PokaÅ¼ caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄd Naukowy

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 

Farmaceutyczny 

www.fpn.info.pl 

Cena 24,50 zł 

PISMO POD PATRONATEM 

Przegląd 

WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU 

Naukowy 

MEDYCZNEGO W KATOWICACH IC Value - Current 3.66 

MNiSW 4 

ROK VI (X) 

Nr 8/2009 (55) 

Miesięcznik 

Scientific Review in Pharmacy 

Badanie zależności pomiędzy strukturą 

i działaniem pochodnych benzodiazepiny. 

Część III. Pochodne benzodiazepiny działające 

na receptor benzodiazepinowy (BDZ-R)0 

Ekspresja żelatynaz A i B oraz inwazyjność 

komórek raka płuc i raka pęcherza moczowego 

w hodowlach in vitro 0traktowanych 

wybranymi tetracyklinami 

Przeciwbakteryjne działanie galanginy 

zawartej w propolisie 

w stosunku do bakterii Gram-dodatnich0 

Wpływ wodnego ekstraktu 

z kłączy Iris dichotoma Pall 

na aktywność mitotyczną 

ocenianą testem allium 

Białko ORP150 zapobiega degradacji kolagenu 

w hodowlach fibroblastów skóry ludzkiej 

w przebiegu głodzenia 

Rola cynku w zaburzeniach smaku 

Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (AMD) 

– czynniki ryzyka i profilaktyka 

0 

ISSN 1425-5073 

1


PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH 

Miesięcznik 

Przegląd Naukowy 


Index Copernicus 3,66 

MNiSW 4 

Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief: 

Prof. dr hab. Krystyna Olczyk 

Adres redakcji / Editorial Adress: 

ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / Poland 

Tel. +48 32 364 11 50, +48 514 342 345 

Fax. + 48 32 364 11 58 

E-mail: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl 

Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board 

Przewodniczący / Head: 

Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec 

Członkowie / Members: 

Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok 

Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja 

Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków 

Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa 

Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź 

Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania 

Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja 

Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin 

Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań 

Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja 

Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia 

Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria 

Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary: 

Dr n. med. Robert D. Wojtyczka 

E-mail: fpn@kwiecinski.pl 

Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków 

Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin 

Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec 

Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice 

Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia 

Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa 

Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok 

Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław 

Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin 

Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia 

Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja 

Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk 

Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia 

Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board: 

Dr n. farm. Paweł Olczyk 

Dr n. biol. Małgorzata Kępa 

Mgr Anna Szeremeta 

Mgr Agnieszka Jura – Półtorak 

Dr n. hum. Anna Kierczak 

Wydawca / Publisher: 

Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego 

Adres Wydawcy / Publisher Adress: 


ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Poland 

tel. +48 33 817 28 79, fax +48 33 817 36 31 

Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.) 

Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Skład / Technical Editor: 

Agnieszka Romańska Robert Cyganik Jerzy Partyka 

E-mail: agnieszka.romanska@kwiecinski.pl 

Nakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copies 

Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. 

Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education. 

Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. 

Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach 

z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania 

nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą 

wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja 

nie odpowiada. 

All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright 

laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the 

rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints 

are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for 

advertisements and reader letters.

Zdj. Zygmunt Wieczorek 

Szanowni Państwo, 

Koleżanki i Koledzy, 

Drodzy Czytelnicy 

I znowu parę słów do Państwa, i tym razem także z dobrymi 

dla naszego środowiska wieściami. 

Zaczynamy lekturę bieżącego numeru Farmaceutycznego 

Przeglądu Naukowego od zapowiedzi znaczącego wydarzenia 

w świecie młodych farmaceutów, jakie będzie miało 

miejsce wiosną przyszłego roku, tj. Dorocznego Kongresu 

Europejskiego Stowarzyszenia Studentów Farmacji – EPSA 

(European Pharmaceutical Students’ Association). EPSA 

reprezentuje 120 tys. studentów farmacji w 32 krajach europejskich. 

Celem EPSA jest rozwój interesów europejskich 

studentów farmacji oraz zachęcanie do kontaktów i do wzajemnej 

współpracy. 

33 rd EPSA Annual Congress odbędzie się w Krakowie, 

w dniach 22 kwiecień – 2 maj 2010 r. Motto nadchodzącego 

Kongresu to: Patients, generics and counterfeiting 

– facing the pharmaceutical challenges of today. Tym razem 

środowisko studentów farmacji z innych krajów Europy 

powierzyło studentom z Polski zaszczytny obowiązek zorganizowania 

najbliższego Kongresu. Tegoroczny Kongres 

EPSA organizowany jest przy współpracy z Zespołem Sekcji 

Studenckich Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego 

– Młodą Farmacją. 

Pełniąc z ramienia Prezydium Zarządu Głównego Polskiego 

Towarzystwa Farmaceutycznego funkcję Opiekuna 

Młodej Farmacji, staram się wspomóc Organizatorów Kongresu 

w pozyskiwaniu funduszy na zabezpieczenie coraz 

wyższych kosztów konferencyjnych. Co najważniejsze, 

Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne wspiera, i finansowo 

i logistycznie, nadchodzące Przedsięwzięcie. 

Sami studenci pracują niezwykle intensywnie, wykazując 

ogrom samodzielności, inwencji i zasługującego na 

uznanie – zaangażowania. Życzymy studentom powodzenia, 

wielu inspirujących przeżyć naukowych oraz udanych 

spotkań towarzyskich. Nadchodzący Kongres przyczyni się 

z pewnością do dalszego zacieśnienia wakacyjnych wymian 

studenckich, poszerzenia zakresu odbywania praktyk zawodowych 

oraz do zintensyfikowania mobilności studentów 

w ramach realizacji programu studiów. 

Wracając do naszego bieżącego numeru – zapraszam 

do lektury kolejnych artykułów. Cieszy niezmiernie coraz 

większe zainteresowanie czasopismem ze strony wybitnych 

Profesorów i Autorów Prac, którzy powierzają swoje prace 

Farmaceutycznemu Przeglądowi Naukowemu. 

W bieżącym numerze, obok prac, które powstały 

w Śląskim Uniwersytecie Medycznym w Katowicach, publikujemy 

prace z Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku 

i Łodzi, a także w Lublinie – w kooperacji z Uniwersytetem 

Medycznym w Warszawie i ośrodkami zagranicznymi. 

Szanowni Państwo. Nieustająco zapraszam na łamy Farmaceutycznego 

Przeglądu Naukowego. Uzupełniamy zaległości 

wydawnicze. Musimy zdążyć uporać się z zaległościami 

do końca bieżącego roku. Mam nadzieję, iż prac nam 

nie zabraknie, a Państwo dostrzegą korzyści, wypływające 

z umieszczania prac w naszym wspólnym czasopiśmie. Jeszcze 

trochę cierpliwości i może uda nam się publikować prace 

z zagranicy. Odpowiednie kroki zostały już przedsięwzięte. 

Życzmy sobie sukcesu, a na razie, pracujmy na niego 

sami, by stał się on także i naszym udziałem i zasługą. 

Z serdecznymi pozdrowieniami, 

Redaktor Naczelny 

Prof. dr hab. Krystyna Olczyk



Miesięcznik 



Nr 8 / 2009 

Index Copernicus 3,66 

MNiSW 4 

Spis treści 




na receptor benzodiazepinowy (BDZ-R)0 8 

Structure-Activity Relationship of Benzodiazepine Derivatives. Part III. 

Benzodiazepine Derivatives with Benzodiazepine-Receptor Affinities 

Ekspresja żelatynaz A i B oraz inwazyjność komórek raka płuc i raka pęcherza moczowego 

w hodowlach in vitro 0traktowanych wybranymi tetracyklinami 17 

Expression of Gelatinases A and B and The Invasiveness 0 

of in vitro Cultured Lung Cancer and Bladder Cancer Cells 0 

Treated with Selected Tetracyclines 

Przeciwbakteryjne działanie galanginy zawartej w propolisie 

w stosunku do bakterii Gram-dodatnich0 24 

The antibacterial activity of galangin in propolis 

against Gram-possitive bacteria 

Wpływ wodnego ekstraktu z kłączy Iris dichotoma Pall 

na aktywność mitotyczną ocenianą testem allium0 27 

Influence of the water extract from rhizome of Iris dichotoma Pall 

on the mitotic activity of allium test cells0 


w hodowlach fibroblastów skóry ludzkiej w przebiegu głodzenia 0 32 

Oxygen regulated protein 150 prevents collagen degradation 

in glucose-deprived fibroblasts0 

Rola cynku w zaburzeniach smaku0 39 

The Role of Zinc in Taste Disorders 


– czynniki ryzyka i profilaktyka 43 

Age-related macular degeneration (AMD) 

– risk factors and prophylaxis0

Farm Przegl Nauk, 2009,8, 7-11 


33 rd European Pharmaceutical Students’ Association 

Annual Congress, 

April 26 th – May 2 nd 2010, Krakow, Poland 

European Pharmaceutical Students’ Association (EPSA) represents over 120,000 Pharmacy students 

in 32 European countries. 

The original objectives of EPSA were established in 1982, and were expanded and updated at the 21st EPSA 

congress in Alcala de Henares and Madrid, Spain in 1998, when the whole structure of EPSA was revised. 

The main aim of EPSA is to: 

“Develop the interests and opinions of European Pharmacy students 

and to encourage contact and co-operation between them” 

There are several ways in which EPSA acts in order to fulfill this aim:z 

- Maintenance of a permanent web of contact and exchange of information for and between Pharmacy students 

and their representative organizations 

- Development of a campaign to increase the mobility of European Pharmacy students particularly for periods 

of academic, practical or research work abroad 

- Development of a consensus of opinion between European Pharmacy students on Pharmacy Education and on 

other 

issues relevant to their interests and the profession of Pharmacy 

- Development and organization of activities supported by the above opinions which serve to increase the profile 

of Pharmacy students and the profession 

- Organization of events in accordance with the specification of the Regulations, Standing Orders and Handbook 

of the Association 

- Support and/or organization of any other activities deemed to be in keeping with the EPSA’s aims 

Annual Congress 

The EPSA Annual Congress is the biggest and most important event in the EPSA calendar. This is an opportunity for 

all the EPSA members to meet and discuss EPSA and the Pharmacy profession in general. The EPSA Annual Congress 

consists of an educational program, General Assemblies and a social program. The event lasts for a week. The EPSA 

Annual Congress is also a chance for the delegates from all the Member Organizations to come together to refuel their 

spirit and enthusiasm for the upcoming year. 

EPSA organizes workshops and trainings during this event, covering these fields: Humanitarian, Pharmacy Education, 

Pharmacy Awareness, Professional Development, Public Health, Mobility and Pharmaceutical Sciences 

During the Annual Congress the new team of EPSA is elected for a one-year mandate by the Ordinary Members of 

EPSA. A yearly report from each mandate in EPSA is presented and voted upon by the officials. 

The Social Program consists of different things from congress to congress, and it is always exciting and fun. 

The 33 rd EPSA Annual Congress is held by Students’ Section of Polish Pharmaceutical Society “Young Pharmacy” 

in Krakow, Poland from April 26 th to May 2 nd 2010. The topic of the event is Patents, generics and counterfeiting 

- facing the pharmaceutical challenges oftoday. 

More information about EPSA and its projects you can find on the website: www.epsa-online.org 

Krzysztof Nesterowicz 

EPSA Annual Congress 2010 Organizing Committee Chairperson 

Contact: krzysztof.nesterowicz@gmail.com 

7





na receptor benzodiazepinowy (BDZ-R)* 

Structure-Activity Relationship of Benzodiazepine Derivatives. Part III. 

Benzodiazepine Derivatives with Benzodiazepine-Receptor Affinities. 

Elżbieta Brzezińska, Piotr Włodno 

Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Medycznej, 

Wydział Farmaceutyczny Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 

Streszczenie 

Przeprowadzono analizę ilościowej zależności pomiędzy 

strukturą i działaniem (QSAR) 69 pochodnych 5-fenylo- 

1,4-benzodiazepin-2-on działających na receptor benzodiazepinowy 

(BDZ-R). W analizie zastosowano parametry 

fizykochemiczne badanych związków obliczone z zastosowaniem 

metody pół-empirycznej PM3. Zastosowano 

analizę regresji wielokrotnej (MR), analizę skupień (CA) 

i analizę funkcji dyskryminacyjnej (DFA) w celu wyłonienia 

grupy zmiennych klasyfikujących pochodne benzodiazepiny 

zgodnie z poziomem ich aktywności biologicznej. 

Dzięki zastosowaniu analizy MR ustalono istotną rolę 

parametrów: V (objętość cząsteczki), HA (liczba wiązań 

wodorowych), Md (moment dipolowy), halo, Cl, I (liczba 

podstawników halogenowych) i %PSA (powierzchnia 

polarna cząsteczki) dla aktywności biologicznej badanych 

związków. Istotne równanie regresji wieloczynnikowej 

uzyskane w MR zawiera parametry użyte w metodach CA 

i DFA. Analizy DFA i CA wykazały, że parametry: V, HA 

i %PSA są odpowiedzialne za klasyfikację związków jako 

silnie i słabo działające. Zdolność przekraczania bariery 

krew-mózg odgrywa ważną rolę w tej klasyfikacji. 

Słowa kluczowe: ilościowa zależność pomiędzy struktura 

i aktywnością; analiza regresji; analiza funkcji dyskryminacyjnej; 

analiza skupień; pochodne benzodiazepiny 

Wstęp 

Podstawowe działanie benzodiazepin jest związane 

z centralnym układem nerwowym, a najliczniejszą grupę 

stanowią pochodne 1,4-benzodiazepiny. Stanowią one najważniejszą 

grupę leków uspokajających. Podstawowy mechanizm 

działania tych leków związany jest z istnieniem 

specyficznych miejsc wiązania w obrębie receptorów GA- 

BA A 

-ergicznych. Określenie tych miejsc jako receptorów 

benzodiazepinowych (BDZ-R) ma raczej charakter umowny 

Abstract 

A quantitative structure-activity relationship (QSAR) 

analysis of 69 5-fenyl-1,4-benzodiazepin-2-one derivatives 

with benzodiazepine-receptor affinities was carried 

out. The semi-empirical method PM3 was employed to 

calculate a set of physicochemical parameters for investigated 

compounds. The Multiple Regression analysis 

(MR), Cluster Analysis (CA), and Discriminant Function 

Analysis (DFA) were employed to reduce dimensionality 

and investigate which subset of variables is effective for 

classifying the benzodiazepine derivatives according to 

their biological activity degree. By using the MR we have 

found the important role of the parameters: V (molecular 

volume), HA (number of hydrogen bounds), Md (dipole 

moment), halo, Cl, I (number of halogen substituents) 

and %PSA (polar surface area) of investigated benzodiazepines 

for their activity. The relationship involved the 

parameters used in CA and DFA methods. The DFA and 

CA methods showed that the parameters V, HA and %PSA 

are responsible for separation between compounds with 

higher and lower activity. The blood-brain barrier permeability 

plays very important role in this classification. 

Key words: quantitative structure-activity relationship; 

regression, discriminant and cluster analysis, benzodiazepine 

derivatives 

i może być uważana za błędną [1]. Działanie tych związków 

polega na nasileniu hamujących funkcji GABA-ergicznych 

neuronów. BDZ-R jest częścią receptora GABA A 

[2,3]. Ligandy 

tych miejsc wiążących mogą się różnić zdolnością do 

aktywacji receptora. Do uzyskania działania przeciwlękowego 

potrzebna jest mniejsza całkowita aktywacja receptora 

w porównaniu do aktywacji całkowitej receptora potrzebnej 

do wywołania działania uspokajającego i miorelaksującego 

[4]. Budowa chemiczna tych benzodiazepin charakteryzuje 

się obecnością pierścienia heterocyklicznego skondensowa- 

*Badania wykonano w ramach tematu badawczego finansowanego przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi 

Nr 502-13-626 

8


nego jest z pierścieniem benzenowym podstawionym chlorem 

w położeniu C7. Pierwowzorem struktury jest pochodna 

typu amidyny – chlordiazepoksyd. Natomiast wprowadzenie 

w miejsce ugrupowania amidynowego struktury laktamowej 

dało najbardziej reprezentatywne leki tej grupy, które można 

traktować, jako analogi diazepamu. Obecność ugrupowania 

N-metylowego w położeniu C2 chlordiazepoksydu prowadzi 

do powstania rozpuszczalnego w wodzie chlorowodorku. 

Grupę metylową przy atomie azotu ugrupowania laktamowego 

diazepamu, która warunkuje zwiększoną aktywność 

w porównaniu z analogami niepodstawionymi, można 

zastąpić ugrupowaniem o podwyższonej lipofilowości, np. 

cyklopropylometylowym (prazepam) lub trifluorometylowym 

(halazepam) [5]. Atom chloru w położeniu C7 w istotny 

sposób decyduje o właściwościach przeciwlękowych 

i uspokajających. Jego zamiana na atom bromu nie wpływa 

znacząco na profil aktywności farmakologicznej. Zamiana 

atomu chloru w położeniu C7 na grupę nitrową powoduje 

zasadniczą zmianę aktywności ośrodkowej. Leki pochodne 

7-nitrodemetylodiazepamu: nitrazepam, klonazepam i flunitrazepam 

stosowane są jako środki o działaniu nasennym 

i przeciwdrgawkowym. Do układu benzodiazepiny może 

być dołączony trzeci pierścień heterocykliczny. Najczęściej 

skutkuje to nasileniem działania nasennego. Mimo różnej 

od pochodnych 1,4-benzodiazepiny budowy chemicznej, 

1,5-benzodiazepiny wykazują podobny profil aktywności 

biologicznej. Zwraca się uwagę na ich podobieństwo we 

fragmencie N1, C2 i C3 do diazepamu (klobazam, triflubazam). 

Preparaty te działają silnie przeciwlękowo Jedynym 

lekiem z grupy 2,3-benzodiazepiny jest tofizopam, który odbiega 

strukturalnie od pochodnych 1,4- i 1,5-benzodiazepin, 

jego działanie farmakologiczne jest jednak zbliżone. 

Przeprowadzono wiele analiz QSAR dotyczących pochodnych 

1,4-benzodiazepiny o działaniu diazepamo-podobnym. 

Na podstawie analiz [6,7] stwierdzono zależność 

wprost proporcjonalną aktywności od lipofilowości (log P). 

Podsumowaniem przeglądu analiz QSAR [8] może być potwierdzenie 

znaczenia cech hydrofobowych, które ujawnia 

się zarówno w analizie in virto jak i in vivo. Znaczenie oddziaływań 

hydrofobowych dotyczy tradycyjnie podstawnika 

w pozycji C7. Ustalono również wartość optymalną log P 

całych struktur (log P = 2,91(±0,38)). Równocześnie stwierdzono, 

że dla podstawników przy C7 i C2’(w pierścieniu 

aromatycznym przy C5) istotniejsze są efekty steryczne niż 

elektronowe wynikające z ich rodzaju. Można stwierdzić, że 

największą rolę w oddziaływaniu z receptorem odgrywają 

parametry steryczne oraz hydrofobowe. Widoczne są jednak 

również wpływy parametrów elektronowych [9]. Niejednoznaczność 

wyników w zakresie aktywności może być 

spowodowana olbrzymią liczbą receptorów znajdujących 

się w komórkach mózgowych stosowanych w pomiarach 

aktywności benzodiazepin. Badania toksyczności benzodiazepin 

[10] wykazały, iż wzrastająca liczba podstawników 

chlorowych powoduje spadek toksyczności, zwiększenie 

liczby donorów wiązań wodorowych powoduje wzrost toksyczności. 

Niniejsza praca dotyczy badania grupy 69 pochodnych 

5-fenylo-1,4-benzodiazepin-2-onu dla ustalenia charakterystyki 

wymagań strukturalnych BDZ o działaniu diazepamopodobnym. 

Dane strukturalne i o aktywności biologicznej 

związków zgromadzono na podstawie bibliografii [8]. 

Materiały i metody 

Analizowane w pracy BDZ należą do grupy pochodnych 

5-fenylo-1,4-benzodiazepin-2-onu. Do badań przyjęto 

69 związków (G1-G69) pochodzących z bibliografii [8]. 

Strukturę pochodnych i aktywność podano w Tabeli 1. 

Tabela 1. Struktura badanych pochodnych 1,4-benzodiazepin-2-onu G1-G69 [8] 

R 7 R 1 

O 

N 

R 6 

R 2 

R 5 

N 

R 4 

R 3 

związki R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 log1/C 

G1 CH 3 

OCON(CH 3 

) 2 

Cl 6,05 

G2 C(CH 3 

) 3 

Cl 6,21 

G3 CH 3 

NH 2 

6,34 

G4 CH 3 

F NHCONHCH 3 

6,34 

G5 CH 2 

OCH 3 

NO 2 

6,37 

G6 NH 2 

6,41 

G7 CH 3 

CN 6,42 

G8 NHOH 6,45 

G9 Cl 6,49 

G10 C(CH 3 

) 3 

Cl NO 2 

6,52 

G11 CH 3 

F Cl Cl 6,52 

G12 CH 3 

CH 3 

6,77 

G13 CH 3 

F Cl 6,82 

G14 CH 2 

CHOHCH 2 

OH F Cl 6,85 

G15 CH 2 

C 3 

H 5 

Cl 6,96 

G16 CH 3 

F NHOH 7,02 

G17 CH 2 

CCH Cl 7,03 

9

Farm Przegl Nauk, 2009,8 

G18 CH 2 

CF 3 

Cl 7,04 

G19 NH 2 

7,12 

G20 CH 3 

F Cl 7,14 

G21 Cl 7,15 

G22 CH 3 

F NH 2 

7,19 

G23 CH 3 

CH 3 

Cl 7,31 

G24 CHO 7,37 

G25 (CH 2 

) 2 

OCH 2 

CONH 2 

F Cl 7,37 

G26 F 7,40 

G27 CH 3 

F Cl Cl 7,40 

G28 Cl Cl 7,43 

G29 Cl 7,43 

G30 C 2 

H 5 

7,44 

G31 CH 3 

F CN 7,52 

G32 F F 7,55 

G33 CH 2 

CH 2 

OH F Cl 7,61 

G34 CHCH 2 

7,62 

G35 F 7,68 

G36 F F 7,72 

G37 F CH 3 

7,72 

G38 F COCH 3 

7,74 

G39 OH Cl 7,74 

G40 CH 3 

F 7,77 

G41 CH 3 

OH Cl 7,79 

G42 CH 3 

F 7,85 

G43 NO 2 

7,99 

G44 Cl 8,03 

G45 CH 3 

Cl 8,09 

G46 F F 8,13 

G47 Cl Cl Cl 8,15 

G48 CH 3 

CH 3 

F NO 2 

8,15 

G49 CH 3 

Cl Cl Cl 8,26 

G50 F N 3 

8,27 

G51 CH 3 

F F 8,29 

G52 CH 3 

F F Cl 8,39 

G53 H Cl CH 3 

8,41 

G54 Cl Cl 8,41 

G55 CH 3 

F NO 2 

8,42 

G56 CH 3 

Cl 8,42 

G57 F Cl Cl 8,44 

G58 CF3 NO 2 

8,45 

G59 CH 3 

F Cl 8,46 

G60 Cl F Cl 8,52 

G61 CH 3 

F I 8,54 

G62 CH 3 

F F Br 8,62 

G63 CH 3 

Cl NO 2 

8,66 

G64 F Cl 8,70 

G65 Cl Cl 8,74 

G66 Cl NO 2 

8,74 

G67 F F Cl 8,79 

G68 F NO 2 

8,82 

G69 CH 3 

Cl NO 2 

8,92 

Dane o właściwościach fizykochemicznych związków 

G1-G69 ustalono metodami obliczeniowymi z zastosowaniem 

metod pół-empirycznych. Podstawą badania właściwości 

były struktury związków w minimum energetycznym 

(po optymalizacji geometrycznej metodą PM3 bez przeglądu 

konformacji). Związki opisano zbiorem zmiennych zgromadzonych 

za pomocą programów HyperChem 7.1, ACD- 

Labs 8.0 (logD i pK): log P - lipofilowość, %PSA – odsetek 

powierzchni o charakterze polarnym, N-N – odległość pomiędzy 

atomami azotu BDZ, HD i HA – liczba donorów 

i akceptorów wiązań wodorowych, Q1 i Q2 – ładunek elektryczny 

na N1 i N4 BDZ, V – objętość cząsteczki, Cl, F, 

I – liczba atomów chlorowca, P – polaryzowalność objętościowa, 

S – pole powierzchni, M – masa cząsteczkowa, 

Md – moment dipolowy, eH i eL – energia orbitali HOMO 

i LUMO, B1 i B2 – wskaźnik przenikania BBB, log D 

– współczynnik dystrybucji We wszystkich poniższych analizach 

wykorzystano dane o aktywności biologicznej w po- 

10

staci zahamowania przyłączenia [ 3 H]diazepamu do BDZ-R 

(log 1/C), pochodzące z pracy źródłowej [8] (dane surowe 

przedstawiono w Tabeli 2.). 


Analizę statystyczną przeprowadzono z zastosowaniem 

programu STATISTICA 7.1, metodami: regresji wielokrotnej 

(MR); analizy skupień (CA) metodą grupowania 

k-średnich; analizy funkcji dyskryminacyjnej (DFA). 

Tabela 2. Wartości parametrów fizykochemicznych (dane surowe) dla związków G1-G69 

