Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

fpn.sum.edu.pl
from fpn.sum.edu.pl More from this publisher
29.11.2014 Views

Farm Przegl Nauk, 2010, 12 z białkami, jak i frakcji wolnej. Wiadomo jednak, iż tylko część niezwiązana jest formą aktywną i jako taka wywiera wpływ na funkcjonowanie organizmu. Stąd też tak liczne badania dotyczące oznaczania poziomu kortyzolu również w innych tkankach i płynach ustrojowych. Do niedawna największe znaczenie odgrywał mocz, który standardowo stosuje się w badaniach przesiewowych podczas diagnozowania syndromu Cushinga. Od kilku lat w diagnostyce medycznej, jako materiał badawczy stosuje się również ślinę. W przypadku moczu, jak również śliny możliwe jest oznaczenie wyłącznie stężenia frakcji wolnej hormonu, jednakże liczne badania dowiodły, iż ta forma kortyzolu wystarcza do postawienia prawidłowej diagnozy. Wielokrotnie w przytoczonych publikacjach podkreślano wysoki stopień korelacji pomiędzy zmianami stężeń kortyzolu we krwi oraz ślinie. Dowiedziono, iż ślina może stanowić dogodną alternatywę, jako materiał badawczy nie tylko dla moczu, ale również dla krwi, która jest najczęściej stosowana. O przewadze śliny jako alternatywnego materiału do badań diagnostycznych świadczyć może fakt, iż większość obecnie prowadzonych badań dotyczących stopnia korelacji poziomu kortyzolu we krwi i pozostałych płynach ustrojowych dotyczy właśnie śliny. Piśmiennictwo 1. Chrousos GP. Adrenocorticosteroids & adrenocortical antagonists. W: Basic and clinical pharmacology. Red. Katzung BG. Mc Graw Hill, Boston 2007; 635-645. 2. Semple RK, Bolander Jr FF. Biochemical endocrinology. W: Medical biochemistry, 3rd ed. Red. Baynes JW, Dominiczak MH, Mosby Elsevier, Filadelfia 2009; 525-549. 3. Budziszewska B, Lasoń W. Neuroendokrynne mechanizmy działania leków przeciwdepresyjnych. Triangulum M.B.P., Wrocław 2003. 4. Lydyard PM, Whelan A, Fanger MW. Testy immunologiczne. W: Immunologia, krótkie wykłady. Red. Lydyard PM i wsp. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001; 314-318. 5. Putignano P i wsp. Salivary cortisol measurement in normal – weight, obese and anorexic women: comparison with plasma cortisol. Eur J Endocrinol 2001; 145: 165-171. 6. Baghai i wsp. Evaluation of a salivary based combined dexamethasone/CRH test in patients with major depression. Psychoneuroendocrinology 2002; 27: 385-399. 7. Bhagwagar Z, Hafizi S, Cowen PJ. Acute citalopram administration produces correlated increases in plasma and salivary cortisol. Psychopharmacology 2002; 163: 118-120. 8. Nadeem HS, Attenburrow M-J, Cowen PJ. Comparison of the effects of citalopram and escitalopram on 5-HTmediated neuroendocrine responses. Neuropsychopharmacology 2004: 29: 1699-1703. 9. Gozansky WS i wsp. Salivary cortisol determined by enzyme immunoassay is preferable to serum total cortisol for assessment of dynamic hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity. Clin Endocrinol 2005; 63: 336-341. 10. Marcus-Perlman Y i wsp. Low-dose ACTH (1 µg) salivary test: a potential alternative to the classical blood test. Clin Endocrinol 2006; 64: 215-218. 11. Ahn R-S i wsp. Salivary cortisol and DHEA levels in the Korean population: age-related differences, diurnal rhythm, and correlations with serum levels. Yonsei Med J 2007; 48: 379-388. 12. Restituto P i wsp. Advantage of salivary cortisol measurements in the diagnosis of glucocorticoid related disorders. Clin Biochem 2008; 41: 688-692. 13. Poll E-M i wsp. Saliva collection method affects predictability of serum cortisol. Clin Chim Acta 2007; 382: 15-19. 14. Kartsova LA, Bessonova EA. Determination of steroids in biological samples by micellar electrokinetic chromatography. Anal Chem 2007; 62: 68-75. 15. Yaneva M i wsp. Midnight salivary cortisol for the initial diagnosis of Cushing’s Syndrome of various causes. J Clin Endocrinol Metab 2004; 7: 3345-3351. 16. van Cruijsen N i wsp. Analysis of cortisol and other stress-related hormones in patients with Ménière’s Disease. Otol Neurotol 2005; 26: 1214-1219. 17. Viardot A i wsp. Reproducibility of nighttime salivary cortisol and its use in the diagnosis of hypercortisolism compared with urinary free cortisol and overnight dexamethasone suppression test. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90: 5730-5736. 18. Putignano P i wsp. Midnight salivary cortisol versus urinary free and midnight serum cortisol as screening tests for Cushing’s syndrome. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88: 4153-4157. data otrzymania pracy: 30.09.2010 r. data akceptacji do druku: 03.11.2010 r. Adres do korespondencji: prof. dr hab. Marek Wesołowski Katedra i Zakład Chemii Analitycznej Gdański Uniwersytet Medyczny Al. Gen. J. Hallera 107, 80-416 Gdańsk Tel. + 48 58 349 31 20, fax +48 58 349 31 24 e-mail: marwes@gumed.edu.pl 26

