Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
Share Embed Flag
Download ePaper

Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

fpn.sum.edu.pl
from fpn.sum.edu.pl More from this publisher
29.11.2014 Views

Farm Przegl Nauk, 2010, 12 Pierwszy etap analizy SSCP obejmuje denaturację termiczną dwuniciowego DNA (double-strand DNA dsDNA,) w buforze obciążającym z dodatkiem czynnika denaturującego (najczęściej formamid, rzadziej – mocznik lub wodorotlenek sodu) i mieszaniny barwników oraz szybkie schłodzenie w celu zapobiegnięcia renaturacji rozdzielonych fragmentów DNA [1]. W drugim etapie badania uzyskane jednoniciowe cząsteczki poddawane są elektroforezie w niedenaturującym żelu poliakrylamidowym. Ruchliwość elektroforetyczna fragmentów ssDNA zależy od ich wielkości, ładunku oraz struktury przestrzennej. W warunkach niedenaturujących poszczególne jednoniciowe cząsteczki DNA przyjmują określoną konformację (strukturę drugo- i trzeciorzędową), uwarunkowaną wewnątrzcząsteczkowymi interakcjami. Przyjęta struktura zależna jest od długości nici, sekwencji nukleotydów oraz umiejscowienia i liczby regionów, w obrębie których doszło do wewnętrznego sparowania zasad [3]. Technika SSCP umożliwia wykrywanie zarówno znanych mutacji i polimorfizmów, jak również nie opisanych dotychczas zmian w materiale genetycznym. Nieznana mutacja może zostać dokładnie scharakteryzowana po zakończeniu analizy SSCP. W tym celu należy wypłukać z żelu zmutowany fragment DNA, a następnie poddać go reamplifikacji i sekwencjonowaniu [3]. Czynniki wpływające na czułość metody SSCP Na czułość opisanej metody wpływa wiele czynników, takich jak: wielkość badanego fragmentu DNA i zawartość w nim par GC, obecność specyficznych mutacji w analizowanym fragmencie, temperatura żelu podczas elektroforezy, rodzaj żelu i stopień jego usieciowania, obecność glicerolu w żelu, skład buforu (siła jonowa i pH) oraz stężenie DNA. Optymalna długość fragmentów ssDNA do analizy SSCP mieści się w zakresie 150-200 nukleotydów i zapewnia wykrywalność zmian w sekwencji na poziomie 80-90%. Dla fragmentów o długości >300 par zasad (pz) obserwuje się znaczny spadek czułości [2, 4, 5]. Uważa się, że za wyjątkiem transwersji G→T, typ mutacji w badanym fragmencie DNA nie wpływa znacząco na czułość techniki [4]. Odkryto natomiast, że duża zawartość par GC w matrycowym DNA poprawia czułość SSCP. Jest to prawdopodobnie spowodowane tworzeniem większej liczby wiązań wodorowych, a zatem, bardziej stabilnych konformerów [2, 5]. Z kolei stosunek cytozyny do adenozyny w analizowanym fragmencie dodatnio koreluje z optymalną temperaturą elektroforezy (T S ), która może zostać oszacowana przy użyciu następującego wzoru: T S = [80×C/(A+1)]/{2.71 + [C/(A+1)]} [6]. Temperatura żelu jest jednym z najważniejszych czynników wpływających na szybkość z jaką migrują cząsteczki ssDNA podczas elektroforezy i nie powinna przekraczać 20°C. W zbyt wysokiej temperaturze zmniejsza się wydajność tworzenia konformerów. Poza tym, często dochodzi do powstawania dwóch niestabilnych struktur, które w trakcie rozdziału elektroforetycznego przechodzą z jednej formy w drugą, czego efektem jest obecność smug i rozmytych prążków w elektroforegramie. Dane