach za pomocą testu MTT - lub bardzo<br />
wysokie zahamowanie ekspresji MMP.<br />
Do oceny wpływu badanych modulatorów na fenotyp<br />
komórek linii A459 i T24 posłużono się badaniem adhezji<br />
komórek nowotworowych do podłoża matriżel – testu<br />
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
stosowanego w badaniach adhezji, propagacji,<br />
wzrostu oraz podziałów komórkowych - oraz<br />
testem Wound Healing Assay – stosowanego<br />
w analizie migracji i ruchliwości komórek nowotworowych.<br />
Badanie adhezji komórek do<br />
podłoża matriżel po traktowaniu komórek oksytetracykliną<br />
wykazało, że nie ma ona wpływu<br />
na adhezję komórek linii A549 (p=0,078) i T24<br />
(p=0,196) do podłoża, bądź różnica w stopniu<br />
adhezji w porównaniu z kontrolą jest na granicy<br />
istotnych statystycznie różnic; jedynie w stężeniu<br />
3 μM wykazano spadek adhezyjności komórek<br />
linii A549 (p=0,016). Doksycyklina indukowała<br />
wzrost adhezyjności w stężeniu 3 μM w hodowlach<br />
komórek linii T24 (p=0,040). Limecyklina<br />
w największym użytym stężeniu (50 μM) indukowała<br />
istotne obniżenie adhezyjności komórek linii<br />
A549 (p=0,003), natomiast w pozostałych stężeniach<br />
nie wykazano istotnego wpływu na komórki<br />
obu badanych linii. Co ciekawe, zaobserwowano<br />
wzrost stopnia przylegania komórek linii T24 do<br />
powierzchni matrigelu po stymulacji tetracykliną<br />
w najniższych użytych w badaniu stężeniach, tj.<br />
6 μM i 3 μM. Natomiast w stosunku do komórek linii<br />
A549 wykazano istotne obniżenie adhezyjności<br />
w stężeniach 12,5 μM (p=0,028), 6 μM (p=0,022)<br />
i 3 μM (p=0,008) (Ryc. 4). Badanie za pomocą Wound<br />
Healing Assay wykazało zmiany, jakie zaszły<br />
w adherentnych hodowlach komórek linii A549<br />
i T24 po stymulacji zastosowanymi modulatorami.<br />
W trakcie prowadzonego badania zaobserwowano<br />
brak całkowitego zarastania rysy przez komórki<br />
linii A549 o niskim potencjale migracyjnym, a po<br />
24 godzinach obumieranie hodowanych komórek<br />
tworzących zbyt gęste skupiska (Ryc. 5). W hodowlach<br />
obu linii komórkowych zaobserwowano<br />
cytotoksyczne działanie doksycykliny w stężeniu<br />
50 μM (obserwacje mikroskopowe). W przypadku<br />
pozostałych antybiotyków zauważono wyraźną<br />
zależność stopnia zarastania rysy od stężenia badanego<br />
modulatora - im większe stężenie tetracyklin,<br />
tym mniejszy stopień zarastania rysy. Zauważono<br />
również różnicę w potencjale migracyjnym<br />
i inwazyjności komórek linii A549, które nie zarastały<br />
całkowicie rysy, a po 24 godzinach hodowli<br />
obumierały, a komórkami linii T24, które po prowadzeniu<br />
hodowli przez 72 godziny całkowicie zarastały rysę.<br />
Dyskusja<br />
Rak płuc i rak pęcherza moczowego są jednymi z najczęściej<br />
występujących nowotworów charakteryzującymi<br />
się wysokim potencjałem przerzutowym oraz inwazyjnością<br />
[12, 13]. Stąd też do badań opisanych w pracy wykorzystano<br />
ustalone linie komórkowe A549 i T24 stanowiące modele<br />
eksperymentalne in vitro wymienionych nowotworów. Hodowle<br />
badanych linii posłużyły do oceny wpływu wybranych<br />
tetracyklin na procesy związane z inwazyjnością komórek<br />
nowotworowych. W pierwszej kolejności przeprowadzono<br />
testy cytotoksyczności (MTT), pozwalające na wyznacze-<br />
21
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
5a<br />
5b<br />
Ryc. 5. Zdjęcia przedstawiające zmiany, jakie zaszły w przeciągu 72 godzin<br />
w hodowli komórek linii T24 (ryc. 5a) oraz 24 godzin hodowli komórek linii A549<br />
(ryc. 5b) po stymulacji doksycykliną. Na zdjęciach z hodowli po traktowaniu<br />
doksycykliną w stężeniu 50µM dostrzegalny jest wyraźny efekt cytotoksyczny<br />
(potwierdzony testem MTT). W przypadku pozostałych stężeń widać wyraźną<br />
zależność stopnia zarastania wolnej powierzchni naczynia hodowlanego od<br />
stężenia modulatora. W trakcie prowadzonego badania zaobserwowano brak<br />
całkowitego zarastania powierzchni przez komórki linii A549, a po 24 godzinach<br />
obumieranie hodowanych komórek tworzących zbyt gęste skupiska.<br />
nie optymalnych stężeń oraz czasu ekspozycji komórek na<br />
badane tetracykliny, a także na opisanie ogólnego wpływu<br />
badanych modulatorów na proliferację i apoptozę komórek<br />
nowotworowych linii raka płuc i raka pęcherza. Szczególnie<br />
wysoki efekt cytotoksyczny w stosunku do badanych linii<br />
nowotworowych wykazywała doksycyklina, co znajduje<br />
potwierdzenie w danych literaturowych [14, 15, 16].<br />
Przedstawione wyniki w części dotyczącej wpływu doksycykliny<br />
na ekspresję genu MMP-9 dla linii T24 znalazły<br />
odzwierciedlenie w badaniach prowadzonych przez Hanemaaijer<br />
i wsp. na komórkach śródbłonka (HUVEC) oraz<br />
fibroblastach izolowanych z torebki stawowej [17]. Z kolei<br />
inne badania dotyczące ekspresji mRNA MMP-2 i MMP-9<br />
w tętniaku aorty brzusznej wykazał trzykrotne obniżenie<br />
ekspresji MMP-2 i czterokrotne obniżenie ekspresji MMP-9<br />
w ścianie aorty po zastosowaniu doksycykliny [18]. Analogię<br />
w stosunku do prowadzonych badań znaleziono również<br />
w analizie wpływu doksycykliny na komórki czerniaka<br />
linii B16, w których wykazano obniżenie ekspresji genów<br />
MMP-2 i MMP-9 po zastosowaniu tego modulatora aktywności<br />
w porównaniu z kontrolą. Łączyło się to z zahamowaniem<br />
wzrostu guza o 35,63% [15]. Inne badania<br />
pokazały, że doksycyklina w farmakologicznie<br />
dostępnych, nietoksycznych dawkach hamuje<br />
syntezę mRNA, produkcję i aktywację MMP-9<br />
stymulowaną przez TGF-β w komórkach nabłonka<br />
rogówki [19]. Wyniki te korespondują<br />
z badaniami przeprowadzonymi przez szereg<br />
ośrodków dotyczących wpływu doksycykliny<br />
i jej modyfikowanych analogów na aktywność<br />
MMP-2 i MMP-9 z zastosowaniem różnych linii<br />
komórkowych [15, 16, 19, 20]. Wpływ pozostałych<br />
tetracyklin (oksytetracyklina, tetracyklina<br />
i limecyklina) nie jest praktycznie opisywany<br />
w literaturze w kontekście nowotworów.<br />
Głównym problemem badawczym w przedstawionej<br />
pracy stanowiła analiza wpływu badanych<br />
modulatorów ekspresji MMP na inwazyjność<br />
komórek nowotworowych. Zjawisko<br />
inwazyjności warunkują przede wszystkim takie<br />
cechy, jak potencjał metastatyczny i proangiogenny<br />
guzów pierwotnych. Są one wynikiem<br />
aktywacji szlaków molekularnych uczestniczących<br />
w procesie pokonywania bariery błony<br />
podstawnej oraz śródbłonka sąsiadujących naczyń<br />
krwionośnych przez komórki nowotworowe,<br />
a z drugiej strony zwiększenia ekspresji białek<br />
powierzchniowych związanych z adhezją, co<br />
zapewnia komórkom nowotworu zagnieżdżenie<br />
w nowym miejscu organizmu i utworzenie guza<br />
wtórnego [21]. Niedostateczna siła oddziaływania<br />
komórek nowotworu z otaczającym środowiskiem<br />
zewnętrznym nie tylko uniemożliwia<br />
rozwój powstającego przerzutu, ale także śmierć<br />
komórek nowotworowych na drodze opisanej<br />
jako anoikis, czyli zależnej od adhezji. Uzyskane<br />
wyniki wskazują przede wszystkim na inhibitorowy<br />
wpływ tetracyklin w procesach migracji<br />
komórek nowotworowych linii A549 i T24.<br />
natomiast w przypadku analizy adhezji komórek<br />
do białek macierzy pozakomórkowej (matrigel)<br />
wpływ tetracyklin nie jest jednoznaczny – wykazano zarówno<br />
hamowanie, jak i stymulację adhezji. Wykazano, iż<br />
wpływ tetracyklin na opisane procesy związany był z wyciszeniem<br />
ekspresji metaloproteaz MMP-2 i MMP-9 (zarówno<br />
na poziomie mRNA, jak i białka). Należy podkreślić, iż<br />
w badaniach przeanalizowano wpływ badanych tetracyklin<br />
na ekspresję najczęściej opisywanych w literaturze metaloproteaz<br />
– żelatynazy A i B - o najszerzej opisanym związku<br />
z rozwojem nowotworów złośliwych. Jednak badane modulatory<br />
z grupy tetracyklin wpływają także na ekspresję<br />
i/lub aktywność również wielu innych enzymów z tej grupy,<br />
co podkreślono we wstępie. Badane efekty wyciszenia ekspresji<br />
MMPs są więc z pewnością sumarycznym efektem<br />
wpływu tetracyklin na wiele różnych metaloproteaz.<br />
Otrzymane wyniki potwierdzają doniesienia innych autorów.<br />
Chetty i wsp. wykazali, że genowo-specyficzne wyciszenie<br />
ekspresji MMP-2 za pomocą RNAi powoduje obniżenie<br />
migracji komórek raka płuc A549 przez matrigel oraz<br />
angiogenezy in vitro, a in vivo (u myszy) obniżenie tempa<br />
przerzutowania [22]. Wpływ doksycykliny na różne aspek-<br />
22
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
ty nowotworzenia jest opisany w literaturze najlepiej ze<br />
wszystkich tetracyklin. Wykazano między innymi, iż hamuje<br />
ona o 28% stopień zagnieżdżania się komórek raka piersi<br />
w kościach u myszy [23], a także w istotny sposób hamuje<br />
rozwój przerzutów czerniaka u myszy poprzez obniżenie<br />
ekspresji MMP-2 i MMP-9 i związane z tym zahamowanie<br />
angiogenezy [15]. Według Franco i wsp. doksycyklina (31<br />
i 104 μM) hamuje o 20% migrację komórek mięśniowych<br />
in vitro w teście wound healing assay, a także adhezyjność<br />
tych komórek do podłoża pokrytego białkami macierzy pozakomórkowej<br />
[24]. Inhibitory metaloproteaz - Col-3 (Metastat<br />
- modyfikowana pochodna doksycykliny) i AG1478<br />
(bloker receptora EGF) - wykazują istotny wpływ hamujący<br />
inwazyjność komórek raka tarczycy in vitro poprzez zahamowanie<br />
ekspresji MMP-2 [16]. Col-3 oraz inne modyfikowane<br />
pochodne tetracyklin wpływają także hamująco na<br />
inwazyjność komórek raka prostaty in vitro oraz stopień ich<br />
przerzutowania [14].<br />
Wnioski<br />
• Potwierdzono hamujący wpływ doksycykliny na ekspresję<br />
żelatynazy A i B na poziomie mRNA i białka.<br />
Podobny, choć słabszy efekt wykazały inne tetracykliny<br />
(oksytetracyklina, tetracyklina, limecyklina).<br />
• Badane tetracykliny hamowały migrację komórek nowotworowych<br />
A549 i T24 w sposób zależny od dawki.<br />
• Wpływ badanych tetracyklin na procesy adhezji komórek<br />
nowotworowych A549 i T24 nie był wyraźny i istotnie<br />
różnił się w zależności od typu badanego związku<br />
oraz jego stężenia.<br />
Dziękujemy pracownikom Katedry Analizy Instrumentalnej<br />
za udostępnienie czytnika mikropłytek.<br />
Piśmiennictwo<br />
1. Deryugina E, Quigley J. Matrix metalloproteinases and<br />
tumor metastasis. Cancer Metastasis Rev 2006; 25: 9-34.<br />
2. Jodele S i wsp. Modifying the soil to affect the seed: role<br />
of stromal-derived matrix metalloproteinases in cancer<br />
progression. Cancer Metastasis Rev 2006; 25: 35-43.<br />
3. Stefanidakis M, Koivunen E. Cell-surface association<br />
between matrix metalloproteinases and integrins: role of<br />
the complexes in leukocyte migration and cancer progression.<br />
Blood 2006; 108: 1441-50.<br />
4. Pavlaki M, Zucker S. Matrix metalloproteinases inhibitors(M-<br />
MPIs): the beginning of phase I or the termination of phase III<br />
clinical trials. Cancer Metastasis Rev 2003; 22: 177-203.<br />
5. Ramnath N, Creaven P. Matrix metalloproteinases inhibitors.<br />
Curr Oncol Rep 2004; 6: 96-102.<br />
6. Pirard B. Insight into the structural determinants for selective<br />
inhibition of matrix metalloproteinases. Drug Discover<br />
Today 2007; 12: 640-6.<br />
7. Chakraborti S i wsp. Regulation of matrix metalloproteinases:<br />
an overview. Mol Cell Biochem 2003; 253: 269-85.<br />
8. Chu Q i wsp. A phase II and pharmacological study of<br />
the matrix metalloproteinase inhibitor (MMPI) COL-3<br />
in patients with advanced soft tissue sarcomas. Invest<br />
New Drugs 2007; 25: 359-67.<br />
9. Syed S i wsp. A phase I and pharmacokinetic study of<br />
Col-3 (Metastat), an oral tetracycline derivative with potent<br />
matrix metalloproteinase and antitumor properties.<br />
Clin Cancer Res 2004; 10: 6512-21.<br />
10. Reese R, Betts R, Gumustop B. Handbook of antibiotics.<br />
Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia 2000.<br />
11. Quintero M i wsp. Nitric oxide is a factor in the stabilization<br />
of hypoxia-inducible factor-1α in cancer: role of<br />
free radical formation. Cancer Res 2006; 66: 770-4.<br />
12. Goodman G. Lung cancer 1: prevention of lung cancer.<br />
Thorax 2002; 57: 994-9.<br />
13. Pashos C i wsp. Bladder cancer: epidemiology, diagnosis,<br />
and management. Cancer Pract 2002; 10: 311-22.<br />
14. Lokeshwar B i wsp. Inhibition of cell proliferation, invasion,<br />
tumor growth and metastasis by an oral non-antimicrobial<br />
tetracycline analog (Col-3) in a metastatic<br />
prostate cancer model. Int J Cancer 2002; 98: 297-309.<br />
15. Sun B i wsp. Doxycycline influences microcirculation patterns<br />
in B16 melanoma. Exp Biol Med 2007; 232: 1300-7.<br />
16. Yeh M i wsp. Differentiated thyroid cancer cell invasion<br />
is regulated through epidermal growth factor receptor-dependent<br />
activation of matrix metalloproteinase<br />
(MMP)-2/gelatinase A. Endocrine-Related Cancer 2006;<br />
13: 1173-83.<br />
17. Hanemaaijer R i wsp. Inhibition of MMP synthesis by doxycycline<br />
and chemically modified tetracyclines (CMTs) in<br />
human endothelial cells. Adv Dent Res 1998; 12: 114-8.<br />
18. Thompson R, Baxter B. MMP inhibition in abdominal<br />
aortic aneurysm. Rationale for a prospective randomized<br />
clinical trial. Ann N Y Acad Sci 1999; 878: 159-78.<br />
19. Kim H i wsp. Doxycycline inhibits TGF-β1-induced<br />
MMP-9 via Smad and MAPK pathways in human corneal<br />
epithelial cells. Invest Ophtalmol Vis Sci 2005; 46: 840-8.<br />
20. Fiotti N i wsp. Short term effects of doxycycline on matrix<br />
metalloproteinases 2 and 9. Cardiovasc Drugs Ther<br />
2009; 23: 153-9.<br />
21. Ziober L, Silverman S, Kramer R. Adhesive mechanisms<br />
regulating invasion and metastasis in oral cancer. Crit<br />
Rev Oral Biol Med 2001; 12: 499-510.<br />
22. Chetty C i wsp. Adenovirus-mediated small interfering<br />
RNA against matrix metalloproteinase-2 suppresses tumor<br />
growth and lung metastasis in mice. Mol Cancer<br />
Ther 2006; 5: 2289-99.<br />
23. Duivenvoorden W i wsp. Doxycycline decreases tumor<br />
burden in a bone metastasis model of human breast cancer.<br />
Cancer Res 2002; 62: 1588-91.<br />
24. Franco C i wsp. Doxycycline alters vascular smooth muscle<br />
cell adhesion, migration, and reorganization of fibrillar<br />
collagen matrices. Am J Pathol 2006; 168: 1697-1709.<br />
Adres do korespondencji:<br />
Dr n. farm. Daniel Sypniewski<br />
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej ŚUM<br />
ul. Narcyzów 1; 41-200 Sosnowiec<br />
tel. (032) 364-10-02, e-mail: dsypniewski@sum.edu.pl<br />
23
Farm Przegl Nauk, 2009,8, 24-26<br />
Przeciwbakteryjne działanie galanginy zawartej w propolisie<br />
w stosunku do bakterii Gram-dodatnich<br />
The antibacterial activity of galangin in propolis<br />
against Gram-possitive bacteria<br />
Robert Kubina 1 , Agata Kabała-Dzik 1 , Robert D. Wojtyczka 2 , Ewa Szaflarska-Stojko 1<br />
1<br />
Katedra i Zakład Patologii Wydział <strong>Farmaceutyczny</strong> z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej<br />
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach<br />
2<br />
Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydział <strong>Farmaceutyczny</strong> z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej<br />
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach<br />
Streszczenie<br />
Jedną z podstawowych i zarazem najlepiej poznanych<br />
funkcji propolisu jest jego działanie przeciwbakteryjne.<br />
Wrażliwość na propolis wykazują zarówno bakterie<br />
Gram-dodatnie jak i Gram-ujemne. Jego przeciwbakteryjne<br />
właściwości są możliwe na skutek występowania wielu<br />
substancji chemicznych takich jak: flawonoidy, trójterpeny<br />
oraz estry kwasów fenolowych.<br />
Flawonoidy to związki organiczne bardzo rozpowszechnione<br />
w przyrodzie pochodzenia głównie roślinnego<br />
o charakterze barwników. Najczęściej mają kolor żółty.<br />
Związki te mogą występować samodzielnie, jako aglikony<br />
lub w połączeniu z cukrami, jako tak zwane glikozydy<br />
flawonoidowe. Ogólna zawartość flawonoidów w czystym<br />
propolisie stanowi około 4,4 % -10,8%.<br />
Jednym z flawonoidów zasługujących na szczególną uwagę<br />
jest galangina. Jest ona związkiem pochodzenia naturalnego<br />
należącym do jednej z grup flawonoidów zwanej<br />
flawonolami. Liczne doniesienia literaturowe sugerują, że<br />
galangina zawarta w kicie pszczelim działa bakteriostatycznie<br />
zarówno na szczepy Staphylococcus aureus wrażliwe<br />
na działanie antybiotyków, jak również wykazuje<br />
działanie na szczepy MRSA oporne na działanie metycyliny<br />
(ang. methicillin-resistant S. aureus – MRSA).<br />
Summary<br />
One of the most basic and simultaneously the most meticulously<br />
examined function of propolis (bee glue) is its<br />
antibacterial activity. Both Gram-positive and Gram-negative<br />
bacteria demonstrate susceptibility to propolis. Its<br />
antibacterial properties exist as a result of occurence of a<br />
number of chemical substances such as flavonoids, triterpens<br />
and acid phenolic esters.<br />
Flavonoids are chiefly plant-derived organic compounds<br />
of stain character that prevail in nature. In most cases they<br />
are yellow in colour. These compounds may occur independently<br />
as aglycones or in connection with saccharides<br />
as so-called flavonoid glycosides. Total content of flavonoids<br />
in pure propolis constitutes ca. 4,4% - 10,8%.<br />
One of the flavonoids that is worth closer examination is<br />
galangin. It is a natural compaund belonging to flavonols<br />
that are a class of flavonoids. Numerous studies suggest<br />
that galangin contained in bee glue exerts a bacteriostatic<br />
effect not only on Staphylococcus aureus bacterial strains<br />
that are susceptible to antibiotic actions but also on<br />
MRSA (methicillin-resistant S. aureus) bacterial strains<br />
that are methicillin-resistant.<br />
Key words: propolis, galangin, antibacterial activity<br />
Słowa kluczowe: propolis, galangina, działanie przeciwbakteryjne<br />
Rozwój nauk analitycznych oraz farmakognozji przyczynił<br />
się do ponownego wzrostu zainteresowania produktami<br />
pochodzenia naturalnego. Substancje biogenne zawarte<br />
w surowcach roślinnych oraz zwierzęcych od wieków wykorzystywane<br />
są w medycynie. Jednym z produktów wytwarzanych<br />
przez pszczoły jest propolis (kit pszczeli). Jego<br />
barwa i skład zależy nie tylko od gatunku drzew, z których<br />
zbierana jest żywica, ale także od rasy pszczół, okresu zbioru<br />
oraz od miejsca oblotu pszczół. Do niedawna sądzono, że<br />
skład jakościowy propolisu zależy od miejsca pochodzenia.<br />
Obecnie jednak wiadomo, że rejon świata, z którego pszczo-<br />
ły pozyskują pyłek wpływa jedynie na ilościową zawartość<br />
substancji biologicznie czynnych.<br />
Barwa propolisu może być zróżnicowana od brązowoczerwonej<br />
poprzez brązową i żółtą aż po zielonkawą. Surowiec<br />
kitu pszczelego przynoszony jest do ula w postaci<br />
kropel żywicy umieszczonej w koszyczkach odnóży pszczół<br />
lotnych, a następnie przeżuwany przez pszczoły stacjonarne,<br />
które modyfikują jego skład wydzieliną gruczołów ślinowych<br />
i woskowych zwiększając w ten sposób jego aktywność farmakologiczną.<br />
Do drzew europejskich, które stanowią źródło<br />
propolisu zalicza się topolę (Populus sp.), wierzbę (Salix sp.),<br />
24
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
wiąz (Ulmus sp.), jesion (Fraxinus sp.), dąb (Quercus sp.)<br />
oraz kasztanowca zwyczajnego (Aesculus hippocastanum).<br />
Propolis ze względu na swoje właściwości wykorzystywany<br />
jest przez pszczoły do wyścielania wnętrza ula oraz<br />
uszczelniania jego struktur. Stanowi on swoistą barierę<br />
chroniącą wnętrze ula przed wszelkiego rodzaju drobnoustrojami.<br />
Pozwala to przede wszystkim ochraniać złożone<br />
jaja oraz stwarzać odpowiedni mikroklimat potrzebny do<br />
prawidłowego rozwoju czerwiu.<br />
Propolis zawiera wiele biologicznie czynnych substancji<br />