Farm Przegl Nauk, 2010,12, 27-33 copyright © 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Zalety i ograniczenia technik przesiewowych SSCP i DGGE w diagnostyce molekularnej Advantages and limitations of screening techniques SSCP and DGGE in molecular diagnostics Ewa Moric-Janiszewska, Ludmiła Węglarz Katedra i Zakład Biochemii, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Streszczenie Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA (ang. single stranded conformation polymorphism, SSCP) jest łatwą, szybką i jedną z najczęściej stosowanych technik elektroforetycznych umożliwiających wykrywanie polimorfizmu genetycznego oraz innych niewielkich zmian w materiale genetycznym, takich jak: mutacje punktowe, małe delecje i insercje, czy też mikroinwersje. Technika ta wykorzystuje fakt, że podczas elektroforezy w warunkach niedenaturujących każda jednoniciowa cząsteczka DNA przyjmuje właściwą sobie konformację zależną między innymi od jej sekwencji, w związku z czym zamiana nawet pojedynczego nukleotydu w kilkuset nukleotydowej nici spowoduje zmianę struktury przestrzennej, co w konsekwencji prowadzi do różnic w ruchliwości elektroforetycznej. Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego (ang. denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) jest znaną od dawna metodą, powszechnie wykorzystywaną do przesiewowego wykrywania mutacji w materiale genetycznym. Pozwala ona na zidentyfikowanie, ale nie na dokładną charakterystykę mutacji punktowych oraz niewielkich insercji i delecji. Technika DGGE wykorzystuje fakt, że zmutowane cząsteczki DNA ulegają częściowej denaturacji w żelu w innym stężeniu czynnika denaturującego, niż cząsteczki niezmutowane. W przedstawionej pracy opisano odmiany wyżej wymienionych technik molekularnych, ich zalety i ograniczenia stosowania. Opisano również nową technikę HRM przydatną do analizy polimorfizmów. Abstract Single-stranded conformation polymorphism analysis of DNA fragments (SSCP) is easy, fast and one of the most commonly used electrophoretic techniques to detect genetic polymorphisms and other minor changes in the genetic material, such as point mutations, small deletions, insertions and microinversions. This technique exploits the fact that during the electrophoresis under non-denaturing conditions each single-stranded DNA molecule adopts a proper conformation dependent on its sequence, and therefore even a single nucleotide substitution in several hundred nucleotide strands will change the spatial structure, which in turn leads to differences in electrophoretic mobility. Electrophoresis in a gradient of denaturing factor (DGGE) is a well known method commonly used for screening detection of mutations in the genetic material. It allows identification, but not an accurate characterization of point mutations, small insertions and deletions. DGGE technique exploits the fact that the mutant DNA molecules undergo partial denaturation in a gel at different concentration of denaturing factor than non-mutated ones. In the paper, these two molecular techniques have been described including their advantages and limitations of use. Also desribes a new HRM technique which useful for the analysis of polymorhisms. Key words: SSCP analysis, DGGE analysis, HRM analysis, molecular diagnostics Słowa kluczowe: analiza SSCP, analiza DGGE, analiza HRM, diagnostyka molekularna Technika SSCP Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowych fragmentów DNA (ang. single stranded conformation polymorphism, SSCP) jest łatwą, szybką i jedną z najczęściej stosowanych technik elektroforetycznych umożliwiających wykrywanie polimorfizmu genetycznego oraz innych niewielkich zmian w materiale genetycznym, takich jak: mutacje punktowe, małe delecje i insercje, czy też mikroinwersje [1, 2]. Technika ta wykorzystuje fakt, że podczas elektroforezy w warunkach niedenaturujących każda jednoniciowa cząsteczka DNA przyjmuje właściwą sobie konformację zależną między innymi od jej sekwencji, w związku z czym zamiana nawet pojedynczego nukleotydu w kilkuset nukleotydowej nici spowoduje zmianę struktury przestrzennej, co w konsekwencji prowadzi do różnic w ruchliwości elektroforetycznej [1, 2]. Materiał do analizy SSCP stanowią próbki DNA genomowego, bądź będącego produktem reakcji odwrotnej transkrypcji, komplementarnego DNA (cDNA, complementary DNA). Docelowa sekwencja jest amplifikowana w reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR), której produkty są następnie wykorzystywane do właściwego badania polimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA (single-strand DNA, ssDNA) [1, 2]. 27