związki log1/C S V logP P M HD HA Q1 Q2 

G1 6,05 360,25 321,83 3,50 38,54 371,82 0 6 0,01 -0,20 

G2 6,21 333,52 299,87 3,84 34,46 326,83 0 3 -0,01 -0,11 

G3 6,34 282,60 247,66 1,71 30,38 265,31 2 4 0,01 -0,11 

G4 6,34 338,04 297,08 1,45 35,40 340,36 0 3 0,02 -0,11 

G5 6,37 319,28 279,85 -1,22 33,34 325,32 0 7 0,03 -0,07 

G6 6,41 260,77 229,95 1,46 28,55 251,29 3 4 0,04 -0,12 

G7 6,42 283,71 253,83 2,53 30,88 275,31 0 4 0,02 -0,12 

G8 6,45 246,85 218,82 2,24 27,20 236,27 1 3 0,04 -0,12 

G9 6,49 258,95 232,46 2,76 29,12 270,72 1 3 0,04 -0,12 

G10 6,52 354,19 318,09 -0,07 38,31 371,82 0 6 -0,02 -0,11 

G11 6,52 296,03 266,40 3,67 32,80 337,18 0 3 0,02 -0,11 

G12 6,77 279,06 251,23 3,18 30,87 264,33 1 3 0,04 -0,12 

G13 6,82 279,18 252,33 3,15 30,87 302,74 0 3 0,01 -0,11 

G14 6,85 338,49 300,08 2,33 39,91 362,79 2 5 -0,01 -0,11 

G15 6,96 332,51 295,26 4,10 36,27 324,81 0 3 0,01 -0,12 

G16 7,02 293,22 257,64 2,44 30,93 299,30 2 5 0,02 -0,12 

G17 7,03 304,44 273,87 3,28 33,52 308,77 0 3 0,01 -0,12 

G18 7,04 307,17 274,24 3,98 32,52 352,74 0 3 0,01 -0,11 

G19 7,12 273,50 243,09 1,98 30,47 285,73 3 4 0,05 -0,20 

G20 7,14 282,49 252,88 3,15 30,87 302,74 0 3 0,01 -0,12 

G21 7,15 262,77 232,97 2,76 29,12 270,72 1 3 0,04 -0,12 

G22 7,19 282,62 249,89 1,85 30,29 283,31 2 4 0,03 -0,12 

G23 7,28 279,35 249,11 3,23 30,96 284,74 1 3 0,03 -0,12 

G24 7,31 295,29 266,74 3,55 32,79 298,77 0 3 0,02 -0,13 

G25 7,37 267,35 236,79 1,92 29,12 264,28 1 4 0,04 -0,12 

G26 7,37 369,78 323,56 1,66 38,45 389,81 2 6 0,00 -0,11 

G27 7,40 249,98 221,39 2,38 27,10 254,26 1 3 0,04 -0,12 

G28 7,40 294,11 263,90 3,53 32,89 219,19 0 3 0,01 -0,12 

G29 7,43 276,86 246,85 3,28 21,05 305,16 1 3 0,04 -0,18 

G30 7,43 259,20 231,94 2,76 29,12 270,72 1 3 0,04 -0,12 

G31 7,44 285,78 252,16 3,11 30,87 264,33 1 3 0,04 -0,12 

G32 7,52 287,91 256,69 2,67 30,79 293,30 0 4 0,02 -0,12 

G33 7,55 270,63 238,22 3,04 28,94 306,70 1 3 0,04 -0,10 

G34 7,61 312,13 276,33 2,71 33,34 332,76 1 4 0,00 -0,12 

G35 7,62 277,31 247,08 2,89 30,67 262,31 1 3 0,04 -0,12 

G36 7,68 251,25 221,55 2,38 27,10 254,26 1 3 0,04 -0,12 

G37 7,72 254,02 224,04 2,52 27,01 272,25 1 3 0,04 -0,10 

G38 7,72 272,37 238,14 2,85 28,94 268,29 1 3 0,04 -0,13 

G39 7,74 290,88 256,12 1,69 30,86 296,30 1 4 0,04 -0,12 

G40 7,74 269,70 240,04 2,91 29,76 286,72 2 4 0,05 -0,20 

G41 7,77 266,51 238,44 2,63 28,94 268,29 0 3 0,02 -0,12 

G42 7,79 288,59 256,96 3,15 31,60 300,74 1 4 0,03 -0,20 

G43 7,85 268,24 238,83 2,63 28,94 268,29 0 3 0,02 -0,12 

G44 7,99 271,12 238,07 -1,67 29,04 281,27 1 6 0,04 -0,12 

G45 8,03 262,77 232,97 2,76 29,12 270,72 1 3 0,04 0,04 

11


G46 8,09 279,88 250,06 3,01 30,96 284,74 0 3 0,02 -0,12 

G47 8,13 255,34 224,13 2,52 27,01 272,25 1 3 0,04 -0,12 

G48 8,15 287,78 259,49 3,80 32,98 339,61 1 3 0,04 -0,11 

G49 8,15 308,57 274,55 -0,74 32,62 327,31 0 6 0,02 -0,12 

G50 8,26 305,12 276,50 4,05 34,82 353,64 0 3 0,01 -0,11 

G51 8,27 278,28 245,01 2,22 30,29 295,28 1 6 0,02 -0,13 

G52 8,29 272,11 241,34 2,77 28,85 286,28 0 3 0,02 -0,11 

G53 8,39 287,25 255,21 3,29 30,78 320,73 0 3 0,01 -0,09 

G54 8,41 275,65 246,22 3,28 31,05 305,16 1 3 0,04 -0,12 

G55 8,42 293,39 258,20 -1,28 30,78 313,29 0 6 0,01 -0,11 

G56 8,42 275,61 249,10 3,01 30,96 288,75 1 3 0,02 -0,12 

G57 8,44 282,76 249,54 3,42 30,96 323,15 1 3 0,04 -0,12 

G58 8,45 297,32 261,48 -0,78 30,60 349,27 1 6 0,03 -0,09 

G59 8,46 282,94 252,30 3,44 30,87 302,74 1 3 0,04 -0,13 

G60 8,52 280,66 249,20 3,42 30,96 323,15 1 3 0,04 -0,12 

G61 8,54 297,46 267,20 3,89 33,97 394,19 0 3 0,01 -0,12 

G62 8,62 293,86 262,42 3,56 31,47 365,18 0 3 0,01 -0,09 

G63 8,66 301,05 268,59 -0,90 32,80 329,74 0 6 -0,01 -0,11 

G64 8,70 268,12 235,71 2,90 29,03 288,71 1 3 0,04 -0,12 

G65 8,74 275,51 246,03 3,28 31,05 305,16 1 3 0,04 -0,12 

G66 8,74 284,21 251,30 -1,15 30,96 315,72 1 6 0,03 -0,11 

G67 8,79 270,96 238,27 3,04 29,94 306,70 1 3 0,03 -0,10 

G68 8,82 274,82 240,71 -1,53 28,95 299,27 1 6 0,03 -0,10 

G69 8,92 294,58 259,99 2,75 32,31 299,76 1 6 0,04 -0,11 

związki Md N-N eH eL B1 B2 logD Cl F I Halo %PSA 

G1 3,62 2,89 -9,21 -0,92 -0,26 -0,45 3,37 1 0 0 1 17,38 

12 

G2 3,19 2,97 -9,19 -0,77 0,24 0,02 4,19 1 0 0 1 9,80 

G3 4,83 2,95 -8,70 -0,59 -0,47 -0,39 1,39 0 0 0 0 20,77 

G4 1,25 2,96 -8,94 -0,96 -0,12 0,02 1,16 0 1 0 1 9,66 

G5 3,50 2,97 -9,67 -1,44 -1,34 -0,86 1,40 0 0 0 0 27,47 

G6 5,20 2,97 -8,70 -0,67 -0,64 -0,53 0,76 0 0 0 0 25,88 

G7 1,34 2,98 -9,48 -1,13 -0,31 -0,36 2,10 0 0 0 0 19,90 

G8 4,29 2,97 -9,33 -0,71 -0,13 -0,12 2,08 0 0 0 0 16,80 

G9 4,00 2,95 -9,40 -0,81 -0,06 -0,12 3,66 1 0 0 1 16,01 

G10 2,58 2,98 -9,16 -1,45 -1,03 -0,71 2,77 1 0 0 1 22,16 

G11 2,50 2,95 -9,36 -0,96 0,21 0,02 3,85 2 1 0 3 11,04 

G12 4,83 2,93 -9,16 -0,64 0,01 -0,12 3,00 0 0 0 0 14,86 

G13 3,00 2,94 -9,27 -0,81 0,13 0,02 2,18 1 1 0 2 11,70 

G14 4,56 3,06 -9,37 -1,06 -0,59 -0,62 1,58 1 1 0 2 21,60 

G15 3,45 2,99 -9,14 -0,77 0,28 0,02 4,35 1 0 0 1 9,83 

G16 3,61 2,96 -8,82 -0,78 -0,45 -0,49 0,78 0 1 0 1 22,14 

G17 3,36 3,01 -9,18 -0,80 0,15 0,02 3,44 1 0 0 1 10,73 

G18 5,51 2,96 -9,54 -1,01 0,26 0,02 4,27 1 3 0 4 10,64 

G19 4,96 2,96 -8,66 -0,73 -0,56 -0,53 1,55 1 0 0 1 24,67 

G20 3,97 2,95 -9,18 -0,87 0,13 0,02 3,70 1 1 0 2 11,57 

G21 3,37 2,97 -9,25 -0,84 -0,06 -0,12 3,15 2 0 0 2 15,78 

G22 4,47 2,98 -8,59 -0,72 -0,45 -0,39 0,62 0 1 0 1 20,77 

G23 3,44 2,96 -9,21 -0,81 0,02 -0,12 3,61 1 0 0 1 14,84 

G24 3,12 2,97 -9,15 -0,77 0,20 0,02 3,46 1 0 0 1 11,06 

G25 2,02 2,98 -9,53 -1,05 -0,44 -0,39 2,53 0 0 0 0 21,89 

G26 4,41 2,98 -9,31 -0,98 -0,87 -0,81 1,72 1 1 0 2 22,98 

G27 2,64 2,97 -9,43 -0,92 -0,11 -0,12 2,67 0 1 0 1 16,59 

G28 2,82 2,96 -9,21 -0,95 0,19 0,02 3,49 2 0 0 2 11,11 

G29 3,48 2,96 -9,28 -0,96 0,02 -0,12 3,46 2 0 0 2 14,98 

G30 3,90 2,96 -9,28 -0,77 -0,06 -0,12 2,24 1 0 0 1 16,00 

G31 4,63 2,97 -9,21 -0,69 0,00 -0,12 3,08 0 0 0 0 14,51 

G32 0,36 2,97 -9,43 -1,08 -0,29 -0,36 1,96 0 1 0 1 19,61 

G33 4,23 2,94 -9,38 -1,03 -0,01 -0,12 2,79 1 2 0 3 15,32


G34 3,78 3,00 -9,12 -0,89 -0,23 -0,30 2,20 1 1 0 2 16,95 

G35 4,42 2,97 -9,06 -0,78 -0,04 -0,12 2,57 0 0 0 0 14,95 

G36 3,74 2,96 -9,28 -0,79 -0,11 -0,12 1,95 0 1 0 1 16,50 

G37 4,71 2,94 -9,31 -0,93 -0,09 -0,12 1,85 0 2 0 2 16,32 

G38 3,94 2,96 -9,22 -0,77 -0,04 -0,12 2,41 0 1 0 1 15,22 

G39 3,06 2,97 -9,46 -0,98 -0,35 -0,26 1,69 0 1 0 1 17,43 

G40 2,83 2,98 -9,16 -0,83 -0,33 -0,44 3,31 1 0 0 1 22,87 

G41 2,61 2,97 -9,33 -0,88 0,06 0,02 2,52 0 1 0 1 12,26 

G42 2,54 2,98 -9,10 -0,78 -0,17 -0,30 2,20 1 0 0 1 18,33 

G43 3,46 2,96 -9,18 -0,76 0,06 0,02 1,89 0 1 0 1 12,18 

G44 1,71 2,98 -9,72 -1,59 -1,41 -0,85 2,18 0 0 0 0 32,19 

G45 3,37 2,94 -9,25 -0,84 -0,06 -0,12 3,15 1 0 0 1 15,78 

G46 3,29 2,97 -9,18 0,80 0,11 0,02 2,96 1 0 0 1 11,67 

G47 2,06 2,96 -9,37 -0,96 -0,09 -0,12 2,54 0 2 0 2 16,24 

G48 3,41 2,99 -9,22 -0,93 0,10 -0,12 3,48 3 0 0 3 14,41 

G49 2,38 2,96 -9,75 -1,45 -1,14 -0,71 1,74 0 1 0 1 25,44 

G50 3,24 2,94 -9,16 -0,89 0,27 0,02 3,30 3 0 0 3 10,71 

G51 2,83 3,17 -8,72 -1,22 -0,55 -0,56 0,65 0 1 0 1 24,95 

G52 1,78 2,95 -9,29 -0,92 0,08 0,02 2,38 0 2 0 2 12,01 

G53 3,63 2,95 -9,15 -0,98 0,16 0,02 2,73 1 2 0 3 11,37 

G54 3,00 2,96 -9,20 -0,88 0,02 -0,12 3,31 2 0 0 2 15,04 

G55 2,27 2,97 -9,77 -1,47 -1,22 -0,71 1,25 0 1 0 1 26,75 

G56 3,73 2,96 -9,19 -0,74 0,11 0,02 3,19 1 0 0 1 11,85 

G57 2,72 2,97 -9,20 -1,01 0,05 -0,12 3,83 2 1 0 3 14,66 

G58 2,63 2,96 -10,08 -1,73 -1,27 -0,85 2,43 0 3 0 3 29,36 

G59 2,78 2,95 -9,16 -0,86 0,05 -0,12 3,80 2 0 0 2 14,65 

G60 3,17 2,94 -9,19 -0,96 0,05 -0,12 2,73 2 1 0 3 14,77 

G61 2,86 2,95 -9,00 -0,85 0,25 0,02 3,36 0 1 1 2 10,98 

G62 3,46 2,94 -9,33 -1,00 0,20 0,02 2,65 0 2 1 3 11,12 

G63 2,06 2,95 -9,34 -1,57 -1,16 -0,71 1,55 1 0 0 1 26,07 

G64 2,84 2,96 -9,18 -0,89 -0,03 -0,12 3,01 1 1 0 2 15,46 

G65 3,01 2,96 -9,19 -0,88 0,02 -0,12 3,31 2 0 0 2 15,05 

G66 1,86 2,97 -9,63 -1,53 -1,33 -0,85 2,31 1 0 0 1 30,71 

G67 3,76 2,94 -9,21 -1,01 -0,01 -0,12 2,92 1 2 0 3 15,30 

G68 1,53 2,97 -9,82 -1,64 -1,39 -0,85 2,04 0 1 0 1 31,76 

G69 4,86 2,95 -8,63 -0,70 -0,73 -0,85 2,83 1 0 0 1 29,63 

Wyniki badań 

Analiza Regresji Wielokrotnej (MR – Multiple Regression) 

Przeprowadzono pełną analizę regresji z zastosowaniem 

parametrów fizykochemicznych, obliczonych metodami 

pół-empirycznymi, dla związków G1–G69. Wyznaczono 

macierz korelacji w poszukiwania ścisłych zależności pomiędzy 

zmiennymi niezależnymi. Następnie prowadzono 

systematyczną analizę krokową dla zmiennej zależnej 

– aktywności biologicznej log 1/C z użyciem wszystkich 

zgromadzonych danych fizykochemicznych – zmiennych 

niezależnych. Przeprowadzenie pełnej analizy krokowej dla 

zmiennej zależnej log 1/C wprowadziło do modelu regresji 

7 zmiennych niezależnych. Model ten opisuje ok. 47% 

zmienności całkowitej w badanej grupie przypadków aktywnych 

i wyrażony jest równaniem: 

log 1/C = 12,98(±1,40) 

– 2,50(±0,62) V – 0,23(±0,07) Md + 0,24(±0,08) halo 

+ 1,59(±0,46) I + 0,62(±0,24) HA 

– 0,08(±0,04) %PSA 

+ 0,27(±0,12) Cl 

r = 0,70; R 2 = 0,47; F = 7,616; p


3,0 

2,5 

2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

-0,5 

-1,0 

-1,5 

-2,0 

-2,5 

Wykr. średnich każd. skupienia 

V HA Md Cl I halo log1/C %PSA 

Z mienne 

Skupien. 1 

Skupien. 2 

Skupien. 3 

Skupien. 4 

Skupien. 5 

Wykres średnich wartości standaryzowanych zmiennych grupujących dla 

skupień 1-5 

podobnym na podstawie cech różnicujących poziom 

ich aktywności biologicznej log 1/C. Założono uzyskanie 

podziału na skupienia przypadków reprezentujące 

poziom ich aktywności. Analizę przeprowadzono 

po wprowadzeniu zmiennych wpływających 

na poziom aktywności biologicznej G1-G69 wskazanych 

równaniem analizy MR. 

Fizykochemiczna zmienność struktur związków 

o podobnym poziomie ustalonej aktywności biologicznej 

powoduje, że odpowiednie zróżnicowanie 

średnich log 1/C uzyskano dopiero dla pięciu skupień. 

Poniżej przedstawiono wykres średnich wartości 

zmiennych dla każdego skupienia (Ryc.1.) 

i istotne elementy wyniku analizy wariancji dla tych 

zmiennych (Tabela 3.): 

Związki G1-G69 stanowią bardzo niejednolity 

zbiór przypadków. Nic nie stoi jednak na przeszkodzie 

rozpatrywania wydzielonych skupień 2 i 4 

– o średnich standaryzowanych wartościach 

Tabela 3. Wyniki analizy wariancji dla zmiennych w modelu i wartości średnich dla każdego skupienia 

zmienna F p Średnia sk. 1 Średnia sk. 5 Średnia sk. 3 Średnia sk. 2 Średnia sk. 4 

V 11,37486 0,000000 1,52693 0,510860 -0,486050 -0,233958 0,005949 

HA 41,47506 0,000000 0,58208 0,444058 -0,568075 -0,608330 1,824240 

Md 10,61056 0,000001 -0,84336 1,292506 0,141052 -0,095509 -0,796216 

Cl 19,71681 0,000000 -0,31964 -0,249625 -0,436336 1,334502 -0,529691 

I 0,77913 0,542877 -0,17152 -0,171517 0,266804 -0,171517 -0,171517 

halo 31,47516 0,000000 -1,27383 1,060981 -0,445350 0,985665 -0,344928 

log1/C 18,83766 0,000000 -1,36500 -0,793768 -0,029988 0,547090 1,124464 

%PSA 29,46171 0,000000 -0,07148 0,550713 -0,497044 -0,478594 1,854786 

Tabela 4. Elementy każdego skupienia i ich odległość od środka skupienia 

Działanie słabe Działanie średnie Działanie silne 

Elementy sk. 1 Elementy sk. 5 Elementy sk. 3 Elementy sk. 2 Elementy sk. 4 

związek odległość związek odległość związek odległość związek odległość związek odległość 

G1 0,842202 G3 0,659445 G8 0,794592 G11 0,806527 G44 0,565000 

G2 0,738718 G6 0,782537 G9 0,660225 G21 0,503454 G49 0,478727 

G4 0,784632 G14 0,623942 G12 0,703081 G28 0,594809 G51 0,351507 

G5 1,095353 G16 0,505082 G13 0,539234 G29 0,322794 G55 0,319643 

G7 0,783189 G18 0,838613 G17 0,680411 G33 0,636949 G58 0,735809 

G10 0,726611 G19 0,549904 G20 0,481160 G40 0,713746 G63 0,487478 

G15 0,772192 G22 0,400536 G23 0,364363 G48 0,607518 G66 0,411300 

G32 1,032677 G26 1,063385 G24 0,572739 G50 0,718464 G68 0,489031 

G34 0,535570 G25 0,787136 G53 0,478816 G69 0,911877 

G27 0,534806 G54 0,222005 

G30 0,427176 G57 0,349754 

G31 0,548183 G59 0,264537 

G35 0,477141 G60 0,334998 

G36 0,466582 G64 0,538871 

G37 0,741906 G65 0,348793 

G38 0,340726 G67 0,615411 

G39 0,470981 

G41 0,459837 

G42 0,604673 

G43 0,375830 

G45 0,425694 

G46 0,477715 

G47 0,790243 

G52 0,715998 

G56 0,536943 

G61 2,054794 

G62 2,033153 

14


Tabela 5. Funkcje klasyfikacyjne charakteryzujące grupy 1-5 badanych pochodnych benzodiazepiny 

Funkcje klasyfikacyjne; grupujące dla poziomów działania benzodiazepin o działaniu na GABA-BDZ 

Zmienne w modelu G_1 G_2 G_3 G_4 G_5 

HA -3,86251 1,43126 0,23277 4,26819 -4,07763 

halo -3,39085 2,36836 -1,08100 -0,68897 2,73563 

Cl -2,85011 3,92116 -0,58029 -0,27641 -2,42023 

V 6,16762 -3,23597 -1,35730 0,18701 4,15538 

Md -1,28996 -0,51276 0,41210 -1,09433 1,91621 

%PSA 4,08421 -2,54994 -2,23461 2,35848 5,24816 

I -1,25289 0,53663 0,19698 0,01838 -0,44964 

Stała -8,85989 -5,77698 -2,18001 -8,74389 -6,66827 

log 1/C 0,55 i 1,13, jako grupę o działaniu silnym, 

skupienia 3 – o średniej standaryzowanej wartości 

log 1/C -0,03, jako grupę o działaniu średnim oraz 

skupienia 1 i 5 – o średnich standaryzowanych wartościach 

log 1/C -1,37 i -0,8, jako grupę o działaniu 

słabym. Wyniki analizy wariancji wskazują na parametry 

HA, halo i %PSA, jako najsilniejsze kryteria 

przypisania obiektów do skupień 1-5. Struktura danych 

jest jednak bardzo niejednolita. Obserwacja zamieszczonego 

powyżej wykresu wyraźnie rozróżnia 

grupę pochodnych najsłabiej (skupienie 1) i najsilniej 

(skupienie 4) działających średnimi wartościami 

parametrów V, HA i %PSA. Wartości średnie parametrów 

V i %PSA nie są jednak zgodne z trendem 

ustalonym w analizie MR. Obserwowane odstępstwa 

wynikać mogą z niekorzystnej reprezentacji strukturalnej 

badanej grupy, co uwidoczniło się już na etapie 

analizy MR. Poniżej (w Tabeli 4) przestawiono 

elementy każdego skupienia i ich odległość od środka 

skupienia. Dla większej czytelności uzyskanych 

wyników należy dodać, że kolejność przypadków 

G1-G69 odpowiada wzrastającej sile działania. Wyłonione 

w przebiegu CA, z użyciem wszystkich zmiennych, 

skupienia 1+5, 3 i 2+4 – grupy działania słabego, średniego 

i silnego są podstawą analizy dyskryminacyjnej. 

Analiza Funkcji Dyskryminacyjnej (DFA – Discriminant 

Function Analysis) 

Analiza funkcji dyskryminacyjnej służyła wyznaczeniu 

funkcji klasyfikacyjnych badania przynależności nowych 

pochodnych do grupy słabo, średnio i silnie działających pochodnych 

benzodiazepiny o działaniu klasycznym. Prowadzona 

tu DFA ma charakter ilościowy. Sposób wyznaczenia 

zmiennej grupującej oparty został na wynikach analizy skupień 

z zastosowaniem zmiennych niezależnych, jako kryteriów 

klasyfikacji. Badane pochodne G1-G69 opisano kodami 

grupowymi: 1 i 5 – słabo działające; 3 – średnio działające 

oraz 2 i 4 – silnie działające w stosunku do receptorów 

GABA-BDZ. Do analizy wprowadzono jedynie zmiennych 

niezależne (standaryzowane) ustalonych równaniem analizy 

MR. Jako zmiennej grupującej użyto kodów grupowych 1-5 

wyznaczonych uprzednio w analizie grupowania metodą 

k-średnich CA. Analizę prowadzono przy użyciu krokowej 

metody postępującej wyznaczającej zmienne dyskryminujące 

spośród wprowadzonych do analizy. Po wprowadzeniu 

do modelu 7 zmiennych dyskryminujących uzyskano cztery 

funkcje dyskryminacyjne i na ich podstawie obliczono odpowiednie 

funkcje klasyfikacyjne dla grup 1-5. 

Pierw2 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

-1 

-2 

-3 

Pierw1 wz . pierw2 

-4 

-6 -4 -2 0 2 4 6 

Pierw1 

G_1:1 

G_2:2 

G_3:3 

G_4:4 

G_5:5 

Wykres rozrzutu przypadków G1-G69 na podstawie średnich zmiennych kanonicznych 

funkcji dyskryminacyjnej 1 (pierwiastek 1) w stosunku do funkcji 

dyskryminacyjnej 2 (pierwiastek 2) 

Na podstawie wartości podanych w Tabeli 5 możliwe 

jest zaproponowanie pięciu równań funkcji klasyfikacyjnych 

charakteryzujących grupy 1-5. Z ustalonych funkcji 

dyskryminacyjnych stworzono wykres rozrzutu w celu obserwacji 

dyskryminacji: 

Jak widać, związki najsilniej działające (grupa 2 i 4) 

są wyraźnie rozdzielone pierwszą funkcją dyskryminacyjną. 

Można również stwierdzić, że grupy 2 i 3 są wyraźnie 

skupione, co zgodne jest, pod względem obserwowanych 

wartości log 1/C, z przyporządkowaniem przypadków do 

tych grup. Mimo obserwowanego rozproszenia kontrola 

prawdopodobieństwa a posteriori klasyfikacji związków nie 

wykazuje wielu błędów w przyporządkowaniu przypadków. 

Jedynie dwa przypadki G5 i G53 zostały zakwalifikowane 

nieprawidłowo. Z macierzy struktury czynnikowej wywnioskowano, 

że zmienną o największej mocy dyskryminującej 

jest tu liczba akceptorów wiązań wodorowych, a w drugim 

rzędzie liczba atomów chlorowca w cząsteczce i odsetek powierzchni 

cząsteczki zajęty przez atomy azotu i tlenu połączone 

z atomami wodoru. Wprowadzone do modelu zmienne 

dyskryminujące mają wyraźny związek z dostępnością 

biologiczną i są również wskaźnikami zdolności związków 

do przekraczania BBB. Ustalona macierz klasyfikacji (Tabela 

6) wskazuje na dopasowanie modelu do założonego 

podziału na grupy: 

15


Tabela 6. Macierz obserwowanych i przewidywanych klasyfikacji 

przypadków w grupach z zastosowaniem modelu 

Macierz klasyfikacji. Wiersze: obserwowana klasyfikacja 

Kolumny: Przewidywana klasyfikacja 

Procent poprawnie G_1 G_2 G_3 G_4 G_5 

G_1 87,5000 7 0 0 1 0 

G_2 93,7500 0 15 1 0 0 

G_3 100,0000 0 0 27 0 0 

G_4 100,0000 0 0 0 9 0 

G_5 100,0000 0 0 0 0 9 

Razem 97,1015 7 15 28 10 9 

Wnioski 

Na podstawie przeprowadzonej analizy zaproponowano 

charakterystykę strukturalną pochodnych BDZ o działaniu 

klasycznym na receptor benzodiazepinowy w kompleksie 

GABA-ergicznym. Analiza MR pozwala na ustalenie, że 

wyższa aktywność log 1/C pochodnych G1-G69 zależna 

jest od następujących czynników: objętości van der Waalsa 

V poniżej 255 Å 3 ; momentu dipolowego Md poniżej 3,27D; 

ilości podstawników halogenowych w cząsteczce halo powyżej 

2; obecności atomu jodu I; liczby akceptorów wiązań 

wodorowych HA powyżej 3,79; odsetka powierzchni związanego 

z atomami elektroujemnymi O i N %PSA poniżej 

17,41% oraz; liczby atomów chloru Cl więcej niż 1. Analiza 

ta nie przedstawia jednak silnych zależności. Większość 

tych parametrów wpływa na możliwość przenikania związków 

przez barierę krew-mózg. Przeprowadzona analiza MR 

wskazuje na preferencję dla czynników sprzyjających pokonywaniu 

BBB przez te pochodne benzodiazepiny. Analiza 

skupień pokazuje, że zmienność niektórych parametrów nie 

zachowuje trendu zgodnego z wynikiem analizy regresji. 

Różnice te dają możliwość obserwacji struktury zmienności 

kolejnych parametrów w mniejszych zakresach przypadków 

o bardziej sprecyzowanych właściwościach (np. biologicznych). 

Skupienia te, które podobne są pod względem 

strukturalnym, mogą charakteryzować się nawet trendem 

przeciwnym, co nie ujawnia się w badaniu łącznie całej grupy. 

Jest to najczęściej spowodowane zbyt małym wpływem 

średniej wartości zmiennej dla danego skupienia. Ujawniona 

struktura zmienności całkowitej oraz wyniki analizy 

funkcji dyskryminacyjnej potwierdzają założenie, że zróżnicowanie 

odpowiedzi biologicznej, w grupie pochodnych 

benzodiazepiny o działaniu diazepamo-podobnym, ma podłoże 

farmakodynamiczne, ale również farmakokinetyczne 

i zależy w dużej mierze od ich zdolności przenikania bariery 

krew-mózg. 

Piśmiennictwo 

1. Mutschler E i wsp. Kompendium farmakologii i toksykologii 

Mutschlera, wydanie I polskie, Med Pharm Polska 

2008, Wrocław. 

2. Schofield PR i wsp. Sequence and functional expression 

of the GABA A 

receptor shows a ligand-gated receptor 

superfamily. Nature1988; 328: 221-227. 

3. Stephenson FA. Understanding the GABA A 

receptor: A 

chemically gated ion channel. Biochem J 1988; 249: 

21-32. 

4. Gardner CR. Interpretation of behavioral effects of benzodiazepine 

receptor ligands. Drugs Future 1989; 14: 

51-67. 

5. Wong G i wsp. Synthetic and Computer-Assisted Analysis 

of the Structural Requirements for Selective, High 

Affinity Ligand Binding to Diazepam Insensitive Benzodiazepine 

Receptors. J Med Chem 1993; 36:1820-1830. 

6. Haefely W i wsp. Recent Advances in the Molecular 

Pharmacology of Benzodiazepine Receptors and the 

Structure-Activity Relationships of their Agonists and 

Antagonists. Adv Drug Res 1985; 14: 165-222. 

7. Villar HO, Loew GH. Molecular modulators of benzodiazepine 

receptor ligand binding. J Quantum Chem 

QBS 1989; 6: 261-271. 

8. Hadjipavlou-Litina D, Hansch C. Quantitative Structure-Activity 

Relationship of the Benzodiazpienes. 

A Review and Reevaluation. Chem Rev 1994; 94: 

1483-1505. 

9. Kim K H i wsp. Use of the hydrogen bond potential function 

in a comparative molecular field analysis (CoMFA) 

on a set of benzodiazepines. Comp Mol Des 1993; 7: 

263-280. 

10. Funar-Timofei S, Ionescu D. Structure-Toxicity Study 

Of Benzodiazepines By Computational Studies. Annals 

Of West University Timisoara Series Chemistry 2005; 

14: 221-230. 

Adres do korespondencji: 

Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska, 

Zakład Chemii Analitycznej UM w Łodzi, 

ul. Muszyńskiego 1, 

90-151 Łódź, 

tel. 42 677-92-11; 

e-mail: elzbieta.brzezinska@umed.lodz.pl 

16



Ekspresja żelatynaz A i B oraz inwazyjność komórek raka płuc 

i raka pęcherza moczowego w hodowlach in vitro 

traktowanych wybranymi tetracyklinami* 

Expression of Gelatinases A and B and The Invasiveness 

of in vitro Cultured Lung Cancer and Bladder Cancer Cells 

Treated with Selected Tetracyclines 

Daniel Sypniewski, Ilona Bednarek, Sabina Gałka, Anna Bryła, Grzegorz Machnik, 

Tomasz Loch, Dagna Sołtysik, Daria Błaszczyk 

Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach 

Streszczenie 

Metaloproteazy macierzy pozakomórkowej (MMP) należą 

do enzymów biorących udział w licznych procesach zarówno 

o charakterze fizjologicznym (np. jak gojenie się ran), jak 

również patologicznym, w tym przede wszystkim w onkogenezie. 

Ze względu na swój wielostronny wpływ na rozwój 

i progresję nowotworów złośliwych, nadekspresja genów 

kodujących MMP - zwłaszcza żelatynazę A i B (MMP-2 

i MMP-9) - jest uważana za jeden z głównych czynników 

prognozujących nasiloną inwazyjność nowotworu. W pracy 

przedstawiono wyniki analizy wpływu wybranych tetracyklin 

(doksycykliny, oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny), 

które wykazują zdolność do modulacji ekspresji i aktywności 

MMP, na inwazyjność komórek nowotworowych raka płuc 

oraz raka pęcherza in vitro (linie komórkowe A549 i T24). 

Do wyznaczenia optymalnych stężeń i czasu traktowania zastosowano 

test MTT. Następnie zbadano wpływ tetracyklin 

na ekspresję żelatynazy A i B na poziomie mRNA i białka. 

Wykazano zależność ekspresji mRNA genów kodujących 

żelatynazy od stężenia badanych modulatorów, choć różnice 

w zależności od użytego związku oraz linii komórkowej były 

dość istotne. Na poziomie białka, za pomocą zymografii, wykazano 

zależny od dawki spadek ekspresji obu żelatynaz we 

wszystkich badanych hodowlach. W kolejnym etapie badań 

analizowano wpływ badanych modulatorów MMP na efekty 

fenotypowe w hodowlach komórek nowotworowych. Wykazano 

istotny spadek potencjału inwazyjnego komórek obu 

linii po traktowaniu tetracyklinami - ruchliwość i migracja 

komórek nowotworowych w teście wound healing assay malała 

wraz ze wzrostem stężenia danego modulatora. Badanie 

adhezji komórek do białek matriżelu wykazało, iż proces ten 

jest silnie hamowany głównie przez tetracyklinę, jednak tylko w 

przypadku komórek raka płuc. Ogólnie najsilniejszy wpływ modulacyjny, 

zarówno na ekspresję żelatynaz, jak i na inwazyjność 

komórek nowotworowych, wykazała doksycyklina, co znajduje 

odzwierciedlenie w doniesieniach innych autorów. 