chemicznych, wśród których należy wymienić: aglikony<br />
flawonoidów, kwasy aromatyczne (wśród nich związki<br />
fenolowe), estry aromatyczne, kwasy alifatyczne, alkohole,<br />
ketony, węglowodory, terpeny, substancje lipidowo-woskowe,<br />
enzymy, cukry, aminokwasy, witaminy, białka, olejki<br />
eteryczne oraz mikro i makroelementy [1].<br />
Działanie przeciwbakteryjne propolisu<br />
Jedną z podstawowych i zarazem najlepiej poznanych funkcji<br />
propolisu jest działanie przeciwbakteryjne. Wrażliwość na<br />
działanie propolisu wykazują zarówno bakterie Gram-dodatnie<br />
jak i Gram-ujemne. Wśród ziarniaków Gram-dodatnich wrażliwych<br />
na działanie kitu pszczelego należy wymienić: gronkowca<br />
złocistego (Staphylococcus aureus) oraz paciorkowce takie<br />
jak: Streptococcus pneumoniae oraz Streptococcus pyogenes.<br />
Wśród pałeczek Gram-ujemnych wrażliwych na działanie tego<br />
apifarmakoterapeutyku wymienia się takie drobnoustroje jak:<br />
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aureginosa,<br />
poza tym wrażliwość wykazują także prątki gruźlicy<br />
Mycobacterium tuberculosis, oraz chorobotwórcze dla człowieka<br />
grzyby drożdżoidalne z rodzaju Candida (np. Candida<br />
albicans). Istniejące doniesienia wskazują jednak, iż propolis<br />
posiada silne właściwości przeciwbakteryjne w stosunku do<br />
bakterii Gram-dodatnich, jednak znacznie słabsze w stosunku<br />
do bakterii Gram-ujemnych [2].<br />
Przeciwbakteryjne działanie propolisu jest możliwe<br />
na skutek występowania w nim takich substancji jak: flawonoidy,<br />
trójterpeny oraz estry kwasów fenolowych [3].<br />
W propolisie zidentyfikowano już ponad 50 różnych flawonoidów<br />
zaliczanych do wszystkich pięciu grup chemicznych.<br />
Najczęściej występującymi flawonoidami w propolisie są:<br />
chryzyna, tektochryzyna, pinostrobina, apigenina i chalkon<br />
pinostrobinowy, rzadziej występują: galangina, kemferol,<br />
genkwanina oraz pinobanksyna. Wśród estrów kwasów fenolowych<br />
szczególne właściwości przeciwbakteryjne wykazują<br />
estry etylowe kwasu cynamonowego i kawowego oraz<br />
esty fenylometylowe kwasu benzoesowego [4].<br />
Ogólna charakterystyka flawonoidów<br />
Flawonoidy to związki organiczne bardzo rozpowszechnione<br />
w przyrodzie pochodzenia głównie roślinnego o charakterze<br />
barwników. Najczęściej mają kolor żółty. Obecność między<br />
aromatycznymi atomami węgla układu heterocyklicznego<br />
γ-pironu pozwala zaliczyć te związki do pochodnych benzoγ-pironu,<br />
czyli chromonu. Związki te mogą występować samodzielnie,<br />
jako aglikony lub w połączeniu z cukrami, jako<br />
tak zwane glikozydy flawonoidowe [5].<br />
Ze względu na budowę chemiczna wyróżnia się podklasy<br />
w klasie flawonoidów, takie jak: flawony, flawany, katechiny,<br />
flawanony, flawonole, flawanonole, chalkony oraz izoflawony.<br />
Z grupy flawonów najczęściej w propolisie można<br />
zidentyfikować: chryzynę, tektochryzynę oraz akacetynę.<br />
Spośród flawonoli wymienić należy: galanginę i kemferol.<br />
Grupa flawonów znajdujących się w kicie pszczelim stanowią<br />
przede wszystkim: pinostrobina oraz pinocembryna.<br />
W grupie flawonowów najlepiej poznana oraz najczęściej<br />
występująca jest pinobanksyna. Z grupy chalkonów poznano<br />
dotychczas chalkon pinostrobinowy i pinocembrynowy.<br />
Ogólna zawartość flawonoidów w czystym propolisie stanowi<br />
około 4,4 % -10,8% [6].<br />
Flawonoidy ze względu na swoją różnorodność wykazują<br />
działanie m.in.:<br />
- antyoksydacyjne hamując aktywność lipooksygenaz<br />
i cyklooksygenaz i chelatując jony metali, co prowadzi<br />
do spadku wytwarzania reaktywnych form tlenu.<br />
- przeciwzapalne hamując kaskadę przemian kwasu arachidonowego<br />
- uszczelniające naczynia krwionośne hamując aktywność<br />
enzymów proteolitycznych<br />
- rozkurczowe (spazmolitycznie)<br />
- moczopędne poprzez drażnienie kanalików nerkowych<br />
i utrudnianie resorpcji zwrotnej w nerkach.<br />
- przeciwnowotworowe<br />
- immunomodulujące<br />
- przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe oraz przeciwpasożytnicze<br />
[7,8,9].<br />
W przypadku działania przeciwdrobnoustrojowego poszukuje<br />
się mechanizmu molekularnego umożliwiającego<br />
flawonoidom zabijanie lub osłabianie bakterii. Wiadomo już,<br />
iż każda grupa, a nawet poszczególne flawonoidy oddziałują<br />
w odmienny sposób z komórkami bakteryjnymi. Udowodniono<br />
na przykład, że kwercetyna posiada zdolność bakteriobójczą<br />
dzięki hamowaniu gyrazy DNA bakterii. Obecnie w farmakologii<br />
klinicznej wykorzystuje się podobnego typu leki stosowane<br />
w zakażeniach bakteryjnych - fluorochinolony. Miejscem docelowym<br />
działania tych leków są dwa enzymy bakteryjne: gyraza<br />
DNA i topoizomeraza IV. Chemioterapeutyki te uniemożliwiają<br />
łączenie nici DNA, co powoduje zahamowanie biosyntezy<br />
białka. Kwercetyna hamując działanie gyrazy DNA wykazuje<br />
podobne działanie do fluorochinolonów [10,11,12].<br />
Odmienny wpływ na komórki bakteryjne wykazuje np.<br />
sophoraflawon G. Flawonoid ten hamuje wzrost drobnoustrojów<br />
poprzez zaburzenie funkcji błony komórkowej.<br />
Kolejnym przykładem może być likochalkon A, mający<br />
działanie bakteriobójcze na skutek integracji w przemiany<br />
energetyczne drobnoustrojów.<br />
Istnieje jeszcze duża grupa flawonoidów, których mechanizm<br />
działania przeciwbakteryjnego nie jest jeszcze poznane.<br />
Wśród tych związków znajduje się między innymi<br />
jeden przedstawiciel flawonoli – galangina [10,13].<br />
Galangina – przedstawiciel flawonoli<br />
Jednym z flawonoidów zasługujących na szczególną<br />
uwagę jest galangina. Jej międzynarodowa nazwa chemiczna<br />
to 3,5,7-trihydroksyflawon (Ryc. 1).<br />
Jest ona związkiem pochodzenia naturalnego należącym<br />
do jednej z grup flawonoidów zwanej flawonolami. Jest to<br />
25
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
Ryc. 1 Wzór chemiczny<br />
3,5,7-trihydroksyflawonu<br />
substancja odpowiedzialna<br />
za blokowanie iNOS<br />
mRNA podczas rozwoju<br />
stanu zapalnego, hamowanie<br />
replikacji wirusów oraz<br />
hamowanie rozwoju drobnoustrojów.<br />
Coraz częstsze<br />
problemy z lekoopornością<br />
bakterii spowodowały poszukiwanie<br />
nowych substancji<br />
pomocnych w leczeniu zakażeń bakteryjnych. Od<br />
kilkuset lat w Korei w przypadku przewlekłych zakażeń<br />
drobnoustrojami używa się wyciągu z orientalnego zioła<br />
Alpinia officinarum. Poznanie składu chemicznego tego wyciągu<br />
pozwoliło odkryć przeciedrobnoustrojowe właściwości<br />
galanginy. Flawonoid ten został także zidentyfikowany<br />
m.in. propolisie [14,15].<br />
Liczne doniesienia literaturowe sugerują, że galangina zawarta<br />
w kicie pszczelim działa bakteriostatycznie zarówno na<br />
szczepy Staphylococcus aureus wrażliwe na działanie antybiotyków,<br />
jak również wykazuje działanie na szczepy MRSA oporne<br />
na działanie metycyliny (ang. methicillin-resistant S. aureus<br />
– MRSA) [16]. Badania przeprowadzone przez naukowców<br />
z zespołu Lee YS wykazały, iż stosowanie mieszaniny galanginy<br />
z dodatkiem gentamycyny znacznie obniżało minimalne<br />
stężenie hamujące antybiotyku (MIC) w stosunku do szczepów<br />
metycylinoopornych Staphylococcus aureus (MRSA)[17].<br />
W swoich najnowszych opublikowanych wynikach badań<br />
Cushnie i wsp. [18,19] wykazali, że galangina może powodować<br />
aglutynację komórek bakteryjnych, co sugeruje,<br />
że miejscem docelowym działania tego flawonoidu jest błona<br />
cytoplazmatyczna. Mogłoby to oznaczać, iż galangina nie<br />
wykazuje właściwości bakteriostatycznych czy bakteriobójczych,<br />
lecz powoduje tylko zlepianie się bakterii. Jednakże<br />
dokładny mechanizm molekularny nie został jeszcze poznany.<br />
Prowadzone badania powinny jednak wkrótce odpowiedzieć<br />
na pytanie o właściwości biologiczne galanginy.<br />
Wykorzystanie naturalnych surowców farmakopealnych<br />
otrzymanych na drodze procesów biogennych stało się<br />
genezą powstania receptur wielu leków, bez których trudno<br />
sobie wyobrazić aktualną farmakoterapię. Do grupy tej<br />
między innymi zaliczyć należy: glikozydy nasercowe, leki<br />
hepatoprotekcyjne, czy starą, dobrą, odkrytą przez Flaminga<br />
a zmodyfikowaną przez następców penicylinę. Wśród<br />
współczesnych konwencjonalnych metod leczenia coraz<br />
większym uznaniem cieszy się jednak apiterapia wykorzystująca<br />
lecznicze działanie standaryzowanych czynnych farmakologicznie<br />
frakcji otrzymanych z produktów pszczelich.<br />
Artykuł ten przedstawia tylko jedno działanie kitu pszczelego<br />
– bakteriobójcze, jednakże spektrum działania propolisu jest<br />
bardzo duże. Do tej pory w propolisie odnaleziono ponad 250<br />
substancji chemicznych pochodzenia naturalnego, a do pełnego<br />
poznania składu tego apifarmakoterapeutyku oraz właściwości<br />
biologicznych pozostała jeszcze długa droga.<br />
Piśmiennictwo:<br />
1. Kędzia B. Skład chemiczny i aktywność biologiczna<br />
propolisu pochodzącego z różnych rejonów świata. Post<br />
Fitoter 2006; 1: 23-35.<br />
2. Velazqueza C i wsp. Antibacterial and free-radical scavenging<br />
activities of Sonoran propolis. J App Microbiol<br />
2007; 103: 1747-56.<br />
3. Lu LC, Chen YW, Chou CC. Antibacterial activity of<br />
propolis against Staphylococcus aureus. Int J Food Microbiol<br />
2005; 102: 213– 20.<br />
4. Cushnie TP i wsp. Investigation of the antibacterial activity<br />
of 3-o-octanoyl-(-)-epicatechin. J Appl Microbiol<br />
2008; 105: 1461-69.<br />
5. Miller E. Rola flawonoidów jako przeciwutleniaczy<br />
w organizmie człowieka. Pol Mer Lek 2008; 24; 556-60.<br />
6. Andryskowski G i wsp. Działanie flawonoidów na hodowlę<br />
tkankową prowadzoną w środowisku promieniotwórczego<br />
technetu. Wspol Okol 2002; 6: 548-50.<br />
7. Murray TJ, Yang X, Sherr DH. Growth of a human mammary<br />
tumor cell line is blocked by galangin, a naturally occurring<br />
bioflavonoid, and is accompanied by down-regulation of<br />
cyclins D3, E, and A. Breast Cancer Res 2006; 8: R17.<br />
8. Mishima S i wsp. Antihypertensive effects of brazilian<br />
propolis: Identification of Caffeoylquinic Acids as Constituents<br />
Involved in the Hypotension in Spontaneously<br />
Hypertensive Rats. Biol Pharm Bull 2005; 28: 1909-14.<br />
9. Sarić A i wsp. Antioxidant effects of flavonoid from Croatian<br />
Cystus incanus L. rich bee pollen. Food Chem Toxicol<br />
2009; 47: 547-54.<br />
10. Salomão K i wsp. Brazilian propolis: correlation between<br />
chemical composition and antimicrobial activity. Evid<br />
Based Complement Alternat Med 2008; 5: 317–24.<br />
11. Cushnie TP, Lamb AJ. Antimicrobial activity of flavonoids.<br />
Int J Antimicrob Agents 2005; 26: 343-56.<br />
12. Cushnie TP, Lamb AJ. Assessment of the antibacterial activity<br />
of galangin against 4-quinolone resistant strains of<br />
Staphylococcus aureus. Phytomedicine 2006; 13: 187-91.<br />
13. Cushnie TP, Hamilton VE, Lamb AJ. Assessment of the<br />
antibacterial activity of selected flavonoids and consideration<br />
of discrepancies between previous reports. Microbiol<br />
Res 2003; 158: 281-89.<br />
14. Luo H. Study on apoptosis of BEL-7402 cells induced<br />
by galangin. Zhong Yao Cai 2008; 31: 1204-07.<br />
15. Paulíková H, Berczeliová E. The effect of quercetin and<br />
galangin on glutathione reductase. Biomed Pap Med Fac<br />
Univ 2005; 149: 497-500.<br />
16. Ahn MR i wsp. Correlation between antiangiogenic activity<br />
and antioxidant activity of various components from<br />
propolis. Mol Nutr Food Res 2009; 53: 643-51.<br />
17. Lee YS i wsp. Synergistic effects of the combination of<br />
galangin with gentamicin against methicillin-resistant<br />
Staphylococcus aureus. J Microbiol 2008; 46: 283-88.<br />
18. Cushnie TP i wsp. Aggregation of Staphylococcus aureus<br />
following treatment with the antibacterial flavonol<br />
galangin. J Appl Microbiol 2007; 103: 1562-67.<br />
19. Cushnie TP, Lamb AJ. Detection of galangin-induced cytoplasmic<br />
membrane damage in Staphylococcus aureus by measuring<br />
potassium loss. J Ethnopharmacol 2005; 101: 243-48.<br />
Adres do korespondencji:<br />
mgr Robert Kubina,<br />
Katedra i Zakład Patologii,<br />
tel. 032 364-13-50<br />
e-mail: rkubina@sum.edu.pl<br />
26
Farm Przegl Nauk, 2009,8, 27-31<br />
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
Wpływ wodnego ekstraktu z kłączy Iris dichotoma Pall<br />
na aktywność mitotyczną ocenianą testem allium<br />
Influence of the water extract from rhizome of Iris dichotoma Pall<br />
on the mitotic activity of allium test cells<br />
1<br />
Otgonbaatar U., 1 Purevsuren G., 1 Oyun Z., 1 Narantsetseg G., 1 Khishgee D.,<br />
1<br />
Urjin B., 2 Nowakowska J., 3 Machalska A., 4 Zobel A., 5 Kuraś M., 3 Głowniak K.<br />
1<br />
Institute of Traditional Medicine, Ulaanbaatar-20, 209, Mongolia<br />
2<br />
Uniwersytet Warszawski, Pracownia Mikroskopii Elektronowej<br />
3<br />
Akademia Medyczna w Lublinie, Katedra i Zakład Farmakognozji<br />
z Pracownią Roślin Leczniczych<br />
4<br />
Trent University, Peterborough, Ontario, K9J 7B8 Canada<br />
5<br />
Uniwersytet Warszawski, Zakład Ekotoksykologii<br />
Streszczenie<br />
W pracy przebadano wpływ wodnego ekstraktu z kłączy<br />
Iris doichotoma Pall. na merystemy wierzchołkowe<br />
korzeni, strukturę euchromatyny jąder interfazowych<br />
i chromosomów mitotycznych oraz aktywność podziałową<br />
komórek Testu Allium. Stwierdzono, że pod wpływem<br />
inkubacji w wysokich stężeniach ekstraktu, zarówno chromatyna<br />
jąder interfazowych jak i chromosomy podziałowe<br />
ulegały kondensacji, pogrubieniu i skróceniu. Procent<br />
dzielących się komórek ulegał początkowo redukcji<br />
a później całkowitemu zahamowaniu.<br />
Małe stężenia ekstraktów powodowały despiralizację<br />
chromatyny. Wzrastał procent dzielących się komórek.<br />
Mamy tu, zatem dwojakie działanie ekstraktów z kłączy<br />
Iris i można przypuszczać, że badany ekstrakt może mieć<br />
istotne znaczenie zarówno w zapobieganiu jak i leczeniu<br />
chorób nowotworowych związanych z modyfikacją indeksu<br />
mitotycznego i fazowego.<br />
Summary<br />
A water extract from rootstock of Iris dichotoma Pall. was<br />
used to investigate its effect on meristem cells of the root<br />
tips of the Allium Test. The structure of chromatin of the<br />
interphase nuclei was changed as compared to the control.<br />
The highest concentrations (16 and 8 mg/mL) caused<br />
condensation of chromatin. Dividing cells contained<br />
chromosomes shortened and thickened, but no chromosomal<br />
aberrations were visible. There was a decrease in the<br />
number of mitoses, and already after 24 hours total inhibition.<br />
The lowest concentrations caused despiralisation of<br />
chromatin, and the percentage of mitoses increased; thus<br />
a dual mechanism of reaction was found, which could be<br />
used for both stimulation and inhibition of mitoses, dependent<br />
on concentration.<br />
Key words: Iris dichotoma, extract from rhizome, change<br />
structure of chromatin, condensed and contracted chromosomes,<br />
modification of mitotic and phase index.<br />
Słowa kluczowe: Iris dichotoma, ekstrakty z kłączy,<br />
zmiana struktury chromatyny, kondensacja i kontrakcja<br />
chromosomów, modyfikacja indeksu mitotycznego i fazowego.<br />
Wstęp<br />
Żyjemy w dobie niezwykłego progresu chorób cywilizacyjnych<br />
(otyłość, cukrzyca, choroby nowotworowe, choroby<br />
serca i układu krążenia), wobec których w większości<br />
bezradna jest medycyna akademicka (konwencjonalna).<br />
W związku z tym obserwujemy bardzo dynamiczny rozwój<br />
fitochemii, pociągający za sobą, duże zainteresowanie<br />
lekami pochodzenia roślinnego i duże zapotrzebowanie na<br />
surowce roślinne o dużej zawartości poszukiwanych substancji.<br />
Szczególnie cennymi są tu rośliny odznaczające się<br />
właściwościami przeciwnowotworowymi. W większości są<br />
to rośliny egzotyczne pochodzące ze strefy klimatu tropikalnego,<br />
gdzie nadzwyczajnych właściwości leczniczych<br />
nabywają dzięki specyficznym warunkom glebowym i klimatycznym.<br />
Szczególne właściwości przypisuje się roślinom<br />
południowo-amerykańskim i śródziemnomorskim. Nie<br />
stanowi to jednak bezwzględnej reguły, bowiem na każdym<br />
kontynencie i nieomal w każdym zakątku naszego globu,<br />
znane są różnorodne leki roślinne używane powszechnie<br />
w ludowym lecznictwie. Do takich należy również, rosnący<br />
w ostrym klimacie pustynnym Mongolii Iris dichotoma Pall.<br />
Należy on do rodzaju Iridaceae i zawiera różne biologicznie<br />
czynne substancje, takie jak: kumaryny, saponiny, chinony [1],<br />
iridoidy [2], flawony i izoflawony [3] i inne, dzięki którym od<br />
lat używany jest w medycynie ludowej tego kraju (Ryc. 1).<br />
27
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
z 1938 r.) [4]. Stanowiły je komórki merystematyczne korzeni<br />
przybyszowych Allium cepa. Hodowano je w wodzie<br />
destylowanej w 300 ml naczyniach Erlenmayera w warunkach<br />
laboratoryjnych Zakładu Ekotoksykologii UW. Kiedy<br />
korzenie osiągnęły długość 3 cm (± 0,5 cm) wraz z cebulami<br />
przenoszono je do w/w roztworów w 50 ml zlewkach.<br />
Inkubację w nich prowadzono przez 12, 36, 60 i 84 godz.<br />
W celu zbadania wpływu ekstraktu na aktywność mitotyczną<br />
(indeks mitotyczny i fazowy) komórek Testu Allium<br />
w czasie eksperymentu odcinano wierzchołki korzeni<br />
(o długości ok. 2-3 mm), barwiono je i macerowano w 2%<br />
roztworze acetoorceiny z dodatkiem 1N HCl (w stosunku 9:1)<br />
i wykonywano preparaty gniecione na szkiełkach podstawowych.<br />
Indeks mitotyczny i fazowy obliczano według metody<br />
opisanej przez Lopez-Saez and Fernandez-Gomez i innych<br />
[5 – 9]. Dla każdego wariantu doświadczenia pobierano po<br />
sześć korzeni z trzech analogicznych cebul. Średnie wyniki<br />
indeksu mitotycznego i fazowego wraz z odchyleniami standardowymi<br />
przedstawiono na wykresach a zmiany morfologii<br />
chromosomów fotografowano przy użyciu mikroskopu<br />
świetlnego (NU Zeiss) i standardowej kamery fotograficznej<br />
(Nikon) oraz przedstawiono na tablicach.<br />
Ryc. 1. Kwiat Iris dichotoma Pall<br />
Do wstępnych badań ekstraktów tej rośliny zastosowaliśmy<br />
niezwykle dogodny test Allium [4]. Stanowią go merystematyczne<br />
komórki wierzchołków korzeni przybyszowych<br />
Allium cepa L. Cechują się one dużą jednorodnością<br />
genetyczną, łatwe są do hodowli i wykonania preparatów<br />
mikroskopowych, a co najważniejsze są niezwykle dogodnym<br />
materiałem kariologicznym: posiadają duże jądra komórkowe<br />
z niewielką liczbą (16) dużych chromosomów,<br />
na których bardzo łatwo w mikroskopie świetlnym można<br />
obserwować i liczyć wszelkie mutageniczne aberracje chromosomowe<br />
w poszczególnych fazach mitozy.<br />
Celem naszych badań było ustalenie, w oparciu o ten dogodny<br />
test, wpływu wodnego ekstraktu z kłączy irysa, na<br />
biologiczną jego aktywność a w tym: na strukturę interfazowej<br />
chromatyny i chromosomów podziałowych oraz na<br />
frekwencję podziałową komórek a więc cechy określające<br />
cytostatyczne/cytotoksyczne własności badanego ekstraktu<br />
jako potencjalnego preparatu przeciwnowotworowego.<br />
Materiał i metody<br />
Materiałem badanym były wysuszone i sproszkowane<br />
kłącza Iris dichotoma Pall. zbierane ze stanowisk naturalnych<br />
na stepach w okolicach Ułanbator i otrzymane z Instytutu<br />
Medycyny Naturalnej z Mongolii. Wodny ekstrakt<br />
z kłączy przygotowano zalewając 1 g wysuszonego i sproszkowanego<br />
materiału 40 ml wrzącej wody destylowanej<br />
a następnie pozostawiano mieszaninę na 24 godz. w temperaturze<br />
pokojowej. Po tym czasie ekstrakt przesączano<br />
i wyjściowo obliczano stężenie substancji rozpuszczonych<br />
na 6 mg/ml. Ekstrakt wyjściowy do eksperymentu był odpowiednio<br />
rozcieńczany w celu otrzymania szeregu następujących<br />
stężeń: 0,1; 0,2; 0,4; 0,75; 1,5; 3,0 i 6 mg/ml. Równoległa<br />