eksperymentalne wskazują, że niewystarczająca kontrola temperatury podczas elektroforezy może spowodować zmianę temperatury żelu nawet o 10°C. Stąd też, aby zapewnić powtarzalność wyników oraz zapobiec wynikom fałszywie ujemnym, bardzo ważne jest utrzymanie jednolitej temperatury w trakcie elektroforezy [1, 7]. Najpowszechniej wykorzystywanym żelem do rozdziału kwasów nukleinowych w przebiegu SSCP jest żel poliakrylamidowy o niskim stopniu usieciowania. W analizie SSCP najczęściej wykorzystuje się żele o całkowitym stężeniu akrylamidu w zakresie 4-12% oraz stopniu usieciowania pomiędzy 2% a 3,4% [8]. Stopień usieciowania żelu wyrażany jest przy pomocy parametru %C, czyli stosunku masy bisakrylamidu do sumy mas akrylamidu i bisakrylamidu w przeliczeniu na 100 ml (%C = (bisakrylamid [g]/akrylamid+bisakrylamid [g]) × 100) [2, 8]. Stopień usieciowania żelu można wyrażać też jako stosunek akrylamidu do bisakrylamidu (np. 19:1) [1]. Alternatywnymi podłożami używanymi w analizie SSCP fragmentów znakowanych radioaktywnie są żele takie jak Hydrolink, Hydrolink-D5000 oraz Hydrolink-MDE (MDE). Udowodniono, iż żel Hydrolink cechuje się, w stosunku do akrylamidu, większą jednolitością pod względem wielkości porów oraz daje wyraźniejsze prążki, co wiąże się z jego lepszą rozdzielczością [9]. Obecność w żelu dodatkowych składników może wpłynąć na poprawę jego zdolności rozdzielczej. Najczęściej dodawanym związkiem jest glicerol o stężeniu 5-10% [2, 3]. Przyjmuje się, że jego pozytywny wpływ na wykrywanie mutacji w trakcie rozdziału elektroforetycznego jest związany z obniżeniem pH buforu Tris-boranowego ze względu na reakcję glicerolu z jonami boranowymi bądź też wiąże się z osłabieniem sił elektrostatycznego odpychania pomiędzy ujemnie naładowanymi resztami fosforanowymi obecnymi w szkielecie cząsteczki DNA, co prowadzi do większej stabilności konformerów [2, 10]. Glicerol opóźnia także migrację cząsteczek w żelu, szczególnie w temperaturze 4°C, co prawdopodobnie ma związek z jego lepkością [2, 3]. Glavač i Dean [11] wykazali, że do żelu mogą zostać dodane inne związki o działaniu denaturującym, takie jak 5% mocznik lub formamid, bądź też obojętne (10% dimetylosulfotlenek lub 10-15% sacharoza). Niemniej jednak, spośród nich jedynie sacharoza wywiera podobny do glicerolu, wyraźnie korzystny wpływ na zdolność rozdzielczą badanego żelu. Dowiedziono również, że nałożenie do studzienki żelu próbki o zbyt dużym stężeniu DNA spowoduje renaturację jednoniciowych fragmentów kwasu nukleinowego, co z kolei przyczyni się do nieefektywnej analizy SSCP. Aby temu zapobiec wystarczy bardziej rozcieńczyć próbkę buforem obciążającym [1]. W niekorzystny sposób na skuteczność SSCP może również wpłynąć obecność w próbce starterów pozostałych po reakcji PCR. Będą one łączyć się z komplementarnymi regionami w ssDNA, zmieniając ich konformację, a w związku z tym profil SSCP [12]. Wybrane odmiany techniki SSCP Od momentu, gdy w 1989 roku opisano po raz pierwszy technikę SSCP, dokonano wielu modyfikacji mających na celu zwiększenie jej czułości, wydajności, a także bezpieczeństwa [1, 2]. Choć zasadniczo technika SSCP jest wykorzystywana do badania DNA, to analiza polimorfizmu konformacji ssRNA 28

copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 także jest możliwa. W porównaniu do metody DNA-SSCP, w technice RNA-SSCP (rSSCP) wymagany jest dodatkowy etap transkrypcji, w trakcie którego na bazie produktów PCR generowane są cząsteczki ssRNA. Niemniej jednak, rSSCP okazuje się być metodą skuteczniejszą w wykrywaniu mutacji, a ponadto umożliwia badanie fragmentów o długości większej niż zazwyczaj stosowane odcinki DNA. Przyjmuje się, że jest to wynikiem obecności w RNA dodatkowej grupy hydroksylowej, co sprzyja tworzeniu większego spektrum konformerów, które są dodatkowo bardziej stabilne niż w przypadku DNA. Poza tym, badanie RNA zmniejsza możliwość renaturacji jednoniciowych fragmentów kwasu nukleinowego [13]. Inną próbą adaptacji metody do badania fragmentów DNA dłuższych niż pozwala na to rutynowa analiza jest użycie podczas elektroforezy buforu o niskim pH. Umożliwia to wykrywanie mutacji we fragmentach o długości 300-800 pz [10]. Kolejną możliwość niesie włączenie do analizy SSCP trawienia zbyt długich produktów PCR enzymami restrykcyjnymi. Dzięki takiej modyfikacji możliwe jest otrzymanie fragmentów DNA o optymalnej długości do dalszego badania [14]. Jednym z problemów techniki SSCP jest reasocjacja komplementarnych nici DNA. Metoda pozwalająca na eliminację tej przeszkody polega na użyciu biotynylowanych primerów do reakcji PCR oraz perełek magnetycznych opłaszczonych streptawidyną, co umożliwia izolację i wykorzystanie do dalszej analizy tylko jednej z dwóch komplementarnych nici [15]. Dowiedziono również, że jeśli badanego DNA nie podda się działaniu wysokiej temperatury, to w elektroforegramie ujawnią się, oprócz głównych, stabilnych konformerów, także przejściowe, wolno migrujące prążki, które mogą dostarczyć dodatkowych informacji o zmianach w badanej sekwencji [16]. Maruya i wsp. [17] poddali produkty PCR denaturacji termicznej w roztworze o niskiej sile jonowej (ang. low ionic strength, LIS), co okazało się być bardziej efektywnym sposobem generowania ssDNA niż powszechnie stosowana denaturacja termiczna w obecności formamidu. Co więcej, powstające cząsteczki ssDNA były w roztworze LIS stabilne nawet w temperaturze pokojowej, w związku z czym nie było konieczności chłodzenia próbek w lodzie po denaturacji termicznej. Odmiana ta została określona jako „low ionic strenght single-stranded conformation polymorphism” (LIS -SSCP), a jej dodatkową zaletą jest bardziej czytelny wzór prążków w porównaniu do konwencjonalnego SSCP. Dane eksperymentalne wskazują, że połączenie SSCP z analizą heterodupleksów, a więc dwóch metod zdolnych do wykrywania niewielkich zmian w sekwencji i wymagających podobnego wyposażenia, daje możliwość detekcji większego odsetka mutacji, niż przy użyciu każdej z tych metod oddzielnie [18, 19]. Kolejna odmiana SSCP, charakteryzująca się znacznie wyższą czułością w porównaniu do klasycznej analizy, to wielotemperaturowe SSCP (ang. multitemperature SSCP, mSSCP). Technika mSSCP opiera się na obserwacji, że wskutek kilkukrotnej zmiany temperatury żelu podczas natywnej elektroforezy SSCP zwiększa się wskaźnik wykrywalności punktowych zmian sekwencji, a także skraca czas i