Pokaż cały numer - FPN - Farmaceutyczny PrzeglÄ d Naukowy

Farm Przegl Nauk, 2010, 12
rodzin, które blisko korelują filogenetycznie z gamma- retrowirusami.
Są to np. HERV-R, HERV-W, HERV-H i kilka
innych. Uważa się, że oprócz rekombinacji na poziomie wirusowego
RNA możliwe jest upakowanie cząstek RNA jednego
wirusa w kapsydzie białkowym pochodzącym od innego
wirusa. Taki proces miał miejsce podczas prób terapii
genowej u ssaków naczelnych. Zaobserwowano wówczas
przypadkowe, endogenne sekwencje (w tym należące do
endogennych retrowirusów) w wektorach retrowirusowych,
a następnie wykazano ich ekspresję w organizmie biorcy
[15]. Z kolei dotychczasowe poszukiwania rekombinantów
pomiędzy PERV a HERV nie potwierdziły ich obecności
[16], lecz badania w tej tematyce nie są liczne. Retrowirusy
posiadają w swym genomie wiele sekwencji o charakterze
regulatorowym, które po zakażeniu i integracji z genomowym
DNA w niektórych przypadkach mogą modulować
ekspresję genów leżących w pobliżu [17]. Ze względu na
rolę, jaką spełniają HERV w organizmie człowieka, istotne
jest aby ocenić, czy obecność PERV nie wpływa na ekspresję
tych retrowirusów.
Celem przedstawionej pracy było wykazanie, czy zakażenie
komórek człowieka linii HEK293 wirusami PERV
ma wpływ na poziom ekspresji endogennych retrowirusów
człowieka z rodziny HERV-W. Ocenę procesu ekspresji prowadzono
na poziomie białka.
Materiał i metody
Materiał badany
Próbkami badanymi były komórki linii HEK293 (Human
Embryo Kidney, nr ECACC 85120602), komórki linii
HEK293 infekowanej wirusami PERV (293/CIRCE, nr
ECACC: 97051411), oraz komórki linii nerki świni PK-15
(otrzymane od dr A. Lipowskiego z Państwowego Instytutu
Weterynaryjnego- Państwowego Instytutu Badawczego
w Puławach). Hodowle komórkowe prowadzono w pożywce
DMEM z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej
oraz antybiotyku (PAA, Austria). Wszystkie linie były
utrzymywane w hodowli do uzyskania stanu subkonfluencji
(70-80%) a następnie pasażowane w stosunku 1:6. Komórki
linii 293/CIRCE stanowiły kontrolę dodatnią zakażenia wirusami
PERV. Procedura zakażania komórek HEK293 wirusami
PERV pochodzącymi z nadsączu komórkowego linii
nerki świni PK-15 była przeprowadzona wg metody opisanej
przez Kuddus i wsp. [18] oraz na podstawie informacji
własnych tego autora. Komórki HEK293 były posiewane
1 dobę przed zakażeniem w naczyniu hodowlanym (butelce)
o pojemności 75ml w standardowych warunkach, bez dodatku
antybiotyków. W celu przygotowania zawiesiny wirusów
PERV do infekcji komórek HEK293 zebrano pożywkę
hodowlaną z komórek PK- 15 pobraną po 48 godzinach prowadzenia
hodowli komórkowej a następnie filtrowano przez
filtr o średnicy porów 0,45µm w celu pozbycia się komórek.
Infekcję prowadzono w obecności polibrenu (Hexadimethrine
bromide, Sigma) przez 4 godziny, po czym pożywkę
zlewano i zastępowano świeżą, wolną od wirusów. Hodowlę
kontynuowano do uzyskania 22 pasażu. Próbki komórek
do badań (ok. 5x10 6 ) pobierano w trzech powtórzeniach
po każdym pasażu komórkowym, przemywano roztworem
PBS i zamrażano w -80°C.