kontrola prowadzona była w wodzie destylowanej. Badania<br />
wykonano na komórkach Testu Allium (Test Levana<br />
Wyniki<br />
Podczas inkubacji korzeni Allium w ekstraktach z kłączy<br />
irysa o różnym stężeniu przez 60 godz. zaobserwowano<br />
wyraźne zmiany w ich morfologii. Korzenie inkubowane<br />
w ekstrakcie o najniższym stężeniu (0,1 mg/ml) były dłuższe<br />
od korzeni kontrolnych i nie posiadały widocznych<br />
cech jakiejkolwiek deformacji (Ryc. 2b). Podczas inkubacji<br />
w wyższych stężeniach ekstraktu (0,4 i 1,5 mg/ml) na pograniczu<br />
elongacyjnej i merystematycznej strefy wierzchołka<br />
korzeni, pojawiały się charakterystyczne zgrubienia oznaczone<br />
na fotografii klamrą (Ryc. 2c i 2d). Inkubacja korzeni<br />
w ekstrakcie o stężeniach najwyższych (3 i 6 mg/ml) spowodowała<br />
zahamowanie ich wzrostu i były one krótkie i dodatkowo<br />
ciemno zabarwione (Ryc. 2e).<br />
Analiza preparatów mikroskopowych wykazała wpływ<br />
inkubacji w ekstrakcie na intensywność podziałów komórkowych<br />
i morfologię jąder interfazowych i chromosomów<br />
mitotycznych. Na preparatach kontrolnych obserwowano<br />
regularne podziały mitotyczne o natężeniu charakterystycznym<br />
dla komórek Testu Allium wynoszącym ok. 10%. Jądra<br />
komórek interfazowych miały zróżnicowanie skondensowaną<br />
chromatynę w zależności od fazy cyklu komórkowego,<br />
w której się znajdowały (Ryc. 3a). W komórkach kontrol-<br />
Ryc. 2. Morfologia korzeni Allium cepa L. poddanych działaniu różnych<br />
stężeń wodnego ekstraktu z kłącza Iris dichotoma Pall. przez<br />
36 godz. a) kontrola; b) 0,1 mg/ml; c) 0,4 mg/ml; d) 1,5 mg/ml,<br />
e) 3,0 mg/ml<br />
28
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
nych Testu Allium chromosomy profazowe miały w różnym<br />
stopniu skondensowaną chromatynę tworzącą różnej grubości<br />
splątane nici chromosomów (Ryc. 4a), które w metafazie układały<br />
się w płytce metafazowej a podczas anafazy, ich siostrzane<br />
połówki (chromatydy) w sposób uporządkowany rozchodziły się<br />
do biegunów komórki. Na etapie telofazy nowo powstające jądra<br />
po wytworzeniu błony jądrowej i jąderka, stopniowo przybierały<br />
regularne kształty a chromatyna ulegała dekondensacji.<br />
Inkubacja korzeni Allium cepa w ekstrakcie z kłączy irysa<br />
(0,75 - 6 mg/ml) spowodowała zmiany w morfologii chromosomów<br />
polegające na silnej ich kondensacji i kontrakcji<br />
nie doprowadzającej jednak do powstawania aberracji chromosomowych.<br />
Jądra te w dalszej części pracy będą określane<br />
jako zmienione - cc (z ang. condensed and contraction).<br />
Były to liczne cc-profazy (Ryc. 4c), w których chromosomy<br />
były silnie skondensowane a pomiędzy nimi uwidaczniały<br />
się wyraźne przejaśnienia kariolimfy. Zmienione metafazy<br />
posiadały silnie skondensowane, skrócone chromosomy<br />
zwykle ułożone w rozproszeniu typowym dla C-metafaz<br />
(typowych dla komórek po działaniu kolhicyną) (Ryc. 4d)<br />
lub ściśle ułożone w płytkę metafazalną (Ryc. 4e). Wśród<br />
anafaz i telofaz występowały również zmiany cc (Ryc. 4f<br />
i 4g). Po całkowitym wyhamowaniu aktywności mitotycznej<br />
(po 36 godz. inkubacji) w najwyższym stężeniu ekstraktu,<br />
również jądra komórek interfazowych miały silnie skondensowaną<br />
euchromatynę i były one wyraźnie mniejsze i silniej<br />
wybarwione w porównaniu od jąder kontrolnych (Ryc. 4b).<br />
Analiza indeksu mitotycznego, czyli procentu dzielących<br />
się komórek wykazała, że w czasie ciągłej inkubacji<br />
od 0 do 84 godz. następowały zmiany procentu dzielących<br />
się komórek zależne od użytego stężenia ekstraktu i czasu<br />
trwania inkubacji (Ryc. 5). Dwa najniższe stężenia (0,1<br />
i 0,2 mg/ml) były stymulujące dla podziałów komórkowych<br />
juz od 12 godz. i pozostawały stymulującymi do 84 godzin.<br />
Najwyższą wartość indeksu mitotycznego odnotowano pod<br />
wpływem stężenia 0,1 mg/ml po 36 godz. inkubacji i wynosiła<br />
ona ok. 150% kontroli (Ryc. 3c). Inkubacja w ekstrakcie<br />
o stężeniu 0,4 mg/ml spowodowała obniżenie indeksu mitotycznego<br />
po 12 godz. inkubacji do ok. 60% a następnie<br />
jego powolny wzrost aż po 84 godz., kiedy osiągnął on wartość<br />
zbliżoną do kontroli wyjściowej (100%). Pod wpływem<br />
działania ekstraktu o stężeniu wyższym (1,5 mg/ml) również<br />
po 12 godz. doszło do znacznego obniżenia wartości indeksu<br />
mitotycznego (Ryc. 3b) a następnie wraz z upływem<br />
czasu inkubacji do jego ponownego wzrostu. Z tym, że po<br />
84 godz. wartość indeksu spadła bardziej niż w poprzednim<br />
stężeniu do ok. 70% indeksu kontrolnego. Inkubacja korzeni<br />
w najwyższym ze stosowanych w eksperymencie stężeniu<br />
Ryc. 3. Obraz aktywności podziałowej komórek Testu Allium korzeni<br />
kontrolnych oraz po inkubacji w ekstraktach z kłącza Iris dichotoma<br />
a) podziały kontrolne; b) po 12 godzinnej inkubacji w ekstrakcie<br />
o stężeniu 1,5 mg/ml; c) po 36 godzinnej inkubacji w ekstrakcie<br />
o stężeniu 0,1 mg/ml; d) po 60 godzinnej inkubacji w ekstrakcie<br />
o stężeniu 6 mg/ml. (Pow. 400x)<br />
Ryc. 4. Morfologia chromosomów kontrolnych<br />
komórek Testu Allium oraz pod wpływem inkubacji<br />
w wodnym ekstrakcie z I. dichotoma.<br />
a) Kontrolny obraz komórek w poszczególnych<br />
fazach mitozy (P-profaza; M-metafaza; A-anafaza;<br />
T-telofaza); b) zmieniona morfologia<br />
interfazowych jąder komórek traktowanych<br />
przez 36 godzin ekstraktem o stężeniu 6 mg/<br />
ml; c) zmieniona profaza z wyraźnie zgrubiałymi<br />
chromosomami; d) zmieniona metafaza,<br />
chromosomy krótkie i zgrubiałe rozrzucone<br />
na terenie cytoplazmy; e) zmieniona metafaza<br />
gdzie chromosomy są ułożone skośnie w płytce<br />
metafazowej, tez są skrócone i zgrubiałe;<br />
f) zmieniona anafaza; g) zmieniona telofaza.<br />
(Pow. 800x)<br />
29
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
Ryc. 5. Indeksu mitotyczny kontrolnych komórek Testu Allium i po<br />
inkubacji w różnych stężeniach ekstraktu (0,1; 0,2; 0,4; 0,75; 1,5<br />
i 6,0 mg/ml) z I. dichotoma<br />
30<br />
ekstraktu (6 mg/ml) juz po 12 godz. spowodowała obniżenie indeksu<br />
mitotycznego do 25% i całkowitą jego inhibicję po 36 godz.<br />
i na tym poziomie pozostawał on do 84 godz. inkubacji (Ryc. 3d).<br />
Wyniki tych zmian przedstawiono na wykresie (Ryc. 5).<br />
Jednocześnie ze zmianami indeksu mitotycznego w czasie<br />
trwania inkubacji w ekstraktach wystąpiły zmiany indeksu<br />
fazowego (procent komórek w poszczególnych fazach<br />
mitozy) (Ryc. 6). W początkowych godzinach inkubacji<br />
w niższych stężeniach ekstraktu (0,1 – 0,4 mg/ml) indeks<br />
profaz był niższy w porównaniu do kontroli a indeks metafaz<br />
lekko wzrastał ponad poziom kontroli. Generalnie nie<br />
były to zmiany istotne i nie zaobserwowano występowania<br />
podziałów zmienionych (cc) (Ryc. 6a i 6c). Natomiast inkubacja<br />
w roztworach o stężeniach 0,75 i 1,5 mg/ml spowodowała<br />
wyraźny wzrost procentu profaz i metafaz po 12 godz.<br />
inkubacji, kiedy to dochodziło do wyraźnej redukcji podziałów<br />
a jednocześnie pojawiały się mitozy zmienione, które<br />
stanowiły znaczny odsetek wszystkich komórek dzielących<br />
się (Ryc. 6b). Może to wskazywać na mechanizm blokowania<br />
cyklu komórkowego w punkcie metafaza/anafaza, który<br />
może być związany z uszkodzeniami cytoszkieletu tubulinowego<br />
w komórkach. Najwyższa z użytych koncentracji ekstraktu,<br />
również po 12 godz. inkubacji spowodowała wyraźny<br />
wzrost indeksu profaz a tym samym spadek udziału pozostałych<br />
trzech faz mitozy. Po 36 godz. inkubacji doszło już do całkowitego<br />
zahamowania podziałów komórkowych (Ryc. 6d).<br />
Dyskusja i wnioski<br />
W oparciu o powyższe badania działania wodnego ekstraktu<br />
z I. dichotoma na komórki Testu Allium wyodrębniono<br />
trzy zasadnicze typy reakcji w zależności od jego koncentracji.<br />
Działanie stężeń najniższych uwidaczniało się w przyspieszaniu<br />
(stymulacji) wzrostu merystemów korzeniowych w stosunku<br />
do kontrolnych. Skorelowane to było z obserwowaną, wyraźną<br />
despiralizacją chromatyny interfazowej prowadzącej najprawdopodobniej<br />
do zwiększenia jej transkrypcyjnego potencjału przejawiającego<br />
się w dalszej konsekwencji w skróceniu faz cyklu<br />
komórkowego oraz wzmożonej aktywności mitotycznej [10].<br />
Działanie średnich z badanych koncentracji ekstraktu<br />
przejawiało się z kolei w tworzeniu charakterystycznych<br />
zgrubień dystalnej części strefy przejściowej pomiędzy strefą<br />
mitoz a elongacji komórek, podobnych do tych, jakie powstają<br />
np.: po działaniu kolchicyny lub soli metali ciężkich<br />
(ołowiu, kobaltu i manganu). Jak wynika z naszych wcześniejszych<br />
badań, zgrubienie<br />
to jest efektem<br />
częściowego lub całkowitego<br />
zahamowania<br />
podziałów komórkowych<br />
w strefie mitotycznej,<br />
przy jednoczesnej<br />
zmianie kierunku<br />
wzrostu komórek strefy<br />
elongacyjnej [11], co<br />
związane jest ze zmianą<br />
reorientacji mikrotubul<br />
cytoszkieletu tubulinowego.<br />
Natomiast<br />
redukcja/zahamowanie<br />
podziałów w części<br />
mitotycznej następiło<br />
najprawdopodobniej<br />
na skutek drastycznego<br />
zablokowania syntezy<br />
białek tubulinowych,<br />
co przejawia się w za-<br />
Ryc. 6. Indeks fazowy pod wpływem inkubacji w różnych stężeniach ekstraktu z I. dichotoma, w różnym czasie<br />
trwania inkubacji a) Indeks fazowy w komórkach Testu Allium w trakcie inkubacji w ekstrakcie o stężeniu<br />
0,1 mg/ml; b) Indeks fazowy w komórkach Testu Allium w trakcie inkubacji w ekstrakcie o stężeniu 0,75 mg/ml;<br />
c) Indeks fazowy w komórkach Testu Allium w trakcie inkubacji w ekstrakcie o stężeniu 0,4 mg/ml; d) Indeks<br />
fazowy w komórkach Testu Allium w trakcie inkubacji w ekstrakcie o stężeniu 6 mg/ml<br />
kłóceniu reorientacji<br />
chromosomów w okresie<br />
ich przejścia z fazy<br />
G2 do M i w samej<br />
mitozie przy przejściu<br />
z profazy do metafazy<br />
i z metafazy do anafazy
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
[10]. Podobne sytuacje, aczkolwiek związane z inhibicją polimeryzacji<br />
bądź depolimeryzacji mikrotubul tubulinowych<br />
mamy do czynienia w przypadku wielu cytostatyków jak<br />
np.: winblastyna, winkrystyna, Taxol i Taxoter oraz kofeina<br />
[8, 12]. Istnienie tej bariery pomiędzy poszczególnymi fazami<br />
mitozy uniemożliwia jej zakończenie, ale poprzez ich<br />
restytucję, ponowne cofanie się do interfazy. Doprowadza<br />
to z kolei do stopniowej redukcji poziomu aktywności mitotycznej<br />
albo do całkowitego jej wygaśnięcia. Komórki te<br />
jednak nadal zachowują żywotność, której poziom może nawet<br />
nagle i falowo wzrastać w momencie ponownego przeniesienia<br />
komórek do środowiska kontrolnego. Ekstrakty<br />
o tych stężeniach zmieniają więc metabolizm komórek nie<br />
powodując jednak ich aberracyjnej – mutagennej dezorganizacji<br />
ani zwiększenia ich śmiertelności. Stężenia te określane<br />
są one jako cytostatyczne lub subletalne.<br />
Z kolei najwyższe ze stosowanych stężeń prowadziły<br />
do nieodwracalnych zmian morfologicznych całych merystemów<br />
oraz daleko posuniętych morfologicznych zmian<br />
chromatyny interfazowej i chromosomów podziałowych<br />
polegającej na ich kondensacji i kontrakcji. Taka kondensacja<br />
określana często jako „heterochromatynizacja” a prawidłowiej<br />
jako kondensacja euchromatyny [13] prowadzi do<br />
całkowitej inhibicji transkrypcji a w konsekwencji zablokowania<br />
translacji i aktywności podziałowej oraz do totalnej<br />
inaktywacji całej tkanki aktywnej podziałowo. Takie działanie<br />
czynnika zmieniajacego poziom aktywności podziałowej,<br />
określane jest jako cytotoksyczne – letalne.<br />
Powyższe wyniki badań wskazują, zatem na pewną dwoistość<br />
działania wodnego ekstraktu z kłącza Iris dichotoma.<br />
Z jednej strony na działanie cytoprotekcyjne i stymulujące<br />
a z drugiej na ich działanie inhibujące. W związku z takim<br />
działaniem na komórki Testu Allium mamy tu analogię do<br />
immunomodulacyjnego działania innych cytostatyków na<br />
komórki ludzkie i zwierzęce a wyrażające się (zależnie od<br />
stężenia) w immunostymulacyjnym lub immunosupresyjnym<br />
działaniu [14]. Być, zatem może, że przejawiające się<br />
dwojakie działanie ekstraktu z I. dichotomia na komórki Testu<br />
Allium może w odniesieniu do komórek ludzkich i zwierzęcych<br />
okazać się właśnie działaniem „immunomodulacyjnym”.<br />
Gdyby tak było to ekstrakty z kłączy irysa mogłyby<br />
mieć zastosowanie jako typowe roślinne preparaty wspomagające<br />
terapię nowotworową. Właśnie ze względu na to<br />
dwojakie działanie wodnego ekstraktu z kłączy I. dichotoma<br />
bardzo ważnym staje się dokładne przebadanie mechanizmu<br />
jego działania na komórki ludzkiego organizmu, oraz ustalenie<br />
odpowiednich dawek preparatu w zależności od potrzeb tak aby<br />
wykluczyć np.: możliwość stymulacji rozwoju choroby nowotworowej<br />
podczas jego stosowania. Dalsze badania w tym kierunku<br />
wydają się być bardzo celowe i powinny prowadzić do<br />
ustalenia przeciwnowotworowych aspektów ich działania.<br />
Reasumując dotychczasowe nasze wyniki badań możemy<br />
stwierdzić, że:<br />
1. Wodny wyciąg z kłączy I. dichotoma wykazuje podwójne<br />
działanie („immunomodulujące”) na badane komórki<br />
Testu Allium w zależności od stężenia:<br />
A) Niższe stężenia 0,1-0,4 mg/ml działały stymulująco<br />
na aktywność podziałową<br />
B) Najwyższe stężenie 6,0 mg/ml działało inhibujaco na<br />
tą aktywność.<br />
2. Głównym czynnikiem powodującym zmianę aktywności<br />
podziałowej był stopień kondensacji chromatyny.<br />
3. Zmianom struktury i kondensacji chromatyny nie towarzyszyły<br />
aberracje – wywołujące skutki mutagenne.<br />
4. Mechanizm kondensacji chromatyny należy opracować<br />
szerzej używając metod cytofotometrychnych, w tym<br />
należy ustalić mechanizm zmian struktury chromatyny<br />
przy różnych koncentracjach ekstraktu i w różnych fazach<br />
cyklu komórkowego.<br />
5. Oba powyższe efekty działania ekstraktu z I. dichotoma<br />
(stymulacji i inhibicji) należy rozpatrywać z punktu widzenia<br />
ich użyteczności w działaniach prewencyjnych i/<br />
lub terapeutycznych walki z rakiem<br />
Piśmiennictwo<br />
1. Rahman A. et al. Two New Quinones from Iris bungei.<br />
Chem Pharm Bull 2000; 48: 738-739.<br />
2.<br />
3.<br />
4.<br />
5.<br />
6.<br />
7.<br />
8.<br />
Choudhary M.I. et al. Five New Peltogynoids from Underground<br />
Parts of Iris bungei: A Mongolian Medicinal<br />
Plant. Chem Pharm Bull 2001; 49: 1295-1298.<br />
Choudhary M.I. et al. Four New Flavones and a New Iso-<br />
flavone from Iris bungei. J Nat Prod 2001; 64: 857-860.<br />
Levan A. The effect of colchicine on root mitosis in Allium.<br />
Hereditas 1938; 24: 471-486.<br />
Lopez-Saez, J.F., Fernandez-Gomez E. Partial mitotic<br />
index and phase indices. Experientia 1965; 21: 591-592.<br />
Kuraś M., Malinowska A. Influence of 1-b-D arabinofuranosylcystoine<br />
on mitotic activity of apical meristem of onion (Allium<br />
cepa L.) roots. Acta Soc Bot Polon 1978; 47: 173-187.<br />
Keithtey A.M. et al. Coumarin and its 4- and 7- substi-<br />
tuted derivates as retardants of mitoses in Allium root<br />
promeristem. Int J Pharmacogn 1996; 34: 105-113.<br />
Majewska, A. i wsp. Influence of extracts from schoots<br />
of Taxus baccata var. Elegantissima on mitotic activity<br />
of meristematic cells of Allium cepa L. roots. Acta Soc<br />
Bot Polon 2001; 63: 185-192.<br />
Kuraś M. i wsp. Changes in chromosome structure, mi-<br />
9.<br />
totic activity and nuclear DNA content from cells Allium<br />
Test induced by bark water extract of Uncaria tomentosa<br />
(Willd.) DC. J Ethnopharmacol 2006; 107: 211-221.<br />
10. Woźny A., Michleda J., Ratajczak L. Podstawy biologii<br />
komórki roślinnej. Wyd. Naukowe UAM, Poznań 2000.<br />
11. Wierzbicka M. The effect of leads on the ultrastructural<br />
changes in the root tip onion – Allium cepa L. Folia Histochem<br />
Cytobiol 1986; 24: 340-341.<br />
12. Podbielkowska M. i wsp. Effect of coumarin and its derivatives<br />
no mitosis and ultrastructure of meristematic<br />
cells. Int J Pharmacogn 1995; 33: 7-15.<br />
13. Olszewska M.J. Heterochromatyna i “heterochromatynizacja”.<br />
Post Biol Kom 2007; 34: 391-407.<br />
14. Skopińska-Różewska E. Wpływ substancji naturalnych<br />
na układ odpornościowy. Wyd. Fundacja Pomocy Zdrowiu<br />
– Medycyna Naturalna, Warszawa 2002.<br />
Adres do korespondencji:<br />
Prof. dr hab. Mieczysław Kuraś,<br />
ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa,<br />
tel. 22 554-20-07,<br />
e-mail: kuras@biol.uw.edu.pl<br />
31
Farm Przegl Nauk, 2009,8, 32-38<br />
Oxygen regulated protein 150 prevents collagen degradation<br />
in glucose-deprived fibroblasts<br />
Białko ORP150 zapobiega degradacji kolagenu<br />
w hodowlach fibroblastów skóry ludzkiej w przebiegu głodzenia<br />
Marzanna Cechowska-Pasko<br />
Department of Pharmaceutical Biochemistry Medical University of Białystok<br />
Abstract<br />
Glucose is one of the most common therapeutic agents<br />
used in treatment of patients with various diseases. Recent<br />
studies demonstrated the effect of glucose on protein<br />
synthesis /degradation balance. We decided to study the<br />
effect of glucose deprivation on collagen synthesis and<br />
degradation in fibroblast cultures and a correlation of<br />
these processes with the expression of oxygen/glucose<br />
regulated proteins (ORP150/GRP170) and gelatinolytic<br />
activity. The incorporation of radiolabeled proline into<br />
collagenase-sensitive and hydroxyproline-containing proteins<br />
was used as an index of collagen synthesis, whereas<br />
pulse-chase technique was employed to evaluate the degradation<br />
of newly synthesised proteins. It was demonstrated<br />
that fibroblasts incubated in high glucose medium synthesised<br />
detectable amounts of collagenous proteins. The<br />
shortage of glucose resulted in about 30% reduction in<br />
synthesis of collagenous proteins. These phenomena were<br />
accompanied by an increase in the expression of chaperon<br />
- ORP150 in cultures growing in low glucose medium.<br />
Furthermore, the appearance of ORP150 in glucose deprived<br />
cultures coexisted with an increase of gelatinolytic<br />
activity. The pulse-chase experiments demonstrated that<br />
the reduced amount of newly synthesised collagen was<br />
protected against intracellular degradation. Proportionally<br />
less collagen was degraded in cultures incubated in<br />
low glucose than in high glucose media. It may be suggested<br />
that the increased expression of ORP150 is a factor<br />
which protects collagen against intracellular degradation<br />
induced by glucose deprivation.<br />
Keywords: glucose deprivation; collagen synthesis; collagen<br />
degradation; oxygen-regulated protein 150; fibroblasts<br />
Introduction<br />
Glucose is one of the most common therapeutic agents<br />
used in treatment of patients with various diseases. In most<br />
cases it is administered intravenously to supply energetic<br />
substrate. It was reported recently by several authors that<br />
glucose regulates protein synthesis/degradation balance,<br />
stimulating the biosynthesis and protecting proteins against<br />
Streszczenie<br />
Glukoza jest jednym z najbardziej popularnych<br />
składników wielu preparatów o działaniu farmakologicznym<br />
stosowanych w leczeniu różnych schorzeń. Ostatnie<br />
badania wykazały wpływ glukozy na syntezę/degradację<br />
białek. Zdecydowano ocenić wpływ niedoboru glukozy<br />
na syntezę i degradację kolagenu w fibroblastach skóry<br />
ludzkiej oraz korelację tych procesów z ekspresją białka<br />
regulowanego przez tlen/glukozę (ORP150/GRP170)<br />
i aktywnością żelatynolityczną. Syntezę kolagenu zbadano<br />
na podstawie oceny wbudowywania radioaktywnej proliny<br />
do białek wrażliwych na kolagenazę oraz białek<br />
zawierających hydroksyprolinę, podczas gdy degradację<br />
nowo powstałego białka oceniono przy pomocy techniki<br />
