Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Farm Przegl Nauk, 2010, 12
zmian w profilu SSCP ze względu na rozkład barwnika [1, 3,
16]. Niemniej jednak, okazuje się być przydatna w analizie
rSSCP [13]. Istnieją także doniesienia o wybarwianiu żeli
barwnikami wykorzystywanymi w analizie sekwencyjnej,
takimi jak SYBR Green lub SYBR Gold [3].
Kolejnym sposobem detekcji prążków jest przeniesienie
rozdzielonych fragmentów ssDNA na nylonową membranę
w procesie Southern blotting oraz hybrydyzacja ze znakowanymi
digoksygeniną produktami PCR, w połączeniu
z detekcją chemi-luminescencyjną [25].
Technika DGGE
Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego
(ang. denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) jest
znaną od dawna metodą, powszechnie wykorzystywaną do
przesiewowego wykrywania mutacji w materiale genetycznym.
Pozwala ona na zidentyfikowanie, ale nie na dokładną
charakterystykę, mutacji punktowych oraz niewielkich insercji
i delecji [26]. Technika DGGE wykorzystuje fakt, że
zmutowane cząsteczki DNA będą ulegały częściowej denaturacji
w żelu w innym stężeniu czynnika denaturującego,
niż cząsteczki niezmutowane [26].
Etapem poprzedzającym elektroforezę w gradiencie
czynnika denaturującego jest amplifikacja badanego DNA
techniką PCR. W przypadku heterozygot produktami PCR
są dwa rodzaje homodupleksów i dwa typy heterodupleksów.
Homodupleksy to struktury składające się z dwóch
prawidłowych lub dwóch zmutowanych nici DNA, natomiast
heterodupleksy powstają przez połączenie nici prawidłowej
ze zmutowaną, czego skutkiem jest obecność regionu z niepełnym
sparowaniem zasad w miejscu mutacji. W przypadku
homozygot produktami PCR są jedynie homodupleksy, aby
więc otrzymać mieszaninę homo- i heteodupleksów, a tym samym
zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia mutacji, należy
zmieszać badany DNA z DNA osoby zdrowej [19, 26].
Następnie, produkty PCR są poddawane elektroforezie
w żelu poliakrylamidowym o wzrastającym stężeniu czynnika
denaturującego (mocznik, formamid). Dodatkowo
elektroforezę przeprowadza się w podwyższonej, stałej temperaturze,
zazwyczaj mieszczącej się w zakresie 50-65°C.
Elektroforeza może być wykonywana na żelach z prostopadłym
lub równoległym, w stosunku do kierunku elektroforezy,
gradientem związku denaturującego. W żelach z poziomym
gradientem wykorzystuje się szeroki zakres stężeń
czynnika denaturującego, zazwyczaj 0-100% lub 20-70%,
natomiast w żelach z gradientem pionowym, zakres ten jest
mniejszy, co pozwala uzyskać lepsze rozdzielenie badanych
fragmentów DNA [8]. W tym ostatnim przypadku, na
podstawie doniesień literaturowych, zaleca się, aby różnica
pomiędzy najwyższym i najniższym stężeniem związku denaturującego
nie przekraczała 30% [26].
W trakcie rozdziału elektroforetycznego produkty PCR
migrują jako cząsteczki dwuniciowe, aż do miejsca, w którym
stężenie związków denaturujących jest równe ich temperaturze
meltingu (t m
). W tym punkcie żelu zaczyna się denaturacja
dsDNA, wskutek czego dochodzi do gwałtownego
zahamowania jego migracji [8].
Profil meltingu fragmentu DNA zależy od jego sekwencji
(składu zasad i długości). Obecność niesparowanych
zasad w cząsteczkach heterodupleksów zmniejsza ich całkowitą
stabilność, w związku z czym, w porównaniu do
homodupleksów, denaturują one w żelu przy mniejszym
stężeniu czynnika denaturującego, czyli charakteryzują się
niższą temperaturą meltingu. Stąd też, obecność mutacji
w badanym DNA jest widoczna w elektroforegramie jako
dodatkowe prążki [19, 26, 27].
Całkowitemu rozdzieleniu dsDNA zapobiega się wykorzystując
jeden ze starterów w reakcji PCR, aby przyłączyć
do wybranego końca badanego fragmentu DNA sekwencję
bogatą w pary GC, tzw. GC clamp. Sekwencja taka, zazwyczaj
o długości 40-60 nukleotydów, charakteryzuje się bardzo
wysoką temperaturą denaturacji i pozostaje strukturą
dwuniciową, podczas gdy reszta cząsteczki ulega rozdzieleniu.
Ponadto przyłączenie sekwencji GC clamp zmienia profil
meltingu badanej cząsteczki i przyczynia się do znacznego
wzrostu czułości techniki DGGE [26].
Istotne znaczenie dla prawidłowego przebiegu DGGE ma
określenie profilu meltingu badanego fragmentu DNA. Wykorzystywane
w tym celu specjalne programy komputerowe
są także pomocne w wyborze odpowiednich starterów oraz
ustaleniu optymalnych warunków elektroforezy (zakresu
gradientu czynnika denaturującego). Warunki DGGE mogą
zostać również określone empirycznie, poprzez wykonanie
elektroforezy z poziomym gradientem czynnika denaturującego
[26, 27]. W trakcie DGGE możliwe jest wykrycie
jedynie tych mutacji, które znajdują się w obrębie domeny
o najniższej temperaturze meltingu. Krzywa denaturacji takiej
domeny powinna być jak najbardziej spłaszczona. Zazwyczaj
taki obraz krzywej otrzymuje się po przyłączeniu
sekwencji GC clamp do jednego z końców badanego fragmentu
DNA. W takim przypadku na wykresie powinna być
widoczna także dodatkowa domena, o wysokiej temperaturze
meltingu, odpowiadająca sekwencji GC clamp [26, 27].
Optymalna długość produktów PCR do przeprowadzenia
DGGE mieści się w zakresie 200-400 pz, ponieważ dla fragmentów
dłuższych trudno jest wyznaczyć krzywą meltingu
[26].
Odmiany techniki DGGE
TGGE (ang. temperature gradient gel electrophoresis)
oraz TTGE (ang. temporal temperature gradient gel electrophoresis)
opierają się na takiej samej zasadzie jak DGGE,
z tą różnicą, że warunki denaturujące w trakcie elektroforezy
uzyskuje się przez zastosowanie w miejsce wzrastającego
stężenia chemicznego czynnika denaturującego, gradientu
temperatury w połączeniu ze stałym stężeniem mocznika
w żelu. Analogicznie obecność mutacji jest wykrywana
dzięki temu, że heterodupleksy ulegają denaturacji w niższej
temperaturze niż homodupleksy [8, 28].
W metodzie TTGE temperatura wzrasta stopniowo i jednostajnie
podczas całej elektroforezy, tak że w danym momencie
jest jednakowa w każdym punkcie żelu, natomiast
w TGGE gradient temperaturowy jest stały, ustalony na
początku rozdziału elektroforetycznego [29]. W przypadku
obydwu wyżej wymienionych technik zastosowanie gradientu
temperatury eliminuje konieczność przygotowywania
żeli z gradientem związku chemicznego, co ułatwia wykonanie
badania, a ponadto daje możliwość łatwej zmiany
zakresu gradientu [28, 29].
30