Słowa kluczowe: metaloproteazy macierzy pozakomórkowej 

(MMP), żelatynaza A i B (MMP-2 i MMP-9), tetracykliny, inwazyjność 

nowotworów, rak płuca, rak pęcherza. 

Abstract 

Matrix metalloproteinases (MMPs) are enzymes involved 

in numerous physiological (e.g. wound healing), as well as 

pathological processes where oncogenesis is the most significant 

one. Due to their multifunctionality in tumour promotion 

and progression, MMPs - especially gelatinase A and B 

(MMP-2, MMP-9) - overexpression is considered to be the 

major prognostic factor in cancer invasiveness. In this study 

we performed analysis of the influence of selected tetracyclines 

(doxycycline, oxytetracycline, tetracycline, and limecycline), 

which were postulated to be capable of modulating 

MMPs expression, on the lung cancer and bladder cancer 

cells invasiveness in vitro (A549 and T24 cell lines). MTT 

test was used to determine optimal concentrations and treatment 

intervals in the experiments. Then, we analysed the 

influence of the tetracyclines on gelatinase A and B expression 

both at mRNA, and protein level. Generally, mRNA expression 

depended on the concentration of the modulators, 

although there were significant differences depending on the 

cell line or modulator type. At the protein level there was a 

concentration-dependent decrease in the gelatinases expression 

in all studied cultures, as was ascertained zymographically. 

Further research was focused on the problem how 

MMP modulators effected cancer cells phenotype. Obtained 

results indicate there was a decrease in invasive potential of 

both cell lines after tetracyclines treatment; cell motility and 

migration decreased as the concentration of the certain modulator 

increased, as was shown in wound healing assay. Cell 

adhesion to matrigel proteins showed that only tetracycline 

performed significant inhibitory effect on that process in lung 

cancer cell cultures. Taken together our results indicated that 

the strongest inhibition on both gelatinases expression, and on 

cancer invasiveness was performed by doxycycline. These results 

are in concordance with other papers. 

Key words: matrix metalloproteinases (MMPs), gelatinase A 

and B (MMP-2 and MMP-9), tetracyclines, cancer invasiveness, 

lung cancer, bladder cancer. 

* Praca sfinansowana częściowo ze środków na badania własne (KNW-2-133/08) oraz statutowe ŚUM (KNW-1-145/08). 

17


Wykaz skrótów: DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered 

saline) – sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 

EGF (epidermal growth factor) – naskórkowy czynnik 

wzrostu, FBS (fetal bovine serum) – bydlęca surowica 

płodowa, MMP (matrix metalloproteinases) – metaloproteazy 

macierzy pozakomórkowej, MTT - bromek 

3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, 

RNAi (RNA interference) – interferencja RNA, TIMP (tissue 

inhibitors of matrix metalloproteinases) – tkankowe 

inhibitory metaloproteaz macierzy pozakomórkowej. 

Wstęp 

Badania nad białkami z grupy metaloproteaz macierzy 

pozakomórkowej (MMPs – matrix metalloproteinases) prowadzone 

są od ponad dwudziestu lat. Na ich podstawie wykazano, 

iż podstawowa funkcja tych enzymów, jaką jest proteolityczna 

degradacja i przebudowa białek macierzy zewnątrzkomórkowej, 

wpływa zarówno na przebieg procesów fizjologicznych, 

takich jak gojenie ran, przebudowa i wzrost kości, 

apoptoza, jak i zjawisk patologicznych, z których szczególnie 

ważnym jest proces nowotworzenia. Udział MMP w rozwoju 

nowotworu jest szczególnie ważny, gdyż uczestniczą one we 

wszystkich jego etapach począwszy od wzrostu guza pierwotnego, 

angiogenezy, poprzez etap związany z przerwaniem 

integralności bariery błony podstawnej, naciekaniem okolicznych 

tkanek i przerzutowaniem – mechanizmy związane z inwazyjnością 

komórek nowotworowych - aż po rozwój guzów 

wtórnych [1, 2, 3]. Równocześnie prowadzone są badania 

dotyczące inhibitorów MMP, mające na celu wprowadzenie 

ich do lecznictwa w terapii chorób nowotworowych. Istotą 

działania terapeutycznego inhibitorów MMP ma być zahamowanie 

funkcji enzymatycznej docelowych metaloproteaz, 

a w rezultacie zahamowanie rozwoju nowotworów [4, 5, 6]. 

Ekspresję i aktywność MMP reguluje wiele czynników 

o charakterze endogennym, jak też coraz liczniej opisywane 

czynniki zewnętrzne [7]. Badania nad inhibitorami MMP 

o zastosowaniu terapeutycznym dotyczą małocząsteczkowych 

związków niebiałkowych, w tym bifosfonianów i tetracyklin, 

naturalnych inhibitorów o budowie peptydowej 

(np. TIMP – tissue inhibitors of matrix metalloproteinases), 

jak też prób wykorzystania metod terapii genowej (np. interferencyjnego 

RNA – RNAi, czy też aptamerów). Ponieważ 

prowadzone do tej pory próby wprowadzenia do lecznictwa 

leków z grupy białkowych, niebiałkowych inhibitorów oraz 

bifosfonianów zakończyły się niepowodzeniem, głównie 

z powodu poważnych działań niepożądanych występujących 

po zastosowaniu tych preparatów, w ostatnich latach 

szczególną uwagę skupiono na tetracyklinach, zarówno 

naturalnych, jak i ich półsyntetycznych pochodnych [8, 9]. 

Podstawową zaletą tej grupy leków jest szerokie spektrum 

działania inhibitorowego - odpowiadają za hamowanie aktywności 

zarówno kolagenaz, jak i żelatynaz – oraz działanie 

na poziomie zarówno ekspresji genów, jak i aktywacji 

latentnych form MMPs. Istotną cechą tej grupy modulatorów 

jest też wysoka biodostępność po podaniu doustnym 

(wchłaniają się z przewodu pokarmowego w około 80%) 

oraz dobra penetracja tkanek - tetracykliny przenikają przez 

barierę krew-mózg, przez łożysko, do dróg oddechowych, 

moczowo-płciowych, wątroby, a nawet zębów i kości [10]. 

Z uwagi na wielokierunkowy udział MMP w procesach 

nowotworzenia istnieje konieczność dokładnej charakterystyki 

mechanizmów ich roli w wyżej wymienionych procesach. 

Celem badań przedstawionych w pracy była analiza 

udziału metaloproteaz macierzy pozakomórkowej w inwazyjności 

i progresji nowotworów w modelu in vitro. W tym 

celu zaprojektowano schemat badań służących ocenie wpływu 

wybranych modulatorów z grupy tetracyklin, hamujących 

aktywność metaloproteaz macierzy pozakomórkowej, 

na efekty fenotypowe związane z inwazyjnością komórek 

nowotworowych niedrobnokomórkowego raka płuc (linia 

A549) i raka pęcherza (linia T24). 

Materiał i metody 

Warunki hodowli in vitro 

Badania przeprowadzono na hodowlach in vitro ludzkich 

linii nowotworowych A549 (ATCC: CCL-185) oraz T24 

(ATCC: HTB-4) wywodzących się odpowiednio z raka płuc 

oraz raka pęcherza. Hodowle prowadzone były w standardowych 

warunkach (37°C, 5% wysycenie atmosfery CO 2 

), 

w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (PAA) z dodatkiem 

10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS) (PAA) oraz gentamycyny 

(2 μg/ml) (PAA), w inkubatorze Hera-Cell (Heraeus). 

Monitoring prowadzonych hodowli (liczba komórek 

żywych i martwych, morfologia komórek) prowadzono metodą 

mikroskopii świetlnej z użyciem 0,4% roztworu błękitu 

trypanu w soli fizjologicznej (Sigma-Aldrich) w komorze 

hemocytometrycznej Neubauera przy użyciu mikroskopu 

odwróconego Axiovert 40CFL (Zeiss). 

Warunki traktowania hodowli komórkowych badanymi modulatorami 

ekspresji żelatynaz 

Komórki nowotworowe w prowadzonych hodowlach in 

vitro poddawano działaniu wybranych modulatorów ekspresji 

MMP z grupy tetracyklin: hyklatu doksycykliny (Sigma- 

Aldrich), chlorowodorku oksytetracykliny (Sigma-Aldrich), 

chlorowodorku tetracykliny (Polfa Tarchomin) i limecykliny 

(Galderma). Odpowiednią liczbę komórek wysiewano na płytki 

hodowlane 96-dołkowe lub 24-dołkowe i inkubowano przez 

noc. Następnego dnia usuwano pożywkę, przepłukiwano płytki 

2-krotnie roztworem Dulbecco PBS (DPBS), po czym dodawano 

świeżo przygotowaną pożywkę bez surowicy zawierającą 

odpowiednie stężenia badanych modulatorów. Zastosowano 

następujące stężenia badanych tetracyklin w kolejnych procedurach 

badawczych: testy MTT - 200µM, 100µM, 50µM, 

25µM, 12,5µM, 6µM, 3µM; zymografia, RT-PCR - 50µM, 

12,5µM, 3µM; badanie adhezji komórek do matriżelu, wound 

healing assay - 50µM, 25µM, 12,5µM, 6µM, 3µM. Czas traktowania 

hodowli w teście cytotoksyczności (MTT) wynosił 6h, 

12h i 24h; dla pozostałych badań - 24 godziny. Wyniki badań 

odnoszono do odpowiednich hodowli kontrolnych prowadzonych 

w identycznych warunkach jak hodowle badane, jednak 

bez dodatku żadnego z badanych modulatorów. 

Badanie cytotoksyczności testem MTT 

Liczbę żywych komórek w badanych hodowlach oceniano 

za pomocą testu cytotoksyczności MTT (Sigma-Aldrich). 

Komórki badanych linii wysiewano na płytki hodowlane 96- 

dołkowe (20 tys. kom./dołek). Po przeprowadzeniu inkubacji 

18


w pożywce zawierającej odpowiedni modulator w badanym 

stężeniu, pożywkę usuwano, przepłukiwano hodowle roztworem 

DPBS, po czym dodawano do każdego dołka po 100 

μl RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej zawierające substrat 

bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy 

(MTT) w stężeniu 0,5 mg/ml. Płytki inkubowano przez 2 godziny, 

a następnie dodawano po 100 μl mieszaniny etanol- 

DMSO (1:1) w celu rozpuszczenia barwnych kryształów produktu 

redukcji MTT (formazanów). Po 2-godzinnej inkubacji 

dokonywano pomiarów spektralnych w czytniku mikropłytek 

Triad LT (Dynex) przy fali długości 570 nm. 

Oznaczanie ekspresji mRNA żelatynaz techniką Real-Time 

RT-PCR 

Ekspresję genów kodujących żelatynazy: MMP-2 

i MMP-9 na poziomie mRNA określono stosując ilościową 

technikę RT-PCR z detekcją w czasie rzeczywistym (Real-Time 

RT-PCR) z użyciem barwnika fluorescencyjnego 

SYBR Green I. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziło: 

2 μl 10x buforu A, 2 μl (4 μl w przypadku MMP-2) 25 mM 

MgCl 2 

, po 1,35 μl 3 μM roztworów starterów F i R, 0,7 μl 

1x SYBR Green I, 0,1 μl odwrotnej transkryptazy Multiscribe 

RT (50 U/μl), 0,1 μl polimerazy DNA Ampli TaqGold 

(5 U/μl), 160 ng matrycowego RNA oraz wodę do 20 μl. 

Wszystkie odczynniki zakupiono w Applied Biosystems, 

z wyjątkiem starterów (IBB PAN, Warszawa) oraz SYBR 

Green I (Invitrogen). Skład mieszaniny reakcyjnej dla każdego 

badanego transkryptu był identyczny z wyjątkiem 

starterów, których sekwencje były specyficzne dla danego 

mRNA badanego genu. Zastosowano następujące sekwencje 

starterów: do detekcji mRNA MMP-2 starter F (forward, 

sensowy): 5’CAGGGAGCGCTACGATGGAG3’, 

starter R (reverse, antysensowy): 5’TCCTTGGGGCAGC- 

CATAGAA 3’ (sekwencje zaprojektowane w programie 

EMBOSS); dla mRNA MMP-9 starter F: 5’GCTCAC- 

CTTCACTCGCGTG3’, starter R: 5’CGCGACACCA- 

AACTGGATG3’ [11]. Równocześnie, w każdej próbce 

prowadzono detekcję mRNA genu kontrolnego - β-aktyny 

stosując dostępny komercyjnie zestaw starterów o sekwencjach: 

F: 5’TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA3’, 

R: 5’CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3’. Matrycę 

w reakcjach RT-PCR stanowiły ekstrakty RNA z komórek 

badanych hodowli in vitro uzyskane metodą fenolowo-chloroformową 

przy użyciu odczynnika Tri-Reagent (Sigma-Aldrich). 

Profil termiczny reakcji był następujący: 48ºC przez 

30 minut (RT), 95ºC 10 min., następnie 40 cykli złożonych 

z 30-sekundowej inkubacji w 95ºC i 1-minutowej inkubacji 

w 60ºC, po czym przeprowadzano końcową elongację 

przez 10 min., w 72ºC. Wszystkie analizy przeprowadzono 

w aparacie Mx3000P (Stratagene). Zmianę ekspresji MMP-2 

i MMP-9 określano metodą ΔΔCt w odniesieniu do poziomu 

mRNA genu β-aktyny jako kontroli endogennej. Jako kalibrator 

w metodzie ΔΔCt posłużyły hodowle kontrolne (nie 

traktowane żadnym z modulatorów). 

Zymograficzna detekcja żelatynaz 

Ekspresję żelatynaz MMP-2 i MMP-9 na poziomie białka 

określono wykorzystując elektroforezę w żelu poliakrylamidowym 

z dodatkiem żelatyny. Do studzienek 10% żeli 

poliakrylamidowych z SDS i żelatyną (2 mg/ml) nakładano 

po 30 μl mieszaniny złożonej z równych ilości 2x roztworu 

obciążającego (0,125 M Tris-HCl, pH=6,8; 20% glicerol; 

4% SDS; 0,01% błękit bromofenolowy) i supernatantów 

z badanych hodowli uprzednio zagęszczonych za pomocą 

kolumienek chromatograficznych Vivaspin 500 (Sigma-Aldrich). 

Po przeprowadzeniu rozdziału elektroforetycznego 

w buforze elektroforetycznym (1% SDS, 20 mM Tris, 190 

mM glicyna; pH=8,3), żele 3-krotnie płukano w buforze renaturującym 

(2,5% Triton X-100), a następnie żele te inkubowano 

w buforze rozwijającym (50 mM Tris-HCl, pH=7,5; 

200 mM NaCl; 5 mM CaCl 2 

; 2 μM ZnSO 4 

; 0,02% Brij-35) 

w temp. 37°C przez 48 godzin. Po inkubacji żele barwiono 

przez noc w 0,5% roztworze błękitu Coomassie. Następnego 

dnia żele odbarwiano w mieszaninie metanolu, kwasu octowego 

i wody (5:4:1). Zymogramy rejestrowano w systemie 

dokumentacji żelowej LabWorks 4.0 (Cambridge, UK). 

Badanie adhezji komórek nowotworowych do podłoża matrigel 

Do badania adhezji wykorzystano płytki hodowlane 96- 

dołkowe pokryte matriżelem (BD Matrigel Cellware Basement 

Membrane, Becton-Dickinson). Warstwa macierzy pozakomórkowej 

wynosiła 100µg/cm 2 . Po 24 h stymulacji modulatorami 

w podanym zakresie stężeń (od 50µM do 3µM), komórki 

odklejano, wirowano, a następnie zawieszano w 2% RPMI. 

Do każdej studzienki dodawano po 0,1 ml zawiesiny komórek 

(w stężeniu 200 tys/100µl). Płytki inkubowano przez 2 godziny 

w temp. 37°C. Po inkubacji 2 razy przepłukiwano studzienki 

roztworem DPBS. Komórki utrwalano w roztworze Cytofix 

(0,05 ml 4% paraformaldehydu w DPBS na każdą studzienkę) 

przez 30 min. Następnie usuwano utrwalacz i przeprowadzano 

barwienie (0,05 ml 0,1% roztworu fioletu krystalicznego 

w DPBS) przez 30 min. Po wybarwieniu przepłukiwano każdą 

studzienkę dwukrotnie roztworem DPBS. Płytki analizowano 

w mikroskopie odwróconym Axiovert 40CFL (Zeiss). 

Badanie migracji i ruchliwości komórek nowotworowych 

testem Wound Healing Assay 

Komórki badanych linii wysiewano na 24-dołkowe płytki 

i prowadzono hodowlę przez około 48 godzin do uzyskania 

konfluentnych hodowli. Następnie w każdej studzience 

wykonywano rysę o szerokości 1 mm, po czym dwukrotnie 

intensywnie przepłukiwano płytkę roztworem PBS. Bezpośrednio 

po wykonaniu rysy rozpoczęto traktowanie komórek 

badanymi modulatorami w podanym zakresie stężeń 

(50-3 μM). Po 24 godzinach usuwano pożywkę i dodawano 

świeże, pełne medium. Obserwacje prowadzono przez kolejne 

24 godziny prowadząc dokumentację za pomocą mikroskopu 

odwróconego Axiovert 40CFL (Zeiss). 

Analiza statystyczna 

Dane ilościowe porównano za pomocą analizy wariancji 

(ANOVA). Do obliczeń wykorzystano program STATISTI- 

CA 6,0. 

Wyniki badań 

Po przeanalizowaniu wyników testów MTT dla badanych 

tetracyklin w zakresie stężeń 200 µM - 3 µM, nie prowadzono 

dalszych badań z zastosowaniem stężenia 200 µM 

19


Ryc. 1. Wykres zależności absorbancji od stężenia doksycykliny, 

oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny po 

24 godzinach w hodowlach komórek linii A549 

i T24. przedstawiono wartości średnie +/- odchylenie 

standardowe. * - istotna statystycznie różnica w odniesieniu 

do hodowli kontrolnej. 

i 100 µM, ponieważ stężenia te powodowały zbyt 

silny efekt cytotoksyczny w stosunku do hodowli 

komórkowych linii A549 i T24, co uniemożliwiałoby 

wiarygodną analizę badań inwazyjności. 

Wybrano także optymalny czas traktowania 

hodowli badanymi tetracyklinami (24 godziny). 

Zakres działania cytotoksycznego obserwowany 

w testach MTT dość istotnie różnił się pomiędzy 

poszczególnymi badanymi modulatorami (Ryc. 

1). 

Badania poziomu ekspresji genów MMP-2 

i MMP-9 na poziomie mRNA dokonano za pomocą 

ilościowej techniki RT-PCR z detekcją w czasie 

rzeczywistym. Zastosowano metodę relatywnej 

oceny ekspresji genów (ΔΔCt) w odniesieniu do 

ekspresji genu β-aktyny. W przypadku linii A549 

wykazano spadek poziomu ekspresji genu MMP-2 

po stymulacji wszystkimi z zastosowanych tetracyklin 

przy niemal wszystkich stężeniach 

(Ryc. 2). Obniżenie ekspresji genu MMP-9 na poziomie 

istotnym statystycznie wykazano po zastosowaniu 

limecykliny w stężeniu 3 µM (p

Ryc. 3. Zymogramy przedstawiające aktywność proteolityczną żelatynaz MMP-2 

i MMP-9 w supernatantach z hodowli komórkowych linii A549 (ryc. A) i T24 (ryc. 

B) po 24 godzinach traktowania doksycykliną, oksytetracykliną, tetracykliną 

i limecykliną. 

Ryc. 4. Wykres zależności ilości komórek ulegających adhezji po podłoża 

matriżel od stężenia doksycykliny, oksytetracykliny, tetracykliny i limecykliny po 

24 godzinach hodowli komórek linii A549 i T24 (* - istotna statystycznie różnica 

w odniesieniu do hodowli kontrolnej). 

wieństwie do linii A549, w komórkach linii T24 obie metaloproteazy 

wykazywały podobną aktywność. W przypadku obu 

badanych linii komórkowych obserwowano obniżenie intensywności 

prążków wraz ze wzrostem stężenia zastosowanych 

modulatorów. Opisana zależność miała charakter krokowy 

(gradacyjny), co wskazuje na zmiany aktywności MMP 

w sposób zależny od dawki stosowanego modulatora. Bardzo 

słabo widoczne były prążki odpowiadające metaloproteazom 

MMP-2 i MMP-9 przy 50 µM stężeniu doksycykliny. 

Wskazuje to bądź na działanie cytotoksyczne doksycykliny 

w stosowanym stężeniu - co dodatkowo znalazło odzwierciedlenie 

w badaniach za pomocą testu MTT - lub bardzo 

wysokie zahamowanie ekspresji MMP. 

Do oceny wpływu badanych modulatorów na fenotyp 

komórek linii A459 i T24 posłużono się badaniem adhezji 

komórek nowotworowych do podłoża matriżel – testu 


stosowanego w badaniach adhezji, propagacji, 

wzrostu oraz podziałów komórkowych - oraz 

testem Wound Healing Assay – stosowanego 

w analizie migracji i ruchliwości komórek nowotworowych. 

Badanie adhezji komórek do 

podłoża matriżel po traktowaniu komórek oksytetracykliną 

wykazało, że nie ma ona wpływu 

na adhezję komórek linii A549 (p=0,078) i T24 

(p=0,196) do podłoża, bądź różnica w stopniu 

adhezji w porównaniu z kontrolą jest na granicy 

istotnych statystycznie różnic; jedynie w stężeniu 

3 μM wykazano spadek adhezyjności komórek 

linii A549 (p=0,016). Doksycyklina indukowała 

wzrost adhezyjności w stężeniu 3 μM w hodowlach 

komórek linii T24 (p=0,040). Limecyklina 

w największym użytym stężeniu (50 μM) indukowała 

istotne obniżenie adhezyjności komórek linii 

A549 (p=0,003), natomiast w pozostałych stężeniach 

nie wykazano istotnego wpływu na komórki 

obu badanych linii. Co ciekawe, zaobserwowano 

wzrost stopnia przylegania komórek linii T24 do 

powierzchni matrigelu po stymulacji tetracykliną 

w najniższych użytych w badaniu stężeniach, tj. 

6 μM i 3 μM. Natomiast w stosunku do komórek linii 

A549 wykazano istotne obniżenie adhezyjności 

w stężeniach 12,5 μM (p=0,028), 6 μM (p=0,022) 

i 3 μM (p=0,008) (Ryc. 4). Badanie za pomocą Wound 

Healing Assay wykazało zmiany, jakie zaszły 

w adherentnych hodowlach komórek linii A549 

i T24 po stymulacji zastosowanymi modulatorami. 

W trakcie prowadzonego badania zaobserwowano 

brak całkowitego zarastania rysy przez komórki 

linii A549 o niskim potencjale migracyjnym, a po 

24 godzinach obumieranie hodowanych komórek 

tworzących zbyt gęste skupiska (Ryc. 5). W hodowlach 

obu linii komórkowych zaobserwowano 

cytotoksyczne działanie doksycykliny w stężeniu 

50 μM (obserwacje mikroskopowe). W przypadku 

pozostałych antybiotyków zauważono wyraźną 

zależność stopnia zarastania rysy od stężenia badanego 

modulatora - im większe stężenie tetracyklin, 

tym mniejszy stopień zarastania rysy. Zauważono 

również różnicę w potencjale migracyjnym 

i inwazyjności komórek linii A549, które nie zarastały 

całkowicie rysy, a po 24 godzinach hodowli 

obumierały, a komórkami linii T24, które po prowadzeniu 

hodowli przez 72 godziny całkowicie zarastały rysę. 

Dyskusja 

Rak płuc i rak pęcherza moczowego są jednymi z najczęściej 

występujących nowotworów charakteryzującymi 

się wysokim potencjałem przerzutowym oraz inwazyjnością 

[12, 13]. Stąd też do badań opisanych w pracy wykorzystano 

ustalone linie komórkowe A549 i T24 stanowiące modele 

eksperymentalne in vitro wymienionych nowotworów. Hodowle 

badanych linii posłużyły do oceny wpływu wybranych 

tetracyklin na procesy związane z inwazyjnością komórek 

nowotworowych. W pierwszej kolejności przeprowadzono 

testy cytotoksyczności (MTT), pozwalające na wyznacze- 

21


5a 

5b 

Ryc. 5. Zdjęcia przedstawiające zmiany, jakie zaszły w przeciągu 72 godzin 

w hodowli komórek linii T24 (ryc. 5a) oraz 24 godzin hodowli komórek linii A549 

(ryc. 5b) po stymulacji doksycykliną. Na zdjęciach z hodowli po traktowaniu 

doksycykliną w stężeniu 50µM dostrzegalny jest wyraźny efekt cytotoksyczny 

(potwierdzony testem MTT). W przypadku pozostałych stężeń widać wyraźną 

zależność stopnia zarastania wolnej powierzchni naczynia hodowlanego od 

stężenia modulatora. W trakcie prowadzonego badania zaobserwowano brak 

całkowitego zarastania powierzchni przez komórki linii A549, a po 24 godzinach 

obumieranie hodowanych komórek tworzących zbyt gęste skupiska. 

nie optymalnych stężeń oraz czasu ekspozycji komórek na 

badane tetracykliny, a także na opisanie ogólnego wpływu 

badanych modulatorów na proliferację i apoptozę komórek 

nowotworowych linii raka płuc i raka pęcherza. Szczególnie 

wysoki efekt cytotoksyczny w stosunku do badanych linii 

nowotworowych wykazywała doksycyklina, co znajduje 

potwierdzenie w danych literaturowych [14, 15, 16]. 

Przedstawione wyniki w części dotyczącej wpływu doksycykliny 

na ekspresję genu MMP-9 dla linii T24 znalazły 

odzwierciedlenie w badaniach prowadzonych przez Hanemaaijer 

i wsp. na komórkach śródbłonka (HUVEC) oraz 

fibroblastach izolowanych z torebki stawowej [17]. Z kolei 

inne badania dotyczące ekspresji mRNA MMP-2 i MMP-9 

w tętniaku aorty brzusznej wykazał trzykrotne obniżenie 

ekspresji MMP-2 i czterokrotne obniżenie ekspresji MMP-9 

w ścianie aorty po zastosowaniu doksycykliny [18]. Analogię 

w stosunku do prowadzonych badań znaleziono również 

w analizie wpływu doksycykliny na komórki czerniaka 

linii B16, w których wykazano obniżenie ekspresji genów 

MMP-2 i MMP-9 po zastosowaniu tego modulatora aktywności 

w porównaniu z kontrolą. Łączyło się to z zahamowaniem 

wzrostu guza o 35,63% [15]. Inne badania 

pokazały, że doksycyklina w farmakologicznie 

dostępnych, nietoksycznych dawkach hamuje 

syntezę mRNA, produkcję i aktywację MMP-9 

stymulowaną przez TGF-β w komórkach nabłonka 

rogówki [19]. Wyniki te korespondują 

z badaniami przeprowadzonymi przez szereg 

ośrodków dotyczących wpływu doksycykliny 

i jej modyfikowanych analogów na aktywność 

MMP-2 i MMP-9 z zastosowaniem różnych linii 

komórkowych [15, 16, 19, 20]. Wpływ pozostałych 

tetracyklin (oksytetracyklina, tetracyklina 

i limecyklina) nie jest praktycznie opisywany 

w literaturze w kontekście nowotworów. 

Głównym problemem badawczym w przedstawionej 

pracy stanowiła analiza wpływu badanych 

modulatorów ekspresji MMP na inwazyjność 

komórek nowotworowych. Zjawisko 

inwazyjności warunkują przede wszystkim takie 

cechy, jak potencjał metastatyczny i proangiogenny 

guzów pierwotnych. Są one wynikiem 

aktywacji szlaków molekularnych uczestniczących 

w procesie pokonywania bariery błony 

podstawnej oraz śródbłonka sąsiadujących naczyń 

krwionośnych przez komórki nowotworowe, 

a z drugiej strony zwiększenia ekspresji białek 

powierzchniowych związanych z adhezją, co 

zapewnia komórkom nowotworu zagnieżdżenie 

w nowym miejscu organizmu i utworzenie guza 

wtórnego [21]. Niedostateczna siła oddziaływania 

komórek nowotworu z otaczającym środowiskiem 

zewnętrznym nie tylko uniemożliwia 

rozwój powstającego przerzutu, ale także śmierć 

komórek nowotworowych na drodze opisanej 

jako anoikis, czyli zależnej od adhezji. Uzyskane 

wyniki wskazują przede wszystkim na inhibitorowy 

wpływ tetracyklin w procesach migracji 

komórek nowotworowych linii A549 i T24. 

natomiast w przypadku analizy adhezji komórek 

do białek macierzy pozakomórkowej (matrigel) 

wpływ tetracyklin nie jest jednoznaczny – wykazano zarówno 

hamowanie, jak i stymulację adhezji. Wykazano, iż 

wpływ tetracyklin na opisane procesy związany był z wyciszeniem 

ekspresji metaloproteaz MMP-2 i MMP-9 (zarówno 

na poziomie mRNA, jak i białka). Należy podkreślić, iż 

w badaniach przeanalizowano wpływ badanych tetracyklin 

na ekspresję najczęściej opisywanych w literaturze metaloproteaz 

– żelatynazy A i B - o najszerzej opisanym związku 

z rozwojem nowotworów złośliwych. Jednak badane modulatory 

z grupy tetracyklin wpływają także na ekspresję 

i/lub aktywność również wielu innych enzymów z tej grupy, 

co podkreślono we wstępie. Badane efekty wyciszenia ekspresji 

MMPs są więc z pewnością sumarycznym efektem 

wpływu tetracyklin na wiele różnych metaloproteaz. 

Otrzymane wyniki potwierdzają doniesienia innych autorów. 

