Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Farm Przegl Nauk, 2010,12, 27-33
copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073
Zalety i ograniczenia technik przesiewowych SSCP i DGGE
w diagnostyce molekularnej
Advantages and limitations of screening techniques SSCP and DGGE
in molecular diagnostics
Ewa Moric-Janiszewska, Ludmiła Węglarz
Katedra i Zakład Biochemii, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Streszczenie
Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów
DNA (ang. single stranded conformation polymorphism,
SSCP) jest łatwą, szybką i jedną z najczęściej stosowanych
technik elektroforetycznych umożliwiających wykrywanie
polimorfizmu genetycznego oraz innych niewielkich zmian
w materiale genetycznym, takich jak: mutacje punktowe, małe
delecje i insercje, czy też mikroinwersje. Technika ta wykorzystuje
fakt, że podczas elektroforezy w warunkach niedenaturujących
każda jednoniciowa cząsteczka DNA przyjmuje
właściwą sobie konformację zależną między innymi od jej
sekwencji, w związku z czym zamiana nawet pojedynczego
nukleotydu w kilkuset nukleotydowej nici spowoduje zmianę
struktury przestrzennej, co w konsekwencji prowadzi do różnic
w ruchliwości elektroforetycznej. Elektroforeza w gradiencie
czynnika denaturującego (ang. denaturing gradient gel electrophoresis,
DGGE) jest znaną od dawna metodą, powszechnie
wykorzystywaną do przesiewowego wykrywania mutacji
w materiale genetycznym. Pozwala ona na zidentyfikowanie,
ale nie na dokładną charakterystykę mutacji punktowych oraz
niewielkich insercji i delecji. Technika DGGE wykorzystuje
fakt, że zmutowane cząsteczki DNA ulegają częściowej denaturacji
w żelu w innym stężeniu czynnika denaturującego,
niż cząsteczki niezmutowane. W przedstawionej pracy opisano
odmiany wyżej wymienionych technik molekularnych,
ich zalety i ograniczenia stosowania. Opisano również nową
technikę HRM przydatną do analizy polimorfizmów.
Abstract
Single-stranded conformation polymorphism analysis of
DNA fragments (SSCP) is easy, fast and one of the most
commonly used electrophoretic techniques to detect genetic
polymorphisms and other minor changes in the genetic material,
such as point mutations, small deletions, insertions
and microinversions. This technique exploits the fact that
during the electrophoresis under non-denaturing conditions
each single-stranded DNA molecule adopts a proper conformation
dependent on its sequence, and therefore even
a single nucleotide substitution in several hundred nucleotide
strands will change the spatial structure, which in turn
leads to differences in electrophoretic mobility. Electrophoresis
in a gradient of denaturing factor (DGGE) is a well
known method commonly used for screening detection of
mutations in the genetic material. It allows identification,
but not an accurate characterization of point mutations,
small insertions and deletions. DGGE technique exploits
the fact that the mutant DNA molecules undergo partial denaturation
in a gel at different concentration of denaturing
factor than non-mutated ones. In the paper, these two molecular
techniques have been described including their advantages
and limitations of use. Also desribes a new HRM
technique which useful for the analysis of polymorhisms.
Key words: SSCP analysis, DGGE analysis, HRM analysis,
molecular diagnostics
Słowa kluczowe: analiza SSCP, analiza DGGE, analiza
HRM, diagnostyka molekularna
Technika SSCP
Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowych
fragmentów DNA (ang. single stranded conformation polymorphism,
SSCP) jest łatwą, szybką i jedną z najczęściej
stosowanych technik elektroforetycznych umożliwiających
wykrywanie polimorfizmu genetycznego oraz innych niewielkich
zmian w materiale genetycznym, takich jak: mutacje
punktowe, małe delecje i insercje, czy też mikroinwersje [1,
2]. Technika ta wykorzystuje fakt, że podczas elektroforezy
w warunkach niedenaturujących każda jednoniciowa cząsteczka
DNA przyjmuje właściwą sobie konformację zależną
między innymi od jej sekwencji, w związku z czym zamiana
nawet pojedynczego nukleotydu w kilkuset nukleotydowej nici
spowoduje zmianę struktury przestrzennej, co w konsekwencji
prowadzi do różnic w ruchliwości elektroforetycznej [1, 2].
Materiał do analizy SSCP stanowią próbki DNA genomowego,
bądź będącego produktem reakcji odwrotnej transkrypcji,
komplementarnego DNA (cDNA, complementary
DNA). Docelowa sekwencja jest amplifikowana w reakcji
łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction,
PCR), której produkty są następnie wykorzystywane do właściwego
badania polimorfizmu konformacji jednoniciowego
DNA (single-strand DNA, ssDNA) [1, 2].
27