Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Farm Przegl Nauk, 2010, 12
różnicy krzywych denaturacji wyznaczonej w stosunku do
wybranej próby referencyjnej. Wykresy te dobrze ilustrują
różnice w badanych próbach [33, 34].
Podsumowanie
Czułość metody mSSCP została oceniona na 86%, a jej
powtarzalność na 99% w badaniach Bezak i wsp. [35], którzy
wykorzystali tę technikę w analizie genu XI czynnika
krzepnięcia, a następnie otrzymane wyniki potwierdzili
przeprowadzając sekwencjonowanie z użyciem znaczników
fluorescencyjnych. Biorąc pod uwagę mnogość czynników
wpływających na efektywność analizy SSCP oraz
fakt, że mutacje powodujące zmianę ruchliwości w jednych
warunkach, mogą w innych okolicznościach takiej zmiany
nie spowodować, dany fragment DNA bada się zazwyczaj
w różnych warunkach, aby zwiększyć prawdopodobieństwo
ujawnienia zmian sekwencji. Odsetek mutacji wykrywanych
metodą SSCP mieści się w zakresie od 70% do >95%
dla badań ze zmiennymi dwoma lub trzema parametrami [1,
2]. Jednym z najważniejszych czynników wpływających na
efektywność analizy SSCP jest wielkość badanego fragmentu
DNA. Optymalna długość ssDNA powinna mieścić się
w zakresie 150-200 pz. Dla fragmentów dłuższych niż 300
pz czułość analizy znacznie spada [2]. Zaletą techniki SSCP
jest łatwa interpretacja wyników badania ze względu na
możliwość porównania położenia prążka w żelu względem
wzorca markera wielkości DNA. Wykorzystana w przeprowadzonych
badaniach odmiana SSCP – mSSCP charakteryzuje
się wyższą czułością w stosunku do klasycznej
analizy polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów
DNA, z powodu zastosowania podczas elektroforezy
gradientu temperatury zamiast przeprowadzania kilku
rozdziałów elektroforetycznych w stałych temperaturach
[7, 20].
Czułość techniki DGGE jest oceniana na 82-100%, kiedy
do badanego fragmentu dołączona zostaje sekwencja GC
clamp [4, 19, 36]. Jednakże niektórzy autorzy uważają, że
na dzień dzisiejszy czułość DGGE jest za niska, aby metoda
ta mogła być rutynowo wykorzystywana w praktyce klinicznej
[19]. Aby analiza DGGE była w pełni efektywna, należy
określić profil meltingu badanej sekwencji DNA oraz ustalić
zakres gradientu, w którym przewiduje się uzyskać najlepsze
rozdzielenie badanych fragmentów. Wyboru warunków
dla elektroforezy z pionowym gradientem czynnika denaturującego
można dokonać na dwa sposoby: albo wykorzystując
specjalny program komputerowy (np. MacMelt firmy
Bio-Rad), albo empirycznie, przez wykonanie elektroforezy
poziomej w szerokim zakresie stężeń czynnika denaturującego
(0‐100%) [8, 27]. Użyteczność techniki DGGE jest
ograniczona ze względu na konieczność posiadania specjalnego
aparatu, przygotowywania żeli z gradientem związków
denaturujących oraz syntezy primerów bogatych w pary GC
(GC clamp). Dodatkowo, w przypadku pewnych sekwencji
DNA (np. bogatych w pary GC lub zawierających więcej niż
jedną domenę meltingu), istnieje konieczność modyfikowania
produktu PCR albo sekwencji primera przed dokonaniem
elektroforezy w gradiencie czynnika denaturującego, co wydłuża
czas analizy i utrudnia jej wykonanie [8, 19, 26, 27].
Obecnie, metoda DGGE ustępuje miejsca swoim odmianom
(TGGE, TTGE, CDGE), których główną zaletą jest wyeliminowanie
z użycia żeli z gradientem chemicznego czynnika
denaturującego [8, 28, 29]. Również µTGGE wydaje się
być techniką potencjalnie użyteczną w praktyce klinicznej,
ze względu na znaczną redukcję kosztów i czasu analizy,
a także niewielką objętość próbki potrzebną do przeprowadzenia
badania. Jednakże na dzień dzisiejszy metoda ta nie
jest powszechnie wykorzystywana, ponieważ dotychczas
nie przeprowadzono badań oceniających na szeroką skalę
jej czułość oraz swoistość [19, 31]. W przypadku analizy
DGGE wskazane jest określenie, przy pomocy programu
komputerowego, profilu meltingu dla każdego z badanych
amplimerów, ponieważ w trakcie elektroforezy w gradiencie
czynnika denaturującego istnieje możliwość wykrycia tylko
tych mutacji, które znajdują się w obrębie domeny o najniższej
temperaturze meltingu. Ponadto analiza komputerowa
jest pomocna w wyborze optymalnych warunków analizy
(zakresu gradientu czynnika denaturującego) oraz dobraniu
odpowiednich sekwencji starterów [27]. Nową opartą
na analizie PCR w czasie rzeczywistym techniką przydatną
w analizie polimorfizmów jest analiza HRM.
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Napierała D i wsp. Wykrywanie mutacji punktowych
i polimorfizmu DNA metodą SSCP. [W:] Słomski R red.
Przykłady analiz DNA. Poznań: Wydawnictwo Akademii
Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu;
2004: 95-96.
Vorechovsky I. Single Strand Conformation Polymorphism
(SSCP) Analysis. [W:] Walker JM, Rapley R. red.
Medical Biomethods Handbook. Totowa, New Jersey:
Humana Press, Inc.; 2005: 73-77.
Gasser RB i wsp. Single-strand conformation polymorphism
(SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat
Protoc 2006; 1 (6): 3121-3128.
Kakavas VK i wsp. PCR-SSCP: a method for the molecular
analysis of genetic diseases. Mol Biotechnol 2008;
38(2): 155-163.
Kakavas KV i wsp. Identification of the commonest
cystic fibrosis transmembrane regulator gene DeltaF508
mutation: evaluation of PCR--single-strand
conformational polymorphism and polyacrylamide gel
electrophoresis. Biomed Chromatogr 2006; 20(10):
1120-1125.
Li W i wsp. Estimation of the optimal electrophoretic
temperature of DNA single-strand conformation polymorphism
by DNA base composition. Electrophoresis
2003; 24 (14): 2283-2289.
Constantinou M i wsp. Application of multiplex FISH,
CGH and MSSCP techniques for cytogenetic and molecular
analysis of transitional cell carcinoma (TCC) cells
in voided urine specimens. J Appl Genet 2006; 47(3):
273-5.
The DCode Universal Mutation Detection System.
Bio-Rad 1996: 11-14, 27-28, 34-35. (http://www.bio-rad.
com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1709080C.pdf).
Børresen AL. Mismatch detection using heteroduplex
analysis. Curr Protoc Hum Genet 2002 Aug;Chapter
7:Unit 7.3.
32