Chetty i wsp. wykazali, że genowo-specyficzne wyciszenie 

ekspresji MMP-2 za pomocą RNAi powoduje obniżenie 

migracji komórek raka płuc A549 przez matrigel oraz 

angiogenezy in vitro, a in vivo (u myszy) obniżenie tempa 

przerzutowania [22]. Wpływ doksycykliny na różne aspek- 

22


ty nowotworzenia jest opisany w literaturze najlepiej ze 

wszystkich tetracyklin. Wykazano między innymi, iż hamuje 

ona o 28% stopień zagnieżdżania się komórek raka piersi 

w kościach u myszy [23], a także w istotny sposób hamuje 

rozwój przerzutów czerniaka u myszy poprzez obniżenie 

ekspresji MMP-2 i MMP-9 i związane z tym zahamowanie 

angiogenezy [15]. Według Franco i wsp. doksycyklina (31 

i 104 μM) hamuje o 20% migrację komórek mięśniowych 

in vitro w teście wound healing assay, a także adhezyjność 

tych komórek do podłoża pokrytego białkami macierzy pozakomórkowej 

[24]. Inhibitory metaloproteaz - Col-3 (Metastat 

- modyfikowana pochodna doksycykliny) i AG1478 

(bloker receptora EGF) - wykazują istotny wpływ hamujący 

inwazyjność komórek raka tarczycy in vitro poprzez zahamowanie 

ekspresji MMP-2 [16]. Col-3 oraz inne modyfikowane 

pochodne tetracyklin wpływają także hamująco na 

inwazyjność komórek raka prostaty in vitro oraz stopień ich 

przerzutowania [14]. 

Wnioski 

• Potwierdzono hamujący wpływ doksycykliny na ekspresję 

żelatynazy A i B na poziomie mRNA i białka. 

Podobny, choć słabszy efekt wykazały inne tetracykliny 

(oksytetracyklina, tetracyklina, limecyklina). 

• Badane tetracykliny hamowały migrację komórek nowotworowych 

A549 i T24 w sposób zależny od dawki. 

• Wpływ badanych tetracyklin na procesy adhezji komórek 

nowotworowych A549 i T24 nie był wyraźny i istotnie 

różnił się w zależności od typu badanego związku 

oraz jego stężenia. 

Dziękujemy pracownikom Katedry Analizy Instrumentalnej 

za udostępnienie czytnika mikropłytek. 


1. Deryugina E, Quigley J. Matrix metalloproteinases and 

tumor metastasis. Cancer Metastasis Rev 2006; 25: 9-34. 

2. Jodele S i wsp. Modifying the soil to affect the seed: role 

of stromal-derived matrix metalloproteinases in cancer 

progression. Cancer Metastasis Rev 2006; 25: 35-43. 

3. Stefanidakis M, Koivunen E. Cell-surface association 

between matrix metalloproteinases and integrins: role of 

the complexes in leukocyte migration and cancer progression. 

Blood 2006; 108: 1441-50. 

4. Pavlaki M, Zucker S. Matrix metalloproteinases inhibitors(M- 

MPIs): the beginning of phase I or the termination of phase III 

clinical trials. Cancer Metastasis Rev 2003; 22: 177-203. 

5. Ramnath N, Creaven P. Matrix metalloproteinases inhibitors. 

Curr Oncol Rep 2004; 6: 96-102. 

6. Pirard B. Insight into the structural determinants for selective 

inhibition of matrix metalloproteinases. Drug Discover 

Today 2007; 12: 640-6. 

7. Chakraborti S i wsp. Regulation of matrix metalloproteinases: 

an overview. Mol Cell Biochem 2003; 253: 269-85. 

8. Chu Q i wsp. A phase II and pharmacological study of 

the matrix metalloproteinase inhibitor (MMPI) COL-3 

in patients with advanced soft tissue sarcomas. Invest 

New Drugs 2007; 25: 359-67. 

9. Syed S i wsp. A phase I and pharmacokinetic study of 

Col-3 (Metastat), an oral tetracycline derivative with potent 

matrix metalloproteinase and antitumor properties. 

Clin Cancer Res 2004; 10: 6512-21. 

10. Reese R, Betts R, Gumustop B. Handbook of antibiotics. 

Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia 2000. 

11. Quintero M i wsp. Nitric oxide is a factor in the stabilization 

of hypoxia-inducible factor-1α in cancer: role of 

free radical formation. Cancer Res 2006; 66: 770-4. 

12. Goodman G. Lung cancer 1: prevention of lung cancer. 

Thorax 2002; 57: 994-9. 

13. Pashos C i wsp. Bladder cancer: epidemiology, diagnosis, 

and management. Cancer Pract 2002; 10: 311-22. 

14. Lokeshwar B i wsp. Inhibition of cell proliferation, invasion, 

tumor growth and metastasis by an oral non-antimicrobial 

tetracycline analog (Col-3) in a metastatic 

prostate cancer model. Int J Cancer 2002; 98: 297-309. 

15. Sun B i wsp. Doxycycline influences microcirculation patterns 

in B16 melanoma. Exp Biol Med 2007; 232: 1300-7. 

16. Yeh M i wsp. Differentiated thyroid cancer cell invasion 

is regulated through epidermal growth factor receptor-dependent 

activation of matrix metalloproteinase 

(MMP)-2/gelatinase A. Endocrine-Related Cancer 2006; 

13: 1173-83. 

17. Hanemaaijer R i wsp. Inhibition of MMP synthesis by doxycycline 

and chemically modified tetracyclines (CMTs) in 

human endothelial cells. Adv Dent Res 1998; 12: 114-8. 

18. Thompson R, Baxter B. MMP inhibition in abdominal 

aortic aneurysm. Rationale for a prospective randomized 

clinical trial. Ann N Y Acad Sci 1999; 878: 159-78. 

19. Kim H i wsp. Doxycycline inhibits TGF-β1-induced 

MMP-9 via Smad and MAPK pathways in human corneal 

epithelial cells. Invest Ophtalmol Vis Sci 2005; 46: 840-8. 

20. Fiotti N i wsp. Short term effects of doxycycline on matrix 

metalloproteinases 2 and 9. Cardiovasc Drugs Ther 

2009; 23: 153-9. 

21. Ziober L, Silverman S, Kramer R. Adhesive mechanisms 

regulating invasion and metastasis in oral cancer. Crit 

Rev Oral Biol Med 2001; 12: 499-510. 

22. Chetty C i wsp. Adenovirus-mediated small interfering 

RNA against matrix metalloproteinase-2 suppresses tumor 

growth and lung metastasis in mice. Mol Cancer 

Ther 2006; 5: 2289-99. 

23. Duivenvoorden W i wsp. Doxycycline decreases tumor 

burden in a bone metastasis model of human breast cancer. 

Cancer Res 2002; 62: 1588-91. 

24. Franco C i wsp. Doxycycline alters vascular smooth muscle 

cell adhesion, migration, and reorganization of fibrillar 

collagen matrices. Am J Pathol 2006; 168: 1697-1709. 


Dr n. farm. Daniel Sypniewski 

Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej ŚUM 

ul. Narcyzów 1; 41-200 Sosnowiec 

tel. (032) 364-10-02, e-mail: dsypniewski@sum.edu.pl 

23


Przeciwbakteryjne działanie galanginy zawartej w propolisie 

w stosunku do bakterii Gram-dodatnich 

The antibacterial activity of galangin in propolis 

against Gram-possitive bacteria 

Robert Kubina 1 , Agata Kabała-Dzik 1 , Robert D. Wojtyczka 2 , Ewa Szaflarska-Stojko 1 

1 

Katedra i Zakład Patologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej 

Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach 

2 

Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej 


Streszczenie 

Jedną z podstawowych i zarazem najlepiej poznanych 

funkcji propolisu jest jego działanie przeciwbakteryjne. 

Wrażliwość na propolis wykazują zarówno bakterie 

Gram-dodatnie jak i Gram-ujemne. Jego przeciwbakteryjne 

właściwości są możliwe na skutek występowania wielu 

substancji chemicznych takich jak: flawonoidy, trójterpeny 

oraz estry kwasów fenolowych. 

Flawonoidy to związki organiczne bardzo rozpowszechnione 

w przyrodzie pochodzenia głównie roślinnego 

o charakterze barwników. Najczęściej mają kolor żółty. 

Związki te mogą występować samodzielnie, jako aglikony 

lub w połączeniu z cukrami, jako tak zwane glikozydy 

flawonoidowe. Ogólna zawartość flawonoidów w czystym 

propolisie stanowi około 4,4 % -10,8%. 

Jednym z flawonoidów zasługujących na szczególną uwagę 

jest galangina. Jest ona związkiem pochodzenia naturalnego 

należącym do jednej z grup flawonoidów zwanej 

flawonolami. Liczne doniesienia literaturowe sugerują, że 

galangina zawarta w kicie pszczelim działa bakteriostatycznie 

zarówno na szczepy Staphylococcus aureus wrażliwe 

na działanie antybiotyków, jak również wykazuje 

działanie na szczepy MRSA oporne na działanie metycyliny 

(ang. methicillin-resistant S. aureus – MRSA). 

Summary 

One of the most basic and simultaneously the most meticulously 

examined function of propolis (bee glue) is its 

antibacterial activity. Both Gram-positive and Gram-negative 

bacteria demonstrate susceptibility to propolis. Its 

antibacterial properties exist as a result of occurence of a 

number of chemical substances such as flavonoids, triterpens 

and acid phenolic esters. 

Flavonoids are chiefly plant-derived organic compounds 

of stain character that prevail in nature. In most cases they 

are yellow in colour. These compounds may occur independently 

as aglycones or in connection with saccharides 

as so-called flavonoid glycosides. Total content of flavonoids 

in pure propolis constitutes ca. 4,4% - 10,8%. 

One of the flavonoids that is worth closer examination is 

galangin. It is a natural compaund belonging to flavonols 

that are a class of flavonoids. Numerous studies suggest 

that galangin contained in bee glue exerts a bacteriostatic 

effect not only on Staphylococcus aureus bacterial strains 

that are susceptible to antibiotic actions but also on 

MRSA (methicillin-resistant S. aureus) bacterial strains 

that are methicillin-resistant. 

Key words: propolis, galangin, antibacterial activity 

Słowa kluczowe: propolis, galangina, działanie przeciwbakteryjne 

Rozwój nauk analitycznych oraz farmakognozji przyczynił 

się do ponownego wzrostu zainteresowania produktami 

pochodzenia naturalnego. Substancje biogenne zawarte 

w surowcach roślinnych oraz zwierzęcych od wieków wykorzystywane 

są w medycynie. Jednym z produktów wytwarzanych 

przez pszczoły jest propolis (kit pszczeli). Jego 

barwa i skład zależy nie tylko od gatunku drzew, z których 

zbierana jest żywica, ale także od rasy pszczół, okresu zbioru 

oraz od miejsca oblotu pszczół. Do niedawna sądzono, że 

skład jakościowy propolisu zależy od miejsca pochodzenia. 

Obecnie jednak wiadomo, że rejon świata, z którego pszczo- 

ły pozyskują pyłek wpływa jedynie na ilościową zawartość 

substancji biologicznie czynnych. 

Barwa propolisu może być zróżnicowana od brązowoczerwonej 

poprzez brązową i żółtą aż po zielonkawą. Surowiec 

kitu pszczelego przynoszony jest do ula w postaci 

kropel żywicy umieszczonej w koszyczkach odnóży pszczół 

lotnych, a następnie przeżuwany przez pszczoły stacjonarne, 

które modyfikują jego skład wydzieliną gruczołów ślinowych 

i woskowych zwiększając w ten sposób jego aktywność farmakologiczną. 

Do drzew europejskich, które stanowią źródło 

propolisu zalicza się topolę (Populus sp.), wierzbę (Salix sp.), 

24


wiąz (Ulmus sp.), jesion (Fraxinus sp.), dąb (Quercus sp.) 

oraz kasztanowca zwyczajnego (Aesculus hippocastanum). 

Propolis ze względu na swoje właściwości wykorzystywany 

jest przez pszczoły do wyścielania wnętrza ula oraz 

uszczelniania jego struktur. Stanowi on swoistą barierę 

chroniącą wnętrze ula przed wszelkiego rodzaju drobnoustrojami. 

Pozwala to przede wszystkim ochraniać złożone 

jaja oraz stwarzać odpowiedni mikroklimat potrzebny do 

prawidłowego rozwoju czerwiu. 

Propolis zawiera wiele biologicznie czynnych substancji 

chemicznych, wśród których należy wymienić: aglikony 

flawonoidów, kwasy aromatyczne (wśród nich związki 

fenolowe), estry aromatyczne, kwasy alifatyczne, alkohole, 

ketony, węglowodory, terpeny, substancje lipidowo-woskowe, 

enzymy, cukry, aminokwasy, witaminy, białka, olejki 

eteryczne oraz mikro i makroelementy [1]. 

Działanie przeciwbakteryjne propolisu 

Jedną z podstawowych i zarazem najlepiej poznanych funkcji 

propolisu jest działanie przeciwbakteryjne. Wrażliwość na 

działanie propolisu wykazują zarówno bakterie Gram-dodatnie 

jak i Gram-ujemne. Wśród ziarniaków Gram-dodatnich wrażliwych 

na działanie kitu pszczelego należy wymienić: gronkowca 

złocistego (Staphylococcus aureus) oraz paciorkowce takie 

jak: Streptococcus pneumoniae oraz Streptococcus pyogenes. 

Wśród pałeczek Gram-ujemnych wrażliwych na działanie tego 

apifarmakoterapeutyku wymienia się takie drobnoustroje jak: 

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aureginosa, 

poza tym wrażliwość wykazują także prątki gruźlicy 

Mycobacterium tuberculosis, oraz chorobotwórcze dla człowieka 

grzyby drożdżoidalne z rodzaju Candida (np. Candida 

albicans). Istniejące doniesienia wskazują jednak, iż propolis 

posiada silne właściwości przeciwbakteryjne w stosunku do 

bakterii Gram-dodatnich, jednak znacznie słabsze w stosunku 

do bakterii Gram-ujemnych [2]. 

Przeciwbakteryjne działanie propolisu jest możliwe 

na skutek występowania w nim takich substancji jak: flawonoidy, 

trójterpeny oraz estry kwasów fenolowych [3]. 

W propolisie zidentyfikowano już ponad 50 różnych flawonoidów 

zaliczanych do wszystkich pięciu grup chemicznych. 

Najczęściej występującymi flawonoidami w propolisie są: 

chryzyna, tektochryzyna, pinostrobina, apigenina i chalkon 

pinostrobinowy, rzadziej występują: galangina, kemferol, 

genkwanina oraz pinobanksyna. Wśród estrów kwasów fenolowych 

szczególne właściwości przeciwbakteryjne wykazują 

estry etylowe kwasu cynamonowego i kawowego oraz 

esty fenylometylowe kwasu benzoesowego [4]. 

Ogólna charakterystyka flawonoidów 

Flawonoidy to związki organiczne bardzo rozpowszechnione 

w przyrodzie pochodzenia głównie roślinnego o charakterze 

barwników. Najczęściej mają kolor żółty. Obecność między 

aromatycznymi atomami węgla układu heterocyklicznego 

γ-pironu pozwala zaliczyć te związki do pochodnych benzoγ-pironu, 

czyli chromonu. Związki te mogą występować samodzielnie, 

jako aglikony lub w połączeniu z cukrami, jako 

tak zwane glikozydy flawonoidowe [5]. 

Ze względu na budowę chemiczna wyróżnia się podklasy 

w klasie flawonoidów, takie jak: flawony, flawany, katechiny, 

flawanony, flawonole, flawanonole, chalkony oraz izoflawony. 

Z grupy flawonów najczęściej w propolisie można 

zidentyfikować: chryzynę, tektochryzynę oraz akacetynę. 

Spośród flawonoli wymienić należy: galanginę i kemferol. 

Grupa flawonów znajdujących się w kicie pszczelim stanowią 

przede wszystkim: pinostrobina oraz pinocembryna. 

W grupie flawonowów najlepiej poznana oraz najczęściej 

występująca jest pinobanksyna. Z grupy chalkonów poznano 

dotychczas chalkon pinostrobinowy i pinocembrynowy. 

Ogólna zawartość flawonoidów w czystym propolisie stanowi 

około 4,4 % -10,8% [6]. 

Flawonoidy ze względu na swoją różnorodność wykazują 

działanie m.in.: 

- antyoksydacyjne hamując aktywność lipooksygenaz 

i cyklooksygenaz i chelatując jony metali, co prowadzi 

do spadku wytwarzania reaktywnych form tlenu. 

- przeciwzapalne hamując kaskadę przemian kwasu arachidonowego 

- uszczelniające naczynia krwionośne hamując aktywność 

enzymów proteolitycznych 

- rozkurczowe (spazmolitycznie) 

- moczopędne poprzez drażnienie kanalików nerkowych 

i utrudnianie resorpcji zwrotnej w nerkach. 

- przeciwnowotworowe 

- immunomodulujące 

- przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe oraz przeciwpasożytnicze 

[7,8,9]. 

W przypadku działania przeciwdrobnoustrojowego poszukuje 

się mechanizmu molekularnego umożliwiającego 

flawonoidom zabijanie lub osłabianie bakterii. Wiadomo już, 

iż każda grupa, a nawet poszczególne flawonoidy oddziałują 

w odmienny sposób z komórkami bakteryjnymi. Udowodniono 

na przykład, że kwercetyna posiada zdolność bakteriobójczą 

dzięki hamowaniu gyrazy DNA bakterii. Obecnie w farmakologii 

klinicznej wykorzystuje się podobnego typu leki stosowane 

w zakażeniach bakteryjnych - fluorochinolony. Miejscem docelowym 

działania tych leków są dwa enzymy bakteryjne: gyraza 

DNA i topoizomeraza IV. Chemioterapeutyki te uniemożliwiają 

łączenie nici DNA, co powoduje zahamowanie biosyntezy 

białka. Kwercetyna hamując działanie gyrazy DNA wykazuje 

podobne działanie do fluorochinolonów [10,11,12]. 

Odmienny wpływ na komórki bakteryjne wykazuje np. 

sophoraflawon G. Flawonoid ten hamuje wzrost drobnoustrojów 

poprzez zaburzenie funkcji błony komórkowej. 

Kolejnym przykładem może być likochalkon A, mający 

działanie bakteriobójcze na skutek integracji w przemiany 

energetyczne drobnoustrojów. 

Istnieje jeszcze duża grupa flawonoidów, których mechanizm 

działania przeciwbakteryjnego nie jest jeszcze poznane. 

Wśród tych związków znajduje się między innymi 

jeden przedstawiciel flawonoli – galangina [10,13]. 

Galangina – przedstawiciel flawonoli 

Jednym z flawonoidów zasługujących na szczególną 

uwagę jest galangina. Jej międzynarodowa nazwa chemiczna 

to 3,5,7-trihydroksyflawon (Ryc. 1). 

Jest ona związkiem pochodzenia naturalnego należącym 

do jednej z grup flawonoidów zwanej flawonolami. Jest to 

25


Ryc. 1 Wzór chemiczny 

3,5,7-trihydroksyflawonu 

substancja odpowiedzialna 

za blokowanie iNOS 

mRNA podczas rozwoju 

stanu zapalnego, hamowanie 

replikacji wirusów oraz 

hamowanie rozwoju drobnoustrojów. 

Coraz częstsze 

problemy z lekoopornością 

bakterii spowodowały poszukiwanie 

nowych substancji 

pomocnych w leczeniu zakażeń bakteryjnych. Od 

kilkuset lat w Korei w przypadku przewlekłych zakażeń 

drobnoustrojami używa się wyciągu z orientalnego zioła 

Alpinia officinarum. Poznanie składu chemicznego tego wyciągu 

pozwoliło odkryć przeciedrobnoustrojowe właściwości 

galanginy. Flawonoid ten został także zidentyfikowany 

m.in. propolisie [14,15]. 

Liczne doniesienia literaturowe sugerują, że galangina zawarta 

w kicie pszczelim działa bakteriostatycznie zarówno na 

szczepy Staphylococcus aureus wrażliwe na działanie antybiotyków, 

jak również wykazuje działanie na szczepy MRSA oporne 

na działanie metycyliny (ang. methicillin-resistant S. aureus 

– MRSA) [16]. Badania przeprowadzone przez naukowców 

z zespołu Lee YS wykazały, iż stosowanie mieszaniny galanginy 

z dodatkiem gentamycyny znacznie obniżało minimalne 

stężenie hamujące antybiotyku (MIC) w stosunku do szczepów 

metycylinoopornych Staphylococcus aureus (MRSA)[17]. 

W swoich najnowszych opublikowanych wynikach badań 

Cushnie i wsp. [18,19] wykazali, że galangina może powodować 

aglutynację komórek bakteryjnych, co sugeruje, 

że miejscem docelowym działania tego flawonoidu jest błona 

cytoplazmatyczna. Mogłoby to oznaczać, iż galangina nie 

wykazuje właściwości bakteriostatycznych czy bakteriobójczych, 

lecz powoduje tylko zlepianie się bakterii. Jednakże 

dokładny mechanizm molekularny nie został jeszcze poznany. 

Prowadzone badania powinny jednak wkrótce odpowiedzieć 

na pytanie o właściwości biologiczne galanginy. 

Wykorzystanie naturalnych surowców farmakopealnych 

otrzymanych na drodze procesów biogennych stało się 

genezą powstania receptur wielu leków, bez których trudno 

sobie wyobrazić aktualną farmakoterapię. Do grupy tej 

między innymi zaliczyć należy: glikozydy nasercowe, leki 

hepatoprotekcyjne, czy starą, dobrą, odkrytą przez Flaminga 

a zmodyfikowaną przez następców penicylinę. Wśród 

współczesnych konwencjonalnych metod leczenia coraz 

większym uznaniem cieszy się jednak apiterapia wykorzystująca 

lecznicze działanie standaryzowanych czynnych farmakologicznie 

frakcji otrzymanych z produktów pszczelich. 

Artykuł ten przedstawia tylko jedno działanie kitu pszczelego 

– bakteriobójcze, jednakże spektrum działania propolisu jest 

bardzo duże. Do tej pory w propolisie odnaleziono ponad 250 

substancji chemicznych pochodzenia naturalnego, a do pełnego 

poznania składu tego apifarmakoterapeutyku oraz właściwości 

biologicznych pozostała jeszcze długa droga. 

Piśmiennictwo: 

1. Kędzia B. Skład chemiczny i aktywność biologiczna 

propolisu pochodzącego z różnych rejonów świata. Post 

Fitoter 2006; 1: 23-35. 

2. Velazqueza C i wsp. Antibacterial and free-radical scavenging 

activities of Sonoran propolis. J App Microbiol 

2007; 103: 1747-56. 

3. Lu LC, Chen YW, Chou CC. Antibacterial activity of 

propolis against Staphylococcus aureus. Int J Food Microbiol 

2005; 102: 213– 20. 

4. Cushnie TP i wsp. Investigation of the antibacterial activity 

of 3-o-octanoyl-(-)-epicatechin. J Appl Microbiol 

2008; 105: 1461-69. 

5. Miller E. Rola flawonoidów jako przeciwutleniaczy 

w organizmie człowieka. Pol Mer Lek 2008; 24; 556-60. 

6. Andryskowski G i wsp. Działanie flawonoidów na hodowlę 

tkankową prowadzoną w środowisku promieniotwórczego 

technetu. Wspol Okol 2002; 6: 548-50. 

7. Murray TJ, Yang X, Sherr DH. Growth of a human mammary 

tumor cell line is blocked by galangin, a naturally occurring 

bioflavonoid, and is accompanied by down-regulation of 

cyclins D3, E, and A. Breast Cancer Res 2006; 8: R17. 

8. Mishima S i wsp. Antihypertensive effects of brazilian 

propolis: Identification of Caffeoylquinic Acids as Constituents 

Involved in the Hypotension in Spontaneously 

Hypertensive Rats. Biol Pharm Bull 2005; 28: 1909-14. 

9. Sarić A i wsp. Antioxidant effects of flavonoid from Croatian 

Cystus incanus L. rich bee pollen. Food Chem Toxicol 

2009; 47: 547-54. 

10. Salomão K i wsp. Brazilian propolis: correlation between 

chemical composition and antimicrobial activity. Evid 

Based Complement Alternat Med 2008; 5: 317–24. 

11. Cushnie TP, Lamb AJ. Antimicrobial activity of flavonoids. 

Int J Antimicrob Agents 2005; 26: 343-56. 

12. Cushnie TP, Lamb AJ. Assessment of the antibacterial activity 

of galangin against 4-quinolone resistant strains of 

Staphylococcus aureus. Phytomedicine 2006; 13: 187-91. 

13. Cushnie TP, Hamilton VE, Lamb AJ. Assessment of the 

antibacterial activity of selected flavonoids and consideration 

of discrepancies between previous reports. Microbiol 

Res 2003; 158: 281-89. 

14. Luo H. Study on apoptosis of BEL-7402 cells induced 

by galangin. Zhong Yao Cai 2008; 31: 1204-07. 

15. Paulíková H, Berczeliová E. The effect of quercetin and 

galangin on glutathione reductase. Biomed Pap Med Fac 

Univ 2005; 149: 497-500. 

16. Ahn MR i wsp. Correlation between antiangiogenic activity 

and antioxidant activity of various components from 

propolis. Mol Nutr Food Res 2009; 53: 643-51. 

17. Lee YS i wsp. Synergistic effects of the combination of 

galangin with gentamicin against methicillin-resistant 

Staphylococcus aureus. J Microbiol 2008; 46: 283-88. 

18. Cushnie TP i wsp. Aggregation of Staphylococcus aureus 

following treatment with the antibacterial flavonol 

galangin. J Appl Microbiol 2007; 103: 1562-67. 

19. Cushnie TP, Lamb AJ. Detection of galangin-induced cytoplasmic 

membrane damage in Staphylococcus aureus by measuring 

potassium loss. J Ethnopharmacol 2005; 101: 243-48. 


mgr Robert Kubina, 

Katedra i Zakład Patologii, 

tel. 032 364-13-50 

e-mail: rkubina@sum.edu.pl 

26



Wpływ wodnego ekstraktu z kłączy Iris dichotoma Pall 

na aktywność mitotyczną ocenianą testem allium 

Influence of the water extract from rhizome of Iris dichotoma Pall 

on the mitotic activity of allium test cells 

1 

Otgonbaatar U., 1 Purevsuren G., 1 Oyun Z., 1 Narantsetseg G., 1 Khishgee D., 

1 

Urjin B., 2 Nowakowska J., 3 Machalska A., 4 Zobel A., 5 Kuraś M., 3 Głowniak K. 

1 

Institute of Traditional Medicine, Ulaanbaatar-20, 209, Mongolia 

2 

Uniwersytet Warszawski, Pracownia Mikroskopii Elektronowej 

3 

Akademia Medyczna w Lublinie, Katedra i Zakład Farmakognozji 

z Pracownią Roślin Leczniczych 

4 

Trent University, Peterborough, Ontario, K9J 7B8 Canada 

5 

Uniwersytet Warszawski, Zakład Ekotoksykologii 

Streszczenie 

W pracy przebadano wpływ wodnego ekstraktu z kłączy 

Iris doichotoma Pall. na merystemy wierzchołkowe 

korzeni, strukturę euchromatyny jąder interfazowych 

i chromosomów mitotycznych oraz aktywność podziałową 

komórek Testu Allium. Stwierdzono, że pod wpływem 

inkubacji w wysokich stężeniach ekstraktu, zarówno chromatyna 

jąder interfazowych jak i chromosomy podziałowe 

ulegały kondensacji, pogrubieniu i skróceniu. Procent 

dzielących się komórek ulegał początkowo redukcji 

a później całkowitemu zahamowaniu. 

Małe stężenia ekstraktów powodowały despiralizację 

chromatyny. Wzrastał procent dzielących się komórek. 

Mamy tu, zatem dwojakie działanie ekstraktów z kłączy 

Iris i można przypuszczać, że badany ekstrakt może mieć 

istotne znaczenie zarówno w zapobieganiu jak i leczeniu 

chorób nowotworowych związanych z modyfikacją indeksu 

mitotycznego i fazowego. 

Summary 

A water extract from rootstock of Iris dichotoma Pall. was 

used to investigate its effect on meristem cells of the root 

tips of the Allium Test. The structure of chromatin of the 

interphase nuclei was changed as compared to the control. 

The highest concentrations (16 and 8 mg/mL) caused 

condensation of chromatin. Dividing cells contained 

chromosomes shortened and thickened, but no chromosomal 

aberrations were visible. There was a decrease in the 

number of mitoses, and already after 24 hours total inhibition. 

The lowest concentrations caused despiralisation of 

chromatin, and the percentage of mitoses increased; thus 

a dual mechanism of reaction was found, which could be 

used for both stimulation and inhibition of mitoses, dependent 

on concentration. 

Key words: Iris dichotoma, extract from rhizome, change 

structure of chromatin, condensed and contracted chromosomes, 

modification of mitotic and phase index. 

Słowa kluczowe: Iris dichotoma, ekstrakty z kłączy, 

zmiana struktury chromatyny, kondensacja i kontrakcja 

chromosomów, modyfikacja indeksu mitotycznego i fazowego. 

Wstęp 

Żyjemy w dobie niezwykłego progresu chorób cywilizacyjnych 

(otyłość, cukrzyca, choroby nowotworowe, choroby 

serca i układu krążenia), wobec których w większości 

bezradna jest medycyna akademicka (konwencjonalna). 

W związku z tym obserwujemy bardzo dynamiczny rozwój 

fitochemii, pociągający za sobą, duże zainteresowanie 

lekami pochodzenia roślinnego i duże zapotrzebowanie na 

surowce roślinne o dużej zawartości poszukiwanych substancji. 

Szczególnie cennymi są tu rośliny odznaczające się 

właściwościami przeciwnowotworowymi. W większości są 

to rośliny egzotyczne pochodzące ze strefy klimatu tropikalnego, 

gdzie nadzwyczajnych właściwości leczniczych 

nabywają dzięki specyficznym warunkom glebowym i klimatycznym. 

Szczególne właściwości przypisuje się roślinom 

południowo-amerykańskim i śródziemnomorskim. Nie 

stanowi to jednak bezwzględnej reguły, bowiem na każdym 

kontynencie i nieomal w każdym zakątku naszego globu, 

znane są różnorodne leki roślinne używane powszechnie 

w ludowym lecznictwie. Do takich należy również, rosnący 

w ostrym klimacie pustynnym Mongolii Iris dichotoma Pall. 