całkowity koszt analizy. Dane eksperymentalne wykazały ponadto, że wzór prążków powstały w wyniku zastosowania mSSCP charakteryzuje się lepszą zdolnością dyskryminacyjną niż profile uzyskane z badania tych samych próbek w różnych, ale stałych temperaturach [7, 20]. Poprawę wydajności analizy SSCP można osiągnąć przez połączenie jej z techniką multipleks-PCR, która polega na jednoczesnej amplifikacji kilku różnych fragmentów DNA dzięki wprowadzeniu do mieszaniny reakcyjnej wielu par starterów. Produkty reakcji multipleks-PCR nakłada się następnie do jednej studzienki w żelu, przez co możliwe jest rozdzielenie nawet dziesięciu eksonów badanego genu na jednej ścieżce żelu. Modyfikacja taka jest określana jako multiplex-SSCP (MSSCP) [21]. Kolejną odmianą pozwalającą na analizę wielu fragmentów ssDNA na jednej linii żelu jest technika DOVAM -S (ang. detection of virtually all mutations-SSCP), która dodatkowo charakteryzuje się praktycznie 100% czułością w wykrywaniu mutacji. W analizie DOVAM-S produkty PCR zostają poddane elektroforezie w pięciu odmiennych, niedenaturujących warunkach zgodnie z procedurą opisaną przez Liu i wsp. [22]. Różnice dotyczą rodzaju żelu, buforu, temperatury oraz dodatku glicerolu. W celu wyeliminowania używanych w technice DO- VAM-S znaczników radioizotopowych, a także zredukowania liczby żeli koniecznych do analizy, powstała kolejna odmiana – fluorescent DOVAM-S (F-DOVAM-S) wykorzystująca barwniki fluorescencyjne. Technika F-DOVAM-S jest połączeniem elektroforezy mSSCP (multitemperature SSCP) w 2 zestawach warunków ze znakowaniem fluorescencyjnym. Pozwala to na wykrycie 97% mutacji, a ponadto przyczynia się do znacznego zwiększenia wydajności analizy. Użycie trzech barwników – 6FAM (niebieski), VIC (zielony) oraz NED (żółty), daje możliwość rozdziału w każdej linii żelu jednocześnie próbek pochodzących od trzech pacjentów. Co więcej, stosowanie kilku różnokolorowych barwników stwarza możliwość włączenia do każdej ścieżki żelu wewnętrznego wzorca, wskutek czego identyfikacja nawet niewielkich zmian położenia prążków stanie się łatwiejsza [23]. Źródłem kolejnych modyfikacji w metodzie SSCP jest sposób detekcji konformerów. Czułą, choć stwarzającą potencjalne niebezpieczeństwo dla wykonującego analizę, metodą jest użycie znakowanych radioaktywnie starterów lub deoksynukleotydów do reakcji PCR [3]. Wśród najczęściej stosowanych radioizotopów znajdują się 32 P, 33 P oraz 35 S [3, 16, 24]. Jednym ze sposobów, które pozwalają na wykluczenie znaczników izotopowych z analizy SSCP jest zastosowanie w ich miejsce barwników fluorescencyjnych. Znakowanie fluorescencyjne możliwe jest zarówno w trakcie reakcji PCR, jak również po jej zakończeniu, a ponadto pozwala na wprowadzenie do analizy jednocześnie kilku barwników [23]. Innym rozwiązaniem dla nieizotopowej analizy SSCP jest barwienie żelu solami srebra po zakończeniu elektroforezy. Metoda ta jest prawie tak czuła jak znakowanie radioaktywne i daje możliwość trwałego zapisu wyników i długotrwałego przechowywania żeli [1, 2]. Opisywano przypadki barwienia żeli bromkiem etydyny, jednakże technika ta może być za mało czuła do wykrycia subtelnych 29