Farm Przegl Nauk, 2010, 12<br />

z białkami, jak i frakcji wolnej. Wiadomo jednak, iż tylko<br />

część niezwiązana jest formą aktywną i jako taka wywiera<br />

wpływ na funkcjonowanie organizmu. Stąd też tak liczne<br />

badania dotyczące oznaczania poziomu kortyzolu również<br />

w innych tkankach i płynach ustrojowych.<br />

Do niedawna największe znaczenie odgrywał mocz,<br />

który standardowo stosuje się w badaniach przesiewowych<br />

podczas diagnozowania syndromu Cushinga. Od kilku lat<br />

w diagnostyce medycznej, jako materiał badawczy stosuje<br />

się również ślinę. W przypadku moczu, jak również śliny<br />

możliwe jest oznaczenie wyłącznie stężenia frakcji wolnej<br />

hormonu, jednakże liczne badania dowiodły, iż ta forma<br />

kortyzolu wystarcza do postawienia prawidłowej diagnozy.<br />

Wielokrotnie w przytoczonych publikacjach podkreślano<br />

wysoki stopień korelacji pomiędzy zmianami stężeń<br />

kortyzolu we krwi oraz ślinie. Dowiedziono, iż ślina może<br />

stanowić dogodną alternatywę, jako materiał badawczy nie<br />

tylko dla moczu, ale również dla krwi, która jest najczęściej<br />

stosowana. O przewadze śliny jako alternatywnego materiału<br />

do badań diagnostycznych świadczyć może fakt, iż większość<br />

obecnie prowadzonych badań dotyczących stopnia<br />

korelacji poziomu kortyzolu we krwi i pozostałych płynach<br />

ustrojowych dotyczy właśnie śliny.<br />

Piśmiennictwo<br />

1. Chrousos GP. Adrenocorticosteroids & adrenocortical<br />

antagonists. W: Basic and clinical pharmacology.<br />

Red. Katzung BG. Mc Graw Hill, Boston 2007;<br />

635-645.<br />

2. Semple RK, Bolander Jr FF. Biochemical endocrinology.<br />

W: Medical biochemistry, 3rd ed. Red. Baynes JW,<br />

Dominiczak MH, Mosby Elsevier, Filadelfia 2009;<br />

525-549.<br />

3. Budziszewska B, Lasoń W. Neuroendokrynne mechanizmy<br />

działania leków przeciwdepresyjnych. Triangulum<br />

M.B.P., Wrocław 2003.<br />

4. Lydyard PM, Whelan A, Fanger MW. Testy immunologiczne.<br />

W: Immunologia, krótkie wykłady. Red. Lydyard<br />

PM i wsp. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa<br />

2001; 314-318.<br />

5. Putignano P i wsp. Salivary cortisol measurement in<br />

normal – weight, obese and anorexic women: comparison<br />

with plasma cortisol. Eur J Endocrinol 2001; 145:<br />

165-171.<br />

6. Baghai i wsp. Evaluation of a salivary based combined<br />

dexamethasone/CRH test in patients with major depression.<br />

Psychoneuroendocrinology 2002; 27: 385-399.<br />

7. Bhagwagar Z, Hafizi S, Cowen PJ. Acute citalopram<br />

administration produces correlated increases in plasma<br />