Należy on do rodzaju Iridaceae i zawiera różne biologicznie 

czynne substancje, takie jak: kumaryny, saponiny, chinony [1], 

iridoidy [2], flawony i izoflawony [3] i inne, dzięki którym od 

lat używany jest w medycynie ludowej tego kraju (Ryc. 1). 

27


z 1938 r.) [4]. Stanowiły je komórki merystematyczne korzeni 

przybyszowych Allium cepa. Hodowano je w wodzie 

destylowanej w 300 ml naczyniach Erlenmayera w warunkach 

laboratoryjnych Zakładu Ekotoksykologii UW. Kiedy 

korzenie osiągnęły długość 3 cm (± 0,5 cm) wraz z cebulami 

przenoszono je do w/w roztworów w 50 ml zlewkach. 

Inkubację w nich prowadzono przez 12, 36, 60 i 84 godz. 

W celu zbadania wpływu ekstraktu na aktywność mitotyczną 

(indeks mitotyczny i fazowy) komórek Testu Allium 

w czasie eksperymentu odcinano wierzchołki korzeni 

(o długości ok. 2-3 mm), barwiono je i macerowano w 2% 

roztworze acetoorceiny z dodatkiem 1N HCl (w stosunku 9:1) 

i wykonywano preparaty gniecione na szkiełkach podstawowych. 

Indeks mitotyczny i fazowy obliczano według metody 

opisanej przez Lopez-Saez and Fernandez-Gomez i innych 

[5 – 9]. Dla każdego wariantu doświadczenia pobierano po 

sześć korzeni z trzech analogicznych cebul. Średnie wyniki 

indeksu mitotycznego i fazowego wraz z odchyleniami standardowymi 

przedstawiono na wykresach a zmiany morfologii 

chromosomów fotografowano przy użyciu mikroskopu 

świetlnego (NU Zeiss) i standardowej kamery fotograficznej 

(Nikon) oraz przedstawiono na tablicach. 

Ryc. 1. Kwiat Iris dichotoma Pall 

Do wstępnych badań ekstraktów tej rośliny zastosowaliśmy 

niezwykle dogodny test Allium [4]. Stanowią go merystematyczne 

komórki wierzchołków korzeni przybyszowych 

Allium cepa L. Cechują się one dużą jednorodnością 

genetyczną, łatwe są do hodowli i wykonania preparatów 

mikroskopowych, a co najważniejsze są niezwykle dogodnym 

materiałem kariologicznym: posiadają duże jądra komórkowe 

z niewielką liczbą (16) dużych chromosomów, 

na których bardzo łatwo w mikroskopie świetlnym można 

obserwować i liczyć wszelkie mutageniczne aberracje chromosomowe 

w poszczególnych fazach mitozy. 

Celem naszych badań było ustalenie, w oparciu o ten dogodny 

test, wpływu wodnego ekstraktu z kłączy irysa, na 

biologiczną jego aktywność a w tym: na strukturę interfazowej 

chromatyny i chromosomów podziałowych oraz na 

frekwencję podziałową komórek a więc cechy określające 

cytostatyczne/cytotoksyczne własności badanego ekstraktu 

jako potencjalnego preparatu przeciwnowotworowego. 

Materiał i metody 

Materiałem badanym były wysuszone i sproszkowane 

kłącza Iris dichotoma Pall. zbierane ze stanowisk naturalnych 

na stepach w okolicach Ułanbator i otrzymane z Instytutu 

Medycyny Naturalnej z Mongolii. Wodny ekstrakt 

z kłączy przygotowano zalewając 1 g wysuszonego i sproszkowanego 

materiału 40 ml wrzącej wody destylowanej 

a następnie pozostawiano mieszaninę na 24 godz. w temperaturze 

pokojowej. Po tym czasie ekstrakt przesączano 

i wyjściowo obliczano stężenie substancji rozpuszczonych 

na 6 mg/ml. Ekstrakt wyjściowy do eksperymentu był odpowiednio 

rozcieńczany w celu otrzymania szeregu następujących 

stężeń: 0,1; 0,2; 0,4; 0,75; 1,5; 3,0 i 6 mg/ml. Równoległa 

kontrola prowadzona była w wodzie destylowanej. Badania 

wykonano na komórkach Testu Allium (Test Levana 

Wyniki 

Podczas inkubacji korzeni Allium w ekstraktach z kłączy 

irysa o różnym stężeniu przez 60 godz. zaobserwowano 

wyraźne zmiany w ich morfologii. Korzenie inkubowane 

w ekstrakcie o najniższym stężeniu (0,1 mg/ml) były dłuższe 

od korzeni kontrolnych i nie posiadały widocznych 

cech jakiejkolwiek deformacji (Ryc. 2b). Podczas inkubacji 

w wyższych stężeniach ekstraktu (0,4 i 1,5 mg/ml) na pograniczu 

elongacyjnej i merystematycznej strefy wierzchołka 

korzeni, pojawiały się charakterystyczne zgrubienia oznaczone 

na fotografii klamrą (Ryc. 2c i 2d). Inkubacja korzeni 

w ekstrakcie o stężeniach najwyższych (3 i 6 mg/ml) spowodowała 

zahamowanie ich wzrostu i były one krótkie i dodatkowo 

ciemno zabarwione (Ryc. 2e). 

Analiza preparatów mikroskopowych wykazała wpływ 

inkubacji w ekstrakcie na intensywność podziałów komórkowych 

i morfologię jąder interfazowych i chromosomów 

mitotycznych. Na preparatach kontrolnych obserwowano 

regularne podziały mitotyczne o natężeniu charakterystycznym 

dla komórek Testu Allium wynoszącym ok. 10%. Jądra 

komórek interfazowych miały zróżnicowanie skondensowaną 

chromatynę w zależności od fazy cyklu komórkowego, 

w której się znajdowały (Ryc. 3a). W komórkach kontrol- 

Ryc. 2. Morfologia korzeni Allium cepa L. poddanych działaniu różnych 

stężeń wodnego ekstraktu z kłącza Iris dichotoma Pall. przez 

36 godz. a) kontrola; b) 0,1 mg/ml; c) 0,4 mg/ml; d) 1,5 mg/ml, 

e) 3,0 mg/ml 

28


nych Testu Allium chromosomy profazowe miały w różnym 

stopniu skondensowaną chromatynę tworzącą różnej grubości 

splątane nici chromosomów (Ryc. 4a), które w metafazie układały 

się w płytce metafazowej a podczas anafazy, ich siostrzane 

połówki (chromatydy) w sposób uporządkowany rozchodziły się 

do biegunów komórki. Na etapie telofazy nowo powstające jądra 

po wytworzeniu błony jądrowej i jąderka, stopniowo przybierały 

regularne kształty a chromatyna ulegała dekondensacji. 

Inkubacja korzeni Allium cepa w ekstrakcie z kłączy irysa 

(0,75 - 6 mg/ml) spowodowała zmiany w morfologii chromosomów 

polegające na silnej ich kondensacji i kontrakcji 

nie doprowadzającej jednak do powstawania aberracji chromosomowych. 

Jądra te w dalszej części pracy będą określane 

jako zmienione - cc (z ang. condensed and contraction). 

Były to liczne cc-profazy (Ryc. 4c), w których chromosomy 

były silnie skondensowane a pomiędzy nimi uwidaczniały 

się wyraźne przejaśnienia kariolimfy. Zmienione metafazy 

posiadały silnie skondensowane, skrócone chromosomy 

zwykle ułożone w rozproszeniu typowym dla C-metafaz 

(typowych dla komórek po działaniu kolhicyną) (Ryc. 4d) 

lub ściśle ułożone w płytkę metafazalną (Ryc. 4e). Wśród 

anafaz i telofaz występowały również zmiany cc (Ryc. 4f 

i 4g). Po całkowitym wyhamowaniu aktywności mitotycznej 

(po 36 godz. inkubacji) w najwyższym stężeniu ekstraktu, 

również jądra komórek interfazowych miały silnie skondensowaną 

euchromatynę i były one wyraźnie mniejsze i silniej 

wybarwione w porównaniu od jąder kontrolnych (Ryc. 4b). 

Analiza indeksu mitotycznego, czyli procentu dzielących 

się komórek wykazała, że w czasie ciągłej inkubacji 

od 0 do 84 godz. następowały zmiany procentu dzielących 

się komórek zależne od użytego stężenia ekstraktu i czasu 

trwania inkubacji (Ryc. 5). Dwa najniższe stężenia (0,1 

i 0,2 mg/ml) były stymulujące dla podziałów komórkowych 

juz od 12 godz. i pozostawały stymulującymi do 84 godzin. 

Najwyższą wartość indeksu mitotycznego odnotowano pod 

wpływem stężenia 0,1 mg/ml po 36 godz. inkubacji i wynosiła 

ona ok. 150% kontroli (Ryc. 3c). Inkubacja w ekstrakcie 

o stężeniu 0,4 mg/ml spowodowała obniżenie indeksu mitotycznego 

po 12 godz. inkubacji do ok. 60% a następnie 

jego powolny wzrost aż po 84 godz., kiedy osiągnął on wartość 

zbliżoną do kontroli wyjściowej (100%). Pod wpływem 

działania ekstraktu o stężeniu wyższym (1,5 mg/ml) również 

po 12 godz. doszło do znacznego obniżenia wartości indeksu 

mitotycznego (Ryc. 3b) a następnie wraz z upływem 

czasu inkubacji do jego ponownego wzrostu. Z tym, że po 

84 godz. wartość indeksu spadła bardziej niż w poprzednim 

stężeniu do ok. 70% indeksu kontrolnego. Inkubacja korzeni 

w najwyższym ze stosowanych w eksperymencie stężeniu 

Ryc. 3. Obraz aktywności podziałowej komórek Testu Allium korzeni 

kontrolnych oraz po inkubacji w ekstraktach z kłącza Iris dichotoma 

a) podziały kontrolne; b) po 12 godzinnej inkubacji w ekstrakcie 

o stężeniu 1,5 mg/ml; c) po 36 godzinnej inkubacji w ekstrakcie 

o stężeniu 0,1 mg/ml; d) po 60 godzinnej inkubacji w ekstrakcie 

o stężeniu 6 mg/ml. (Pow. 400x) 

Ryc. 4. Morfologia chromosomów kontrolnych 

komórek Testu Allium oraz pod wpływem inkubacji 

w wodnym ekstrakcie z I. dichotoma. 

a) Kontrolny obraz komórek w poszczególnych 

fazach mitozy (P-profaza; M-metafaza; A-anafaza; 

T-telofaza); b) zmieniona morfologia 

interfazowych jąder komórek traktowanych 

przez 36 godzin ekstraktem o stężeniu 6 mg/ 

ml; c) zmieniona profaza z wyraźnie zgrubiałymi 

chromosomami; d) zmieniona metafaza, 

chromosomy krótkie i zgrubiałe rozrzucone 

na terenie cytoplazmy; e) zmieniona metafaza 

gdzie chromosomy są ułożone skośnie w płytce 

metafazowej, tez są skrócone i zgrubiałe; 

f) zmieniona anafaza; g) zmieniona telofaza. 

(Pow. 800x) 

29


Ryc. 5. Indeksu mitotyczny kontrolnych komórek Testu Allium i po 

inkubacji w różnych stężeniach ekstraktu (0,1; 0,2; 0,4; 0,75; 1,5 

i 6,0 mg/ml) z I. dichotoma 

30 

ekstraktu (6 mg/ml) juz po 12 godz. spowodowała obniżenie indeksu 

mitotycznego do 25% i całkowitą jego inhibicję po 36 godz. 

i na tym poziomie pozostawał on do 84 godz. inkubacji (Ryc. 3d). 

Wyniki tych zmian przedstawiono na wykresie (Ryc. 5). 

Jednocześnie ze zmianami indeksu mitotycznego w czasie 

trwania inkubacji w ekstraktach wystąpiły zmiany indeksu 

fazowego (procent komórek w poszczególnych fazach 

mitozy) (Ryc. 6). W początkowych godzinach inkubacji 

w niższych stężeniach ekstraktu (0,1 – 0,4 mg/ml) indeks 

profaz był niższy w porównaniu do kontroli a indeks metafaz 

lekko wzrastał ponad poziom kontroli. Generalnie nie 

były to zmiany istotne i nie zaobserwowano występowania 

podziałów zmienionych (cc) (Ryc. 6a i 6c). Natomiast inkubacja 

w roztworach o stężeniach 0,75 i 1,5 mg/ml spowodowała 

wyraźny wzrost procentu profaz i metafaz po 12 godz. 

inkubacji, kiedy to dochodziło do wyraźnej redukcji podziałów 

a jednocześnie pojawiały się mitozy zmienione, które 

stanowiły znaczny odsetek wszystkich komórek dzielących 

się (Ryc. 6b). Może to wskazywać na mechanizm blokowania 

cyklu komórkowego w punkcie metafaza/anafaza, który 

może być związany z uszkodzeniami cytoszkieletu tubulinowego 

w komórkach. Najwyższa z użytych koncentracji ekstraktu, 

również po 12 godz. inkubacji spowodowała wyraźny 

wzrost indeksu profaz a tym samym spadek udziału pozostałych 

trzech faz mitozy. Po 36 godz. inkubacji doszło już do całkowitego 

zahamowania podziałów komórkowych (Ryc. 6d). 

Dyskusja i wnioski 

W oparciu o powyższe badania działania wodnego ekstraktu 

z I. dichotoma na komórki Testu Allium wyodrębniono 

trzy zasadnicze typy reakcji w zależności od jego koncentracji. 

Działanie stężeń najniższych uwidaczniało się w przyspieszaniu 

(stymulacji) wzrostu merystemów korzeniowych w stosunku 

do kontrolnych. Skorelowane to było z obserwowaną, wyraźną 

despiralizacją chromatyny interfazowej prowadzącej najprawdopodobniej 

do zwiększenia jej transkrypcyjnego potencjału przejawiającego 

się w dalszej konsekwencji w skróceniu faz cyklu 

komórkowego oraz wzmożonej aktywności mitotycznej [10]. 

Działanie średnich z badanych koncentracji ekstraktu 

przejawiało się z kolei w tworzeniu charakterystycznych 

zgrubień dystalnej części strefy przejściowej pomiędzy strefą 

mitoz a elongacji komórek, podobnych do tych, jakie powstają 

np.: po działaniu kolchicyny lub soli metali ciężkich 

(ołowiu, kobaltu i manganu). Jak wynika z naszych wcześniejszych 

badań, zgrubienie 

to jest efektem 

częściowego lub całkowitego 

zahamowania 

podziałów komórkowych 

w strefie mitotycznej, 

przy jednoczesnej 

zmianie kierunku 

wzrostu komórek strefy 

elongacyjnej [11], co 

związane jest ze zmianą 

reorientacji mikrotubul 

cytoszkieletu tubulinowego. 

Natomiast 

redukcja/zahamowanie 

podziałów w części 

mitotycznej następiło 

najprawdopodobniej 

na skutek drastycznego 

zablokowania syntezy 

białek tubulinowych, 

co przejawia się w za- 

Ryc. 6. Indeks fazowy pod wpływem inkubacji w różnych stężeniach ekstraktu z I. dichotoma, w różnym czasie 

trwania inkubacji a) Indeks fazowy w komórkach Testu Allium w trakcie inkubacji w ekstrakcie o stężeniu 

0,1 mg/ml; b) Indeks fazowy w komórkach Testu Allium w trakcie inkubacji w ekstrakcie o stężeniu 0,75 mg/ml; 

c) Indeks fazowy w komórkach Testu Allium w trakcie inkubacji w ekstrakcie o stężeniu 0,4 mg/ml; d) Indeks 

fazowy w komórkach Testu Allium w trakcie inkubacji w ekstrakcie o stężeniu 6 mg/ml 

kłóceniu reorientacji 

chromosomów w okresie 

ich przejścia z fazy 

G2 do M i w samej 

mitozie przy przejściu 

z profazy do metafazy 

i z metafazy do anafazy


[10]. Podobne sytuacje, aczkolwiek związane z inhibicją polimeryzacji 

bądź depolimeryzacji mikrotubul tubulinowych 

mamy do czynienia w przypadku wielu cytostatyków jak 

np.: winblastyna, winkrystyna, Taxol i Taxoter oraz kofeina 

[8, 12]. Istnienie tej bariery pomiędzy poszczególnymi fazami 

mitozy uniemożliwia jej zakończenie, ale poprzez ich 

restytucję, ponowne cofanie się do interfazy. Doprowadza 

to z kolei do stopniowej redukcji poziomu aktywności mitotycznej 

albo do całkowitego jej wygaśnięcia. Komórki te 

jednak nadal zachowują żywotność, której poziom może nawet 

nagle i falowo wzrastać w momencie ponownego przeniesienia 

komórek do środowiska kontrolnego. Ekstrakty 

o tych stężeniach zmieniają więc metabolizm komórek nie 

powodując jednak ich aberracyjnej – mutagennej dezorganizacji 

ani zwiększenia ich śmiertelności. Stężenia te określane 

są one jako cytostatyczne lub subletalne. 

Z kolei najwyższe ze stosowanych stężeń prowadziły 

do nieodwracalnych zmian morfologicznych całych merystemów 

oraz daleko posuniętych morfologicznych zmian 

chromatyny interfazowej i chromosomów podziałowych 

polegającej na ich kondensacji i kontrakcji. Taka kondensacja 

określana często jako „heterochromatynizacja” a prawidłowiej 

jako kondensacja euchromatyny [13] prowadzi do 

całkowitej inhibicji transkrypcji a w konsekwencji zablokowania 

translacji i aktywności podziałowej oraz do totalnej 

inaktywacji całej tkanki aktywnej podziałowo. Takie działanie 

czynnika zmieniajacego poziom aktywności podziałowej, 

określane jest jako cytotoksyczne – letalne. 

Powyższe wyniki badań wskazują, zatem na pewną dwoistość 

działania wodnego ekstraktu z kłącza Iris dichotoma. 

Z jednej strony na działanie cytoprotekcyjne i stymulujące 

a z drugiej na ich działanie inhibujące. W związku z takim 

działaniem na komórki Testu Allium mamy tu analogię do 

immunomodulacyjnego działania innych cytostatyków na 

komórki ludzkie i zwierzęce a wyrażające się (zależnie od 

stężenia) w immunostymulacyjnym lub immunosupresyjnym 

działaniu [14]. Być, zatem może, że przejawiające się 

dwojakie działanie ekstraktu z I. dichotomia na komórki Testu 

Allium może w odniesieniu do komórek ludzkich i zwierzęcych 

okazać się właśnie działaniem „immunomodulacyjnym”. 

Gdyby tak było to ekstrakty z kłączy irysa mogłyby 

mieć zastosowanie jako typowe roślinne preparaty wspomagające 

terapię nowotworową. Właśnie ze względu na to 

dwojakie działanie wodnego ekstraktu z kłączy I. dichotoma 

bardzo ważnym staje się dokładne przebadanie mechanizmu 

jego działania na komórki ludzkiego organizmu, oraz ustalenie 

odpowiednich dawek preparatu w zależności od potrzeb tak aby 

wykluczyć np.: możliwość stymulacji rozwoju choroby nowotworowej 

podczas jego stosowania. Dalsze badania w tym kierunku 

wydają się być bardzo celowe i powinny prowadzić do 

ustalenia przeciwnowotworowych aspektów ich działania. 

Reasumując dotychczasowe nasze wyniki badań możemy 

stwierdzić, że: 

1. Wodny wyciąg z kłączy I. dichotoma wykazuje podwójne 

działanie („immunomodulujące”) na badane komórki 

Testu Allium w zależności od stężenia: 

A) Niższe stężenia 0,1-0,4 mg/ml działały stymulująco 

na aktywność podziałową 

B) Najwyższe stężenie 6,0 mg/ml działało inhibujaco na 

tą aktywność. 

2. Głównym czynnikiem powodującym zmianę aktywności 

podziałowej był stopień kondensacji chromatyny. 

3. Zmianom struktury i kondensacji chromatyny nie towarzyszyły 

aberracje – wywołujące skutki mutagenne. 

4. Mechanizm kondensacji chromatyny należy opracować 

szerzej używając metod cytofotometrychnych, w tym 

należy ustalić mechanizm zmian struktury chromatyny 

przy różnych koncentracjach ekstraktu i w różnych fazach 

cyklu komórkowego. 

5. Oba powyższe efekty działania ekstraktu z I. dichotoma 

(stymulacji i inhibicji) należy rozpatrywać z punktu widzenia 

ich użyteczności w działaniach prewencyjnych i/ 

lub terapeutycznych walki z rakiem 


1. Rahman A. et al. Two New Quinones from Iris bungei. 

Chem Pharm Bull 2000; 48: 738-739. 

2. 

3. 

4. 

5. 

6. 

7. 

8. 

Choudhary M.I. et al. Five New Peltogynoids from Underground 

Parts of Iris bungei: A Mongolian Medicinal 

Plant. Chem Pharm Bull 2001; 49: 1295-1298. 

Choudhary M.I. et al. Four New Flavones and a New Iso- 

flavone from Iris bungei. J Nat Prod 2001; 64: 857-860. 

Levan A. The effect of colchicine on root mitosis in Allium. 

Hereditas 1938; 24: 471-486. 

Lopez-Saez, J.F., Fernandez-Gomez E. Partial mitotic 

index and phase indices. Experientia 1965; 21: 591-592. 

Kuraś M., Malinowska A. Influence of 1-b-D arabinofuranosylcystoine 

on mitotic activity of apical meristem of onion (Allium 

cepa L.) roots. Acta Soc Bot Polon 1978; 47: 173-187. 

Keithtey A.M. et al. Coumarin and its 4- and 7- substi- 

tuted derivates as retardants of mitoses in Allium root 

promeristem. Int J Pharmacogn 1996; 34: 105-113. 

Majewska, A. i wsp. Influence of extracts from schoots 

of Taxus baccata var. Elegantissima on mitotic activity 

of meristematic cells of Allium cepa L. roots. Acta Soc 

Bot Polon 2001; 63: 185-192. 

Kuraś M. i wsp. Changes in chromosome structure, mi- 

9. 

totic activity and nuclear DNA content from cells Allium 

Test induced by bark water extract of Uncaria tomentosa 

(Willd.) DC. J Ethnopharmacol 2006; 107: 211-221. 

10. Woźny A., Michleda J., Ratajczak L. Podstawy biologii 

komórki roślinnej. Wyd. Naukowe UAM, Poznań 2000. 

11. Wierzbicka M. The effect of leads on the ultrastructural 

changes in the root tip onion – Allium cepa L. Folia Histochem 

Cytobiol 1986; 24: 340-341. 

12. Podbielkowska M. i wsp. Effect of coumarin and its derivatives 

no mitosis and ultrastructure of meristematic 

cells. Int J Pharmacogn 1995; 33: 7-15. 

13. Olszewska M.J. Heterochromatyna i “heterochromatynizacja”. 

Post Biol Kom 2007; 34: 391-407. 

14. Skopińska-Różewska E. Wpływ substancji naturalnych 

na układ odpornościowy. Wyd. Fundacja Pomocy Zdrowiu 

– Medycyna Naturalna, Warszawa 2002. 


Prof. dr hab. Mieczysław Kuraś, 

ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, 

tel. 22 554-20-07, 

e-mail: kuras@biol.uw.edu.pl 

31


Oxygen regulated protein 150 prevents collagen degradation 

in glucose-deprived fibroblasts 


w hodowlach fibroblastów skóry ludzkiej w przebiegu głodzenia 

Marzanna Cechowska-Pasko 

Department of Pharmaceutical Biochemistry Medical University of Białystok 

Abstract 

Glucose is one of the most common therapeutic agents 

used in treatment of patients with various diseases. Recent 

studies demonstrated the effect of glucose on protein 

synthesis /degradation balance. We decided to study the 

effect of glucose deprivation on collagen synthesis and 

degradation in fibroblast cultures and a correlation of 

these processes with the expression of oxygen/glucose 

regulated proteins (ORP150/GRP170) and gelatinolytic 

activity. The incorporation of radiolabeled proline into 

collagenase-sensitive and hydroxyproline-containing proteins 

was used as an index of collagen synthesis, whereas 

pulse-chase technique was employed to evaluate the degradation 

of newly synthesised proteins. It was demonstrated 

that fibroblasts incubated in high glucose medium synthesised 

detectable amounts of collagenous proteins. The 

shortage of glucose resulted in about 30% reduction in 

synthesis of collagenous proteins. These phenomena were 

accompanied by an increase in the expression of chaperon 

- ORP150 in cultures growing in low glucose medium. 

Furthermore, the appearance of ORP150 in glucose deprived 

cultures coexisted with an increase of gelatinolytic 

activity. The pulse-chase experiments demonstrated that 

the reduced amount of newly synthesised collagen was 

protected against intracellular degradation. Proportionally 

less collagen was degraded in cultures incubated in 

low glucose than in high glucose media. It may be suggested 

that the increased expression of ORP150 is a factor 

which protects collagen against intracellular degradation 

induced by glucose deprivation. 

Keywords: glucose deprivation; collagen synthesis; collagen 

degradation; oxygen-regulated protein 150; fibroblasts 

Introduction 

Glucose is one of the most common therapeutic agents 

used in treatment of patients with various diseases. In most 

cases it is administered intravenously to supply energetic 

substrate. It was reported recently by several authors that 

glucose regulates protein synthesis/degradation balance, 

stimulating the biosynthesis and protecting proteins against 

Streszczenie 

Glukoza jest jednym z najbardziej popularnych 

składników wielu preparatów o działaniu farmakologicznym 

stosowanych w leczeniu różnych schorzeń. Ostatnie 

badania wykazały wpływ glukozy na syntezę/degradację 

białek. Zdecydowano ocenić wpływ niedoboru glukozy 

na syntezę i degradację kolagenu w fibroblastach skóry 

ludzkiej oraz korelację tych procesów z ekspresją białka 

regulowanego przez tlen/glukozę (ORP150/GRP170) 

i aktywnością żelatynolityczną. Syntezę kolagenu zbadano 

na podstawie oceny wbudowywania radioaktywnej proliny 

do białek wrażliwych na kolagenazę oraz białek 

zawierających hydroksyprolinę, podczas gdy degradację 

nowo powstałego białka oceniono przy pomocy techniki 

„pulse-chase”. Wykazano, że fibroblasty inkubowane 

w medium o wysokim stężeniu glukozy syntetyzują kolagen. 

Niedobór glukozy spowodował obniżenie syntezy 

białek kolagenowych o około 30%, zwiększenie syntezy 

białka opiekuńczego – ORP150 oraz nasilenie aktywności 

żelatynolitycznej. Badania „pulse-chase” wykazały, że 

obniżona ilość nowo zsyntetyzowanego kolagenu była 

chroniona przed wewnątrzkomórkową degradacją. Proporcjonalnie 

mniej kolagenu zostało zdegradowane 

w hodowlach komórek pozbawionych glukozy w porównaniu 

do inkubowanych w medium o wysokim stężeniu 

glukozy. Sugeruje się, że ORP150 jest czynnikiem, który 

chroni kolagen przed wewnątrzkomórkową degradacją, 

indukowaną przez niedobór glukozy. 

Słowa kluczowe: niedobór glukozy; synteza kolagenu; 

degradacja kolagenu; białko ORP 150; fibroblasty 

intracellular degradation [1-3]. For this reason it was decided 

to study the effect of glucose on collagen synthesis/ 

degradation in fibroblast cultures. 

Collagen is the most abundant extracellular protein in 

mammals, responsible for maintenance of architecture and 

integrity of connective tissue. It was described in our previous 

paper that glucose deprivation resulted in a marked 

decrease of collagen content in fibroblast cultures [4]. This 

32


phenomenon may be evoked by a decrease of collagen biosynthesis, 

increased degradation of this protein or by coexistence 

of both phenomena. 

Obviously collagen biosynthesis requires energy supply. 

Glucose is the main energetic substrate and glycolysis is the main 

process which supplies energy for fibroblasts grown in vitro [5]. 

For these reasons the glucose shortage may reduce intracellular 

pool of ATP required for the functions of these cells, including 

collagen biosynthesis. Furthermore, the shortage of glucose in 

culture medium enhances proteolytic (and gelatinolytic) activity 

in these cells [1,6] and may promote collagen degradation. 

On the other hand glucose deprivation appeared to be a 

factor which induces the expression of oxygen-regulated protein 

(ORP) 150 in fibroblast cultures [4]. Oxygen-regulated 

protein of molecular weight 150 kDa (ORP150) and glucose 

- regulated protein of molecular weight 170 (GRP170) are 

endoplasmic reticulum (ER) chaperones, which facilitate 

protein folding [2]. The GRP170 is a glycosylated form of 

ORP150. The ORP150/GRP170 system is a part of the ER 

machinery that assists in the folding and assembly of secretory 

and membrane proteins within the ER [3]. The expression 

of ORP150 increases in a range of pathologic situations 

such as brain ischaemia [7], atherosclerotic plaques [8] and malignant 

tumours [9-11] suggesting that ORP150 is a contributory 

factor for the cellular response to environmental stress. 

The role of ORP150 in cellular physiology remains unclear. 

Some observations indicate that ORP150, like GRP78 and 

GRP94, is involved in the processing of proteins in the secretory 

pathway [12]. This allows suggesting that ORP150 is a chaperon, 

which protects intracellular collagen against proteolytic effects 

exerted by glucose shortage. In order to test such a hypothesis 

we decided to study the effect of glucose deprivation in culture 

medium on proline incorporation into total proteins and specifically 

into collagenase-sensitive and hydroxyproline-containing 

proteins. Furthermore, the degradation of newly synthesised 

collagen and correlation of this process with the expression of 

glucose-regulated proteins (ORP150/GRP170) was studied. 