Ekstrakcja DNA i reakcja łańcuchowa polimerazy
(PCR)
Kwas deoksyrybonukleinowy ekstrahowano z komórek
(ok. 5x10 6 ) pobranych po każdym pasażu. Do izolacji DNA
zastosowano proteinazę K (Fermentas, Litwa), a po 1 godzinie
inkubacji w 55°C przeprowadzono precypitację białek
przez dodanie 5M roztworu NaCl. DNA wytrącano z roztworu
za pomocą 2-propanolu, osad przemywano 70% roztworem
alkoholu etylowego. DNA rozpuszczano w buforze
TE (10 mM Tris-HCl, pH=8,0; 1mM EDTA) w końcowej
objętości 100µl. Jakość i stężenie ekstraktów DNA oceniano
spektrofotometrycznie przy długościach fali 260 i 280nm.
Stężenia kwasów nukleinowych w ekstraktach wynosiły
średnio od 100-250ng/µl, stosunek A 260/280
wahał się od 1,70
do 1,85. Reakcję łańcuchową polimerazy przeprowadzono
z użyciem aparatu Mastercycler ep PCR (Eppendorf, Niemcy).
Do detekcji materiału genetycznego PERV zastosowano
warunki opisane przez Paradis i wsp [19], przy użyciu
starterów: PERV_F: TGA TCT AGT GAG AGA GGC AGA
G oraz PERV_R: CGC ACA CTG GTC CTT GTC G. Jako
kontrolę reakcji zastosowano fragment genu konstytutywnego-
dehydrogenazy 3-fosforanu gliceraldehydu świni
(pGAPDH). Startery do reakcji PCR dla tego genu zaprojektowano
za pomocą programu eprimer3 (pakiet EMBOSS).
Sekwencje starterów były następujące: pGAPDH_F: TGT
CGC CAT CAA TGA CCC C; pGAPDH_R: TGA CAA
GCT TCC CAT TCT C. Skład mieszaniny reakcyjnej stanowił
1x bufor reakcyjny, 200nM każdego z dNTP, 300nM
każdego ze starterów, 2,5mM MgCl 2
, 1U polimerazy Taq
(Fermentas, Litwa). Do mieszaniny dodawano 1µl ekstraktów
DNA (100-250ng). Warunki termiczne: 95°C-5min., 40
cykli: 95°C-30sek, 61°C-30sek, 72°C-40sek; 72°C-10min.
Po reakcji produkty analizowano w 1,5% żelu agarozowym
barwionym bromkiem etydyny w obecności wzorca wielkości
DNA pUC Mix Marker 8 (Fermentas, Litwa). Oczekiwane
długości produktów wynosiły dla PERV: 262 pz, dla
pGAPDH: 216 pz.
Analiza western-blot
Lizę komórek (ok. 5x10 6 ) prowadzono w 250µl lodowatego
buforu RIPA (50mM Tris HCl pH=8, 150 mM
NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoksycholan sodu, 0.1% SDS)
z dodatkiem 1/100 objętości inhibitorów proteaz (Protease
Inhibition Cocktail, Sigma, Niemcy). Lizat komórkowy
wstrząsano na lodzie (1godz.) i wirowano przy 13000 x g
przez 15 min. Uzyskany nadsącz przenoszono do nowych
probówek i mierzono absorbancję (A 595
) w obecności odczynnika
Bradforda. Krzywą kalibracyjną do określenia
stężenia całkowitego białka przygotowano na bazie próbek
albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o znanych stężeniach
(Fermentas, Litwa). Próbki badane w ilości odpowiadającej
30µg całkowitego białka nakładano na 10% żel poliakrylamidowy.
Elektroforezę prowadzono w obecności markera
wielkości białek PageRuler unstained protein ladder lub
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Fermentas, Litwa).
Bezpośrednio po elektroforezie przeprowadzono elektrobloting
celem przeniesienia próbek na membranę PVDF
(Pall Technology, USA). Membrany suszono w temperaturze
pokojowej i przechowywano do dalszej analizy. Detekcję
białek endogennych retrowirusów człowieka rodziny
16