Farm Przegl Nauk, 2010, 12<br />

Pierwszy etap analizy SSCP obejmuje denaturację termiczną<br />

dwuniciowego DNA (double-strand DNA dsDNA,)<br />

w buforze obciążającym z dodatkiem czynnika denaturującego<br />

(najczęściej formamid, rzadziej – mocznik lub wodorotlenek<br />

sodu) i mieszaniny barwników oraz szybkie schłodzenie<br />

w celu zapobiegnięcia renaturacji rozdzielonych fragmentów<br />

DNA [1]. W drugim etapie badania uzyskane jednoniciowe<br />

cząsteczki poddawane są elektroforezie w niedenaturującym<br />

żelu poliakrylamidowym. Ruchliwość elektroforetyczna<br />

fragmentów ssDNA zależy od ich wielkości, ładunku oraz<br />

struktury przestrzennej. W warunkach niedenaturujących<br />

poszczególne jednoniciowe cząsteczki DNA przyjmują określoną<br />

konformację (strukturę drugo- i trzeciorzędową), uwarunkowaną<br />

wewnątrzcząsteczkowymi interakcjami. Przyjęta<br />

struktura zależna jest od długości nici, sekwencji nukleotydów<br />

oraz umiejscowienia i liczby regionów, w obrębie których<br />

doszło do wewnętrznego sparowania zasad [3].<br />

Technika SSCP umożliwia wykrywanie zarówno znanych<br />

mutacji i polimorfizmów, jak również nie opisanych<br />

dotychczas zmian w materiale genetycznym. Nieznana mutacja<br />

może zostać dokładnie scharakteryzowana po zakończeniu<br />

analizy SSCP. W tym celu należy wypłukać z żelu<br />

zmutowany fragment DNA, a następnie poddać go reamplifikacji<br />

i sekwencjonowaniu [3].<br />

Czynniki wpływające na czułość metody SSCP<br />

Na czułość opisanej metody wpływa wiele czynników,<br />

takich jak: wielkość badanego fragmentu DNA i zawartość<br />

w nim par GC, obecność specyficznych mutacji w analizowanym<br />

fragmencie, temperatura żelu podczas elektroforezy,<br />

rodzaj żelu i stopień jego usieciowania, obecność glicerolu<br />

w żelu, skład buforu (siła jonowa i pH) oraz stężenie DNA.<br />

Optymalna długość fragmentów ssDNA do analizy SSCP<br />

mieści się w zakresie 150-200 nukleotydów i zapewnia wykrywalność<br />

zmian w sekwencji na poziomie 80-90%. Dla<br />

fragmentów o długości >300 par zasad (pz) obserwuje się<br />

znaczny spadek czułości [2, 4, 5].<br />

Uważa się, że za wyjątkiem transwersji G→T, typ mutacji<br />

w badanym fragmencie DNA nie wpływa znacząco<br />

na czułość techniki [4]. Odkryto natomiast, że duża zawartość<br />

par GC w matrycowym DNA poprawia czułość<br />

SSCP. Jest to prawdopodobnie spowodowane tworzeniem<br />

większej liczby wiązań wodorowych, a zatem, bardziej<br />

stabilnych konformerów [2, 5]. Z kolei stosunek cytozyny<br />

do adenozyny w analizowanym fragmencie dodatnio koreluje<br />

z optymalną temperaturą elektroforezy (T S<br />

), która<br />

może zostać oszacowana przy użyciu następującego wzoru:<br />

T S<br />

= [80×C/(A+1)]/{2.71 + [C/(A+1)]} [6].<br />

Temperatura żelu jest jednym z najważniejszych czynników<br />

wpływających na szybkość z jaką migrują cząsteczki<br />

ssDNA podczas elektroforezy i nie powinna przekraczać<br />

20°C. W zbyt wysokiej temperaturze zmniejsza się wydajność<br />

tworzenia konformerów. Poza tym, często dochodzi<br />

do powstawania dwóch niestabilnych struktur, które w trakcie<br />

rozdziału elektroforetycznego przechodzą z jednej formy<br />

w drugą, czego efektem jest obecność smug i rozmytych prążków<br />

w elektroforegramie. Dane eksperymentalne wskazują, że<br />

niewystarczająca kontrola temperatury podczas elektroforezy<br />

może spowodować zmianę temperatury żelu nawet o 10°C.<br />

Stąd też, aby zapewnić powtarzalność wyników oraz zapobiec<br />