„pulse-chase”. Wykazano, że fibroblasty inkubowane<br />
w medium o wysokim stężeniu glukozy syntetyzują kolagen.<br />
Niedobór glukozy spowodował obniżenie syntezy<br />
białek kolagenowych o około 30%, zwiększenie syntezy<br />
białka opiekuńczego – ORP150 oraz nasilenie aktywności<br />
żelatynolitycznej. Badania „pulse-chase” wykazały, że<br />
obniżona ilość nowo zsyntetyzowanego kolagenu była<br />
chroniona przed wewnątrzkomórkową degradacją. Proporcjonalnie<br />
mniej kolagenu zostało zdegradowane<br />
w hodowlach komórek pozbawionych glukozy w porównaniu<br />
do inkubowanych w medium o wysokim stężeniu<br />
glukozy. Sugeruje się, że ORP150 jest czynnikiem, który<br />
chroni kolagen przed wewnątrzkomórkową degradacją,<br />
indukowaną przez niedobór glukozy.<br />
Słowa kluczowe: niedobór glukozy; synteza kolagenu;<br />
degradacja kolagenu; białko ORP 150; fibroblasty<br />
intracellular degradation [1-3]. For this reason it was decided<br />
to study the effect of glucose on collagen synthesis/<br />
degradation in fibroblast cultures.<br />
Collagen is the most abundant extracellular protein in<br />
mammals, responsible for maintenance of architecture and<br />
integrity of connective tissue. It was described in our previous<br />
paper that glucose deprivation resulted in a marked<br />
decrease of collagen content in fibroblast cultures [4]. This<br />
32
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
phenomenon may be evoked by a decrease of collagen biosynthesis,<br />
increased degradation of this protein or by coexistence<br />
of both phenomena.<br />
Obviously collagen biosynthesis requires energy supply.<br />
Glucose is the main energetic substrate and glycolysis is the main<br />
process which supplies energy for fibroblasts grown in vitro [5].<br />
For these reasons the glucose shortage may reduce intracellular<br />
pool of ATP required for the functions of these cells, including<br />
collagen biosynthesis. Furthermore, the shortage of glucose in<br />
culture medium enhances proteolytic (and gelatinolytic) activity<br />
in these cells [1,6] and may promote collagen degradation.<br />
On the other hand glucose deprivation appeared to be a<br />
factor which induces the expression of oxygen-regulated protein<br />
(ORP) 150 in fibroblast cultures [4]. Oxygen-regulated<br />
protein of molecular weight 150 kDa (ORP150) and glucose<br />
- regulated protein of molecular weight 170 (GRP170) are<br />
endoplasmic reticulum (ER) chaperones, which facilitate<br />
protein folding [2]. The GRP170 is a glycosylated form of<br />
ORP150. The ORP150/GRP170 system is a part of the ER<br />
machinery that assists in the folding and assembly of secretory<br />
and membrane proteins within the ER [3]. The expression<br />
of ORP150 increases in a range of pathologic situations<br />
such as brain ischaemia [7], atherosclerotic plaques [8] and malignant<br />
tumours [9-11] suggesting that ORP150 is a contributory<br />
factor for the cellular response to environmental stress.<br />
The role of ORP150 in cellular physiology remains unclear.<br />
Some observations indicate that ORP150, like GRP78 and<br />
GRP94, is involved in the processing of proteins in the secretory<br />
pathway [12]. This allows suggesting that ORP150 is a chaperon,<br />
which protects intracellular collagen against proteolytic effects<br />
exerted by glucose shortage. In order to test such a hypothesis<br />
we decided to study the effect of glucose deprivation in culture<br />
medium on proline incorporation into total proteins and specifically<br />
into collagenase-sensitive and hydroxyproline-containing<br />
proteins. Furthermore, the degradation of newly synthesised<br />
collagen and correlation of this process with the expression of<br />
glucose-regulated proteins (ORP150/GRP170) was studied.<br />
Materials and methods<br />
Reagents<br />
The DMEM was provided by Invitrogen (San Diego,<br />
USA). Passive lysis buffer (Promega, Madison, USA), monoclonal<br />
anti-human ORP 150 (IBL, Gunma, Japan), highly<br />
purified bacterial collagenase (type VII), Sigma-Fast BCIP/<br />
NBT reagent, alkaline phosphatase-labelled anti-mouse<br />
immunoglobulin G were purchased from Sigma (St Louis,<br />
USA), as were most other chemicals and buffers used.<br />
[2,3,4,5 – 3 H] L-proline was obtained from Hartmann Analytic<br />
(Braunschweig, Germany). Nitrocellulose membranes<br />
(0.2 μm), Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel<br />
electrophoresis (SDS-PAGE) molecular weight standards<br />
and Coomassie Brilliant Blue R-250 were purchased from<br />
Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA).<br />
Cell cultures<br />
The experiments were performed on the human skin<br />
fibroblast cell line (CRL-1474) purchased from American<br />
Type Culture Collection (ATCC). The cells were cultured in<br />
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), containing<br />
glucose at 4.5 mg/ml (high glucose DMEM) supplemented<br />
with 10% heat-inactivated foetal calf serum (FCS), 2 mM<br />
L-glutamine, penicillin (100 U/ml) and streptomycin (100<br />
μg/ml). The cells were seeded at a density of 5 x 10 5 cells<br />
in 2 ml medium and grown on six-well plates, in a 5 % CO 2<br />
incubator, at 37 O C.<br />
Experimental procedure<br />
5 x 10 5 cells in 2 ml medium were seeded in six-well plates<br />
and incubated for seven days in the high glucose DMEM. In<br />
these conditions the cultured cells reached 70-80% confluency.<br />
After this time the medium was removed and replaced<br />
with 2 ml of the fresh DMEM (without calf serum):<br />
1. the high glucose DMEM contained 4.5 mg of glucose<br />
per ml (25mM),<br />
2. the low glucose DMEM contained 0.5 mg of glucose per<br />
ml (2.8 mM).<br />
Each was supplemented with [2,3,4,5– 3 H] L-proline,<br />
ascorbate (50 µg/ml), 2 mM L-glutamine, penicillin (100<br />
U/ml) and streptomycin (100 μg/ml). The incubation was<br />
continued for 12, 24, 48 hours. The fibroblast did not divide<br />
during the incubation in serum-free medium. No increase in<br />
cell density was observed in this period.<br />
After incubation the culture media were removed, the cell<br />
layers were washed with PBS and submitted to the action of<br />
lysis buffer. It allowed separating the cells and extracellular<br />
matrix from the bottom of culture vessels and suspending<br />
them in the buffer.<br />
Filtration Assay<br />
Each hydrophilic Durapore membrane (0.65-µm pore<br />
size) was soaked with 250µl of 25% TCA. The cell lysates<br />
and culture media were treated with 50% TCA (final TCA<br />
concentration 25%) and next incubated at 4 o C for 1h. The<br />
formed precipitate was collected on the filter membranes<br />
and separated from the supernatant using a vacuum source<br />
attached to the 1225 Sampling Manifold (Millipore). To<br />
remove all unincorporated [ 3 H]-proline, the filters were<br />
washed 3 times with 5 ml of 10% TCA by vacuum-filtration<br />
through the membrane. After removing the underdrain and<br />
drying, the membranes were then punched out into scintillation<br />
vials and the filter-bound radioactivity was quantified<br />
by liquid scintillation counting [13,14].<br />
The assay of collagenase-sensitive protein<br />
The collagenase-sensitive protein was measured using<br />
the method described by Petrkofsky and Diegelman [15].<br />
The cell lysates and culture media were treated with high purity<br />
bacterial collagenases (type VII-Sigma). N-ethylmaleimide<br />
was applied as an inhibitor of unspecific proteolytic<br />
activity associated with collagenase. The amount of newly<br />
synthesised collagen was expressed in dpm of [ 3 H]-proline,<br />
incorporated into protein susceptible to the action of bacterial<br />
collagenases [15].<br />
Determination of radioactive hydroxyproline<br />
Cell lysate or incubation medium was submitted to hydrolysis<br />
in 6 M HCl, at 100 O C, for 16 h. The hydrolysates<br />
were evaporated to dryness in a rotary glass evaporator. The<br />
33
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
dried residues were dissolved in 1 ml of 2M HCl and submitted<br />
to chromatography on a column (1 x 9 cm), containing<br />
Dowex 50W, equilibrated and eluted with 2M HCl. Such<br />
a procedure made possible to separate [ 3 H]-hydroxyproline<br />
from [ 3 H]-proline [16]. The amounts of radioactive hydroxyproline<br />
were counted in a scintillation counter.<br />
Pulse-chase experiment<br />
The confluent cell cultures were incubated for 48 h with<br />
radioactive proline as described in the Experimental Procedure.<br />
The medium was removed, the cell layer was washed<br />
with PBS and submitted to incubation in high and low glucose<br />
medium (without serum), containing non-labelled 10<br />
mM proline (“0” time) and incubated for 4 h. After this time<br />
the cells were lysed, cell lysates were submitted to filtration<br />
assay (to measure total protein) or to the determination of<br />
collagenase-sensitive proteins. The decrease in the amounts<br />
of total and collagen- sensitive proteins was calculated.<br />
Detection of gelatinolytic activity<br />
Gelatinolytic activity in cell culture lysates was studied<br />
with zymographic method described by Woessner [18].<br />
In order to activate zymogen forms of metalloproteinases<br />
some lysates were submitted to the action of p-aminophenylmercuric<br />
acetate (APMA). The lysates were mixed with<br />
Laemmli sample buffer [17] containing 2.5% SDS (without<br />
reducing agent). 30 μg of protein were submitted to electrophoresis<br />
on 10% polyacrylamide gels containing gelatin at a<br />
concentration of 1 mg/ml, under non-reducing conditions.<br />
After electrophoresis, the gels were incubated first in 2%<br />
Triton X-100 at 37°C for 30 min to remove SDS and then in<br />
substrate buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0 containing 5mM<br />
CaCl 2<br />
) at 37°C for 24 h. After staining with 1% Coomassie<br />
Brilliant Blue R 250, the gelatine-degrading enzymes<br />
present in cell culture lysates were identified as clear zones<br />
in a blue background.<br />
Statistical analysis<br />
The mean values for six assays ± standard deviations<br />
(SD) were calculated. Statistical analysis was performed using<br />
Student’s ‘t’-test.<br />
Results<br />
It can be seen from Fig. 1A that fibroblasts incubated<br />
in high glucose medium incorporated significant amounts<br />
of radioactive proline into high molecular weight proteins.<br />
Sodium dodecyl sulphate /Polyacrylamide gel electrophoresis<br />
(SDS/PAGE)<br />
The cell cultures were washed with cold PBS and solubilised<br />
in 200 μl lysis buffer per well. The lysates (containing<br />
both cells and extracellular matrix lysis products) were<br />
centrifuged at 10,000 x g, at 4 O C, for 10 min. The samples of<br />
lysates containing 30 μg of protein were subjected to SDS-<br />
PAGE, as described by Laemmli [17]. The following Bio-Rad’s<br />
unstained standards were used: myosin (200 kDa), galactosidase<br />
(116.2 kDa), phosphorylase b (97.4 kDa), bovine serum<br />
albumin (66.2 kDa), ovalbumin (45 kDa). The electrophoresis<br />
was run for 40–45 minutes. In each experiment 7.5 % polyacrylamide<br />
gel and constant current (25 mA) were used.<br />
Immunoblotting<br />
The proteins were transferred to nitrocellulose membranes<br />
and then pre-treated with Tris-buffered saline (TBS)<br />
containing 0.05% Tween 20 (TBS-T) and 5% non fat dry<br />
milk, at room temperature, for 2 hours. Membranes were<br />
probed with a mixture containing anti-ORP150 antibody (1:<br />
1000) in 5% dried milk in TBS-T at 4 O C for 16 h. Then,<br />
the alkaline phosphatase conjugated antibody against mouse<br />
IgG (whole molecule) was added at concentration 1:7500<br />
in TBS-T for 1 h with slow shaking. The nitrocellulose was<br />
washed with TBS-T (five times for 5 min) and exposed to<br />
Sigma-Fast BCIP/NBT reagent.<br />
Fig. 1. The effect of glucose deprivation on the incorporation of [ 3 H]-<br />
L-proline into: (A) total proteins, (B) collagenase-sensitive proteins,<br />
(C) hydroxyproline-containing proteins by human skin fibroblasts incubated<br />
in high glucose (white bars) and low glucose (black bars)<br />
DMEM for 12 h, 24 h and 48 h. Mean values from 3 experiments ±<br />
SD are presented. * p< 0.001.<br />
34
Time dependent increase of proline incorporation was observed.<br />
Total amount of proline incorporated into high molecular<br />
weight material after 48 h incubation was above 3<br />
times higher in comparison to 12 h incubation. The shortage<br />
of glucose resulted in a decrease of proline incorporation<br />
into proteins synthesised in fibroblast cultures. The time dependent<br />
relation of this inhibitory effect of glucose shortage<br />
was observed. In the case of cultures incubated for 12 h<br />
only a slight decrease of proline incorporation was apparent,<br />
whereas after 24-48 h such an effect was more evident. The<br />
cells incubated in low glucose medium synthesised almost<br />
50% less radioactive proteins than those grown in high glucose<br />
medium (Fig. 1A).<br />
Fig. 1B shows that the investigated cells incubated in<br />
high glucose medium synthesised detectable amounts of<br />
collagenase-sensitive proteins. The quantities of these proteins<br />
grew about 3 times if incubation was prolonged from<br />
12 to 48 h (Fig 1B). The shortage of glucose resulted in<br />
about 30% reduction in synthesis of collagenase-sensitive<br />
proteins, both those secreted into culture medium and remaining<br />
in the cell layer (Fig. 1B).<br />
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
Fig. 2. Pulse-chase labelling of total (A) and collagenase-sensitive proteins (B) with [ 3 H]-L-proline. Human<br />
skin fibroblasts were incubated in high glucose (white bars) and low glucose (black bars) DMEM for 48 h<br />
and the label was chased for additional 4 h. Mean values ± SD are presented. * p< 0.001.<br />
Fig. 1C shows that the fibroblasts incubated in high glucose<br />
medium synthesised detectable amounts of hydroxyproline-containing<br />
proteins. The quantities of hydroxyproline-containing<br />
proteins<br />
grew above twice if incubation<br />
was prolonged from 12<br />
to 48 h (Fig. 1C). As in the<br />
previous case the shortage<br />
of glucose resulted in about<br />
30% reduction in synthesis<br />
of hydroxyproline-containing<br />
proteins (Fig. 1A,B,C).<br />
The “pulse chase” experiment<br />
demonstrated degradation<br />
of total protein and collagen<br />
newly synthesised by<br />
fibroblast incubated in both<br />
media. The amount of total<br />
radioactive protein synthesised<br />
in pulse period (100%)<br />
decreased during the chase<br />
period to about 57%. The rest<br />
(about 43%) were degraded.<br />
No differences between cultures<br />
incubated in high glucose<br />
and low glucose media<br />
were observed (Fig. 2A). In<br />
contrast to total protein the<br />
degradation of collagen depended<br />
on the presence of<br />
glucose in culture media. In<br />
cultures incubated in high<br />
glucose medium the proportional<br />
amounts of radioactive<br />
collagen decreased in<br />
chase period to almost 26%<br />
of initial value, whereas the<br />
rest (above 74%) were degraded. A lower degradation of<br />
collagen was observed in cultures incubated in low glucose<br />
medium. About 63% of initial collagen amounts were found<br />
after the chase period. Only 37 % of newly synthesised collagen<br />
was degraded in this time (Fig. 2B).<br />
Fig. 3 shows that the expression of ORP150 and its glycosylated<br />
form GRP170 in fibroblasts cultures. It is apparent<br />
that the expression of these proteins depends on the presence<br />
of glucose in culture medium and it changes during the incubation.<br />
The expression of GRP170 was observed in cultures<br />
incubated both in high glucose and low glucose DMEM, independently<br />
on incubation time (lanes 1-6). The cells incubated<br />
both in high glucose (lane1) and low glucose DMEM<br />
(lane 2) for 12 h did not express ORP150. Prolongation of<br />
Fig. 3. Western immunoblot analysis of oxygen/glucose-regulated<br />
proteins, ORP150/GRP170, synthesised by human skin fibroblasts.<br />
The cells were grown in high glucose (H) and low glucose (L) DMEM<br />
for 12 h, 24 h and 48h. Samples containing 30 μg of protein were<br />
submitted to electrophoresis and immunoblotting.<br />
35
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
incubation time up to 24 h in low glucose DMEM resulted in<br />
an appearance of slight band corresponding to ORP150 (lane<br />
4). The prolongation of incubation in low glucose DMEM<br />
up to 48 h resulted in intensification of ORP150 whereas the<br />
expression of GRP170 was slightly reduced (lane 6).<br />
Fig. 4 shows the presence of gelatinolytic activity in<br />
the cell culture lysates. The cells cultured for 12 h in high<br />
glucose DMEM (lane 1) as well as in low glucose DMEM<br />
(lane 3) have shown an enzyme which corresponds to the<br />
zymogen form of MMP-2 this being activated under the action<br />
of SDS. The treatment with APMA did not evoke any<br />
change in electrophoretic activity of this enzyme (lanes: 2<br />
and 4). No MMP-9 has been detected.<br />
Extending the incubation up to 24 h in high glucose did<br />
not evoke any change in electrophoretic activity of this enzyme<br />
(lanes: 5 and 6). In contrast to them in the cells cultured<br />
in low glucose an intensification of pro-MMP-2 bands and<br />
appearance of an MMP-2 active form (lane 7 and 8) have<br />
been observed. Furthermore, a slight expression of both<br />
pro-MMP-9 and active MMP-9 was detected. The action<br />
of APMA did not evoke further increase in MMP-2 activity<br />
(lane 8). Extending the incubation of cells in high glucose<br />
up to 48 h resulted in a slight intensification of pro-MMP-2<br />
bands (lane 9 and 10). In contrast to them in the cells cultured<br />
in low glucose DMEM for 48 h further increase of<br />
MMP-2 expression has been observed. Bands corresponding<br />
to both pro-MMP-2 and active MMP-2 became much<br />
more intensive (lanes 11 and 12). Furthermore, an intensification<br />
of bands corresponding to pro-MMP-9 and active<br />
MMP-9 was apparent (Fig. 4).<br />
This study suggests that<br />
glucose may exert additional<br />
effect. It stimulates<br />
collagen biosynthesis,<br />
whereas glucose<br />
deprivation evokes up<br />
regulation of chaperones,<br />
which protect<br />
newly synthesised collagen<br />
against intracellular<br />
degradation.<br />
It is well known that<br />
collagen is the major human<br />
protein which contains<br />
hydroxyproline.<br />
In contrast to other proteins<br />
it is specifically digested<br />
by bacterial collagenase.<br />
For these reasons<br />
the incorporation<br />
of radiolabeled proline<br />
into collagenase-sensitive and hydroxyproline-containing<br />
protein is used as an index of collagen synthesis, whereas<br />
pulse-chase technique allows evaluating the degradation of<br />
newly synthesised protein [19].<br />
Fig. 4. Gelatinolytic activity of fibroblasts cultured in high glucose (H) and low glucose (L) DMEM for 12,<br />
24 and 48 h, without APMA (-), with APMA (+). All samples submitted to zymography contained 30 μg of<br />
protein.<br />
APMA - p-aminophenylmercuric acetate.<br />
We decided to study the effect of glucose deprivation<br />
on total protein/ collagen synthesis and degradation in fibroblast<br />
cultures, and correlation of these processes with the<br />
expression of oxygen/glucose-regulated proteins (ORP150/<br />
GRP170) and gelatinolytic activity. It was demonstrated that<br />
fibroblasts incubated in high glucose DMEM synthesised<br />
detectable amounts of collagenous proteins. They constituted<br />
a few per cent of total radioactive proteins. The shortage<br />
of glucose resulted in about 50% decrease in total protein<br />