Materials and methods 

Reagents 

The DMEM was provided by Invitrogen (San Diego, 

USA). Passive lysis buffer (Promega, Madison, USA), monoclonal 

anti-human ORP 150 (IBL, Gunma, Japan), highly 

purified bacterial collagenase (type VII), Sigma-Fast BCIP/ 

NBT reagent, alkaline phosphatase-labelled anti-mouse 

immunoglobulin G were purchased from Sigma (St Louis, 

USA), as were most other chemicals and buffers used. 

[2,3,4,5 – 3 H] L-proline was obtained from Hartmann Analytic 

(Braunschweig, Germany). Nitrocellulose membranes 

(0.2 μm), Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel 

electrophoresis (SDS-PAGE) molecular weight standards 

and Coomassie Brilliant Blue R-250 were purchased from 

Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). 

Cell cultures 

The experiments were performed on the human skin 

fibroblast cell line (CRL-1474) purchased from American 

Type Culture Collection (ATCC). The cells were cultured in 

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), containing 

glucose at 4.5 mg/ml (high glucose DMEM) supplemented 

with 10% heat-inactivated foetal calf serum (FCS), 2 mM 

L-glutamine, penicillin (100 U/ml) and streptomycin (100 

μg/ml). The cells were seeded at a density of 5 x 10 5 cells 

in 2 ml medium and grown on six-well plates, in a 5 % CO 2 

incubator, at 37 O C. 

Experimental procedure 

5 x 10 5 cells in 2 ml medium were seeded in six-well plates 

and incubated for seven days in the high glucose DMEM. In 

these conditions the cultured cells reached 70-80% confluency. 

After this time the medium was removed and replaced 

with 2 ml of the fresh DMEM (without calf serum): 

1. the high glucose DMEM contained 4.5 mg of glucose 

per ml (25mM), 

2. the low glucose DMEM contained 0.5 mg of glucose per 

ml (2.8 mM). 

Each was supplemented with [2,3,4,5– 3 H] L-proline, 

ascorbate (50 µg/ml), 2 mM L-glutamine, penicillin (100 

U/ml) and streptomycin (100 μg/ml). The incubation was 

continued for 12, 24, 48 hours. The fibroblast did not divide 

during the incubation in serum-free medium. No increase in 

cell density was observed in this period. 

After incubation the culture media were removed, the cell 

layers were washed with PBS and submitted to the action of 

lysis buffer. It allowed separating the cells and extracellular 

matrix from the bottom of culture vessels and suspending 

them in the buffer. 

Filtration Assay 

Each hydrophilic Durapore membrane (0.65-µm pore 

size) was soaked with 250µl of 25% TCA. The cell lysates 

and culture media were treated with 50% TCA (final TCA 

concentration 25%) and next incubated at 4 o C for 1h. The 

formed precipitate was collected on the filter membranes 

and separated from the supernatant using a vacuum source 

attached to the 1225 Sampling Manifold (Millipore). To 

remove all unincorporated [ 3 H]-proline, the filters were 

washed 3 times with 5 ml of 10% TCA by vacuum-filtration 

through the membrane. After removing the underdrain and 

drying, the membranes were then punched out into scintillation 

vials and the filter-bound radioactivity was quantified 

by liquid scintillation counting [13,14]. 

The assay of collagenase-sensitive protein 

The collagenase-sensitive protein was measured using 

the method described by Petrkofsky and Diegelman [15]. 

The cell lysates and culture media were treated with high purity 

bacterial collagenases (type VII-Sigma). N-ethylmaleimide 

was applied as an inhibitor of unspecific proteolytic 

activity associated with collagenase. The amount of newly 

synthesised collagen was expressed in dpm of [ 3 H]-proline, 

incorporated into protein susceptible to the action of bacterial 

collagenases [15]. 

Determination of radioactive hydroxyproline 

Cell lysate or incubation medium was submitted to hydrolysis 

in 6 M HCl, at 100 O C, for 16 h. The hydrolysates 

were evaporated to dryness in a rotary glass evaporator. The 

33


dried residues were dissolved in 1 ml of 2M HCl and submitted 

to chromatography on a column (1 x 9 cm), containing 

Dowex 50W, equilibrated and eluted with 2M HCl. Such 

a procedure made possible to separate [ 3 H]-hydroxyproline 

from [ 3 H]-proline [16]. The amounts of radioactive hydroxyproline 

were counted in a scintillation counter. 

Pulse-chase experiment 

The confluent cell cultures were incubated for 48 h with 

radioactive proline as described in the Experimental Procedure. 

The medium was removed, the cell layer was washed 

with PBS and submitted to incubation in high and low glucose 

medium (without serum), containing non-labelled 10 

mM proline (“0” time) and incubated for 4 h. After this time 

the cells were lysed, cell lysates were submitted to filtration 

assay (to measure total protein) or to the determination of 

collagenase-sensitive proteins. The decrease in the amounts 

of total and collagen- sensitive proteins was calculated. 

Detection of gelatinolytic activity 

Gelatinolytic activity in cell culture lysates was studied 

with zymographic method described by Woessner [18]. 

In order to activate zymogen forms of metalloproteinases 

some lysates were submitted to the action of p-aminophenylmercuric 

acetate (APMA). The lysates were mixed with 

Laemmli sample buffer [17] containing 2.5% SDS (without 

reducing agent). 30 μg of protein were submitted to electrophoresis 

on 10% polyacrylamide gels containing gelatin at a 

concentration of 1 mg/ml, under non-reducing conditions. 

After electrophoresis, the gels were incubated first in 2% 

Triton X-100 at 37°C for 30 min to remove SDS and then in 

substrate buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0 containing 5mM 

CaCl 2 

) at 37°C for 24 h. After staining with 1% Coomassie 

Brilliant Blue R 250, the gelatine-degrading enzymes 

present in cell culture lysates were identified as clear zones 

in a blue background. 

Statistical analysis 

The mean values for six assays ± standard deviations 

(SD) were calculated. Statistical analysis was performed using 

Student’s ‘t’-test. 

Results 

It can be seen from Fig. 1A that fibroblasts incubated 

in high glucose medium incorporated significant amounts 

of radioactive proline into high molecular weight proteins. 

Sodium dodecyl sulphate /Polyacrylamide gel electrophoresis 

(SDS/PAGE) 

The cell cultures were washed with cold PBS and solubilised 

in 200 μl lysis buffer per well. The lysates (containing 

both cells and extracellular matrix lysis products) were 

centrifuged at 10,000 x g, at 4 O C, for 10 min. The samples of 

lysates containing 30 μg of protein were subjected to SDS- 

PAGE, as described by Laemmli [17]. The following Bio-Rad’s 

unstained standards were used: myosin (200 kDa), galactosidase 

(116.2 kDa), phosphorylase b (97.4 kDa), bovine serum 

albumin (66.2 kDa), ovalbumin (45 kDa). The electrophoresis 

was run for 40–45 minutes. In each experiment 7.5 % polyacrylamide 

gel and constant current (25 mA) were used. 

Immunoblotting 

The proteins were transferred to nitrocellulose membranes 

and then pre-treated with Tris-buffered saline (TBS) 

containing 0.05% Tween 20 (TBS-T) and 5% non fat dry 

milk, at room temperature, for 2 hours. Membranes were 

probed with a mixture containing anti-ORP150 antibody (1: 

1000) in 5% dried milk in TBS-T at 4 O C for 16 h. Then, 

the alkaline phosphatase conjugated antibody against mouse 

IgG (whole molecule) was added at concentration 1:7500 

in TBS-T for 1 h with slow shaking. The nitrocellulose was 

washed with TBS-T (five times for 5 min) and exposed to 

Sigma-Fast BCIP/NBT reagent. 

Fig. 1. The effect of glucose deprivation on the incorporation of [ 3 H]- 

L-proline into: (A) total proteins, (B) collagenase-sensitive proteins, 

(C) hydroxyproline-containing proteins by human skin fibroblasts incubated 

in high glucose (white bars) and low glucose (black bars) 

DMEM for 12 h, 24 h and 48 h. Mean values from 3 experiments ± 

SD are presented. * p< 0.001. 

34

Time dependent increase of proline incorporation was observed. 

Total amount of proline incorporated into high molecular 

weight material after 48 h incubation was above 3 

times higher in comparison to 12 h incubation. The shortage 

of glucose resulted in a decrease of proline incorporation 

into proteins synthesised in fibroblast cultures. The time dependent 

relation of this inhibitory effect of glucose shortage 

was observed. In the case of cultures incubated for 12 h 

only a slight decrease of proline incorporation was apparent, 

whereas after 24-48 h such an effect was more evident. The 

cells incubated in low glucose medium synthesised almost 

50% less radioactive proteins than those grown in high glucose 

medium (Fig. 1A). 

Fig. 1B shows that the investigated cells incubated in 

high glucose medium synthesised detectable amounts of 

collagenase-sensitive proteins. The quantities of these proteins 

grew about 3 times if incubation was prolonged from 

12 to 48 h (Fig 1B). The shortage of glucose resulted in 

about 30% reduction in synthesis of collagenase-sensitive 

proteins, both those secreted into culture medium and remaining 

in the cell layer (Fig. 1B). 


Fig. 2. Pulse-chase labelling of total (A) and collagenase-sensitive proteins (B) with [ 3 H]-L-proline. Human 

skin fibroblasts were incubated in high glucose (white bars) and low glucose (black bars) DMEM for 48 h 

and the label was chased for additional 4 h. Mean values ± SD are presented. * p< 0.001. 

Fig. 1C shows that the fibroblasts incubated in high glucose 

medium synthesised detectable amounts of hydroxyproline-containing 

proteins. The quantities of hydroxyproline-containing 

proteins 

grew above twice if incubation 

was prolonged from 12 

to 48 h (Fig. 1C). As in the 

previous case the shortage 

of glucose resulted in about 

30% reduction in synthesis 

of hydroxyproline-containing 

proteins (Fig. 1A,B,C). 

The “pulse chase” experiment 

demonstrated degradation 

of total protein and collagen 

newly synthesised by 

fibroblast incubated in both 

media. The amount of total 

radioactive protein synthesised 

in pulse period (100%) 

decreased during the chase 

period to about 57%. The rest 

(about 43%) were degraded. 

No differences between cultures 

incubated in high glucose 

and low glucose media 

were observed (Fig. 2A). In 

contrast to total protein the 

degradation of collagen depended 

on the presence of 

glucose in culture media. In 

cultures incubated in high 

glucose medium the proportional 

amounts of radioactive 

collagen decreased in 

chase period to almost 26% 

of initial value, whereas the 

rest (above 74%) were degraded. A lower degradation of 

collagen was observed in cultures incubated in low glucose 

medium. About 63% of initial collagen amounts were found 

after the chase period. Only 37 % of newly synthesised collagen 

was degraded in this time (Fig. 2B). 

Fig. 3 shows that the expression of ORP150 and its glycosylated 

form GRP170 in fibroblasts cultures. It is apparent 

that the expression of these proteins depends on the presence 

of glucose in culture medium and it changes during the incubation. 

The expression of GRP170 was observed in cultures 

incubated both in high glucose and low glucose DMEM, independently 

on incubation time (lanes 1-6). The cells incubated 

both in high glucose (lane1) and low glucose DMEM 

(lane 2) for 12 h did not express ORP150. Prolongation of 

Fig. 3. Western immunoblot analysis of oxygen/glucose-regulated 

proteins, ORP150/GRP170, synthesised by human skin fibroblasts. 

The cells were grown in high glucose (H) and low glucose (L) DMEM 

for 12 h, 24 h and 48h. Samples containing 30 μg of protein were 

submitted to electrophoresis and immunoblotting. 

35


incubation time up to 24 h in low glucose DMEM resulted in 

an appearance of slight band corresponding to ORP150 (lane 

4). The prolongation of incubation in low glucose DMEM 

up to 48 h resulted in intensification of ORP150 whereas the 

expression of GRP170 was slightly reduced (lane 6). 

Fig. 4 shows the presence of gelatinolytic activity in 

the cell culture lysates. The cells cultured for 12 h in high 

glucose DMEM (lane 1) as well as in low glucose DMEM 

(lane 3) have shown an enzyme which corresponds to the 

zymogen form of MMP-2 this being activated under the action 

of SDS. The treatment with APMA did not evoke any 

change in electrophoretic activity of this enzyme (lanes: 2 

and 4). No MMP-9 has been detected. 

Extending the incubation up to 24 h in high glucose did 

not evoke any change in electrophoretic activity of this enzyme 

(lanes: 5 and 6). In contrast to them in the cells cultured 

in low glucose an intensification of pro-MMP-2 bands and 

appearance of an MMP-2 active form (lane 7 and 8) have 

been observed. Furthermore, a slight expression of both 

pro-MMP-9 and active MMP-9 was detected. The action 

of APMA did not evoke further increase in MMP-2 activity 

(lane 8). Extending the incubation of cells in high glucose 

up to 48 h resulted in a slight intensification of pro-MMP-2 

bands (lane 9 and 10). In contrast to them in the cells cultured 

in low glucose DMEM for 48 h further increase of 

MMP-2 expression has been observed. Bands corresponding 

to both pro-MMP-2 and active MMP-2 became much 

more intensive (lanes 11 and 12). Furthermore, an intensification 

of bands corresponding to pro-MMP-9 and active 

MMP-9 was apparent (Fig. 4). 

This study suggests that 

glucose may exert additional 

effect. It stimulates 

collagen biosynthesis, 

whereas glucose 

deprivation evokes up 

regulation of chaperones, 

which protect 

newly synthesised collagen 

against intracellular 

degradation. 

It is well known that 

collagen is the major human 

protein which contains 

hydroxyproline. 

In contrast to other proteins 

it is specifically digested 

by bacterial collagenase. 

For these reasons 

the incorporation 

of radiolabeled proline 

into collagenase-sensitive and hydroxyproline-containing 

protein is used as an index of collagen synthesis, whereas 

pulse-chase technique allows evaluating the degradation of 

newly synthesised protein [19]. 

Fig. 4. Gelatinolytic activity of fibroblasts cultured in high glucose (H) and low glucose (L) DMEM for 12, 

24 and 48 h, without APMA (-), with APMA (+). All samples submitted to zymography contained 30 μg of 

protein. 

APMA - p-aminophenylmercuric acetate. 

We decided to study the effect of glucose deprivation 

on total protein/ collagen synthesis and degradation in fibroblast 

cultures, and correlation of these processes with the 

expression of oxygen/glucose-regulated proteins (ORP150/ 

GRP170) and gelatinolytic activity. It was demonstrated that 

fibroblasts incubated in high glucose DMEM synthesised 

detectable amounts of collagenous proteins. They constituted 

a few per cent of total radioactive proteins. The shortage 

of glucose resulted in about 50% decrease in total protein 

and about 30% reduction in collagenase-sensitive and 

hydroxyproline-containing protein synthesis. The pulsechase 

experiment demonstrated that degradation rate of 

newly synthesised total protein did not change in response to 

glucose deprivation. Both in control and glucose-deprived 

cultures above 40% of radioactive proline incorporated into proteins 

in the pulse period were degraded during the chase phase. 

In contrast to that, the degradation of collagen in chase 

period depended on the presence of glucose in culture medium. 

Despite the cells incubated in low glucose medium 

synthesised less collagen in pulse period, they protected 

newly synthesised collagen against degradation in chase 

phase. Proportionally less collagen was degraded in cultures 

incubated in low glucose than in high glucose media despite 

of increased gelatinolytic activity after 24 or 48 h. These 

phenomena were accompanied by an increase in expression 

of ORP150 in cultures growing in low glucose medium. 

Discussion 

Glucose is commonly used therapeutic agent. In common 

opinion, intravenous administration of this sugar supplements 

the pool of energetic substrates in human body. 

The mechanism of decreased collagen synthesis at the 

conditions of glucose deprivation is easy to explain. No 

doubt, the shortage of the main energetic substrate in culture 

medium decreases ATP-formation and reduces all energyrequiring 

anabolic processes within the cells. It is more dif- 

36


ficult to explain why glucose deprivation results in protection 

of the newly synthesised collagen against intracellular 

degradation. 

The endoplasmic reticulum is an organelle where secretory 

or membrane proteins are synthesised. Approximately 

one-third of all cellular proteins are translocated into the lumen 

of the ER with its unique oxidising and Ca2+-rich environment, 

where post-translational modification, folding and 

oligomerisation of nascent proteins occur before they are 

translocated to their final destination. Correct folding is an 

important factor which allows translocation of protein molecules 

to specific subcellular compartments, extracellular 

matrix or to biological fluids [20-22]. The folding process is 

regulated by a group of proteins, referred to as chaperones 

[23]. ER molecular chaperones and folding enzymes associate 

with the newly synthesised, unfolded and/or incompletely 

glycosylated proteins to prevent their aggregation and 

help them to fold and assemble correctly [21,22]. In some 

instances, they function even in the refolding of denatured 

proteins [19]. 

It is known that collagen folding depends on the hydroxylation 

of prolyl residues to achieve sufficient amounts of 

hydroxyprolyl residues to form a stable triple helical structure. 

Properly folded collagen is secreted extracellularly and 

serves as a substrate in the process of fibrogenesis. Underhydroxylated 

collagen is unable to form a stable triple helical 

structure and cannot be secreted from the synthesising cell. 

It is degraded by the intracellular proteolytic system [24]. 

Many stress conditions, such as glucose deprivation, reduces 

the folding process which results in the accumulation 

of unfolded/misfolded proteins within the cell [25,26]. The 

accumulation of unfolded proteins activates the so called 

“unfolded protein response”, which enhances cell survival 

by limiting the accumulation of unfolded or misfolded proteins 

in the ER [25,26]. Molecular chaperones are induced in 

these conditions, bind to unfolded/misfolded proteins, and help 

them to be folded or refolded correctly [27]. An integral component 

of the cellular response to environmental stress is the 

expression, usually by de novo protein synthesis, of stress-associated 

polypeptides termed oxygen-regulated protein [27,28] . 

Several authors have reported that glucose deprivation 

results in stimulation of protein degradation [1,6] and that 

oxygen or glucose deprivation increases free radicals, which 

in turn, oxidise proteins that are recognized and actively degraded 

by proteasomes [1]. It is apparent from our results 

that collagen (at least in our experimental conditions) is protected 

against proteolysis, induced by glucose-deprivation. 

This phenomenon is accompanied by an increase in the expression 

of ORP150 – a chaperon, which protects intracellular 

proteins against degradation. The appearance of ORP 

150 in glucose deprived cultures coexisted with an increase 

of gelatinolytic activity. Despite glucose shortage reduces 

collagen synthesis, the increased expression of ORP150 

may reduce the degradation of newly synthesised protein 

and protect the cell culture against a massive loss of collagen. 

References 

1. Weih M et al. Proteolysis of oxidized proteins after oxygen-glucose 

deprivation in rat cortical neurons is mediated 

by the proteasome. J Cereb Blood Flow Metab 

2001; 21:1090-1096. 

2. Yoshida H. ER stress and diseases. FEBS J 2007; 

274:630-658. 

3. Flores-Diaz M et al. A cellular UDP-glucose deficiency 

causes overexpression of glucose/oxygen-regulated proteins 

independent of the endoplasmic reticulum stress 

elements. J Biol Chem 2004; 279: 21724-21731. 

4. Cechowska-Pasko M, Pałka J, Bańkowski E. Glucosedepleted 

medium reduces the collagen content of human 

skin fibroblast cultures. Mol Cell Biochem 2007; 

305:79-85. 

5. Bilińska B, Cervinka M, Chadzińska M et al. The cell 

and tissue culture (in Polish). PWN. Warszawa 2004. 

6. Libby P, O'Brien KV. The role of protein breakdown in 

growth, quiescence, and starvation of vascular smooth 

muscle cells. J Cell Physiol 1984; 118:317-323. 

7. Matsushita K et al. Marked, sustained expression of a 

novel 150-kDa oxygen regulated stress protein, in severely 

ischemic mouse neurons. Mol Brain Res 1998; 

60: 98–106. 

8. Tsukamoto Y et al. 150 kDa oxygen regulated protein 

(ORP150) is expressed in human atherosclerotic plaques 

and allows mononuclear phagocytes to withstand cellular 

stress on exposure to hypoxia and modified LDL. J 

Clin Invest 1996; 98: 1930–1941. 

9. Tsukamoto Y et al. Expression of 150 kDa oxygen-regulated 

protein (ORP150), a new member of the HSP70 

family, in human breast cancers. Lab Invest 1998; 78: 

699–706. 

10. Cechowska-Pasko M, Bańkowski E, Chene P. The effect 

of hypoxia on the expression of 150 kDa oxygenregulated 

protein (ORP 150) in HeLa cells. Cell Physiol 

Biochem 2006; 17:89-96. 

11. Cechowska-Pasko M, Bankowski E, Chene P. Glucose 

effect on the expression of 150 kDa oxygen-regulated 

protein in HeLa cells. Biochem Biophys Res Commun 

2005; 337:992-997. 

12. Easton DP, Kaneko Y, Subjeck JR. The Hsp 110 and Grp 

170 stress proteins: newly recognized relatives of the 

Hsp 70s. Cell Stress Chaperones 2000; 5: 276-290. 

13. Fenwick SA et al. 96-well plate-based method for total 

collagen analysis of cell cultures. Biotechniques 2001; 

30:1010-1014. 

14. Koyano Y, Hämmerle H, Mollenhauer J. Analysis of 3Hproline-labeled 

protein by rapid filtration in multiwell 

plates for the study of collagen metabolism. Biotechniques 

1997; 22:706-716. 

15. Peterkofsky B, Diegelmann R. Use of a mixture of proteinase-free 

collagenases for the specific assay of radioactive 

collagen in the presence of other proteins. Biochemistry 

1971; 10:988-994. 

16. Schneir M, Ramamurthy N, Golub L. Skin collagen metabolism 

in the streptozotocin-induced diabetic rat. Enhanced 

catabolism of collagen formed both before and 

during the diabetic state. Diabetes 1982; 31:426-431. 

37


17. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the 

assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 

227: 680-685. 

18. Woessner JF Jr. Determination of hydroxyproline 

in connective tissue. Meth Enzymol 1995; 248, 

510-528. 

19. Bateman JF, Lamande’ SR, Ramshaw JAM. Collagen 

Superfamily In: Wayne D. Comper (ed.) Extracellular 

matix. Molecular Components and Interactions, vol 2. 

Harwood Academic Publishers, Melbourne Australia 

1996, 22-67. 

20. Ellgaard L, Molinari M, Helenius A. Setting the standards: 

quality control in the secretory pathway. Science 

1999; 286: 1882-1888. 

21. Shen Y, Meunier L, Hendershot LM Identification and 

characterization of a novel endoplasmic reticulum (ER) 

DnaJ homologue, which stimulates ATPase activity of 

BiP in vitro and is induced by ER stress. J Biol Chem 

2002; 277: 15947-15956. 

22. Little E et al. The glucose-regulated proteins (GRP78 

and GRP94): functions, gene regulation, and applications. 

Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1994; 4: 1-18. 

23. Gething MJ, Sambrook JF. Protein folding in the cell. 

Nature 1992; 355: 33–45. 

24. Harding HP et al. Transcriptional and translational control 

in the mammalian unfolded protein response. Annu 

Rev Cell Dev Biol 2002; 18: 575-599. 

25. Kaufman RJ et al. The unfolded protein response in nutrient 

sensing and differentiation. Nat Rev Mol Cell Biol 

2002; 3: 411-421. 

26. Miyagi T et al. Antitumor effect of reduction of 150-kDa 

oxygen-regulated protein expression in human prostate 

cancer cells. Mol Urol 2001; 5: 79-80. 

27. Heacock CS, Sutherland RM. Induction characteristics 

of oxygen regulated proteins. Int J Radiat Oncol Biol 

Phys 1986; 12: 1287-1290. 

28. Ozawa K et al. Regulation of tumor angiogenesis by 

oxygen-regulated protein 150, an inducible endoplasmic 

reticulum chaperone. Cancer Res 2001; 61: 4206-4213. 

Address for correspondence: 

Marzanna Cechowska-Pasko, PhD, Department of Pharmaceutical Biochemistry, 

Medical University of Białystok, Mickiewicza 2A, 15-089 Białystok, Poland 

tel. (48.85) 748-56-91 

e-mail: mapasko@gmail.com 

38



Rola cynku w zaburzeniach smaku 

The Role of Zinc in Taste Disorders 

Wanda Suchecka 

Katedra i Zakład Podstawowych Nauk Biomedycznych w Sosnowcu 


Streszczenie 

Substancje mineralne takie jak cynk, miedź i nikiel pełnią 

wiele istotnych funkcji fizjologicznych. Ich poziom oraz 

wzajemne proporcje w komórkach i tkankach decydują 

o stanie zdrowia, wpływają także na metabolizm innych 

składników pożywienia. 

Cynk jest niezbędnym składnikiem pokarmowym wymaganym 

u ludzi i zwierząt do prawidłowego przebiegu 

wielu procesów fizjologicznych włączając w to funkcję 

immunologiczną i antyoksydacyjną, wzrost i rozmnażanie. 

Cynk odgrywa istotną rolę w procesach odczuwania 

smaku, gdyż jest kofaktorem białka G zwanego gustducyną. 

Gustducyna wiąże się z receptorami odpowiedzialnymi 

za odbiór smaku słodkiego, gorzkiego i umami. Białko 

G warunkuje prawidłową czynność kubków smakowych. 

Komórki smakowe reagują na substancje smakowe dzięki 

receptorom obecnym w ich błonach komórkowych. Dane 

z piśmiennictwa naukowego wskazują, że istnieje kilka 

mechanizmów zaburzeń odbioru smaku wynikających 

ze stosowania niektórych leków i że cynk pełni kluczową 

rolę w odbiorze smaku. W stanach niedoboru cynku 

wyraźnie obniża się wrażliwość smakowa. Wykazano, że 

na skutek suplementacji cynkiem dochodzi do poprawy 

czynności zmysłu smaku. 

Słowa kluczowe: smak, cynk, wrażliwość smakowa, zaburzenia 

smaku 

Summary 

Mineral substances, such as zinc, copper and nickel are 

involved in many important physiological processes. The 

health status of organisms is determined by their concentration 

as well as the balance between them in the cells 

and tissues. Zinc is an essential nutrient that is required 

in humans and animals for many physiological functions, 

including immune and antioxidant functions, growth and 

reproduction. Zinc plays a significant role in the process 

of taste sense because it is a cofactor of G-protein called 

gustducin. Gustducin combines with the receptors 

responsible for the reception of sweet, bitter and umami 

taste. G protein is very important for the activity of taste 

buds. Taste cells respond to taste substances due to the 

receptors present in their cell membranes. The data from 

various scientific researches indicate that there are several 

mechanisms for drug-related taste disturbance and that 

zinc plays the key role in taste reception. The decrease in 

taste sensitivity is a visible sign of zinc-deficiency. The 

research indicates an improvement in taste after zinc supplementation. 

Key words: taste, zinc, taste sensitivity, taste disorders 

Ocena jakości pokarmów oparta jest na współdziałaniu 

zmysłu smaku ze zmysłem powonienia. Chociaż zarówno 

receptory zmysłu smaku jak i zmysłu powonienia należą 

do grupy chemoreceptorów, to jednak zachodzące w nich 

mechanizmy chemotransdukcji różnią się w wielu aspektach 

[1,2]. Ponadto odrębne pozostają drogi neuronalne, dzięki 

którym informacja sensoryczna jest przenoszona, analizowana 

i przetwarzana [1]. Mimo różnic, smak i węch ściśle 

ze sobą korelują. W mózgu ssaków, impulsy powstające 

w czuciowych komórkach smakowych i węchowych kierowane 

są do układu limbicznego. Informacje czuciowe 

smakowa i węchowa wysyłane są również przez wzgórze 

do kory mózgowej, gdzie powstaje odczucie i identyfikacja 

odpowiednio smaku i zapachu [1]. Badania wykazały, 

że pewne zapachy poprawiają intensywność postrzegania 

smaków, inne tłumią [2]. Narządy powonienia i smaku wysyłają 

swoje sygnały wyzwalające wrażenia zmysłowe do 

skomplikowanego „labiryntu”, który stanowi psychika człowieka. 

Współdziałanie zmysłu smaku ze zmysłem powonienia 

ma wpływ na ocenę spożywanych pokarmów. Na ocenę 

potrawy wpływa także: doświadczenie, pamięć i osobnicza 

wrażliwość, a więc różne rodzaje skojarzeń. Pokarm obecny 

w jamie ustnej podczas żucia pobudza oprócz zmysłu smaku 

i węchu także receptory bólu i mechanoreceptory zlokalizowane 

w błonie śluzowej języka i jamy ustnej. Są one drażnione 

podczas spożywania posiłku, przez co smak można 

określić jako odczucie wielomodalne, na które wpływ ma 

również ból, ucisk, odczucie pieczenia, temperatura. 

Przyczyny zaburzeń smaku mogą być bardzo różne, począwszy 

od patologii zlokalizowanych w jamie ustnej, przez 

uszkodzenie dróg nerwowych przewodzących impulsy do 

ośrodków w mózgowiu, a skończywszy na niedoborach 

pokarmowych i zaburzeniach metabolicznych związanych 

z chorobami ogólnoustrojowymi, czy też wpływem leków 

[3,4]. 

Całkowity brak odczuwania wszystkich bądź też określonych 

smaków, czyli ageuzja, występuje rzadko ponieważ 

informacja o bodźcach smakowych jest przenoszona drogą 

kilku nerwów czaszkowych [1]. Częściej obserwuje się obniżenie 

zdolności odczuwania smaku (hypogeuzja) lub zniekształcenie 

odczuwania normalnego smaku (dysgeuzja). 

Formami dysgeuzji są [5]: 

39


1. parageuzja – błędne, opaczne odczuwanie wrażeń smakowych, 

2. kakogeuzja – odczuwanie nieprzyjemnych smaków wywołane 

przez prawidłowe substancje smakowe, 

3. phantogeuzja – występowanie halucynacji smakowych 

przy braku jakichkolwiek bodźców smakowych, 

4. aliageuzja – odczuwanie nieprzyjemnych wrażeń przy 

bodźcach smakowych uważanych zwykle za przyjemne, 

Utrata zdolności percepcji smaku, obniżenie odczuwania 

smaku bądź zniekształcenie odczuwania normalnego 

smaku wpływają na ilość i rodzaj spożywanego pokarmu, 

a także na doznania negatywne i pozytywne związane z jego 

przyjmowaniem. Zaburzenia smaku mogą znacząco obniżyć 

jakość życia. 