and salivary cortisol. Psychopharmacology 2002; 163:<br />

118-120.<br />

8. Nadeem HS, Attenburrow M-J, Cowen PJ. Comparison<br />

of the effects of citalopram and escitalopram on 5-HTmediated<br />

neuroendocrine responses. Neuropsychopharmacology<br />

2004: 29: 1699-1703.<br />

9. Gozansky WS i wsp. Salivary cortisol determined by enzyme<br />

immunoassay is preferable to serum total cortisol<br />

for assessment of dynamic hypothalamic-pituitary-adrenal<br />

axis activity. Clin Endocrinol 2005; 63: 336-341.<br />

10. Marcus-Perlman Y i wsp. Low-dose ACTH (1 µg) salivary<br />

test: a potential alternative to the classical blood<br />

test. Clin Endocrinol 2006; 64: 215-218.<br />

11. Ahn R-S i wsp. Salivary cortisol and DHEA levels in<br />

the Korean population: age-related differences, diurnal<br />

rhythm, and correlations with serum levels. Yonsei Med<br />

J 2007; 48: 379-388.<br />

12. Restituto P i wsp. Advantage of salivary cortisol measurements<br />

in the diagnosis of glucocorticoid related disorders.<br />

Clin Biochem 2008; 41: 688-692.<br />

13. Poll E-M i wsp. Saliva collection method affects predictability<br />

of serum cortisol. Clin Chim Acta 2007; 382: 15-19.<br />

14. Kartsova LA, Bessonova EA. Determination of steroids<br />

in biological samples by micellar electrokinetic chromatography.<br />

Anal Chem 2007; 62: 68-75.<br />

15. Yaneva M i wsp. Midnight salivary cortisol for the initial<br />

diagnosis of Cushing’s Syndrome of various causes.<br />

J Clin Endocrinol Metab 2004; 7: 3345-3351.<br />

16. van Cruijsen N i wsp. Analysis of cortisol and other<br />

stress-related hormones in patients with Ménière’s Disease.<br />

Otol Neurotol 2005; 26: 1214-1219.<br />

17. Viardot A i wsp. Reproducibility of nighttime salivary<br />

cortisol and its use in the diagnosis of hypercortisolism<br />

compared with urinary free cortisol and overnight dexamethasone<br />

suppression test. J Clin Endocrinol Metab<br />

2005; 90: 5730-5736.<br />

18. Putignano P i wsp. Midnight salivary cortisol versus urinary<br />

free and midnight serum cortisol as screening tests<br />

for Cushing’s syndrome. J Clin Endocrinol Metab 2003;<br />

88: 4153-4157.<br />

data otrzymania pracy: 30.09.2010 r.<br />

data akceptacji do druku: 03.11.2010 r.<br />

Adres do korespondencji:<br />

prof. dr hab. Marek Wesołowski<br />

Katedra i Zakład Chemii Analitycznej<br />

Gdański Uniwersytet Medyczny<br />

Al. Gen. J. Hallera 107,<br />

80-416 Gdańsk<br />

Tel. + 48 58 349 31 20, fax +48 58 349 31 24<br />

e-mail: marwes@gumed.edu.pl<br />

26

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!