and about 30% reduction in collagenase-sensitive and<br />
hydroxyproline-containing protein synthesis. The pulsechase<br />
experiment demonstrated that degradation rate of<br />
newly synthesised total protein did not change in response to<br />
glucose deprivation. Both in control and glucose-deprived<br />
cultures above 40% of radioactive proline incorporated into proteins<br />
in the pulse period were degraded during the chase phase.<br />
In contrast to that, the degradation of collagen in chase<br />
period depended on the presence of glucose in culture medium.<br />
Despite the cells incubated in low glucose medium<br />
synthesised less collagen in pulse period, they protected<br />
newly synthesised collagen against degradation in chase<br />
phase. Proportionally less collagen was degraded in cultures<br />
incubated in low glucose than in high glucose media despite<br />
of increased gelatinolytic activity after 24 or 48 h. These<br />
phenomena were accompanied by an increase in expression<br />
of ORP150 in cultures growing in low glucose medium.<br />
Discussion<br />
Glucose is commonly used therapeutic agent. In common<br />
opinion, intravenous administration of this sugar supplements<br />
the pool of energetic substrates in human body.<br />
The mechanism of decreased collagen synthesis at the<br />
conditions of glucose deprivation is easy to explain. No<br />
doubt, the shortage of the main energetic substrate in culture<br />
medium decreases ATP-formation and reduces all energyrequiring<br />
anabolic processes within the cells. It is more dif-<br />
36
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
ficult to explain why glucose deprivation results in protection<br />
of the newly synthesised collagen against intracellular<br />
degradation.<br />
The endoplasmic reticulum is an organelle where secretory<br />
or membrane proteins are synthesised. Approximately<br />
one-third of all cellular proteins are translocated into the lumen<br />
of the ER with its unique oxidising and Ca2+-rich environment,<br />
where post-translational modification, folding and<br />
oligomerisation of nascent proteins occur before they are<br />
translocated to their final destination. Correct folding is an<br />
important factor which allows translocation of protein molecules<br />
to specific subcellular compartments, extracellular<br />
matrix or to biological fluids [20-22]. The folding process is<br />
regulated by a group of proteins, referred to as chaperones<br />
[23]. ER molecular chaperones and folding enzymes associate<br />
with the newly synthesised, unfolded and/or incompletely<br />
glycosylated proteins to prevent their aggregation and<br />
help them to fold and assemble correctly [21,22]. In some<br />
instances, they function even in the refolding of denatured<br />
proteins [19].<br />
It is known that collagen folding depends on the hydroxylation<br />
of prolyl residues to achieve sufficient amounts of<br />
hydroxyprolyl residues to form a stable triple helical structure.<br />
Properly folded collagen is secreted extracellularly and<br />
serves as a substrate in the process of fibrogenesis. Underhydroxylated<br />
collagen is unable to form a stable triple helical<br />
structure and cannot be secreted from the synthesising cell.<br />
It is degraded by the intracellular proteolytic system [24].<br />
Many stress conditions, such as glucose deprivation, reduces<br />
the folding process which results in the accumulation<br />
of unfolded/misfolded proteins within the cell [25,26]. The<br />
accumulation of unfolded proteins activates the so called<br />
“unfolded protein response”, which enhances cell survival<br />
by limiting the accumulation of unfolded or misfolded proteins<br />
in the ER [25,26]. Molecular chaperones are induced in<br />
these conditions, bind to unfolded/misfolded proteins, and help<br />
them to be folded or refolded correctly [27]. An integral component<br />
of the cellular response to environmental stress is the<br />
expression, usually by de novo protein synthesis, of stress-associated<br />
polypeptides termed oxygen-regulated protein [27,28] .<br />
Several authors have reported that glucose deprivation<br />
results in stimulation of protein degradation [1,6] and that<br />
oxygen or glucose deprivation increases free radicals, which<br />
in turn, oxidise proteins that are recognized and actively degraded<br />
by proteasomes [1]. It is apparent from our results<br />
that collagen (at least in our experimental conditions) is protected<br />
against proteolysis, induced by glucose-deprivation.<br />
This phenomenon is accompanied by an increase in the expression<br />
of ORP150 – a chaperon, which protects intracellular<br />
proteins against degradation. The appearance of ORP<br />
150 in glucose deprived cultures coexisted with an increase<br />
of gelatinolytic activity. Despite glucose shortage reduces<br />
collagen synthesis, the increased expression of ORP150<br />
may reduce the degradation of newly synthesised protein<br />
and protect the cell culture against a massive loss of collagen.<br />
References<br />
1. Weih M et al. Proteolysis of oxidized proteins after oxygen-glucose<br />
deprivation in rat cortical neurons is mediated<br />
by the proteasome. J Cereb Blood Flow Metab<br />
2001; 21:1090-1096.<br />
2. Yoshida H. ER stress and diseases. FEBS J 2007;<br />
274:630-658.<br />
3. Flores-Diaz M et al. A cellular UDP-glucose deficiency<br />
causes overexpression of glucose/oxygen-regulated proteins<br />
independent of the endoplasmic reticulum stress<br />
elements. J Biol Chem 2004; 279: 21724-21731.<br />
4. Cechowska-Pasko M, Pałka J, Bańkowski E. Glucosedepleted<br />
medium reduces the collagen content of human<br />
skin fibroblast cultures. Mol Cell Biochem 2007;<br />
305:79-85.<br />
5. Bilińska B, Cervinka M, Chadzińska M et al. The cell<br />
and tissue culture (in Polish). PWN. Warszawa 2004.<br />
6. Libby P, O'Brien KV. The role of protein breakdown in<br />
growth, quiescence, and starvation of vascular smooth<br />
muscle cells. J Cell Physiol 1984; 118:317-323.<br />
7. Matsushita K et al. Marked, sustained expression of a<br />
novel 150-kDa oxygen regulated stress protein, in severely<br />
ischemic mouse neurons. Mol Brain Res 1998;<br />
60: 98–106.<br />
8. Tsukamoto Y et al. 150 kDa oxygen regulated protein<br />
(ORP150) is expressed in human atherosclerotic plaques<br />
and allows mononuclear phagocytes to withstand cellular<br />
stress on exposure to hypoxia and modified LDL. J<br />
Clin Invest 1996; 98: 1930–1941.<br />
9. Tsukamoto Y et al. Expression of 150 kDa oxygen-regulated<br />
protein (ORP150), a new member of the HSP70<br />
family, in human breast cancers. Lab Invest 1998; 78:<br />
699–706.<br />
10. Cechowska-Pasko M, Bańkowski E, Chene P. The effect<br />
of hypoxia on the expression of 150 kDa oxygenregulated<br />
protein (ORP 150) in HeLa cells. Cell Physiol<br />
Biochem 2006; 17:89-96.<br />
11. Cechowska-Pasko M, Bankowski E, Chene P. Glucose<br />
effect on the expression of 150 kDa oxygen-regulated<br />
protein in HeLa cells. Biochem Biophys Res Commun<br />
2005; 337:992-997.<br />
12. Easton DP, Kaneko Y, Subjeck JR. The Hsp 110 and Grp<br />
170 stress proteins: newly recognized relatives of the<br />
Hsp 70s. Cell Stress Chaperones 2000; 5: 276-290.<br />
13. Fenwick SA et al. 96-well plate-based method for total<br />
collagen analysis of cell cultures. Biotechniques 2001;<br />
30:1010-1014.<br />
14. Koyano Y, Hämmerle H, Mollenhauer J. Analysis of 3Hproline-labeled<br />
protein by rapid filtration in multiwell<br />
plates for the study of collagen metabolism. Biotechniques<br />
1997; 22:706-716.<br />
15. Peterkofsky B, Diegelmann R. Use of a mixture of proteinase-free<br />
collagenases for the specific assay of radioactive<br />
collagen in the presence of other proteins. Biochemistry<br />
1971; 10:988-994.<br />
16. Schneir M, Ramamurthy N, Golub L. Skin collagen metabolism<br />
in the streptozotocin-induced diabetic rat. Enhanced<br />
catabolism of collagen formed both before and<br />
during the diabetic state. Diabetes 1982; 31:426-431.<br />
37
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
17. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the<br />
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;<br />
227: 680-685.<br />
18. Woessner JF Jr. Determination of hydroxyproline<br />
in connective tissue. Meth Enzymol 1995; 248,<br />
510-528.<br />
19. Bateman JF, Lamande’ SR, Ramshaw JAM. Collagen<br />
Superfamily In: Wayne D. Comper (ed.) Extracellular<br />
matix. Molecular Components and Interactions, vol 2.<br />
Harwood Academic Publishers, Melbourne Australia<br />
1996, 22-67.<br />
20. Ellgaard L, Molinari M, Helenius A. Setting the standards:<br />
quality control in the secretory pathway. Science<br />
1999; 286: 1882-1888.<br />
21. Shen Y, Meunier L, Hendershot LM Identification and<br />
characterization of a novel endoplasmic reticulum (ER)<br />
DnaJ homologue, which stimulates ATPase activity of<br />
BiP in vitro and is induced by ER stress. J Biol Chem<br />
2002; 277: 15947-15956.<br />
22. Little E et al. The glucose-regulated proteins (GRP78<br />
and GRP94): functions, gene regulation, and applications.<br />
Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1994; 4: 1-18.<br />
23. Gething MJ, Sambrook JF. Protein folding in the cell.<br />
Nature 1992; 355: 33–45.<br />
24. Harding HP et al. Transcriptional and translational control<br />
in the mammalian unfolded protein response. Annu<br />
Rev Cell Dev Biol 2002; 18: 575-599.<br />
25. Kaufman RJ et al. The unfolded protein response in nutrient<br />
sensing and differentiation. Nat Rev Mol Cell Biol<br />
2002; 3: 411-421.<br />
26. Miyagi T et al. Antitumor effect of reduction of 150-kDa<br />
oxygen-regulated protein expression in human prostate<br />
cancer cells. Mol Urol 2001; 5: 79-80.<br />
27. Heacock CS, Sutherland RM. Induction characteristics<br />
of oxygen regulated proteins. Int J Radiat Oncol Biol<br />
Phys 1986; 12: 1287-1290.<br />
28. Ozawa K et al. Regulation of tumor angiogenesis by<br />
oxygen-regulated protein 150, an inducible endoplasmic<br />
reticulum chaperone. Cancer Res 2001; 61: 4206-4213.<br />
Address for correspondence:<br />
Marzanna Cechowska-Pasko, PhD, Department of Pharmaceutical Biochemistry,<br />
Medical University of Białystok, Mickiewicza 2A, 15-089 Białystok, Poland<br />
tel. (48.85) 748-56-91<br />
e-mail: mapasko@gmail.com<br />
38
Farm Przegl Nauk, 2009,8, 39-42<br />
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
Rola cynku w zaburzeniach smaku<br />
The Role of Zinc in Taste Disorders<br />
Wanda Suchecka<br />
Katedra i Zakład Podstawowych Nauk Biomedycznych w Sosnowcu<br />
Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach<br />
Streszczenie<br />
Substancje mineralne takie jak cynk, miedź i nikiel pełnią<br />
wiele istotnych funkcji fizjologicznych. Ich poziom oraz<br />
wzajemne proporcje w komórkach i tkankach decydują<br />
o stanie zdrowia, wpływają także na metabolizm innych<br />
składników pożywienia.<br />
Cynk jest niezbędnym składnikiem pokarmowym wymaganym<br />
u ludzi i zwierząt do prawidłowego przebiegu<br />
wielu procesów fizjologicznych włączając w to funkcję<br />
immunologiczną i antyoksydacyjną, wzrost i rozmnażanie.<br />
Cynk odgrywa istotną rolę w procesach odczuwania<br />
smaku, gdyż jest kofaktorem białka G zwanego gustducyną.<br />
Gustducyna wiąże się z receptorami odpowiedzialnymi<br />
za odbiór smaku słodkiego, gorzkiego i umami. Białko<br />
G warunkuje prawidłową czynność kubków smakowych.<br />
Komórki smakowe reagują na substancje smakowe dzięki<br />
receptorom obecnym w ich błonach komórkowych. Dane<br />
z piśmiennictwa naukowego wskazują, że istnieje kilka<br />
mechanizmów zaburzeń odbioru smaku wynikających<br />
ze stosowania niektórych leków i że cynk pełni kluczową<br />
rolę w odbiorze smaku. W stanach niedoboru cynku<br />
wyraźnie obniża się wrażliwość smakowa. Wykazano, że<br />
na skutek suplementacji cynkiem dochodzi do poprawy<br />
czynności zmysłu smaku.<br />
Słowa kluczowe: smak, cynk, wrażliwość smakowa, zaburzenia<br />
smaku<br />
Summary<br />
Mineral substances, such as zinc, copper and nickel are<br />
involved in many important physiological processes. The<br />
health status of organisms is determined by their concentration<br />
as well as the balance between them in the cells<br />
and tissues. Zinc is an essential nutrient that is required<br />
in humans and animals for many physiological functions,<br />
including immune and antioxidant functions, growth and<br />
reproduction. Zinc plays a significant role in the process<br />
of taste sense because it is a cofactor of G-protein called<br />
gustducin. Gustducin combines with the receptors<br />
responsible for the reception of sweet, bitter and umami<br />
taste. G protein is very important for the activity of taste<br />
buds. Taste cells respond to taste substances due to the<br />
receptors present in their cell membranes. The data from<br />
various scientific researches indicate that there are several<br />
mechanisms for drug-related taste disturbance and that<br />
zinc plays the key role in taste reception. The decrease in<br />
taste sensitivity is a visible sign of zinc-deficiency. The<br />
research indicates an improvement in taste after zinc supplementation.<br />
Key words: taste, zinc, taste sensitivity, taste disorders<br />
Ocena jakości pokarmów oparta jest na współdziałaniu<br />
zmysłu smaku ze zmysłem powonienia. Chociaż zarówno<br />
receptory zmysłu smaku jak i zmysłu powonienia należą<br />
do grupy chemoreceptorów, to jednak zachodzące w nich<br />
mechanizmy chemotransdukcji różnią się w wielu aspektach<br />
[1,2]. Ponadto odrębne pozostają drogi neuronalne, dzięki<br />
którym informacja sensoryczna jest przenoszona, analizowana<br />
i przetwarzana [1]. Mimo różnic, smak i węch ściśle<br />
ze sobą korelują. W mózgu ssaków, impulsy powstające<br />
w czuciowych komórkach smakowych i węchowych kierowane<br />
są do układu limbicznego. Informacje czuciowe<br />
smakowa i węchowa wysyłane są również przez wzgórze<br />
do kory mózgowej, gdzie powstaje odczucie i identyfikacja<br />
odpowiednio smaku i zapachu [1]. Badania wykazały,<br />
że pewne zapachy poprawiają intensywność postrzegania<br />
smaków, inne tłumią [2]. Narządy powonienia i smaku wysyłają<br />
swoje sygnały wyzwalające wrażenia zmysłowe do<br />
skomplikowanego „labiryntu”, który stanowi psychika człowieka.<br />
Współdziałanie zmysłu smaku ze zmysłem powonienia<br />
ma wpływ na ocenę spożywanych pokarmów. Na ocenę<br />
potrawy wpływa także: doświadczenie, pamięć i osobnicza<br />
wrażliwość, a więc różne rodzaje skojarzeń. Pokarm obecny<br />
w jamie ustnej podczas żucia pobudza oprócz zmysłu smaku<br />
i węchu także receptory bólu i mechanoreceptory zlokalizowane<br />
w błonie śluzowej języka i jamy ustnej. Są one drażnione<br />
podczas spożywania posiłku, przez co smak można<br />
określić jako odczucie wielomodalne, na które wpływ ma<br />
również ból, ucisk, odczucie pieczenia, temperatura.<br />
Przyczyny zaburzeń smaku mogą być bardzo różne, począwszy<br />
od patologii zlokalizowanych w jamie ustnej, przez<br />
uszkodzenie dróg nerwowych przewodzących impulsy do<br />
ośrodków w mózgowiu, a skończywszy na niedoborach<br />
pokarmowych i zaburzeniach metabolicznych związanych<br />
z chorobami ogólnoustrojowymi, czy też wpływem leków<br />
[3,4].<br />
Całkowity brak odczuwania wszystkich bądź też określonych<br />
smaków, czyli ageuzja, występuje rzadko ponieważ<br />
informacja o bodźcach smakowych jest przenoszona drogą<br />
kilku nerwów czaszkowych [1]. Częściej obserwuje się obniżenie<br />
zdolności odczuwania smaku (hypogeuzja) lub zniekształcenie<br />
odczuwania normalnego smaku (dysgeuzja).<br />
Formami dysgeuzji są [5]:<br />
39
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
1. parageuzja – błędne, opaczne odczuwanie wrażeń smakowych,<br />
2. kakogeuzja – odczuwanie nieprzyjemnych smaków wywołane<br />
przez prawidłowe substancje smakowe,<br />
3. phantogeuzja – występowanie halucynacji smakowych<br />
przy braku jakichkolwiek bodźców smakowych,<br />
4. aliageuzja – odczuwanie nieprzyjemnych wrażeń przy<br />
bodźcach smakowych uważanych zwykle za przyjemne,<br />
Utrata zdolności percepcji smaku, obniżenie odczuwania<br />
smaku bądź zniekształcenie odczuwania normalnego<br />
smaku wpływają na ilość i rodzaj spożywanego pokarmu,<br />
a także na doznania negatywne i pozytywne związane z jego<br />
przyjmowaniem. Zaburzenia smaku mogą znacząco obniżyć<br />
jakość życia.<br />
Niektórzy autorzy wiążą zaobserwowane zaburzenia<br />
smaku ze zmianami w metabolizmie oraz z niedoborem<br />
pierwiastków takich jak cynk, miedź i nikiel [6,7]. Składniki<br />
mineralne są materiałem budulcowym i - chociaż nie spełniają<br />
funkcji energetycznych - regulują czynności ustroju,<br />
a zwłaszcza chemiczną i fizyczną integralność komórek i tkanek.<br />
Dzienne spożycie tych pierwiastków z dietą często nie<br />
pokrywa w pełni zapotrzebowania organizmu na te niezwykle<br />
istotne dla życia biopierwiastki. Na poziom pierwiastków<br />
w organizmie człowieka mają wpływ różne choroby, w tym<br />
również choroby o podłożu genetycznym oraz niezbilansowany<br />
sposób żywienia, obniżenie biodostępności, narażenie<br />
zawodowe, skażenie środowiska [8]. Skutki niedoborów<br />
cynku i miedzi związane są z rolą jaką te pierwiastki spełniają<br />
w żywych organizmach. Cynk jest obecny w centrach<br />
aktywnych wielu (około 200) enzymów uczestniczących<br />
w różnych procesach, w tym w przemianach metabolicznych.<br />
W związku z tym ma wpływ na wszystkie podstawowe<br />
procesy życiowe [8,9,10]. Miedź jako ważny biopierwiastek<br />
jest składnikiem wielu białek, metaloenzymów i niektórych<br />
barwników [9,11,12]. Nikiel zaliczany jest do pierwiastków<br />
subśladowych, których stężenie w różnych tkankach jest bardzo<br />
niskie i wynosi od dziesiątych części do kilkudziesięciu nanogramów<br />
w 1 gramie badanej tkanki [13]. Określenie funkcji<br />
biochemicznej niklu jak i innych subśladowych pierwiastków<br />
jest bezpośrednio związane z trudnościami analitycznymi występującymi<br />
przy oznaczaniu tak niskich stężeń, dlatego też informacje<br />
na temat biochemicznej roli pierwiastków subśladowych<br />
są niepełne, a wiele problemów związanych z wpływem<br />
tych biopierwiastków na funkcjonowanie organizmów żywych<br />
nie zostało do końca wyjaśnionych.<br />
Biodostępność składników mineralnych zawartych<br />
w wodzie, żywności i suplementach ma duże znaczenie<br />
w ocenie stopnia zaspokajania zapotrzebowania organizmu<br />
na składniki mineralne. Płeć, wiek stan odżywiania, podatność<br />
na stres, czynniki genetyczne, stan fizjologiczny (ciąża,<br />
laktacja), mikroflora jelitowa mają duży wpływ na biodostępność<br />
tych minerałów [14].<br />
Warunkiem przyswajalności składników mineralnych<br />
jest z jednej strony ich rozpuszczalność, a z drugiej zdolność<br />
do przenikania przez błony komórkowe. Przyswajalność<br />
cynku jest na ogół proporcjonalna do jego stężenia<br />
w pożywieniu, jednakże obecność różnych związków<br />
w przewodzie pokarmowym może wpływać na wchłanianie<br />
cynku w jelitach. Obecność w diecie pochodnych kwasu fitynowego<br />
jest głównym czynnikiem małej przyswajalności<br />
cynku. Kompleksy cynku utworzone z kwasem fitynowym<br />
utrudniają jego wchłanianie w jelicie. Fosforany i benzoesany<br />
należą także do czynników zmniejszających wchłanianie<br />
cynku w jelitach. Przyswajalność cynku jest obniżana przez<br />
substancje zdolne do jego chelatowania tj. histydynę, cysteinę,<br />
kwas cytrynowy i pikolinowy. Upośledzone wchłanianie<br />
cynku jest z reguły związane z dysfunkcją jelit [15].<br />
Wchłanianie miedzi i cynku warunkuje homeostazę całego<br />
organizmu, przy czym podwyższony stan wysycenia organizmu<br />
tymi pierwiastkami obniża ich wchłanianie [16].<br />
Ustalając normy i zapotrzebowanie organizmu ludzkiego<br />
na składniki mineralne, a zwłaszcza na cynk, należy zwrócić<br />