Niektórzy autorzy wiążą zaobserwowane zaburzenia 

smaku ze zmianami w metabolizmie oraz z niedoborem 

pierwiastków takich jak cynk, miedź i nikiel [6,7]. Składniki 

mineralne są materiałem budulcowym i - chociaż nie spełniają 

funkcji energetycznych - regulują czynności ustroju, 

a zwłaszcza chemiczną i fizyczną integralność komórek i tkanek. 

Dzienne spożycie tych pierwiastków z dietą często nie 

pokrywa w pełni zapotrzebowania organizmu na te niezwykle 

istotne dla życia biopierwiastki. Na poziom pierwiastków 

w organizmie człowieka mają wpływ różne choroby, w tym 

również choroby o podłożu genetycznym oraz niezbilansowany 

sposób żywienia, obniżenie biodostępności, narażenie 

zawodowe, skażenie środowiska [8]. Skutki niedoborów 

cynku i miedzi związane są z rolą jaką te pierwiastki spełniają 

w żywych organizmach. Cynk jest obecny w centrach 

aktywnych wielu (około 200) enzymów uczestniczących 

w różnych procesach, w tym w przemianach metabolicznych. 

W związku z tym ma wpływ na wszystkie podstawowe 

procesy życiowe [8,9,10]. Miedź jako ważny biopierwiastek 

jest składnikiem wielu białek, metaloenzymów i niektórych 

barwników [9,11,12]. Nikiel zaliczany jest do pierwiastków 

subśladowych, których stężenie w różnych tkankach jest bardzo 

niskie i wynosi od dziesiątych części do kilkudziesięciu nanogramów 

w 1 gramie badanej tkanki [13]. Określenie funkcji 

biochemicznej niklu jak i innych subśladowych pierwiastków 

jest bezpośrednio związane z trudnościami analitycznymi występującymi 

przy oznaczaniu tak niskich stężeń, dlatego też informacje 

na temat biochemicznej roli pierwiastków subśladowych 

są niepełne, a wiele problemów związanych z wpływem 

tych biopierwiastków na funkcjonowanie organizmów żywych 

nie zostało do końca wyjaśnionych. 

Biodostępność składników mineralnych zawartych 

w wodzie, żywności i suplementach ma duże znaczenie 

w ocenie stopnia zaspokajania zapotrzebowania organizmu 

na składniki mineralne. Płeć, wiek stan odżywiania, podatność 

na stres, czynniki genetyczne, stan fizjologiczny (ciąża, 

laktacja), mikroflora jelitowa mają duży wpływ na biodostępność 

tych minerałów [14]. 

Warunkiem przyswajalności składników mineralnych 

jest z jednej strony ich rozpuszczalność, a z drugiej zdolność 

do przenikania przez błony komórkowe. Przyswajalność 

cynku jest na ogół proporcjonalna do jego stężenia 

w pożywieniu, jednakże obecność różnych związków 

w przewodzie pokarmowym może wpływać na wchłanianie 

cynku w jelitach. Obecność w diecie pochodnych kwasu fitynowego 

jest głównym czynnikiem małej przyswajalności 

cynku. Kompleksy cynku utworzone z kwasem fitynowym 

utrudniają jego wchłanianie w jelicie. Fosforany i benzoesany 

należą także do czynników zmniejszających wchłanianie 

cynku w jelitach. Przyswajalność cynku jest obniżana przez 

substancje zdolne do jego chelatowania tj. histydynę, cysteinę, 

kwas cytrynowy i pikolinowy. Upośledzone wchłanianie 

cynku jest z reguły związane z dysfunkcją jelit [15]. 

Wchłanianie miedzi i cynku warunkuje homeostazę całego 

organizmu, przy czym podwyższony stan wysycenia organizmu 

tymi pierwiastkami obniża ich wchłanianie [16]. 

Ustalając normy i zapotrzebowanie organizmu ludzkiego 

na składniki mineralne, a zwłaszcza na cynk, należy zwrócić 

szczególną uwagę na biodostępność cynku ze zwyczajowo 

spożywanej diety, określić spożycie tego pierwiastka w grupie 

osób bez symptomów wskazujących na niedobory, jak 

również wykorzystać badania epidemiologiczne dotyczące 

niedoborów cynku w danej populacji [17]. Przy interpretacji 

wyników oznaczania zawartości cynku w surowicy krwi 

zdrowej populacji należy oprzeć się na wartościach referencyjnych 

[8]. W dostępnym krajowym piśmiennictwie 

wartości te są zróżnicowane [18,19], toteż przy interpretacji 

wyników celowym wydaje się posługiwanie własną grupą 

odniesienia [8]. 

Cynk może być oznaczany w różnych tkankach, ale najczęściej 

oznaczany jest w surowicy krwi i we włosach [20]. 

Niskie poziomy miedzi i cynku w diecie, jak również zaburzenia 

w ich absorpcji przez dłuższy okres czasu, mogą prowadzić 

do obniżenia poziomu tych pierwiastków w całym 

organizmie, a w konsekwencji do wystąpienia wielu różnych 

chorób [21], w tym również dysfunkcji zmysłu smaku 

[6,7,21]. Wykazano, że w zaburzeniach smaku występuje 

szczególnie zwiększone zapotrzebowanie organizmu na 

cynk spowodowane obniżonym jego poziomem w surowicy 

krwi oraz zaburzeniami w absorpcji tego pierwiastka [21]. 

Wyniki badań Stefanidou i wsp. [22], oraz Ikeda i wsp. 

[23] wskazują na obniżenie poziomu cynku w surowicy 

krwi wraz z wiekiem, co ma związek z zaburzeniami absorbcji 

cynku u ludzi starszych. Badania innych autorów 

dowodzą braku wpływu wieku na poziom cynku w surowicy 

krwi [24]. W pierwszym przypadku ma to zapewne 

związek ze starzeniem się organizmu czyli stopniowym, 

postępującym i nieodwracalnym zmniejszaniem jego zdolności 

do zachowania równowagi środowiska wewnętrznego 

w odpowiedzi na czynniki środowiska zewnętrznego tj. warunki 

i tryb naszego życia, co zwiększa ryzyko wystąpienia 

różnych chorób. U pacjentów leczonych związkami zawierającym 

grupę tiolową (-SH), jak np. kaptopryl obserwowano 

zaburzenia gospodarki cynkowej, a także występowanie 

ageuzji [25]. Prawdopodobnym mechanizmem takiego działania 

jest zdolność chelatowania jonów cynku przez ten lek. 

Ponadto kaptopryl powoduje zwiększenie wydalania cynku 

z moczem, a co za tym idzie zmniejszenie stężenia cynku 

w surowicy krwi, co być może wiąże się z obecnością grupy 

sulfhydrylowej w cząsteczce tego leku [26]. 

Wykazano ustąpienie hipogeuzji po doustnym podaniu 

soli cynku, miedzi lub niklu w stanach chorobowych związanych 

z podwyższonym poziomem we krwi dwusiarczków 

oraz związków tiolowych [25]. Wiedza na temat wpływu 

miedzi i niklu na wrażliwość smakową jest jednak ogra- 

40


niczona i nie jest jeszcze jednoznacznie wyjaśniona. Dane 

z piśmiennictwa sugerują największy korzystny wpływ cynku 

na wrażliwość smakową [6,7,21]. 

Cynk jest pierwiastkiem występującym praktycznie we 

wszystkich płynach ustrojowych organizmu, minerałem 

niezbędnym dla normalnego wzrostu, a także do syntezy 

białka, ochrony przed wolnymi rodnikami, do zachowania 

odporności humoralnej i komórkowej, utrzymania integralności 

komórek śródbłonka, a także prawidłowej aktywności 

ponad 200 metaloenzymów, spośród których wiele 

spełnia funkcje antyoksydacyjne dzięki zwiększeniu puli 

metalotioneiny cynkowej w wątrobie, nerkach i jelitach. 

Ponadto cynk jest potrzebny na każdym etapie cyklu komórkowego, 

reguluje ekspresję genów i jest niezbędny dla 

syntezy kwasów nukleinowych [17]. Wykazano, że nawet 

umiarkowane obniżenie stężenia tego pierwiastka u ludzi 

prowadzi do zaburzeń neurosensorycznych [6,7,21]. 

Wiadomym jest, iż cynk odgrywa istotną rolę w procesach 

odczuwania smaku, gdyż jest kofaktorem gustducyny 

- białka G uczestniczącego w mechanizmie pobudzania 

komórek smakowych [27]. Komórki smakowe reagują na 

substancje smakowe dzięki receptorom obecnym w ich błonach 

komórkowych. Szczególnie transdukcja smaku słodkiego, 

gorzkiego i umami przebiega z zaangażowaniem 

receptorów należących do grupy receptorów związanych 

z białkami G (GPCR) [28]. Opisano zaburzenia smaku i węchu, 

którym towarzyszyły zmiany osobowości i anoreksja, 

u pacjentów z obniżonym poziomem cynku w przebiegu 

leczenia histydyną [25]. Mechanizm powstawania hipogeuzji 

na skutek deficytu cynku nie jest jeszcze jednoznacznie 

wyjaśniony. Wykazano, że osoby, które przyjęły cynk 

w postaci farmakologicznych suplementów zawierających 

cynk, a także stosujące dietę uwzględniającą produkty bogate 

w ten mikroelement, wykazywały mniej symptomów 

dysgeuzji. W przypadku idiopatycznej dysgeuzji uzyskano 

obiecujące wyniki po zastosowaniu glukonianu cynku 

w dawkach 140 mg na dobę przez 4 miesiące [29] lub 87 

mg na dobę przez 3 miesiące [30]. Skuteczność preparatów 

cynku w leczeniu zaburzeń smaku u większości badanych 

wykazali również Arcavi i wsp. [31]. Obniżenie wrażliwości 

smakowej obserwuje się też przy niedoborze witaminy 

A [32]. Uważa się, że wchłanianie, metabolizm, uwalnianie 

z wątroby, transport i zużycie przez tkanki witaminy A może 

być zależne od zawartości cynku w organizmie. Wykazano, 

że regulacja metabolizmu witamina A przez cynk może odbywać 

się za pośrednictwem dwóch mechanizmów. Jeden 

z nich polega na regulowaniu transportu witaminy A. Niedobór 

cynku może obniżać syntezę białka wiążącego retinol 

w wątrobie i prowadzić do zmniejszenia jego stężenia w surowicy. 

Drugi mechanizm dotyczy przekształcenia retinolu 

w retinal, procesu wymagającego działania enzymu dehydrogenazy 

retinolu [17,32]. Cynk przez obecność w dehydrogenazie 

retinolu katalizuje przemianę witaminy A do jej 

formy aktywnej – retinolu. Pierwiastek ten jest niezbędny 

zatem do utrzymania prawidłowego stężenia witaminy A 

w osoczu krwi. Cynk w enzymach może występować jako 

element strukturalny, katalizator i stabilizator. Dehydrogenaza 

mleczanowa i alkoholowa, fosfataza zasadowa, anhydraza 

węglanowa są najpowszechniejszymi enzymami, 

w których występuje cynk [17]. 

Uważa się, że umiarkowane niedobory cynku występują 

dość powszechnie, ale jednoznacznie trudno to potwierdzić, 

ze względu na brak prostych wskaźników oceny stanu odżywienia 

pod tym względem. Niedobory cynku występują 

zwykle łącznie z niedoborami innych składników odżywczych, 

co również utrudnia ich zdiagnozowanie. Grupami 

ryzyka wystąpienia niedoborów tego pierwiastka są dzieci, 

kobiety ciężarne i karmiące, ludzie starsi, osoby odżywiające 

się głównie produktami pochodzenia roślinnego i alkoholicy. 

Reasumując, cynk jest bardzo ważnym składnikiem 

mineralnym dla organizmu człowieka przez okres całego 

życia osobniczego, a odpowiednia jego ilość pobierana 

z pożywieniem, uzupełniana w miarę potrzeby preparatami, 

zmniejsza ryzyko wystąpienia różnych chorób w tym zaburzeń 

smaku. 

Wrażliwość smakowa jest cechą indywidualną, zależną 

od wielu uwarunkowań zewnętrznych i metabolicznych, 

toteż pomimo stosowania różnych metod 

gustometrycznych umożliwiających ocenę stopnia zaburzeń 

percepcji smakowej terapia pacjentów z objawami 

nieprawidłowego odczuwania smaku jest niezwykle 

trudna. 

Studiowanie piśmiennictwa dotyczącego badań poczucia 

smaku oraz czynników warunkujących doznania smakowe, 

nasuwa refleksję, że wiele niewiadomych wciąż pozostaje 

do wyjaśnienia. 


1. Traczyk WZ: Czucie i percepcja. W: Traczyk WZ, 

Trzebski A. (red): Fizjologia człowieka z elementami 

fizjologii stosowanej i klinicznej. Wydawnictwo Lekarskie 

PZWL. Warszawa. 2004, 135-178. 

2. Djordjevic J, Zatorre RJ, Jones-Gotman M. Odor-induced 

changes in taste perception. Exp Brain Res 2004; 159: 

405-408. 

3. Doty RL, Shah M, Bromley SM. Drug induced taste disorders. 

Drug Saf 2008; 31: 199-215. 

4. Briggs ER. Taste disturbances related to medication use. 

Consult Pharm 2009; 24: 538-543. 

5. Obrębowski A i wsp.: Uwagi do systematyki i terminologii 

zaburzeń węchu i smaku. Otolaryngol Pol 1991; 45: 

104-107. 

6. Takeda N i wsp.: Zinc deficiency in patients with idiopathic 

taste impairment with regard to angiotensin converting 

enzyme activity. Auris Nasus Larynx 2004; 31: 

425-428. 

7. Halczy-Kowalik L. Ocena wrażliwości zmysłu smaku 

w chorobie wrzodowej żołądka i dwunastnicy. Annales 

Academiae Medicae Stetinensis. Roczniki Pomorskiej 

Akademii Medycznej im K. Świerczewskiego w Szczecinie. 

1986; 32: 229-247. 

8. Schlegel-Zawadzka M. Cynk - aspekty zdrowotne i lecznicze, 

przyczyny i objawy niedoborów. Farm Pol 2002; 

58: 452-459. 

9. Hänsch R, Mendel RR. Physiological functions of mineral 

micronutrients (Cu, Zn, Mn, Fe, Ni, Mo, B, Cl). Curr 

Opin Plant Biol 2009; 12: 259-266. 

10. Sahin K i wsp.: Role of dietary zinc in heat-stressed poultry. 

Poult Sci 2009; 88: 2176-2183. 

41


11. Furukawa T i wsp.: Copper transport systems are involved 

in multidrug resistance and drug transport. Curr 

Med Chem 2008; 15: 3268-3278. 

12. Jabłoński E, Sobczak M. Składniki mineralne w diecie 

kobiet ciężarnych i karmiących. Cześć II. Mikrominerały: 

żelazo cynk, miedź, selen, jod, fluor, mangan, molibden, 

chrom. Prz Lek 2007; 64: 170-174. 

13. Długaszek M, Sałacki A, Kaszczuk M. Porównawcza 

analiza zawartości niklu w surowicy, erytrocytach i włosach 

pracowników zawodowo narażonych na kontakt 

z paliwem lotniczym. Pol Prz Med Lot 2008; 14: 327- 

336. 

14. Gawęcki J, Hryniewiecki L. (red): Żywienie człowieka. 

Podstawy nauki o żywieniu. T1. Wydawnictwo Naukowe 

PWN Warszawa 2008. 

15. Basu TK. Intestinal absorption in health and disease micronutrients. 

Best Practis Research in Clinical Gastroenterology 

2003; 17: 957-979. 

16. Smith K. Quantitative aspects of zinc absorption by isolated 

vasculary perfused rat intestine. J Nutr 1980; 110, 

316-323. 

17. Nowicka G, Panczenko-Kresowska B. Czynniki wpływające 

na ustalanie zaleceń żywieniowych na cynk 

- propozycje zmian norm spożycia na ten pierwiastek. 

Żyw Człow Metab 2001; 28: 324-341. 

18. Zmarzły A i wsp.: Stężenie cynku w surowicy krwi u byłych 

narkomanów dożylnych zakażonych HIV, bez klinicznych 

objawów AIDS. Wiad Lek 2004; 57: 249–254. 

19. Tomaszewski J. Diagnostyka laboratoryjna. PZWL. 

Warszawa 2007. 

20. Wiechuła D i wsp.: Zawartość pierwiastków we włosach 

łonowych mężczyzn w wybranych stanach chorobowych. 

Brom Chem Toksykol 2007; 40: 179-185. 

21. Watanabe M i wsp.: Measurements of several metallic elements 

and matrix metalloproteinases (MMPs) in saliva from 

patients with taste disorder. Chem Senses 2005; 30: 121-125. 

22. Stefanidou M i wsp.: Zinc: a multipurpose trace element. 

Arch Toxicol 2006; 80: 1-9. 

23. Ikeda M, Ezaki T, Moriquchi J. Levels of calcium, magnesium 

and zinc in urine among adult women in relation 

to age with special reference to menopause. J Nutr 

Health Aging. 2007; 11: 394-401. 

24. Zaichick V i wsp.: The effect of age and gender on Al, 

B, Ba, Ca, Cu, Fe, K, Li, Mg, Mn, Na, P, S, Sr, V, and Zn 

contents in rib bone of healthy humans. Biol Trace Elem 

Res 2009; 129: 107-115. 

25. Bałczewska E, Nowak A. Zaburzenia smakowe. Nowa 

Stom 2000; 12: 1-2. 

26. Pączkowska M. Wpływ inhibitorów enzymu przekształcającego 

angiotensynę I na wybrane parametry gospodarki 

cynkowej. Pol Arch Med Wew 1996; 96: 32-38. 

27. Hoon MA i wsp.: Functional expressin of the taste specific G- 

protein, alpha-gustducin. Biochem J 1995; 309(2): 629-636. 

28. Zhang Z i wsp.: The transduction channel TRPM5 is 

gated by intracellular calcium in taste cells. J Neurosci 

2007; 23,27: 5777-5786. 

29. Heckmann JG i wsp.: Neurological aspects of taste disorders. 

Arch Neurol 2003; 60: 667-671. 

30. Sakai F i wsp.: Double-blind, placebo-controlled trial 

of zinc picolinate for taste disorders. Acta Otolaryngol 

Suppl 2002; 546: 129-133. 

31. Arcavi L, Shahar A. Drug related taste disturbances: 

emphasis on the elderly. Harefuah 2003; 142: 446-450, 

484-485. 

32. Christian P, West KP. Interactions between zinc and vitamin 

A: a update. Am J Clin 1998; 68: 435-441. 


Wanda Suchecka 

Katedra i Zakład Podstawowych Nauk Biomedycznych 

41-205 Sosnowiec, ul. Kasztanowa 3 

tel. 32 231-32-72 

e- mail: wandas@sum.edu.pl 

42




– czynniki ryzyka i profilaktyka 

Age-related macular degeneration (AMD) 

– risk factors and prophylaxis 

Alicja Zajdel, Adam Wilczok 

Katedra i Zakład Biofarmacji; Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, 

Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 

Streszczenie 

Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (AMD – agerelated 

macular degeneration) jest postępującą, chorobą 

degeneracyjną centralnej części siatkówki (tj. plamki), 

która odpowiada za widzenie centralne. AMD staje się 

coraz częstszą przyczyną utraty wzroku u osób powyżej 

50 roku życia starzejących się społeczeństw krajów wysoko 

uprzemysłowionych. Przyczyną zmian występujących 

w AMD jest zaburzony metabolizm w komórkach obszaru 

plamki. AMD, którego patogeneza wciąż nie została 

dokładnie wyjaśniona, jest schorzeniem o podłożu genetycznym, 

któremu towarzyszą: stres oksydacyjny, stany 

zapalne i dysfunkcja mitochondrialna. Czynnikami ryzyka 

są wiek, płeć żeńska, rasa biała, jasny kolor tęczówki, 

narażenie wzroku na intensywne światło, nadciśnienie 

tętnicze, miażdżyca, wysoki poziom cholesterolu, otyłość, 

palenia tytoniu oraz niedobór przeciwutleniaczy. Dotychczas 

nie opracowano skutecznej metody profilaktyki i leczenia 

AMD. W profilaktyce AMD znajdują zastosowanie 

preparaty lecznicze i suplementy diety zawierające barwniki 

plamki luteinę i/lub zeaksantynę, wielonienasycone 

kwasy tłuszczowe omega-3 – EPA i/lub DHA, witaminy 

C i E, oraz mikroelementy - cynk, selen i miedź. Preparaty 

te przy zmianie stylu życia i sposobu odżywiania mogą 

zmniejszać ryzyko zachorowania na AMD oraz hamować 

progresję choroby. 

Słowa kluczowe: AMD, czynniki ryzyka, profilaktyka 

Abstract 

Age-related macular degeneration (AMD) is a progressive 

degenerative disease of central part of retina (macula), 

which is responsible for central vision. AMD is the 

leading cause of visual impairment and blindness in individuals 

over the age of 50 years, particularly in ageing 

communities of developed countries. The disturbed metabolism 

within macular cells is the most likely the primary 

cause in AMD, a disease which pathogenesis still remains 

unexplained. Genetic predisposition, oxidative stress, inflammatory 

response, and mitochondrial dysfunction play 

a major role in the aetiology of AMD. Other risk factors 

are: advanced age, female sex, white race, bright irises, 

exposition to intensive light, hypertension, atherosclerosis, 

increased cholesterol, obesity, smoking, and antioxidant 

deficiency. There is no known effective prophylaxis 

for AMD, and there is no effective treatment for most cases 

of AMD. Usually in prophylaxis against AMD the Rx 

and OTC (Over-the-counter) formulations containing macular 

pigments lutein and/or zeaxanthin, polyunsaturated 

omega-3 fatty acids EPA and/or DHA, vitamins C and E, 

and microelements zinc, selenium, copper are used. Taking 

such formulations together with changes in lifestyle 

and healthy diet can significantly reduce occurrence and 

progression of AMD. 

Key words: AMD, risk factors, prophylaxis 

Zwyrodnienie plamki związane z wiekiem (AMD – agerelated 

macular degeneration) jest postępującą, przyczyniającą 

się początkowo do dyskomfortu, a następnie ubytków 

widzenia, późno pojawiającą się chorobą degeneracyjną 

centralnej części siatkówki (tj. plamki), która wpływa na 

widzenie centralne niezbędne w takich czynnościach jak 

prowadzenie samochodu i czytanie, rozpoznawanie twarzy, 

znaków drogowych. AMD staje się coraz częstszą chorobą 

oczu starzejących się społeczeństw krajów wysoko uprzemysłowionych. 

W zaawansowanych stadiach choroby dochodzi 

do całkowitego zaniku widzenia centralnego. Szczególnie 

wrażliwy na uszkodzenia w przebiegu AMD jest środek 

plamki zwany dołkiem. Schorzenie to staje się problemem 

społecznym ograniczającym funkcjonowanie osób ogólnie 

sprawnych, gdyż jest najczęstszą przyczyną nieodwracalnej, 

choć niecałkowitej utraty wzroku u osób powyżej 50. 

roku życia. O tym jak poważny problem społeczny stanowi 

zwyrodnienie plamki związane z wiekiem, mogą świadczyć 

dane piśmiennictwa, według których AMD dotyka 25 milionów 

ludzi na świecie. AMD jest przyczyną ślepoty u prawie 

42% chorych, którzy utracili wzrok między 65-74 rokiem 

życia, prawie 2/3 chorych, którzy utracili wzrok między 75- 

84 rokiem życia i ¾ chorych, którzy utracili wzrok po 85 

roku życia [1]. Wyniki przeprowadzonych w różnych regionach 

świata (Europie, Ameryce, Australii, Japonii) badań 

epidemiologicznych szacujących częstość występowania 

zaawansowanych postaci AMD pokazują podobne ryzyko 

rozwoju i częstość występowania choroby. Wykazano, że 

43


w populacji osób w wieku 55-64 lat ryzyko zachorowania na 

AMD wynosi 0.2% i wzrasta do 13% u ludzi w wieku powyżej 

85 lat. Dane statystyczne ze wszystkich rejonów świata 

są zgodne i pokazują wzrastającą tendencję zachorowań, co 

stawia problem AMD w grupie wiodących przyczyn nieodwracalnych 

ubytków widzenia i ślepoty [2]. 

Objawami AMD są pogorszenie widzenia, zauważalne 

zwłaszcza przy czytaniu, zniekształcone widzenie linii prostych, 

problemy z widzeniem centralnym (ciemna plama 

w centrum pola widzenia), rozmycie krawędzi oglądanych 

przedmiotów, trudności w rozróżnianiu kolorów, mogą pojawić 

się zniekształcenia obrazu, tzw. metamorfopsje. Przyczyną 

zmian występujących w AMD jest zaburzona przemiana 

materii w komórkach znajdujących się w obszarze 

plamki w obrębie fotoreceptorów, nabłonka barwnikowego 

siatkówki, błony Brucha i choriokapilarów. W wyniku starzenia 

się tkanek i rozwoju zmian miażdżycowych w drobnych 

naczyniach naczyniówki w obszarze plamki dochodzi 

do zmniejszenia przepływu krwi przez te naczynia, co skutkuje 

niedokrwieniem siatkówki. Naczyniówka stanowi wyłączne 

źródło tlenu i składników odżywczych dla nabłonka 

barwnikowego siatkówki i fotoreceptorów [3, 4]. W efekcie 

zaburzeń przemian metabolicznych komórki zewnętrznych 

warstw siatkówki przestają funkcjonować i obumierają, co 

powoduje pogorszenie ostrości wzroku. Obumierające i odkładające 

się w postaci złogów komórki tworzą umiejscowione 

między nabłonkiem barwnikowym siatkówki a błoną 

Brucha tzw. druzy. We wczesnym stadium AMD, które 

u większości osób nie wpływa na jakość widzenia, występują 

liczne druzy o niewielkich (


Ser) dramatycznie zwiększa się (prawie 60 krotnie) ryzyko rozwoju 

zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem [19]. 

Powszechnie panuje pogląd, że jednym z najważniejszych 

mechanizmów w patogenezie AMD jest stres oksydacyjny, 

który definiuje się jako zaburzenie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej 

w kierunku reakcji utleniania 

przebiegające z udziałem reaktywnych form tlenu. Dłuższa 

ekspozycja na działanie reaktywnych form tlenu przy osłabionych 

mechanizmach obronnych może inicjować powstawanie 

chorób degeneracyjnych. Generowaniu reaktywnych 

form tlenu w siatkówce sprzyja bardzo intensywny metabolizm 

tlenowy i wysokie zużycie tlenu w procesach oddychania 

komórkowego zachodzących w licznych mitchondriach 

segmentów fotoreceptorów. Również wysoka zawartość 

wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, obecność fotouczulaczy 

takich jak rodopsyna i lipofuscyna oraz ekspozycja 

na działanie promieniowania UV, VIS, zwłaszcza wysokoenergetycznego 

światła niebieskiego nasila inicjowanie 

łańcuchowych reakcji wolnorodnikowych uszkadzających 

nabłonek barwnikowy komórek siatkówki. Wytwarzanie 

znacznych ilości reaktywnych form tlenu w siatkówce towarzyszy 

procesom fagocytozy szczytowych segmentów fotoreceptorów 

[20, 21]. Na działanie wolnych rodników narażone są głównie 

obwodowe części czopków, ze względu na zwiększoną zawartość 

wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Na skutek 

gromadzenia produktów niekompletnej degradacji segmentów 

zewnętrznych fotoreceptorów tworzą się druzy będące przyczyną 

zaburzeń transportu substancji odżywczych i tlenu oraz wzrostu 

oporu naczyń siatkówki. Efektem tych procesów są zaburzenia 

przepływu krwi prowadzące do niedożywienia siatkówki 

i w konsekwencji do atrofii siatkówki i naczyniówki. 

Nie wyjaśniona dokładnie patogeneza AMD i brak skutecznych 

metod leczenia zwiększają intensywność badań, 

których celem jest lepsze zrozumienie modyfikowalnych 

czynników ryzyka oraz wyjaśnienie dynamicznej interakcji 

pomiędzy czynnikami genetycznymi i środowiskowymi, 

a zapadalnością na AMD, co pozwoli na lepsze poznanie 

patomechanizmu rozwoju AMD i wprowadzenie prewencyjnych 

strategii zapobiegających lub hamujących rozwój 

choroby. Na podstawie badań epidemiologicznych sugeruje 

się podobny szlak przyczynowy dla chorób układu sercowonaczyniowego 

i AMD oraz podobne czynniki ryzyka, takie 

jak palenie tytoniu, hypercholesterolemia, nadciśnienie tętnicze, 

dieta bogatotłuszczowa, wysoki indeks masy ciała 

[13, 22]. W wieloośrodkowych badaniach populacyjnych 

w tym również w The European Eye Study prowadzonych 

w 7 krajach Europy wykazano zależność pomiędzy ilością 

wypalanych papierosów i czasem trwania nałogu (powyżej 

10 lat) a powstawaniem wysiękowej postaci AMD. Ryzyko 

wystąpienia AMD maleje po zaprzestaniu palenia [23]. Również 

u osób biernie palących zwiększa się ryzyko rozwoju 

AMD. Opisano synergistyczny wzrost ryzyka wystąpienia 

AMD u osób z polimorfizmem ARMS 2 (Ala69Ser) palących 

tytoń [24]. Ponadto, w osoczu osób palących stwierdzono zredukowaną 

zawartość hamującego zapalenia czynnika H [25]. 