wynikom fałszywie ujemnym, bardzo ważne jest utrzymanie<br />

jednolitej temperatury w trakcie elektroforezy [1, 7].<br />

Najpowszechniej wykorzystywanym żelem do rozdziału<br />

kwasów nukleinowych w przebiegu SSCP jest żel poliakrylamidowy<br />

o niskim stopniu usieciowania. W analizie SSCP<br />

najczęściej wykorzystuje się żele o całkowitym stężeniu<br />

akrylamidu w zakresie 4-12% oraz stopniu usieciowania<br />

pomiędzy 2% a 3,4% [8]. Stopień usieciowania żelu wyrażany<br />

jest przy pomocy parametru %C, czyli stosunku masy<br />

bisakrylamidu do sumy mas akrylamidu i bisakrylamidu<br />

w przeliczeniu na 100 ml (%C = (bisakrylamid [g]/akrylamid+bisakrylamid<br />

[g]) × 100) [2, 8]. Stopień usieciowania<br />

żelu można wyrażać też jako stosunek akrylamidu do bisakrylamidu<br />

(np. 19:1) [1].<br />

Alternatywnymi podłożami używanymi w analizie SSCP<br />

fragmentów znakowanych radioaktywnie są żele takie jak<br />

Hydrolink, Hydrolink-D5000 oraz Hydrolink-MDE (MDE).<br />

Udowodniono, iż żel Hydrolink cechuje się, w stosunku do<br />

akrylamidu, większą jednolitością pod względem wielkości<br />

porów oraz daje wyraźniejsze prążki, co wiąże się z jego<br />

lepszą rozdzielczością [9].<br />

Obecność w żelu dodatkowych składników może wpłynąć<br />

na poprawę jego zdolności rozdzielczej. Najczęściej dodawanym<br />

związkiem jest glicerol o stężeniu 5-10% [2, 3].<br />

Przyjmuje się, że jego pozytywny wpływ na wykrywanie<br />

mutacji w trakcie rozdziału elektroforetycznego jest związany<br />

z obniżeniem pH buforu Tris-boranowego ze względu na<br />

reakcję glicerolu z jonami boranowymi bądź też wiąże się<br />

z osłabieniem sił elektrostatycznego odpychania pomiędzy<br />

ujemnie naładowanymi resztami fosforanowymi obecnymi<br />

w szkielecie cząsteczki DNA, co prowadzi do większej stabilności<br />

konformerów [2, 10]. Glicerol opóźnia także migrację<br />

cząsteczek w żelu, szczególnie w temperaturze 4°C, co<br />

prawdopodobnie ma związek z jego lepkością [2, 3].<br />

Glavač i Dean [11] wykazali, że do żelu mogą zostać dodane<br />

inne związki o działaniu denaturującym, takie jak 5%<br />

mocznik lub formamid, bądź też obojętne (10% dimetylosulfotlenek<br />

lub 10-15% sacharoza). Niemniej jednak, spośród<br />

nich jedynie sacharoza wywiera podobny do glicerolu, wyraźnie<br />

korzystny wpływ na zdolność rozdzielczą badanego<br />

żelu.<br />

Dowiedziono również, że nałożenie do studzienki żelu<br />

próbki o zbyt dużym stężeniu DNA spowoduje renaturację<br />

jednoniciowych fragmentów kwasu nukleinowego, co z kolei<br />

przyczyni się do nieefektywnej analizy SSCP. Aby temu<br />

zapobiec wystarczy bardziej rozcieńczyć próbkę buforem<br />

obciążającym [1].<br />

W niekorzystny sposób na skuteczność SSCP może również<br />

wpłynąć obecność w próbce starterów pozostałych po<br />

reakcji PCR. Będą one łączyć się z komplementarnymi regionami<br />

w ssDNA, zmieniając ich konformację, a w związku<br />

z tym profil SSCP [12].<br />

Wybrane odmiany techniki SSCP<br />

Od momentu, gdy w 1989 roku opisano po raz pierwszy<br />

technikę SSCP, dokonano wielu modyfikacji mających na<br />

celu zwiększenie jej czułości, wydajności, a także bezpieczeństwa<br />

[1, 2].<br />

Choć zasadniczo technika SSCP jest wykorzystywana do<br />

badania DNA, to analiza polimorfizmu konformacji ssRNA<br />

28

logo

products

Resources

Company

Terms of service
Privacy policy
Cookie policy
Cookie settings
Imprint
Change language
Made with love in Switzerland
© 2024 Yumpu.com all rights reserved

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!