szczególną uwagę na biodostępność cynku ze zwyczajowo<br />
spożywanej diety, określić spożycie tego pierwiastka w grupie<br />
osób bez symptomów wskazujących na niedobory, jak<br />
również wykorzystać badania epidemiologiczne dotyczące<br />
niedoborów cynku w danej populacji [17]. Przy interpretacji<br />
wyników oznaczania zawartości cynku w surowicy krwi<br />
zdrowej populacji należy oprzeć się na wartościach referencyjnych<br />
[8]. W dostępnym krajowym piśmiennictwie<br />
wartości te są zróżnicowane [18,19], toteż przy interpretacji<br />
wyników celowym wydaje się posługiwanie własną grupą<br />
odniesienia [8].<br />
Cynk może być oznaczany w różnych tkankach, ale najczęściej<br />
oznaczany jest w surowicy krwi i we włosach [20].<br />
Niskie poziomy miedzi i cynku w diecie, jak również zaburzenia<br />
w ich absorpcji przez dłuższy okres czasu, mogą prowadzić<br />
do obniżenia poziomu tych pierwiastków w całym<br />
organizmie, a w konsekwencji do wystąpienia wielu różnych<br />
chorób [21], w tym również dysfunkcji zmysłu smaku<br />
[6,7,21]. Wykazano, że w zaburzeniach smaku występuje<br />
szczególnie zwiększone zapotrzebowanie organizmu na<br />
cynk spowodowane obniżonym jego poziomem w surowicy<br />
krwi oraz zaburzeniami w absorpcji tego pierwiastka [21].<br />
Wyniki badań Stefanidou i wsp. [22], oraz Ikeda i wsp.<br />
[23] wskazują na obniżenie poziomu cynku w surowicy<br />
krwi wraz z wiekiem, co ma związek z zaburzeniami absorbcji<br />
cynku u ludzi starszych. Badania innych autorów<br />
dowodzą braku wpływu wieku na poziom cynku w surowicy<br />
krwi [24]. W pierwszym przypadku ma to zapewne<br />
związek ze starzeniem się organizmu czyli stopniowym,<br />
postępującym i nieodwracalnym zmniejszaniem jego zdolności<br />
do zachowania równowagi środowiska wewnętrznego<br />
w odpowiedzi na czynniki środowiska zewnętrznego tj. warunki<br />
i tryb naszego życia, co zwiększa ryzyko wystąpienia<br />
różnych chorób. U pacjentów leczonych związkami zawierającym<br />
grupę tiolową (-SH), jak np. kaptopryl obserwowano<br />
zaburzenia gospodarki cynkowej, a także występowanie<br />
ageuzji [25]. Prawdopodobnym mechanizmem takiego działania<br />
jest zdolność chelatowania jonów cynku przez ten lek.<br />
Ponadto kaptopryl powoduje zwiększenie wydalania cynku<br />
z moczem, a co za tym idzie zmniejszenie stężenia cynku<br />
w surowicy krwi, co być może wiąże się z obecnością grupy<br />
sulfhydrylowej w cząsteczce tego leku [26].<br />
Wykazano ustąpienie hipogeuzji po doustnym podaniu<br />
soli cynku, miedzi lub niklu w stanach chorobowych związanych<br />
z podwyższonym poziomem we krwi dwusiarczków<br />
oraz związków tiolowych [25]. Wiedza na temat wpływu<br />
miedzi i niklu na wrażliwość smakową jest jednak ogra-<br />
40
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
niczona i nie jest jeszcze jednoznacznie wyjaśniona. Dane<br />
z piśmiennictwa sugerują największy korzystny wpływ cynku<br />
na wrażliwość smakową [6,7,21].<br />
Cynk jest pierwiastkiem występującym praktycznie we<br />
wszystkich płynach ustrojowych organizmu, minerałem<br />
niezbędnym dla normalnego wzrostu, a także do syntezy<br />
białka, ochrony przed wolnymi rodnikami, do zachowania<br />
odporności humoralnej i komórkowej, utrzymania integralności<br />
komórek śródbłonka, a także prawidłowej aktywności<br />
ponad 200 metaloenzymów, spośród których wiele<br />
spełnia funkcje antyoksydacyjne dzięki zwiększeniu puli<br />
metalotioneiny cynkowej w wątrobie, nerkach i jelitach.<br />
Ponadto cynk jest potrzebny na każdym etapie cyklu komórkowego,<br />
reguluje ekspresję genów i jest niezbędny dla<br />
syntezy kwasów nukleinowych [17]. Wykazano, że nawet<br />
umiarkowane obniżenie stężenia tego pierwiastka u ludzi<br />
prowadzi do zaburzeń neurosensorycznych [6,7,21].<br />
Wiadomym jest, iż cynk odgrywa istotną rolę w procesach<br />
odczuwania smaku, gdyż jest kofaktorem gustducyny<br />
- białka G uczestniczącego w mechanizmie pobudzania<br />
komórek smakowych [27]. Komórki smakowe reagują na<br />
substancje smakowe dzięki receptorom obecnym w ich błonach<br />
komórkowych. Szczególnie transdukcja smaku słodkiego,<br />
gorzkiego i umami przebiega z zaangażowaniem<br />
receptorów należących do grupy receptorów związanych<br />
z białkami G (GPCR) [28]. Opisano zaburzenia smaku i węchu,<br />
którym towarzyszyły zmiany osobowości i anoreksja,<br />
u pacjentów z obniżonym poziomem cynku w przebiegu<br />
leczenia histydyną [25]. Mechanizm powstawania hipogeuzji<br />
na skutek deficytu cynku nie jest jeszcze jednoznacznie<br />
wyjaśniony. Wykazano, że osoby, które przyjęły cynk<br />
w postaci farmakologicznych suplementów zawierających<br />
cynk, a także stosujące dietę uwzględniającą produkty bogate<br />
w ten mikroelement, wykazywały mniej symptomów<br />
dysgeuzji. W przypadku idiopatycznej dysgeuzji uzyskano<br />
obiecujące wyniki po zastosowaniu glukonianu cynku<br />
w dawkach 140 mg na dobę przez 4 miesiące [29] lub 87<br />
mg na dobę przez 3 miesiące [30]. Skuteczność preparatów<br />
cynku w leczeniu zaburzeń smaku u większości badanych<br />
wykazali również Arcavi i wsp. [31]. Obniżenie wrażliwości<br />
smakowej obserwuje się też przy niedoborze witaminy<br />
A [32]. Uważa się, że wchłanianie, metabolizm, uwalnianie<br />
z wątroby, transport i zużycie przez tkanki witaminy A może<br />
być zależne od zawartości cynku w organizmie. Wykazano,<br />
że regulacja metabolizmu witamina A przez cynk może odbywać<br />
się za pośrednictwem dwóch mechanizmów. Jeden<br />
z nich polega na regulowaniu transportu witaminy A. Niedobór<br />
cynku może obniżać syntezę białka wiążącego retinol<br />
w wątrobie i prowadzić do zmniejszenia jego stężenia w surowicy.<br />
Drugi mechanizm dotyczy przekształcenia retinolu<br />
w retinal, procesu wymagającego działania enzymu dehydrogenazy<br />
retinolu [17,32]. Cynk przez obecność w dehydrogenazie<br />
retinolu katalizuje przemianę witaminy A do jej<br />
formy aktywnej – retinolu. Pierwiastek ten jest niezbędny<br />
zatem do utrzymania prawidłowego stężenia witaminy A<br />
w osoczu krwi. Cynk w enzymach może występować jako<br />
element strukturalny, katalizator i stabilizator. Dehydrogenaza<br />
mleczanowa i alkoholowa, fosfataza zasadowa, anhydraza<br />
węglanowa są najpowszechniejszymi enzymami,<br />
w których występuje cynk [17].<br />
Uważa się, że umiarkowane niedobory cynku występują<br />
dość powszechnie, ale jednoznacznie trudno to potwierdzić,<br />
ze względu na brak prostych wskaźników oceny stanu odżywienia<br />
pod tym względem. Niedobory cynku występują<br />
zwykle łącznie z niedoborami innych składników odżywczych,<br />
co również utrudnia ich zdiagnozowanie. Grupami<br />
ryzyka wystąpienia niedoborów tego pierwiastka są dzieci,<br />
kobiety ciężarne i karmiące, ludzie starsi, osoby odżywiające<br />
się głównie produktami pochodzenia roślinnego i alkoholicy.<br />
Reasumując, cynk jest bardzo ważnym składnikiem<br />
mineralnym dla organizmu człowieka przez okres całego<br />
życia osobniczego, a odpowiednia jego ilość pobierana<br />
z pożywieniem, uzupełniana w miarę potrzeby preparatami,<br />
zmniejsza ryzyko wystąpienia różnych chorób w tym zaburzeń<br />
smaku.<br />
Wrażliwość smakowa jest cechą indywidualną, zależną<br />
od wielu uwarunkowań zewnętrznych i metabolicznych,<br />
toteż pomimo stosowania różnych metod<br />
gustometrycznych umożliwiających ocenę stopnia zaburzeń<br />
percepcji smakowej terapia pacjentów z objawami<br />
nieprawidłowego odczuwania smaku jest niezwykle<br />
trudna.<br />
Studiowanie piśmiennictwa dotyczącego badań poczucia<br />
smaku oraz czynników warunkujących doznania smakowe,<br />
nasuwa refleksję, że wiele niewiadomych wciąż pozostaje<br />
do wyjaśnienia.<br />
Piśmiennictwo<br />
1. Traczyk WZ: Czucie i percepcja. W: Traczyk WZ,<br />
Trzebski A. (red): Fizjologia człowieka z elementami<br />
fizjologii stosowanej i klinicznej. Wydawnictwo Lekarskie<br />
PZWL. Warszawa. 2004, 135-178.<br />
2. Djordjevic J, Zatorre RJ, Jones-Gotman M. Odor-induced<br />
changes in taste perception. Exp Brain Res 2004; 159:<br />
405-408.<br />
3. Doty RL, Shah M, Bromley SM. Drug induced taste disorders.<br />
Drug Saf 2008; 31: 199-215.<br />
4. Briggs ER. Taste disturbances related to medication use.<br />
Consult Pharm 2009; 24: 538-543.<br />
5. Obrębowski A i wsp.: Uwagi do systematyki i terminologii<br />
zaburzeń węchu i smaku. Otolaryngol Pol 1991; 45:<br />
104-107.<br />
6. Takeda N i wsp.: Zinc deficiency in patients with idiopathic<br />
taste impairment with regard to angiotensin converting<br />
enzyme activity. Auris Nasus Larynx 2004; 31:<br />
425-428.<br />
7. Halczy-Kowalik L. Ocena wrażliwości zmysłu smaku<br />
w chorobie wrzodowej żołądka i dwunastnicy. Annales<br />
Academiae Medicae Stetinensis. Roczniki Pomorskiej<br />
Akademii Medycznej im K. Świerczewskiego w Szczecinie.<br />
1986; 32: 229-247.<br />
8. Schlegel-Zawadzka M. Cynk - aspekty zdrowotne i lecznicze,<br />
przyczyny i objawy niedoborów. Farm Pol 2002;<br />
58: 452-459.<br />
9. Hänsch R, Mendel RR. Physiological functions of mineral<br />
micronutrients (Cu, Zn, Mn, Fe, Ni, Mo, B, Cl). Curr<br />
Opin Plant Biol 2009; 12: 259-266.<br />
10. Sahin K i wsp.: Role of dietary zinc in heat-stressed poultry.<br />
Poult Sci 2009; 88: 2176-2183.<br />
41
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
11. Furukawa T i wsp.: Copper transport systems are involved<br />
in multidrug resistance and drug transport. Curr<br />
Med Chem 2008; 15: 3268-3278.<br />
12. Jabłoński E, Sobczak M. Składniki mineralne w diecie<br />
kobiet ciężarnych i karmiących. Cześć II. Mikrominerały:<br />
żelazo cynk, miedź, selen, jod, fluor, mangan, molibden,<br />
chrom. Prz Lek 2007; 64: 170-174.<br />
13. Długaszek M, Sałacki A, Kaszczuk M. Porównawcza<br />
analiza zawartości niklu w surowicy, erytrocytach i włosach<br />
pracowników zawodowo narażonych na kontakt<br />
z paliwem lotniczym. Pol Prz Med Lot 2008; 14: 327-<br />
336.<br />
14. Gawęcki J, Hryniewiecki L. (red): Żywienie człowieka.<br />
Podstawy nauki o żywieniu. T1. Wydawnictwo Naukowe<br />
PWN Warszawa 2008.<br />
15. Basu TK. Intestinal absorption in health and disease micronutrients.<br />
Best Practis Research in Clinical Gastroenterology<br />
2003; 17: 957-979.<br />
16. Smith K. Quantitative aspects of zinc absorption by isolated<br />
vasculary perfused rat intestine. J Nutr 1980; 110,<br />
316-323.<br />
17. Nowicka G, Panczenko-Kresowska B. Czynniki wpływające<br />
na ustalanie zaleceń żywieniowych na cynk<br />
- propozycje zmian norm spożycia na ten pierwiastek.<br />
Żyw Człow Metab 2001; 28: 324-341.<br />
18. Zmarzły A i wsp.: Stężenie cynku w surowicy krwi u byłych<br />
narkomanów dożylnych zakażonych HIV, bez klinicznych<br />
objawów AIDS. Wiad Lek 2004; 57: 249–254.<br />
19. Tomaszewski J. Diagnostyka laboratoryjna. PZWL.<br />
Warszawa 2007.<br />
20. Wiechuła D i wsp.: Zawartość pierwiastków we włosach<br />
łonowych mężczyzn w wybranych stanach chorobowych.<br />
Brom Chem Toksykol 2007; 40: 179-185.<br />
21. Watanabe M i wsp.: Measurements of several metallic elements<br />
and matrix metalloproteinases (MMPs) in saliva from<br />
patients with taste disorder. Chem Senses 2005; 30: 121-125.<br />
22. Stefanidou M i wsp.: Zinc: a multipurpose trace element.<br />
Arch Toxicol 2006; 80: 1-9.<br />
23. Ikeda M, Ezaki T, Moriquchi J. Levels of calcium, magnesium<br />
and zinc in urine among adult women in relation<br />
to age with special reference to menopause. J Nutr<br />
Health Aging. 2007; 11: 394-401.<br />
24. Zaichick V i wsp.: The effect of age and gender on Al,<br />
B, Ba, Ca, Cu, Fe, K, Li, Mg, Mn, Na, P, S, Sr, V, and Zn<br />
contents in rib bone of healthy humans. Biol Trace Elem<br />
Res 2009; 129: 107-115.<br />
25. Bałczewska E, Nowak A. Zaburzenia smakowe. Nowa<br />
Stom 2000; 12: 1-2.<br />
26. Pączkowska M. Wpływ inhibitorów enzymu przekształcającego<br />
angiotensynę I na wybrane parametry gospodarki<br />
cynkowej. Pol Arch Med Wew 1996; 96: 32-38.<br />
27. Hoon MA i wsp.: Functional expressin of the taste specific G-<br />
protein, alpha-gustducin. Biochem J 1995; 309(2): 629-636.<br />
28. Zhang Z i wsp.: The transduction channel TRPM5 is<br />
gated by intracellular calcium in taste cells. J Neurosci<br />
2007; 23,27: 5777-5786.<br />
29. Heckmann JG i wsp.: Neurological aspects of taste disorders.<br />
Arch Neurol 2003; 60: 667-671.<br />
30. Sakai F i wsp.: Double-blind, placebo-controlled trial<br />
of zinc picolinate for taste disorders. Acta Otolaryngol<br />
Suppl 2002; 546: 129-133.<br />
31. Arcavi L, Shahar A. Drug related taste disturbances:<br />
emphasis on the elderly. Harefuah 2003; 142: 446-450,<br />
484-485.<br />
32. Christian P, West KP. Interactions between zinc and vitamin<br />
A: a update. Am J Clin 1998; 68: 435-441.<br />
Adres do korespondencji:<br />
Wanda Suchecka<br />
Katedra i Zakład Podstawowych Nauk Biomedycznych<br />
41-205 Sosnowiec, ul. Kasztanowa 3<br />
tel. 32 231-32-72<br />
e- mail: wandas@sum.edu.pl<br />
42
Farm Przegl Nauk, 2009,8, 43-47<br />
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (AMD)<br />
– czynniki ryzyka i profilaktyka<br />
Age-related macular degeneration (AMD)<br />
– risk factors and prophylaxis<br />
Alicja Zajdel, Adam Wilczok<br />
Katedra i Zakład Biofarmacji; Wydział <strong>Farmaceutyczny</strong> z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,<br />
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach<br />
Streszczenie<br />
Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (AMD – agerelated<br />
macular degeneration) jest postępującą, chorobą<br />
degeneracyjną centralnej części siatkówki (tj. plamki),<br />
która odpowiada za widzenie centralne. AMD staje się<br />
coraz częstszą przyczyną utraty wzroku u osób powyżej<br />
50 roku życia starzejących się społeczeństw krajów wysoko<br />
uprzemysłowionych. Przyczyną zmian występujących<br />
w AMD jest zaburzony metabolizm w komórkach obszaru<br />
plamki. AMD, którego patogeneza wciąż nie została<br />
dokładnie wyjaśniona, jest schorzeniem o podłożu genetycznym,<br />
któremu towarzyszą: stres oksydacyjny, stany<br />
zapalne i dysfunkcja mitochondrialna. Czynnikami ryzyka<br />
są wiek, płeć żeńska, rasa biała, jasny kolor tęczówki,<br />
narażenie wzroku na intensywne światło, nadciśnienie<br />
tętnicze, miażdżyca, wysoki poziom cholesterolu, otyłość,<br />
palenia tytoniu oraz niedobór przeciwutleniaczy. Dotychczas<br />
nie opracowano skutecznej metody profilaktyki i leczenia<br />
AMD. W profilaktyce AMD znajdują zastosowanie<br />
preparaty lecznicze i suplementy diety zawierające barwniki<br />
plamki luteinę i/lub zeaksantynę, wielonienasycone<br />
kwasy tłuszczowe omega-3 – EPA i/lub DHA, witaminy<br />
C i E, oraz mikroelementy - cynk, selen i miedź. Preparaty<br />
te przy zmianie stylu życia i sposobu odżywiania mogą<br />
zmniejszać ryzyko zachorowania na AMD oraz hamować<br />
progresję choroby.<br />
Słowa kluczowe: AMD, czynniki ryzyka, profilaktyka<br />
Abstract<br />
Age-related macular degeneration (AMD) is a progressive<br />
degenerative disease of central part of retina (macula),<br />
which is responsible for central vision. AMD is the<br />
leading cause of visual impairment and blindness in individuals<br />
over the age of 50 years, particularly in ageing<br />
communities of developed countries. The disturbed metabolism<br />
within macular cells is the most likely the primary<br />
cause in AMD, a disease which pathogenesis still remains<br />
unexplained. Genetic predisposition, oxidative stress, inflammatory<br />
response, and mitochondrial dysfunction play<br />
a major role in the aetiology of AMD. Other risk factors<br />
are: advanced age, female sex, white race, bright irises,<br />
exposition to intensive light, hypertension, atherosclerosis,<br />
increased cholesterol, obesity, smoking, and antioxidant<br />
deficiency. There is no known effective prophylaxis<br />
for AMD, and there is no effective treatment for most cases<br />
of AMD. Usually in prophylaxis against AMD the Rx<br />
and OTC (Over-the-counter) formulations containing macular<br />
pigments lutein and/or zeaxanthin, polyunsaturated<br />
omega-3 fatty acids EPA and/or DHA, vitamins C and E,<br />
and microelements zinc, selenium, copper are used. Taking<br />
such formulations together with changes in lifestyle<br />
and healthy diet can significantly reduce occurrence and<br />
progression of AMD.<br />
Key words: AMD, risk factors, prophylaxis<br />
Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (AMD – agerelated<br />
macular degeneration) jest postępującą, przyczyniającą<br />
się początkowo do dyskomfortu, a następnie ubytków<br />
widzenia, późno pojawiającą się chorobą degeneracyjną<br />
centralnej części siatkówki (tj. plamki), która wpływa na<br />
widzenie centralne niezbędne w takich czynnościach jak<br />
prowadzenie samochodu i czytanie, rozpoznawanie twarzy,<br />
znaków drogowych. AMD staje się coraz częstszą chorobą<br />
oczu starzejących się społeczeństw krajów wysoko uprzemysłowionych.<br />
W zaawansowanych stadiach choroby dochodzi<br />
do całkowitego zaniku widzenia centralnego. Szczególnie<br />
wrażliwy na uszkodzenia w przebiegu AMD jest środek<br />
plamki zwany dołkiem. Schorzenie to staje się problemem<br />
społecznym ograniczającym funkcjonowanie osób ogólnie<br />
sprawnych, gdyż jest najczęstszą przyczyną nieodwracalnej,<br />
choć niecałkowitej utraty wzroku u osób powyżej 50.<br />
roku życia. O tym jak poważny problem społeczny stanowi<br />
zwyrodnienie plamki związane z wiekiem, mogą świadczyć<br />
dane piśmiennictwa, według których AMD dotyka 25 milionów<br />
ludzi na świecie. AMD jest przyczyną ślepoty u prawie<br />
42% chorych, którzy utracili wzrok między 65-74 rokiem<br />
życia, prawie 2/3 chorych, którzy utracili wzrok między 75-<br />
84 rokiem życia i ¾ chorych, którzy utracili wzrok po 85<br />
roku życia [1]. Wyniki przeprowadzonych w różnych regionach<br />
świata (Europie, Ameryce, Australii, Japonii) badań<br />
epidemiologicznych szacujących częstość występowania<br />
zaawansowanych postaci AMD pokazują podobne ryzyko<br />
rozwoju i częstość występowania choroby. Wykazano, że<br />
43
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
w populacji osób w wieku 55-64 lat ryzyko zachorowania na<br />
AMD wynosi 0.2% i wzrasta do 13% u ludzi w wieku powyżej<br />
85 lat. Dane statystyczne ze wszystkich rejonów świata<br />
są zgodne i pokazują wzrastającą tendencję zachorowań, co<br />
stawia problem AMD w grupie wiodących przyczyn nieodwracalnych<br />
ubytków widzenia i ślepoty [2].<br />
Objawami AMD są pogorszenie widzenia, zauważalne<br />
zwłaszcza przy czytaniu, zniekształcone widzenie linii prostych,<br />
problemy z widzeniem centralnym (ciemna plama<br />
w centrum pola widzenia), rozmycie krawędzi oglądanych<br />
przedmiotów, trudności w rozróżnianiu kolorów, mogą pojawić<br />
się zniekształcenia obrazu, tzw. metamorfopsje. Przyczyną<br />
zmian występujących w AMD jest zaburzona przemiana<br />
materii w komórkach znajdujących się w obszarze<br />
plamki w obrębie fotoreceptorów, nabłonka barwnikowego<br />
siatkówki, błony Brucha i choriokapilarów. W wyniku starzenia<br />
się tkanek i rozwoju zmian miażdżycowych w drobnych<br />
naczyniach naczyniówki w obszarze plamki dochodzi<br />
do zmniejszenia przepływu krwi przez te naczynia, co skutkuje<br />
niedokrwieniem siatkówki. Naczyniówka stanowi wyłączne<br />
źródło tlenu i składników odżywczych dla nabłonka<br />
barwnikowego siatkówki i fotoreceptorów [3, 4]. W efekcie<br />
zaburzeń przemian metabolicznych komórki zewnętrznych<br />
warstw siatkówki przestają funkcjonować i obumierają, co<br />
powoduje pogorszenie ostrości wzroku. Obumierające i odkładające<br />
się w postaci złogów komórki tworzą umiejscowione<br />
między nabłonkiem barwnikowym siatkówki a błoną<br />
Brucha tzw. druzy. We wczesnym stadium AMD, które<br />
u większości osób nie wpływa na jakość widzenia, występują<br />
liczne druzy o niewielkich (
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