W kohortowych badaniach populacyjnych przeprowadzonych 

w Australii (Blue Mountain Eye Study), których 

celem była ocena związku pomiędzy chorobami układu 

sercowo-naczyniowego i ich czynnikami ryzyka innymi niż 

palenie a długoterminowym ryzykiem wystąpienia zwyrodnienia 

plamki związanego z wiekiem uczestniczyło 3654 

osób powyżej 49 roku życia, które przebadano w latach 

1992-1994, 2335 osób przebadano ponownie po 5 latach 

(1997-1999) i 1952 z tych osób przebadano po 10 latach 

(2002-2004). Zaobserwowano, że wzrost stężenia lipoprotein 

cholesterolu wysokiej gęstości (HDL) był odwrotnie 

proporcjonalny do wystąpienia typu późnego AMD. Podwyższony 

stosunek całkowity cholesterol/HDL cholesterol 

zapowiadało wystąpienie typu późnego AMD oraz zaniku 

geograficznego. Cukrzyca zwiększała ryzyko wystąpienia 

zaniku geograficznego, ale nie zwiększała ryzyka wystąpienia 

postaci neowaskularnej AMD. Dodatni wywiad w kierunku 

przebytego udaru, lub innej choroby układu sercowonaczyniowego 

(udar, zawał mięśnia sercowego, dusznica 

bolesna) zapowiadał wystąpienie wczesnego AMD oraz pojawienie 

się rozlanych miękkich lub retikularnych druzów. 

Inne obserwacje prowadzone w ramach projektu Blue Mountain 

Eye Study badające zależność AMD i nadciśnienia 

tętniczego pokazały, że wartość ciśnienia pulsu, skurczowego 

i rozkurczowego ciśnienia krwi oraz obecność nadciśnienia 

tętniczego w badaniu pierwotnym nie były związane 

z wystąpieniem AMD [22]. W odróżnieniu od wyników Blue 

Mountain Eye Study rezultaty innych randomizowanych badań 

klinicznych z grupą kontrolną AREDS (Age-related Eye 

Disease Study Research Group), w których 10-letnią obserwacją 

objęto 1117 osób zdrowych, bez oznak AMD, oraz 3640 

pacjentów z objawami AMD o różnym stopniu zaawansowania 

pokazały, że wzrost ciśnienia zwiększa ryzyko wystąpienia 

i progresji AMD. Ponadto udowodniono związek pomiędzy 

podwyższonym rozkurczowym ciśnieniem krwi, historią przebiegu 

nadciśnienia i zastosowaniem leków przeciwnadciśnieniowych 

oraz wysiękową postacią AMD. Związku takiego nie 

obserwowano w przypadku suchej postaci AMD [25]. 

Również rezultaty badań łączących AMD i miażdżycę 

naczyń nie są jednoznaczne. Część z nich pokazuje pozytywne 

korelacje między AMD i miażdżycą, podczas gdy inne 

tylko pozytywne powiązanie pomiędzy AMD i tworzeniem 

blaszek miażdżycowych. Szereg badań nie potwierdza tych 

zależności [13]. Uważa się, że samo leczenie choroby sercowo-naczyniowej 

może mieć wpływ na AMD w szczególności 

rozważa się zależność pomiędzy AMD i stosowaniem statyn. 

W badaniach klinicznych, z których żadne nie było kontrolowaną 

próbą randomizowaną nie otrzymano jednoznacznych 

rezultatów. Dlatego nie jest pewne, czy statyny wykazują protekcyjny 

efekt. W wielu jednak badaniach udowodniono, że 

leczenie statynami ma znaczenie w profilaktyce AMD [27]. 

Rezultaty licznych badań obserwacyjnych pokazują 

pozytywną zależność pomiędzy występowaniem wczesnego 

AMD i wysokim BMI, co tłumaczy się wysokim powinowactwem 

tkanki tłuszczowej do luteiny, zasadniczego 

barwnika plamki oka, który wykazuje silne właściwości antyoksydacyjne 

[8, 10, 13]. Duże spożycie zwierzęcych oraz 

tłuszczów roślinnych, także tych zwierających nienasycone 

kwasy tłuszczowe z rodziny omega-6, zwiększa ryzyko pojawienia 

się lub progresji w kierunku zaawansowanych postaci 

AMD [28]. Istnieje kilka teorii wyjaśniających możliwą 

rolę lipidów w AMD: połączenie pomiędzy chorobą sercowo-naczyniową, 

miażdżycą i AMD, powiązanie szlaków 

genetyczych cholesterolu, apolipoproteiny E z AMD i fakt, 

że zawartość lipidów narasta ekspotencjalnie z wiekiem 

w błonie Brucha, półprzepuszczalnej błonie, która oddziela 

receptory od naczyń krwionośnych, wysoka wrażliwość 

45


wielonienasyconych kwasów tłuszczowych na działanie 

reaktywnych form tlenu i reakcje wolnorodnikowe. Wielonienasycone 

kwasy tłuszczowe z grupy omega-3 takie jak 

kwas dokozaheksaenowy (DHA) i kwas eikozapentaenowy 

(EPA) występują w wysokich stężeniach w siatkówce, gdzie 

pełnią szereg funkcji, np. strukturalnych, funkcjonalnych 

i ochronnych. DHA stanowi 50% wszystkich wielonienasyconych 

kwasów tłuszczowych występujących w zewnętrznych 

segmentach fotoreceptorów i stale uczestniczy w przemianach 

związanych z prawidłowym cyklem widzenia [29]. 

Takie kwasy mogą oddziaływać na wiele procesów, np. proces 

angiogenezy, ekspresji genów oraz mogą pełnić funkcje 

regulatorów przeżywalności komórek siatkówki, zapaleń 

i równowagi energetycznej [6]. Warunki panujące w obszarze 

plamki (wysokie stężenie tlenu, działanie fototoksycznego 

niebieskiego zakresu widma światła) sprzyjają peroksydacji 

wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, co może 

być jedną z przyczyn niedoboru DHA prowadzącego do 

nieodwracalnych zmian morfologicznych i funkcjonalnych 

siatkówki i w konsekwencji do rozwoju AMD [30]. 

Ze względu na nieznaną etiologię choroby nie możliwe 

jest leczenie przyczynowe AMD. Nie jest znane skuteczne 

leczenie postaci suchej, natomiast stosowane są różne metody 

spowolnienia naturalnego przebiegu postaci wysiękowej 

– neowaskularnej, takie jak: terapia fotodynamiczna, termiczna 

fotokoagulacja laserowa, termoterapia przezźreniczna 

oraz stosowanie związków o działaniu antyangiogennym 

(pegaptanib sodu – Macugen, bevacizumab – Avastin, ranibizumab 

– Lucentis, octan anekortawu – Retaane, acetonid 

triamcinolonu Kenalog). Niestety obecne sposoby leczenia 

wysiękowej postaci AMD nawet takie jak terapia fotodynamiczna 

i zastosowanie inhibitorów VEGF wykazują ograniczoną 

skuteczność [5, 6, 31]. Zgodnie z obecnym stanem 

wiedzy, jedyną metodą profilaktyki lub zahamowania istniejących 

procesów chorobowych w przypadku formy suchej 

AMD (90% przypadków) jest stosowanie odpowiedniej diety 

bogatej w owoce warzywa, ryby sprzyjającej obniżeniu 

poziomu cholesterolu. Zmiana stylu życia ma istotny wpływ 

na zmniejszenie zapadalności na AMD i postęp choroby. 

Dotyczy to zaprzestania palenia tytoniu, ograniczenia spożycia 

alkoholu, zwiększenia aktywności fizycznej, zmniejszenia 

masy ciała i stosowania antyoksydantów takich jak 

luteina i zeaksantyna. Ochronna rola luteiny i zeaksantyny 

wynika z faktu, że barwniki te gromadzą się wybiórczo 

w siatkówce oka, a w szczególności w plamce, gdzie są odpowiedzialne 

za nadawanie jej charakterystycznego żółtego 

zabarwienia. Barwniki te pełnią one rolę filtru światła, przez 

co zapobiegają inicjowanemu przez światło oksydacyjnemu 

uszkodzeniu struktur siatkówki. Wykazano, że zwiększenie 

ilości barwników plamkowych może opóźniać związane 

z wiekiem zmiany zachodzące w siatkówce. W profilaktyce 

AMD podkreśla się również korzyści wynikające ze stosowania 

WNKT z grupy omega-3 z jednoczesnym ograniczeniem 

podaży kwasów omega-6, współczynnik spożycia 

kwasów omega-3 w stosunku do omega-6 powinien wynosić 

4–5 : 1 [28, 30]. 

Styl życia i sposób odżywiania są jednymi z najważniejszych 

czynników, na które można oddziaływać. W randomizowanych 

badaniach klinicznych AREDS, w których 

u badanych pacjentów stosowano codzienną suplementację 

diety składającą się z preparatów witamin C i E, beta karotenu, 

cynku i miedzi w różnych konfiguracjach w porównaniu 

z efektem placebo, stwierdzono zredukowane tempo 

rozwoju zaawansowanych postaci AMD o 25 % przez okres 

5 lat i w rezultacie obniżenie ryzyka pogorszenia wzroku 

o 19 % [29]. W programie badawczym AREDS nie ujęto 

jednak suplementacji karotenoidów tworzących barwnik 

plamki (luteiny i zeaksantyny), a jedynie beta karoten. 

Wpływ suplementacji diety ujawniał się najbardziej wśród 

pacjentów przyjmujących wszystkie antyoksydanty oraz 

cynk jednocześnie. Taka suplementacja diety nie jest wskazana 

dla wszystkich pacjentów, np. przy zwiększonej podaży 

beta karotenu może zwiększać się o 17 % względne ryzyko 

rozwoju raka płuc u palaczy [32]. Również wysokie dawki 

witaminy E zostały powiązane ze zwiększonym ryzykiem 

śmierci [33] i ze zwiększonym ryzykiem niewydolności serca 

wśród ludzi z cukrzycą albo chorobą sercową [34]. 

W kohortowych badaniach populacyjnych Blue Mountain 

Eye Study, których celem była ocena związku między 

podstawową dietą i uzupełniającym podawaniem antyoksydantów 

a ryzykiem zachorowania na jakąkolwiek postać 

zwyrodnienia plamki związane z wiekiem w długotrwałej 

obserwacji. Zaobserwowano, że wśród uczestników, którzy 

charakteryzowali się wysokim spożyciem luteiny i zeaksantyny, 

występowało zredukowane ryzyko wystąpienia zlewających 

się druzów miękkich i rozwoju wysiękowej postaci 

AMD. Badanie to potwierdziło wnioski Age-Related Eye 

Disease Study dotyczące ochronnego wpływu cynku na 

rozwój AMD, ale nie potwierdziło ochronnego wpływu suplementacji 

beta-karotenu, a wręcz przeciwnie wskazało na 

wzrost ryzyka rozwoju wysiękowej postaci AMD. Zależność 

zwiększonego ryzyka rozwoju wysiękowej postaci AMD 

u osób z wysokim spożyciem beta-karotenu była potwierdzona 

zarówno w grupie osób palących tytoń, jak i w grupie 

osób niepalących [35]. W badaniach tych udowodniono także 

pozytywny wpływ kwasu DHA i spożycia ryb na zmniejszenie 

ryzyka wystąpienia wczesnych postaci AMD u osób spożywających 

ryby więcej niż raz w tygodniu [36, 37]. 

W podeszłym wieku naturalny antyoksydacyjny system 

obronny oka ulega osłabieniu, czemu towarzyszy pogorszenie 

naturalnej bariery ochronnej oka przed szkodliwym 

wpływem procesów wolnorodnikowych indukowanych 

światłem. U starszych pacjentów coraz trudniejsze staje się 

utrzymanie właściwego poziomu luteiny i zeaksantyny jedynie 

za pomocą zwykłej diety. Może ono być wspomagane 

odpowiednią suplementacją. W aptekach dostępnych jest 

coraz więcej preparatów leczniczych i suplementów diety 

przeznaczonych do długotrwałego stosowania o działaniu 

profilaktycznym i leczniczym, które przy zmianie stylu życia 

i sposobu odżywiania mogą zmniejszać ryzyko zachorowania 

na AMD oraz hamować progresję choroby. Zgodnie z obecną 

wiedzą medyczną, optymalnie skomponowany preparat 

powinien zawierać, co najmniej jeden z dwóch naturalnych 

barwników plamki - luteinę i/lub zeaksantynę oraz przynajmniej 

jeden z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych 

omega-3 – EPA i/lub DHA. Ponadto preparat taki powinien 

zawierać witaminy C i E, które zapobiegają wolnorodnikowemu 

utlenianiu z wielonienasyconych kwasów tłuszczowych 

oraz mikroelementy - cynk, selen i miedź, które warunkują 

prawidłowe działanie enzymów antyoksydacyjnych. 

46



1. Bunce C, Wormald R. Causes of blind certifications in England 

and Wales: April 1999-March 2000. Eye 2008; 22: 

905-911. 

2. Smith W i wsp. Risk factors for age-related macular degeneration: 

Pooled findings from three continents. Ophthalmology 

2001; 108: 697-704. 

3. McConnell V, Silvestri G. Age-related macular degeneration. 

Ulster Med J 2005; 74: 82–92. 

4. de Jong PT. Age-related macular degeneration. N Engl J 

Med 2006; 355: 1474–1485. 

5. Jager RD, Mieler WF, Miller JW. Age-Related Macular 

Degeneration. NEJM 2008; 358: 2606-2617. 

6. Coleman HR i wsp. Age-related macular degeneration. 

Lancet 2008; 372: 1835–1845. 

7. Seddon JM i wsp. The US twin study of age-related macular 

degeneration: relative roles of genetic and environmental 

influences. Arch Ophthalmol 2005; 123: 321-327. 

8. Seddon JM i wsp. CFH gene variant, Y402H, and smoking, 

body mass index, environmental associations with 

advanced age-related macular degeneration. Hum Hered 

2006; 61: 157-165. 

9. Duan Y i wsp. Age-related macular degeneration is associated 

with incident myocardial infarction among elderly 

Americans. Ophthalmology 2007; 114: 732-737. 

10. Francis PJ i wsp. The LOC387715 gene, smoking, body mass 

index, environmental associations with advanced age-related 

macular degeneration. Hum Hered 2007; 63: 212-218. 

11. Ambati J i wsp. Age-related macular degeneration: etiology, 

pathogenesis, and therapeutic strategies. Surv Ophthalmol 

2003; 48: 257-293. 

12. Kanda A, Abecasis G, Swaroop A. Inflammation in the 

pathogenesis of age-related macular degeneration. Br J 

Ophthalmol 2008; 92: 448-450. 

13. Guymer RH, Wei-Tinn Chong E. Modifiable risk factors 

for age-related macular degeneration Med J Austral 

2006; 184: 455-458. 

14. Klein R i wsp. Prevalence of age-related macular degeneration 

in 4 racial/ethnic groups in the Multi-ethnic Study 

of Atherosclerosis. Ophthalmology 2006; 113: 373-380. 

15. Haines JL i wsp. Complement factor H variant increases 

the risk of age-related macular degeneration. Science 

2005; 308: 419-421. 

16. Gold B i wsp. Variation in factor B (BF) and complement 

component 2 (C2) genes is associated with age-related 

macular degeneration. Nat Genet 2006; 38: 458–462. 

17. Yates JR i wsp. Complement C3 variant and the risk of 

age-related macular degeneration. N Engl J Med 2007; 

357: 533–561. 

18. Rivera A i wsp. Hypothetical LOC387715 is a second major 

susceptibility gene for age-related macular degeneration, 

contributing independently of complement factor H 

to disease risk. Hum Mol Genet 2005; 14: 3227-3236. 

19. Seddon JM i wsp. Association of CFH Y402H and 

LOC387715 A69S with progression of age-related macular 

degeneration. JAMA 2007; 297: 1793-1800. 


dr n. farm. Alicja Zajdel 

Katedra i Zakład Biofarmacji SUM 

ul. Narcyzów 1, 41-200 Sosnowiec 

tel. 32 364-10-63, e-mail: azajdel@sum.edu.pl 

20. Beatty S i wsp. The role of oxidative stress in the pathogenesis 

of age-related macular degeneration. Surv Ophthalmol 

2000; 45: 115–134. 

21. Wong RW i wsp. Iron toxicity as a potential factor in 

AMD. Retina 2007; 27: 997-1003. 

22. Tan JS i wsp. Cardiovascular risk factors and the long-term 

incidence of age-related macular degeneration: the Blue Mountains 

Eye Study. Ophthalmology 2007; 114: 1143-1150. 

23. Chakravarthy U i wsp. Cigarette smoking and age-related 

macular degeneration in the EUREYE Study. Ophthalmology 

2007; 114: 1157-1163. 

24. Schmidt S i wsp. Cigarette smoking strongly modifies 

the association of LOC387715 and age-related macular 

degeneration. Am J Hum Genet 2006; 78: 852-864. 

25. Esparza-Gordillo J i wsp. Genetic and environmental 

factors influencing the human factor H plasma levels. 

Immunogenetics 2004; 56: 77-82. 

26. Hyman L i wsp. Hypertension, cardiovascular disease, 

and age-related macular degeneration. Age-Related Macular 

Degeneration Risk Factors Study Group Arch Ophthalmol 

2000; 118: 351-358. 

27. Guymer RH i wsp. HMG CoA reductase inhibitors (statins): 

do they have a role in age-related macular degeneration? 

Surv Ophthalmol 2005; 50: 194-206. 

28. Chong E, Sinclair AJ, Guymer RH. Facts on fats. Clin 

Exp Ophthalmol 2006; 34: 464–471. 

29. Age-Related Eye Disease Study Research Group. A randomized, 

placebo-controlled, clinical trial of high-dose supplementation 

with vitamins C and E, beta carotene, and zinc for 

age-related macular degeneration and vision loss: AREDS 

report no. 8. Arch Ophthalmol 2001; 119: 1417-1436. 

30. Kowalski M, Borucka AI, Szaflik J. Kwasy omega-3 w 

profilaktyce zwyrodnienia plamki związanego z wiekiem. 

Forum Medycyny Rodzinnej 2008; 2: 309–313. 

31. Okruszko A i wsp. The results of wet AMD treatment by 

intravitreal injections – preliminary report. Klin Oczna 

2007; 109: 389-393. 

32. The Alpha-Tocopherol, Beta Carotene Cancer Prevention 

Study Group. The effect of vitamin E and beta carotene 

on the incidence of lung cancer and other cancers in 

male smokers. N Engl J Med 1994; 330: 1029-1035. 

33. Miller ER i wsp. Meta-analysis: high-dosage vitamin E 

supplementation may increase all-cause mortality. Ann 

Intern Med 2005; 142: 37-46. 

34. Lonn E i wsp. Effects of long-term vitamin E supplementation 

on cardiovascular events and cancer: a randomized 

controlled trial. JAMA 2005; 293: 1338-1347. 

35. Tan JS i wsp. Dietary antioxidants and the long-term incidence 

of age-related macular degeneration: the Blue Mountains 

Eye Study. Ophthalmology 2008; 115: 334-341. 

36 SanGiovanni JP i wsp. The relationship of dietary lipid intake 

and age-related macular degeneration in a case-control study: 

AREDS report no. 20. Arch Ophthalmol 2007; 125: 671-679. 

37. Augood i wsp. Oily fish consumption, dietary docosahexaenoic 

acid and eicosapentaenoic acid intakes, and 

associations with neovascular age-related macular degeneration. 

Am J Clin Nutr 2008; 88: 398-406. 

47


INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OF 

MANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY 

1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewed 

transdisciplinary journal covering the fields of pharmacy, medicine 

and related sciences. The journal publishes conference 

reports and materials, conference announcements, as well as 

letters to the Editor. 

2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printed 

and an electronic form. Electronic versions of articles are to be 

sent to kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl or supplied on 

CD-ROM disks. Printed copies (together with tables, diagrams 

and figures) should be addressed to: 


41-200 Sosnowiec 

ul. Jedności 8 

Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345 

Fax: +48 32 364 11 58 

Disk label should contain the first name(s) and surname(s) 

of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphics 

should be included in separate files. Do not paste pictures and 

graphics to text files. The Editor advises to use Star Office, 

Word, or Word Perfect. The acceptable graphics format is *. 

TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi. 

3. All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief. 

The Authors are encouraged to suggest their reviewers, 

however the final selection of a reviewer is up to the Editorial 

Board. The Editors-in-Chief reserves the right to correct or 

abbreviate the text (after the Author’s approval). 

Authors are requested to resubmit the revised manuscript 

within four weeks. Papers that are not resubmitted within 

four weeks will be treated as a new submission. 

The manuscript that has been rejected by the Scientific 

Review in Pharmacy should not be resubmitted. 

4. A cover letter should be included with the manuscript, containing 

a declaration that the manuscript has not been previously 

published in print or electronic format and is not under consideration 

by another journal or electronic medium, signed by all 

the Authors. It should also include written approval from the 

head of the institution in which the study was conducted. 

5. All human and animal research will have obtained ethical consent 

from the local Bioethical or Ethical Committee. 

6. The material sent in and the review will remain among the 

documentation of the Board of Editors. 

7. Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the whole 

of the copyrights for the published papers (including the right 

to publishing in print, on electronic media, such as CD-ROM 

disks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries is 

allowed without any written permission of the Editor. 

8. Instructions for authors: 

8.1. Manuscript Page Setup 

• Paper: white, A4 format. 

• Margins: 2.5 cm (top, left, right, bottom) 

• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points. 

• Text: Double-spaced, one side of the page only. 

• Numbering: Insert page numbers at bottom right of each 

page. 

• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extra 

line space between paragraphs. 

• Subheads: All subheads should be flush with the left margin, 

with one line above. Indent first line after a subhead. Use an 

extra line space between the subhead and the text. 

• Title or Heading of the article: boldface, on separate 

line. 

• Second-level subhead: boldface, on separate line. 

• Third-level subhead: italic, on separate line. 

8.2. Organization of Manuscript 

• Title page should include: submission date and Author(s) 

full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’ 

full current affiliations (for papers with multiply authors, 

please enumerate the authors and their affiliations in the 

following way: Author 1 , Author 2 , etc; 1 Affiliation, 2 Affiliation, 

etc.). Affiliations should contain the full name of the institution. 

One corresponding author must be designated for 

papers with coauthors. At the bottom of the page the full 

name, academic degrees/titles, and address of the corresponding 

author should be given, including the telephone 

number, fax number and/or e-mail address. If research 

has been funded, please indicate the source of funding 

(including grant index/symbol, grant agencies, corporations, 

or sponsors). 

• The second page should include an abstract (150-250 

words). The abstract must be self-contained, and must not 

require reference to the paper to be understood. The abstract 

should present objectives and scope of the study or 

reasons for writing the paper. The methods and techniques 

or approaches should be described only to the extent necessary 

for comprehension. The findings and conclusions 

should be concise and informative. The abstract should 

be followed by the key words consistent with the Medical 

Subject Headings Index Medicus, and should not contain 

unfamiliar terms that are not defined, undefined acronyms 

and reference citations. Neither displayed equations or 

lists should appear in the abstract. 

• Body text should be organized as follows: 

original paper - introduction, material and methods descriptions, 

research results, discussion; 

review papers – free structure; 

case studies – introduction (motivation for the study), case 

descriptions, discussion of the characteristic symptoms, 

treatment results etc. 

• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-white 

photographs) should be put into a separate envelope. On 

each figure there should be its number (Arabic numerals), 

the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking. 

Figure captions should be placed on separate pages and 

numbered consecutively using Arabic numerals. Previously 

published visual materials should be supplied together 

with the written consent of the Publisher for reprint. 

• Tables, each on a separate page, should be numbered 

using Roman numerals and preceded by their captions. 

Table captions should be placed on separate pages, numbered 

using Roman numerals. 

• The papers should not exceed the following limitations: 

original and review work – 10 pages and others – 5 pages. 

8.3. References to the works cited should be presented at the 

end of the paper and arranged according to the sequence 

of citations in the body text. The acronyms for journal titles 

should be used according to Index Medicus. Each entry, 

starting with a new line, should be given a number and 

must be presented as follows: 

• journal citation: 

Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic 

multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117: 

557-67. 

If there are more than three authors, the name of the first 

one should be given, followed by an ,,et al” annotation. 

Komosińska-Vassev K et al. Graves’ disease-associated 

changes in the serum lysosomal glycosidases activity and 

glycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331: 

97-102. 

• the specific chapter: 

Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. Biochemia 

Harpera. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. 

Warszawa 1994, 59-69. 

• monograph: 

Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw 

2004. 

References to the works cited within the text should be numbered 

using Arabic numerals and placed between brackets, 

e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations: 

original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliography 

entries. 

48


REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM 

1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowane 

prace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz poglądowe, 

z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i pokrewnych. 

Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na temat 

konferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do Redakcji. 

2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłać 

w formie elektronicznej na adres: kolegium.redakcyjne@ 

kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dysku CD- 

ROM) oraz – w jednym egzemplarzu wydruku komputerowego 

(z tabelami, wykresami i rycinami) na adres Redakcji: 

Farmaceutyczny Przegląd Naukowy 

41-200 Sosnowiec 

ul. Jedności 8 

Tel: +48 32 364 11 50, +48 514 342 345 

Fax: +48 32 364 11 58 

Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów) 

i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory. 

Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych. 

Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word, 

Word Perfect. Akceptowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor: 

CMYK, rozdzielczość 300 dpi. 

3. Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych 

każdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca się 

autorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcja 

zastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta, 

jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu 

z autorem). 

Autorzy proszeni są o odesłanie poprawionego manuskryptu, 

zgodnie z uwagami recenzenta, w terminie nieprzekraczającym 

czterech tygodni. W przeciwnym razie 

praca będzie traktowana jako nowa publikacja. 

Manuskrypt, który został odrzucony przez recenzenta nie 

może być ponownie przedkładany Redakcji Farmaceutycznego 

Przeglądu Naukowego. 

4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie była 

uprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcji 

innego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawierać 

również podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodę 

Kierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie 

publikacji w czasopiśmie. 

5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, które 

są przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, muszą 

mieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej lub Etycznej. 

6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji 

Redakcji. 

7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskich 

do wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, na 

nośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszcza 

się natomiast drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy. 

8. Instrukcje dla autorów 

8.1. Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu: 

• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, na 

białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnego 

odstępu między kolejnymi wierszami. 

• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny). 

• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt. 

• Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy od 

strony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnym 

rogu. 

• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowych 

odstępów pomiędzy kolejnymi akapitami. 

• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównane 

do lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstem 

należy wprowadzić jeden odstęp. 

• Tytuł pracy – powinien być napisany pogrubioną czcionką. 

• Tytuł rozdziału – powinien być napisany pogrubioną 

czcionką. 

• Tytuł podrozdziału – powinien być napisany pochyloną 

czcionką, 

8.2 Układ manuskryptu 

• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora- 

(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowych 

przy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afiliację 

każdego z nich, w następujący sposób Autor 1 , Autor 2 , 

…; 1 Afiliacja, 2 Afiliacja; tytuł pracy w języku polskim i angielskim, 

nazwę placówki naukowej skąd pochodzi praca. 

U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz adres, 

telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję, 

dotyczącą manuskryptu. W przypadku badań finansowanych 

prosimy o wskazanie źródła finansowania (w tym 

numery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lub 

sponsorów). 

• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie 

(150-250 słów w języku polskim i angielskim), będące 

autonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczać 

odnośników literaturowych. Streszczenie powinno 

zawierać krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawowe 

procedury (wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych, 

metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Pod 

streszczeniem należy umieścić słowa kluczowe w języku 

polskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject Headings 

Index Medicus. 

• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały, 

według następującego schematu: 

prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań, 

dyskusja oraz wnioski; 

prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziały 

i podrozdziały; 

prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby, 

charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp. 

• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe) 

powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane, 

opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy, 

z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać na 

oddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframi 

arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane, 

należy zaopatrzyć w pisemną zgodę Wydawcy na 

ponowną publikację. 

• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należy 

ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułami 

umieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać na 

oddzielnej stronie z numerami tabel, podanymi cyframi 

rzymskimi. 

• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinna 

wynosić 10, a pozostałych – 5 stron. 

8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowania 

w tekście pracy. 

Skróty tytułów czasopism powinny być zgodne z Index 

Medicus. Każda pozycja – pisana od nowego wiersza, 

powinna być opatrzona numerem oraz zredagowana 

zgodnie z niżej podanym przykładem: 

• czasopismo naukowe: 

np.: Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic 

multisystem fibrotic 

disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67. 

Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać 

nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”. 

np.: Komosińska-Vassev K i wsp. Graves’ disease-associated 

changes in the serum lysosomal glycosidases activity 

and the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 

331: 97-102. 

• wydawnictwo zbiorowe: 

np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia 

Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie 

PZWL. Warszawa 1994, 59-69. 

• monografia: 

np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław 

2004. 

Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych, 

powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1]. 

Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach 

oryginalnych do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do 

10 pozycji. 

49



Miesięcznik 

WYDAWCA 



IC Value - Current 3.66 

MNiSW 4 

PRENUMERATA 

Prosimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literami 

i dokonanie wpłat na poczcie lub w banku. 

Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu. 

Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeraty 

otrzymają Państwo po około 2 tygodniach 

od dokonania wpłaty. 

Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeraty 

i Kolportażu: 

Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiego 

ul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Biała 

TEL. 033 817 38 99 

Nr rachunku odbiorcy: 

0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 

ODBIORCA: 


43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2 

74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 



kwota:....................................................................................... 

wpłacający:.............................................................................. 

................................................................................................. 

................................................................................................. 

Zamawiam 

PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY 

FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY 

Nr ............ 

Nr rachunku odbiorcy: 

0 74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 

ODBIORCA: 


43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2 

74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 



kwota:....................................................................................... 

wpłacający:.............................................................................. 

................................................................................................. 

................................................................................................. 

Zamawiam 

PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY 

FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY 

Nr ............

PokaÅ¼ caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?

PokaÅ¼ caÅy numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄd Naukowy