Ser) dramatycznie zwiększa się (prawie 60 krotnie) ryzyko rozwoju<br />
zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem [19].<br />
Powszechnie panuje pogląd, że jednym z najważniejszych<br />
mechanizmów w patogenezie AMD jest stres oksydacyjny,<br />
który definiuje się jako zaburzenie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej<br />
w kierunku reakcji utleniania<br />
przebiegające z udziałem reaktywnych form tlenu. Dłuższa<br />
ekspozycja na działanie reaktywnych form tlenu przy osłabionych<br />
mechanizmach obronnych może inicjować powstawanie<br />
chorób degeneracyjnych. Generowaniu reaktywnych<br />
form tlenu w siatkówce sprzyja bardzo intensywny metabolizm<br />
tlenowy i wysokie zużycie tlenu w procesach oddychania<br />
komórkowego zachodzących w licznych mitchondriach<br />
segmentów fotoreceptorów. Również wysoka zawartość<br />
wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, obecność fotouczulaczy<br />
takich jak rodopsyna i lipofuscyna oraz ekspozycja<br />
na działanie promieniowania UV, VIS, zwłaszcza wysokoenergetycznego<br />
światła niebieskiego nasila inicjowanie<br />
łańcuchowych reakcji wolnorodnikowych uszkadzających<br />
nabłonek barwnikowy komórek siatkówki. Wytwarzanie<br />
znacznych ilości reaktywnych form tlenu w siatkówce towarzyszy<br />
procesom fagocytozy szczytowych segmentów fotoreceptorów<br />
[20, 21]. Na działanie wolnych rodników narażone są głównie<br />
obwodowe części czopków, ze względu na zwiększoną zawartość<br />
wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Na skutek<br />
gromadzenia produktów niekompletnej degradacji segmentów<br />
zewnętrznych fotoreceptorów tworzą się druzy będące przyczyną<br />
zaburzeń transportu substancji odżywczych i tlenu oraz wzrostu<br />
oporu naczyń siatkówki. Efektem tych procesów są zaburzenia<br />
przepływu krwi prowadzące do niedożywienia siatkówki<br />
i w konsekwencji do atrofii siatkówki i naczyniówki.<br />
Nie wyjaśniona dokładnie patogeneza AMD i brak skutecznych<br />
metod leczenia zwiększają intensywność badań,<br />
których celem jest lepsze zrozumienie modyfikowalnych<br />
czynników ryzyka oraz wyjaśnienie dynamicznej interakcji<br />
pomiędzy czynnikami genetycznymi i środowiskowymi,<br />
a zapadalnością na AMD, co pozwoli na lepsze poznanie<br />
patomechanizmu rozwoju AMD i wprowadzenie prewencyjnych<br />
strategii zapobiegających lub hamujących rozwój<br />
choroby. Na podstawie badań epidemiologicznych sugeruje<br />
się podobny szlak przyczynowy dla chorób układu sercowonaczyniowego<br />
i AMD oraz podobne czynniki ryzyka, takie<br />
jak palenie tytoniu, hypercholesterolemia, nadciśnienie tętnicze,<br />
dieta bogatotłuszczowa, wysoki indeks masy ciała<br />
[13, 22]. W wieloośrodkowych badaniach populacyjnych<br />
w tym również w The European Eye Study prowadzonych<br />
w 7 krajach Europy wykazano zależność pomiędzy ilością<br />
wypalanych papierosów i czasem trwania nałogu (powyżej<br />
10 lat) a powstawaniem wysiękowej postaci AMD. Ryzyko<br />
wystąpienia AMD maleje po zaprzestaniu palenia [23]. Również<br />
u osób biernie palących zwiększa się ryzyko rozwoju<br />
AMD. Opisano synergistyczny wzrost ryzyka wystąpienia<br />
AMD u osób z polimorfizmem ARMS 2 (Ala69Ser) palących<br />
tytoń [24]. Ponadto, w osoczu osób palących stwierdzono zredukowaną<br />
zawartość hamującego zapalenia czynnika H [25].<br />
W kohortowych badaniach populacyjnych przeprowadzonych<br />
w Australii (Blue Mountain Eye Study), których<br />
celem była ocena związku pomiędzy chorobami układu<br />
sercowo-naczyniowego i ich czynnikami ryzyka innymi niż<br />
palenie a długoterminowym ryzykiem wystąpienia zwyrodnienia<br />
plamki związanego z wiekiem uczestniczyło 3654<br />
osób powyżej 49 roku życia, które przebadano w latach<br />
1992-1994, 2335 osób przebadano ponownie po 5 latach<br />
(1997-1999) i 1952 z tych osób przebadano po 10 latach<br />
(2002-2004). Zaobserwowano, że wzrost stężenia lipoprotein<br />
cholesterolu wysokiej gęstości (HDL) był odwrotnie<br />
proporcjonalny do wystąpienia typu późnego AMD. Podwyższony<br />
stosunek całkowity cholesterol/HDL cholesterol<br />
zapowiadało wystąpienie typu późnego AMD oraz zaniku<br />
geograficznego. Cukrzyca zwiększała ryzyko wystąpienia<br />
zaniku geograficznego, ale nie zwiększała ryzyka wystąpienia<br />
postaci neowaskularnej AMD. Dodatni wywiad w kierunku<br />
przebytego udaru, lub innej choroby układu sercowonaczyniowego<br />
(udar, zawał mięśnia sercowego, dusznica<br />
bolesna) zapowiadał wystąpienie wczesnego AMD oraz pojawienie<br />
się rozlanych miękkich lub retikularnych druzów.<br />
Inne obserwacje prowadzone w ramach projektu Blue Mountain<br />
Eye Study badające zależność AMD i nadciśnienia<br />
tętniczego pokazały, że wartość ciśnienia pulsu, skurczowego<br />
i rozkurczowego ciśnienia krwi oraz obecność nadciśnienia<br />
tętniczego w badaniu pierwotnym nie były związane<br />
z wystąpieniem AMD [22]. W odróżnieniu od wyników Blue<br />
Mountain Eye Study rezultaty innych randomizowanych badań<br />
klinicznych z grupą kontrolną AREDS (Age-related Eye<br />
Disease Study Research Group), w których 10-letnią obserwacją<br />
objęto 1117 osób zdrowych, bez oznak AMD, oraz 3640<br />
pacjentów z objawami AMD o różnym stopniu zaawansowania<br />
pokazały, że wzrost ciśnienia zwiększa ryzyko wystąpienia<br />
i progresji AMD. Ponadto udowodniono związek pomiędzy<br />
podwyższonym rozkurczowym ciśnieniem krwi, historią przebiegu<br />
nadciśnienia i zastosowaniem leków przeciwnadciśnieniowych<br />
oraz wysiękową postacią AMD. Związku takiego nie<br />
obserwowano w przypadku suchej postaci AMD [25].<br />
Również rezultaty badań łączących AMD i miażdżycę<br />
naczyń nie są jednoznaczne. Część z nich pokazuje pozytywne<br />
korelacje między AMD i miażdżycą, podczas gdy inne<br />
tylko pozytywne powiązanie pomiędzy AMD i tworzeniem<br />
blaszek miażdżycowych. Szereg badań nie potwierdza tych<br />
zależności [13]. Uważa się, że samo leczenie choroby sercowo-naczyniowej<br />
może mieć wpływ na AMD w szczególności<br />
rozważa się zależność pomiędzy AMD i stosowaniem statyn.<br />
W badaniach klinicznych, z których żadne nie było kontrolowaną<br />
próbą randomizowaną nie otrzymano jednoznacznych<br />
rezultatów. Dlatego nie jest pewne, czy statyny wykazują protekcyjny<br />
efekt. W wielu jednak badaniach udowodniono, że<br />
leczenie statynami ma znaczenie w profilaktyce AMD [27].<br />
Rezultaty licznych badań obserwacyjnych pokazują<br />
pozytywną zależność pomiędzy występowaniem wczesnego<br />
AMD i wysokim BMI, co tłumaczy się wysokim powinowactwem<br />
tkanki tłuszczowej do luteiny, zasadniczego<br />
barwnika plamki oka, który wykazuje silne właściwości antyoksydacyjne<br />
[8, 10, 13]. Duże spożycie zwierzęcych oraz<br />
tłuszczów roślinnych, także tych zwierających nienasycone<br />
kwasy tłuszczowe z rodziny omega-6, zwiększa ryzyko pojawienia<br />
się lub progresji w kierunku zaawansowanych postaci<br />
AMD [28]. Istnieje kilka teorii wyjaśniających możliwą<br />
rolę lipidów w AMD: połączenie pomiędzy chorobą sercowo-naczyniową,<br />
miażdżycą i AMD, powiązanie szlaków<br />
genetyczych cholesterolu, apolipoproteiny E z AMD i fakt,<br />
że zawartość lipidów narasta ekspotencjalnie z wiekiem<br />
w błonie Brucha, półprzepuszczalnej błonie, która oddziela<br />
receptory od naczyń krwionośnych, wysoka wrażliwość<br />
45
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
wielonienasyconych kwasów tłuszczowych na działanie<br />
reaktywnych form tlenu i reakcje wolnorodnikowe. Wielonienasycone<br />
kwasy tłuszczowe z grupy omega-3 takie jak<br />
kwas dokozaheksaenowy (DHA) i kwas eikozapentaenowy<br />
(EPA) występują w wysokich stężeniach w siatkówce, gdzie<br />
pełnią szereg funkcji, np. strukturalnych, funkcjonalnych<br />
i ochronnych. DHA stanowi 50% wszystkich wielonienasyconych<br />
kwasów tłuszczowych występujących w zewnętrznych<br />
segmentach fotoreceptorów i stale uczestniczy w przemianach<br />
związanych z prawidłowym cyklem widzenia [29].<br />
Takie kwasy mogą oddziaływać na wiele procesów, np. proces<br />
angiogenezy, ekspresji genów oraz mogą pełnić funkcje<br />
regulatorów przeżywalności komórek siatkówki, zapaleń<br />
i równowagi energetycznej [6]. Warunki panujące w obszarze<br />
plamki (wysokie stężenie tlenu, działanie fototoksycznego<br />
niebieskiego zakresu widma światła) sprzyjają peroksydacji<br />
wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, co może<br />
być jedną z przyczyn niedoboru DHA prowadzącego do<br />
nieodwracalnych zmian morfologicznych i funkcjonalnych<br />
siatkówki i w konsekwencji do rozwoju AMD [30].<br />
Ze względu na nieznaną etiologię choroby nie możliwe<br />
jest leczenie przyczynowe AMD. Nie jest znane skuteczne<br />
leczenie postaci suchej, natomiast stosowane są różne metody<br />
spowolnienia naturalnego przebiegu postaci wysiękowej<br />
– neowaskularnej, takie jak: terapia fotodynamiczna, termiczna<br />
fotokoagulacja laserowa, termoterapia przezźreniczna<br />
oraz stosowanie związków o działaniu antyangiogennym<br />
(pegaptanib sodu – Macugen, bevacizumab – Avastin, ranibizumab<br />
– Lucentis, octan anekortawu – Retaane, acetonid<br />
triamcinolonu Kenalog). Niestety obecne sposoby leczenia<br />
wysiękowej postaci AMD nawet takie jak terapia fotodynamiczna<br />
i zastosowanie inhibitorów VEGF wykazują ograniczoną<br />
skuteczność [5, 6, 31]. Zgodnie z obecnym stanem<br />
wiedzy, jedyną metodą profilaktyki lub zahamowania istniejących<br />
procesów chorobowych w przypadku formy suchej<br />
AMD (90% przypadków) jest stosowanie odpowiedniej diety<br />
bogatej w owoce warzywa, ryby sprzyjającej obniżeniu<br />
poziomu cholesterolu. Zmiana stylu życia ma istotny wpływ<br />
na zmniejszenie zapadalności na AMD i postęp choroby.<br />
Dotyczy to zaprzestania palenia tytoniu, ograniczenia spożycia<br />
alkoholu, zwiększenia aktywności fizycznej, zmniejszenia<br />
masy ciała i stosowania antyoksydantów takich jak<br />
luteina i zeaksantyna. Ochronna rola luteiny i zeaksantyny<br />
wynika z faktu, że barwniki te gromadzą się wybiórczo<br />
w siatkówce oka, a w szczególności w plamce, gdzie są odpowiedzialne<br />
za nadawanie jej charakterystycznego żółtego<br />
zabarwienia. Barwniki te pełnią one rolę filtru światła, przez<br />
co zapobiegają inicjowanemu przez światło oksydacyjnemu<br />
uszkodzeniu struktur siatkówki. Wykazano, że zwiększenie<br />
ilości barwników plamkowych może opóźniać związane<br />
z wiekiem zmiany zachodzące w siatkówce. W profilaktyce<br />
AMD podkreśla się również korzyści wynikające ze stosowania<br />
WNKT z grupy omega-3 z jednoczesnym ograniczeniem<br />
podaży kwasów omega-6, współczynnik spożycia<br />
kwasów omega-3 w stosunku do omega-6 powinien wynosić<br />
4–5 : 1 [28, 30].<br />
Styl życia i sposób odżywiania są jednymi z najważniejszych<br />
czynników, na które można oddziaływać. W randomizowanych<br />
badaniach klinicznych AREDS, w których<br />
u badanych pacjentów stosowano codzienną suplementację<br />
diety składającą się z preparatów witamin C i E, beta karotenu,<br />
cynku i miedzi w różnych konfiguracjach w porównaniu<br />
z efektem placebo, stwierdzono zredukowane tempo<br />
rozwoju zaawansowanych postaci AMD o 25 % przez okres<br />
5 lat i w rezultacie obniżenie ryzyka pogorszenia wzroku<br />
o 19 % [29]. W programie badawczym AREDS nie ujęto<br />
jednak suplementacji karotenoidów tworzących barwnik<br />
plamki (luteiny i zeaksantyny), a jedynie beta karoten.<br />
Wpływ suplementacji diety ujawniał się najbardziej wśród<br />
pacjentów przyjmujących wszystkie antyoksydanty oraz<br />
cynk jednocześnie. Taka suplementacja diety nie jest wskazana<br />
dla wszystkich pacjentów, np. przy zwiększonej podaży<br />
beta karotenu może zwiększać się o 17 % względne ryzyko<br />
rozwoju raka płuc u palaczy [32]. Również wysokie dawki<br />
witaminy E zostały powiązane ze zwiększonym ryzykiem<br />
śmierci [33] i ze zwiększonym ryzykiem niewydolności serca<br />
wśród ludzi z cukrzycą albo chorobą sercową [34].<br />
W kohortowych badaniach populacyjnych Blue Mountain<br />
Eye Study, których celem była ocena związku między<br />
podstawową dietą i uzupełniającym podawaniem antyoksydantów<br />
a ryzykiem zachorowania na jakąkolwiek postać<br />
zwyrodnienia plamki związane z wiekiem w długotrwałej<br />
obserwacji. Zaobserwowano, że wśród uczestników, którzy<br />
charakteryzowali się wysokim spożyciem luteiny i zeaksantyny,<br />
występowało zredukowane ryzyko wystąpienia zlewających<br />
się druzów miękkich i rozwoju wysiękowej postaci<br />
AMD. Badanie to potwierdziło wnioski Age-Related Eye<br />
Disease Study dotyczące ochronnego wpływu cynku na<br />
rozwój AMD, ale nie potwierdziło ochronnego wpływu suplementacji<br />
beta-karotenu, a wręcz przeciwnie wskazało na<br />
wzrost ryzyka rozwoju wysiękowej postaci AMD. Zależność<br />
zwiększonego ryzyka rozwoju wysiękowej postaci AMD<br />
u osób z wysokim spożyciem beta-karotenu była potwierdzona<br />
zarówno w grupie osób palących tytoń, jak i w grupie<br />
osób niepalących [35]. W badaniach tych udowodniono także<br />
pozytywny wpływ kwasu DHA i spożycia ryb na zmniejszenie<br />
ryzyka wystąpienia wczesnych postaci AMD u osób spożywających<br />
ryby więcej niż raz w tygodniu [36, 37].<br />
W podeszłym wieku naturalny antyoksydacyjny system<br />
obronny oka ulega osłabieniu, czemu towarzyszy pogorszenie<br />
naturalnej bariery ochronnej oka przed szkodliwym<br />
wpływem procesów wolnorodnikowych indukowanych<br />
światłem. U starszych pacjentów coraz trudniejsze staje się<br />
utrzymanie właściwego poziomu luteiny i zeaksantyny jedynie<br />
za pomocą zwykłej diety. Może ono być wspomagane<br />
odpowiednią suplementacją. W aptekach dostępnych jest<br />
coraz więcej preparatów leczniczych i suplementów diety<br />
przeznaczonych do długotrwałego stosowania o działaniu<br />
profilaktycznym i leczniczym, które przy zmianie stylu życia<br />
i sposobu odżywiania mogą zmniejszać ryzyko zachorowania<br />
na AMD oraz hamować progresję choroby. Zgodnie z obecną<br />
wiedzą medyczną, optymalnie skomponowany preparat<br />
powinien zawierać, co najmniej jeden z dwóch naturalnych<br />
barwników plamki - luteinę i/lub zeaksantynę oraz przynajmniej<br />
jeden z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych<br />
omega-3 – EPA i/lub DHA. Ponadto preparat taki powinien<br />
zawierać witaminy C i E, które zapobiegają wolnorodnikowemu<br />
utlenianiu z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych<br />
oraz mikroelementy - cynk, selen i miedź, które warunkują<br />
prawidłowe działanie enzymów antyoksydacyjnych.<br />
46
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
Piśmiennictwo<br />
1. Bunce C, Wormald R. Causes of blind certifications in England<br />
and Wales: April 1999-March 2000. Eye 2008; 22:<br />
905-911.<br />
2. Smith W i wsp. Risk factors for age-related macular degeneration:<br />
Pooled findings from three continents. Ophthalmology<br />
2001; 108: 697-704.<br />
3. McConnell V, Silvestri G. Age-related macular degeneration.<br />
Ulster Med J 2005; 74: 82–92.<br />
4. de Jong PT. Age-related macular degeneration. N Engl J<br />
Med 2006; 355: 1474–1485.<br />
5. Jager RD, Mieler WF, Miller JW. Age-Related Macular<br />
Degeneration. NEJM 2008; 358: 2606-2617.<br />
6. Coleman HR i wsp. Age-related macular degeneration.<br />
Lancet 2008; 372: 1835–1845.<br />
7. Seddon JM i wsp. The US twin study of age-related macular<br />
degeneration: relative roles of genetic and environmental<br />
influences. Arch Ophthalmol 2005; 123: 321-327.<br />
8. Seddon JM i wsp. CFH gene variant, Y402H, and smoking,<br />
body mass index, environmental associations with<br />
advanced age-related macular degeneration. Hum Hered<br />
2006; 61: 157-165.<br />
9. Duan Y i wsp. Age-related macular degeneration is associated<br />
with incident myocardial infarction among elderly<br />
Americans. Ophthalmology 2007; 114: 732-737.<br />
10. Francis PJ i wsp. The LOC387715 gene, smoking, body mass<br />
index, environmental associations with advanced age-related<br />
macular degeneration. Hum Hered 2007; 63: 212-218.<br />
11. Ambati J i wsp. Age-related macular degeneration: etiology,<br />
pathogenesis, and therapeutic strategies. Surv Ophthalmol<br />
2003; 48: 257-293.<br />
12. Kanda A, Abecasis G, Swaroop A. Inflammation in the<br />
pathogenesis of age-related macular degeneration. Br J<br />
Ophthalmol 2008; 92: 448-450.<br />
13. Guymer RH, Wei-Tinn Chong E. Modifiable risk factors<br />
for age-related macular degeneration Med J Austral<br />
2006; 184: 455-458.<br />
14. Klein R i wsp. Prevalence of age-related macular degeneration<br />
in 4 racial/ethnic groups in the Multi-ethnic Study<br />
of Atherosclerosis. Ophthalmology 2006; 113: 373-380.<br />
15. Haines JL i wsp. Complement factor H variant increases<br />
the risk of age-related macular degeneration. Science<br />
2005; 308: 419-421.<br />
16. Gold B i wsp. Variation in factor B (BF) and complement<br />
component 2 (C2) genes is associated with age-related<br />
macular degeneration. Nat Genet 2006; 38: 458–462.<br />
17. Yates JR i wsp. Complement C3 variant and the risk of<br />
age-related macular degeneration. N Engl J Med 2007;<br />
357: 533–561.<br />
18. Rivera A i wsp. Hypothetical LOC387715 is a second major<br />
susceptibility gene for age-related macular degeneration,<br />
contributing independently of complement factor H<br />
to disease risk. Hum Mol Genet 2005; 14: 3227-3236.<br />
19. Seddon JM i wsp. Association of CFH Y402H and<br />
LOC387715 A69S with progression of age-related macular<br />
degeneration. JAMA 2007; 297: 1793-1800.<br />
Adres do korespondencji:<br />
dr n. farm. Alicja Zajdel<br />
Katedra i Zakład Biofarmacji SUM<br />
ul. Narcyzów 1, 41-200 Sosnowiec<br />
tel. 32 364-10-63, e-mail: azajdel@sum.edu.pl<br />
20. Beatty S i wsp. The role of oxidative stress in the pathogenesis<br />
of age-related macular degeneration. Surv Ophthalmol<br />
2000; 45: 115–134.<br />
21. Wong RW i wsp. Iron toxicity as a potential factor in<br />
AMD. Retina 2007; 27: 997-1003.<br />
22. Tan JS i wsp. Cardiovascular risk factors and the long-term<br />
incidence of age-related macular degeneration: the Blue Mountains<br />
Eye Study. Ophthalmology 2007; 114: 1143-1150.<br />
23. Chakravarthy U i wsp. Cigarette smoking and age-related<br />
macular degeneration in the EUREYE Study. Ophthalmology<br />
2007; 114: 1157-1163.<br />
24. Schmidt S i wsp. Cigarette smoking strongly modifies<br />
the association of LOC387715 and age-related macular<br />
degeneration. Am J Hum Genet 2006; 78: 852-864.<br />
25. Esparza-Gordillo J i wsp. Genetic and environmental<br />
factors influencing the human factor H plasma levels.<br />
Immunogenetics 2004; 56: 77-82.<br />
26. Hyman L i wsp. Hypertension, cardiovascular disease,<br />
and age-related macular degeneration. Age-Related Macular<br />
Degeneration Risk Factors Study Group Arch Ophthalmol<br />
2000; 118: 351-358.<br />
27. Guymer RH i wsp. HMG CoA reductase inhibitors (statins):<br />
do they have a role in age-related macular degeneration?<br />
Surv Ophthalmol 2005; 50: 194-206.<br />
28. Chong E, Sinclair AJ, Guymer RH. Facts on fats. Clin<br />
Exp Ophthalmol 2006; 34: 464–471.<br />
29. Age-Related Eye Disease Study Research Group. A randomized,<br />
placebo-controlled, clinical trial of high-dose supplementation<br />
with vitamins C and E, beta carotene, and zinc for<br />
age-related macular degeneration and vision loss: AREDS<br />
report no. 8. Arch Ophthalmol 2001; 119: 1417-1436.<br />
30. Kowalski M, Borucka AI, Szaflik J. Kwasy omega-3 w<br />
profilaktyce zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem.<br />
Forum Medycyny Rodzinnej 2008; 2: 309–313.<br />
31. Okruszko A i wsp. The results of wet AMD treatment by<br />
intravitreal injections – preliminary report. Klin Oczna<br />
2007; 109: 389-393.<br />
32. The Alpha-Tocopherol, Beta Carotene Cancer Prevention<br />
Study Group. The effect of vitamin E and beta carotene<br />
on the incidence of lung cancer and other cancers in<br />
male smokers. N Engl J Med 1994; 330: 1029-1035.<br />
33. Miller ER i wsp. Meta-analysis: high-dosage vitamin E<br />
supplementation may increase all-cause mortality. Ann<br />
Intern Med 2005; 142: 37-46.<br />
34. Lonn E i wsp. Effects of long-term vitamin E supplementation<br />
on cardiovascular events and cancer: a randomized<br />
controlled trial. JAMA 2005; 293: 1338-1347.<br />
35. Tan JS i wsp. Dietary antioxidants and the long-term incidence<br />
of age-related macular degeneration: the Blue Mountains<br />
Eye Study. Ophthalmology 2008; 115: 334-341.<br />
36 SanGiovanni JP i wsp. The relationship of dietary lipid intake<br />
and age-related macular degeneration in a case-control study:<br />
AREDS report no. 20. Arch Ophthalmol 2007; 125: 671-679.<br />
37. Augood i wsp. Oily fish consumption, dietary docosahexaenoic<br />
acid and eicosapentaenoic acid intakes, and<br />
associations with neovascular age-related macular degeneration.<br />
Am J Clin Nutr 2008; 88: 398-406.<br />
47
Farm Przegl Nauk, 2009,8<br />
INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OF<br />
MANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY<br />
1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewed<br />
transdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicine<br />
and related sciences. The journal publishes conference<br />
reports and materials, conference announcements, as well as<br />
letters to the Editor.<br />
2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printed<br />
and an electronic form. Electronic versions of articles are to be<br />
sent to kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl or supplied on<br />
CD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagrams<br />
and figures) should be addressed to:<br />
Scientific Review in Pharmacy<br />
41-200 Sosnowiec<br />
ul. Jedności 8<br />
Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345<br />
Fax: +48 32 364 11 58<br />
Disk label should contain the first name(s) and surname(s)<br />
of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphics<br />
should be included in separate files. Do not paste pictures and<br />
graphics to text files. The Editor advises to use Star Office,<br />
Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *.<br />
TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi.<br />
3. All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief.<br />
The Authors are encouraged to suggest their reviewers,<br />
however the final selection of a reviewer is up to the Editorial<br />
Board. The Editors-in-Chief reserves the right to correct or<br />
abbreviate the text (after the Author’s approval).<br />
Authors are requested to resubmit the revised manuscript<br />
within four weeks. Papers that are not resubmitted within<br />
four weeks will be treated as a new submission.<br />
The manuscript that has been rejected by the Scientific<br />
Review in Pharmacy should not be resubmitted.<br />
4. A cover letter should be included with the manuscript, containing<br />
a declaration that the manuscript has not been previously<br />
published in print or electronic format and is not under consideration<br />
by another journal or electronic medium, signed by all<br />
the Authors. It should also include written approval from the<br />
head of the institution in which the study was conducted.<br />
5. All human and animal research will have obtained ethical consent<br />
from the local Bioethical or Ethical Committee.<br />
6. The material sent in and the review will remain among the<br />
documentation of the Board of Editors.<br />
7. Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the whole<br />
of the copyrights for the published papers (including the right<br />
to publishing in print, on electronic media, such as CD-ROM<br />
disks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries is<br />
allowed without any written permission of the Editor.<br />
8. Instructions for authors:<br />
8.1. Manuscript Page Setup<br />
• Paper: white, A4 format.<br />
• Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom)<br />
• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points.<br />
• Text: Double-spaced, one side of the page only.<br />
• Numbering: Insert page numbers at bottom right of each<br />
page.<br />
• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extra<br />
line space between paragraphs.<br />
• Subheads: All subheads should be flush with the left margin,<br />
with one line above. Indent first line after a subhead. Use an<br />
extra line space between the subhead and the text.<br />
• Title or Heading of the article: boldface, on separate<br />
line.<br />
• Second-level subhead: boldface, on separate line.<br />
• Third-level subhead: italic, on separate line.<br />
8.2. Organization of Manuscript<br />
• Title page should include: submission date and Author(s)<br />
full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’<br />
full current affiliations (for papers with multiply authors,<br />
please e<strong>numer</strong>ate the authors and their affiliations in the<br />
following way: Author 1 , Author 2 , etc; 1 Affiliation, 2 Affiliation,<br />
etc.). Affiliations should contain the full name of the institution.<br />
One corresponding author must be designated for<br />
papers with coauthors. At the bottom of the page the full<br />
name, academic degrees/titles, and address of the corresponding<br />
author should be given, including the telephone<br />
number, fax number and/or e-mail address. If research<br />
has been funded, please indicate the source of funding<br />
(including grant index/symbol, grant agencies, corporations,<br />
or sponsors).<br />
• The second page should include an abstract (150-250<br />
words). The abstract must be self-contained, and must not<br />
require reference to the paper to be understood. The abstract<br />
should present objectives and scope of the study or<br />
reasons for writing the paper. The methods and techniques<br />
or approaches should be described only to the extent necessary<br />
for comprehension. The findings and conclusions<br />
should be concise and informative. The abstract should<br />
be followed by the key words consistent with the Medical<br />
Subject Headings Index Medicus, and should not contain<br />
unfamiliar terms that are not defined, undefined acronyms<br />
and reference citations. Neither displayed equations or<br />
lists should appear in the abstract.<br />
• Body text should be organized as follows:<br />
original paper - introduction, material and methods descriptions,<br />
research results, discussion;<br />
review papers – free structure;<br />
case studies – introduction (motivation for the study), case<br />
descriptions, discussion of the characteristic symptoms,<br />
treatment results etc.<br />
• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-white<br />
photographs) should be put into a separate envelope. On<br />
each figure there should be its number (Arabic <strong>numer</strong>als),<br />
the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking.<br />
Figure captions should be placed on separate pages and<br />
numbered consecutively using Arabic <strong>numer</strong>als. Previously<br />
published visual materials should be supplied together<br />
with the written consent of the Publisher for reprint.<br />
• Tables, each on a separate page, should be numbered<br />
using Roman <strong>numer</strong>als and preceded by their captions.<br />
Table captions should be placed on separate pages, numbered<br />
using Roman <strong>numer</strong>als.<br />
• The papers should not exceed the following limitations:<br />
original and review work – 10 pages and others – 5 pages.<br />
8.3. References to the works cited should be presented at the<br />
end of the paper and arranged according to the sequence<br />
of citations in the body text. The acronyms for journal titles<br />
should be used according to Index Medicus. Each entry,<br />
starting with a new line, should be given a number and<br />
must be presented as follows:<br />
• journal citation:<br />
Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic<br />
multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117:<br />
557-67.<br />
If there are more than three authors, the name of the first<br />
one should be given, followed by an ,,et al” annotation.<br />
Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associated<br />
changes in the serum lysosomal glycosidases activity and<br />
glycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331:<br />
97-102.<br />
• the specific chapter:<br />
Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. Biochemia<br />
Harpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.<br />
Warszawa 1994, 59-69.<br />
• monograph:<br />
Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw<br />
2004.<br />
References to the works cited within the text should be numbered<br />
using Arabic <strong>numer</strong>als and placed between brackets,<br />
e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations:<br />
original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliography<br />
entries.<br />
48
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM<br />
1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowane<br />
prace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe,<br />
z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych.<br />
Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na temat<br />
konferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji.<br />
2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłać<br />
w formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@<br />
kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CD-<br />
ROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego<br />
(z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji:<br />
<strong>Farmaceutyczny</strong> Przegląd <strong>Naukowy</strong><br />
41-200 Sosnowiec<br />
ul. Jedności 8<br />
Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345<br />
Fax: +48 32 364 11 58<br />
Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów)<br />
i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory.<br />
Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych.<br />
Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word,<br />
Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor:<br />
CMYK, rozdzielczość 300 dpi.<br />
3. Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych<br />
każdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca się<br />
autorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcja<br />
zastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta,<br />
jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu<br />
z autorem).<br />
Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu,<br />
zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającym<br />
czterech tygodni. W przeciwnym razie<br />
praca będzie traktowana jako nowa publikacja.<br />
Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta nie<br />
może być ponownie przedkładany Redakcji Farmaceutycznego<br />
Przeglądu Naukowego.<br />
4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie była<br />
uprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcji<br />
innego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawierać<br />
również podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodę<br />
Kierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie<br />
publikacji w czasopiśmie.<br />
5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, które<br />
są przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, muszą<br />
mieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej.<br />
6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji<br />
Redakcji.<br />
7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskich<br />
do wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, na<br />
nośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszcza<br />
się natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy.<br />
8. Instrukcje dla autorów<br />
8.1. Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu:<br />
• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, na<br />
białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnego<br />
odstępu między kolejnymi wierszami.<br />
• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny).<br />
• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt.<br />
• Numeracja stron – kolejne <strong>numer</strong>y stron, począwszy od<br />
strony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnym<br />
rogu.<br />
• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowych<br />
odstępów pomiędzy kolejnymi akapitami.<br />
• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównane<br />
do lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstem<br />
należy wprowadzić jeden odstęp.<br />
• Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką.<br />
• Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubioną<br />
czcionką.<br />
• Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochyloną<br />
czcionką,<br />
8.2 Układ manuskryptu<br />
• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora-<br />
(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowych<br />
przy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afiliację<br />
każdego z nich, w następujący sposób Autor 1 , Autor 2 ,<br />
…; 1 Afiliacja, 2 Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim,<br />
nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca.<br />
U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres,<br />
telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję,<br />
dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanych<br />
prosimy o wskazanie źródła finansowania (w tym<br />
<strong>numer</strong>y dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lub<br />
sponsorów).<br />
• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie<br />
(150-250 słów w języku polskim i angielskim), będące<br />
autonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczać<br />
odnośników literaturowych. Streszczenie powinno<br />
zawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawowe<br />
procedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych,<br />
metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Pod<br />
streszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w języku<br />
polskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject Headings<br />
Index Medicus.<br />
• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały,<br />
według następującego schematu:<br />
prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań,<br />
dyskusja oraz wnioski;<br />
prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziały<br />
i podrozdziały;<br />
prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby,<br />
charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp.<br />
• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe)<br />
powinny być umieszczone w osobnej kopercie, po<strong>numer</strong>owane,<br />
opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy,<br />
z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać na<br />
oddzielnej stronie z <strong>numer</strong>ami ilustracji podanymi cyframi<br />
arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane,<br />
należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy na<br />
ponowną publikację.<br />
• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należy<br />
po<strong>numer</strong>ować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułami<br />
umieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać na<br />
oddzielnej stronie z <strong>numer</strong>ami tabel, podanymi cyframi<br />
rzymskimi.<br />
• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinna<br />
wynosić 10, a pozostałych – 5 stron.<br />
8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowania<br />
w tekście pracy.<br />
Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z Index<br />
Medicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza,<br />
powinna być opatrzona <strong>numer</strong>em oraz zredagowana<br />
zgodnie z niżej podanym przykładem:<br />
• czasopismo naukowe:<br />
np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic<br />
multisystem fibrotic<br />
disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.<br />
Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać<br />
nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.<br />
np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associated<br />
changes in the serum lysosomal glycosidases activity<br />
and the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003;<br />
331: 97-102.<br />
• wydawnictwo zbiorowe:<br />
np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia<br />
Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie<br />
PZWL. Warszawa 1994, 59-69.<br />
• monografia:<br />
np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław<br />
2004.<br />
Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych,<br />
powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1].<br />
Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach<br />
oryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do<br />
10 pozycji.<br />
49
<strong>Farmaceutyczny</strong><br />
PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH<br />
Miesięcznik<br />
WYDAWCA<br />
Przegląd <strong>Naukowy</strong><br />
Scientific Review in Pharmacy<br />
IC Value - Current 3.66<br />
MNiSW 4<br />
PRENUMERATA<br />
Prosimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literami<br />
i dokonanie wpłat na poczcie lub w banku.<br />
Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu.<br />
Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej pre<strong>numer</strong>aty<br />
otrzymają Państwo po około 2 tygodniach<br />
od dokonania wpłaty.<br />
Dodatkowych informacji udziela Dział Pre<strong>numer</strong>aty<br />
i Kolportażu:<br />
Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiego<br />
ul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Biała<br />
TEL. 033 817 38 99<br />
Nr rachunku odbiorcy:<br />
0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158<br />
ODBIORCA:<br />
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego<br />
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2<br />
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158<br />
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego<br />
ul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Biała<br />
kwota:.......................................................................................<br />
wpłacający:..............................................................................<br />
.................................................................................................<br />
.................................................................................................<br />
Zamawiam<br />
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY<br />
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY<br />
Nr ............<br />
Nr rachunku odbiorcy:<br />
0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158<br />
ODBIORCA:<br />
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego<br />
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2<br />
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158<br />
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego<br />
ul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Biała<br />
kwota:.......................................................................................<br />
wpłacający:..............................................................................<br />
.................................................................................................<br />
.................................................................................................<br />
Zamawiam<br />
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY<br />
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY<br />
Nr ............