Proizvodnja rekombinantnih proteina.pdf
Proizvodnja rekombinantnih proteina.pdf
Proizvodnja rekombinantnih proteina.pdf
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Kolegij Genetičko inženjerstvo<br />
<strong>Proizvodnja</strong> <strong>rekombinantnih</strong> <strong>proteina</strong><br />
doc. dr. sc. Gordana Maravić<br />
Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju<br />
Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta<br />
GM2005
Zašto rekombinantni proteini?<br />
Znanstvena istraživanja<br />
–proteinska biokemija<br />
• Enzimski testovi<br />
• Određivanje prostorne<br />
strukture<br />
• <strong>Proizvodnja</strong> protutijela<br />
na protein<br />
• Istraživanje interakcija<br />
protein-protein (pulldown<br />
assay)<br />
Farmacija, medicina,<br />
biotehnologija<br />
• <strong>Proizvodnja</strong><br />
<strong>rekombinantnih</strong> lijekova<br />
(hormoni, faktori<br />
rasta...)<br />
• <strong>Proizvodnja</strong> enzima za<br />
primjenu u<br />
prehrambenoj i<br />
tekstilnoj industriji<br />
GM2005
Odabir kriterija za optimalnu<br />
proizvodnju <strong>proteina</strong><br />
• domaćin za ekspresiju<br />
• ekspresijski vektor<br />
• uvjeti ekspresije<br />
• membranski ili topljivi protein<br />
• topljivost i stabilnost<br />
• lokalizacija <strong>proteina</strong><br />
• pročišćavanje i identifikacija<br />
GM2005
Domaćinski sustavi<br />
• Homologni ekspresijski<br />
sustav<br />
• Protein se proizvodi u<br />
istom organizmu iz kojeg<br />
potječe<br />
• Heterologni<br />
ekspresijski sustav<br />
• Protein se ne proizvodi u<br />
organizmu iz kojeg<br />
potječe nego u nekom<br />
drugom domaćinu<br />
• Escherichia coli<br />
• Druge bakterije<br />
• Pichia pastoris<br />
• Drugi kvasci<br />
• Bakulovirusni sustav<br />
• Kultura animalnih<br />
stanica<br />
• Kultura biljnog tkiva<br />
GM2005
Odabir domaćinskog sustava<br />
• Ovisi o veličini i prirodi <strong>proteina</strong><br />
• Veliki proteini (>100 kD) – eukariotski sustav<br />
• Mali proteini (
Odabir domaćinskog soja<br />
• Iskušati različite domaćine prilikom<br />
optimiranja ekspresije (modificirani sojevi –<br />
inaktivirani geni za proteaze, sojevi s<br />
pojačanom ekspresijom rijetkih tRNA)<br />
• Razina ekspresije <strong>proteina</strong> može varirati 10 i<br />
više puta ovisno o izboru ekspresijskog soja<br />
• Primjeri ekspresijskih sojeva E. coli<br />
• MC1061, UT580, GM48, JM101, MG1065, NM522,<br />
MC4100, TOP10F’, BL21(DE3), BL21-CodonPlus<br />
(DE3)<br />
GM2005
Gdje nabaviti stanice domaćina?<br />
• American Type Culture Collection<br />
• http://www.atcc.org<br />
• Clontech Cell Lines<br />
• http://www.clontech.com<br />
• Novagen Cells (BL21)<br />
• http://www.novagen.com<br />
• Invitrogen Cell Lines (Pichia)<br />
• http://www.invitrogen.com<br />
GM2005
Ekspresijski vektori<br />
• Moraju biti kompatibilni s domaćinskim<br />
ekspresijskim sustavom<br />
• Transkripcijski<br />
• Omogućavaju sintezu RNA<br />
• Sadrže promotore za RNA-polimerazu, ali ne i<br />
regulacijske sljedove za sintezu <strong>proteina</strong><br />
• Translacijski<br />
• Omogućavaju povećanu proizvodnju <strong>proteina</strong><br />
• Sadrže regulatorne sljedove za transkripciju i<br />
translaciju<br />
GM2005
Značajke translacijskih<br />
ekspresijskih vektora<br />
• Jaki promotori<br />
• mjesto za vezanje ribosoma<br />
• (RBS; ribosome binding site)<br />
• Terminacijski sljedovi<br />
• Afinitetne oznake (affinity tags); sljedovi<br />
za povećavanje topljivosti<br />
• Višestruko mjesto za kloniranje<br />
GM2005
Promotori<br />
Jaki promotori omogućavaju povećanu<br />
ekspresiju <strong>proteina</strong> – ugrađeni u<br />
komercijalne ekspresijske vektore<br />
• Primjeri:<br />
• Arabinozni operon<br />
• promotor iz bakteriofaga T7<br />
• Trc/Tac promotori – hibridi trp i lac<br />
promotora<br />
• promotori iz faga λ -PL or PR<br />
GM2005
Fuzijski proteini<br />
• Fuzijski protein nastaje povezivanjem željenog<br />
<strong>proteina</strong> s pomoćnim proteinom<br />
• Pomoćni protein često pomaže optimiranju<br />
ekspresije i pročišćavanja <strong>proteina</strong>:<br />
• Povećava razinu ekspresije ciljnog <strong>proteina</strong> (obično N-<br />
terminalna fuzija)<br />
• Olakšava pročišćavanje <strong>proteina</strong><br />
• Poboljšava topljivost <strong>proteina</strong><br />
• Današnji ekspresijski vektori sadrže sljedove za<br />
nekoliko različitih pomoćnih <strong>proteina</strong> uz sljedove<br />
koje prepoznaju različite proteze kako bi se<br />
pomoćni protein mogao odstraniti<br />
GM2005
Uobičajeni fuzijski proteini<br />
Fuzijski protein Dostupnost Broj<br />
aminokiselina<br />
Mw (kDa)<br />
Tioredoksin pET ~109 ~11.8<br />
CBD (cellulose binding domain) pET ~107-158 ~10.8 - 17<br />
KSI (ketosteroid izomeraza) pET ~125 ~13.5<br />
GST (glutation-S-transferaza) pET + pGEX ~220 ~26<br />
MBP (maltose binding protein) NEB ~400 ~45<br />
DHFR (dihidrofolat reduktaza) pQE ~190 ~22<br />
NusA (N utilisation substance) pET ~495 ~55<br />
Intein NEB ~500 ~60<br />
GM2005
Proteaze za kidanje fuzijskih<br />
<strong>proteina</strong><br />
Proteaza Mjesto kidanja Restrikcijski<br />
enzim<br />
N-terminalni<br />
produžetak<br />
Enterokinaza DDDDK/ - -<br />
Faktor Xa IEGR/ - -<br />
Trombin LVPR/GS BamHI 2<br />
PreScission ® LEVLFQ/GP ApaI 2<br />
Tev ENLYFQ/(G ili S) StyI ili BamHI 1 ili 2<br />
GM2005
Afinitetne oznake (tags)<br />
• Omogućavaju lakše pročišćavanje i/ili<br />
detekciju rekombinantnog <strong>proteina</strong><br />
• His-tag - 6-10 histidinskih ostataka za<br />
afinitetnu kromatografiju na koloni s niklom<br />
• FLAG epitop DYKDDDDK<br />
• c-myc epitop EQKLISEEDL<br />
• T7–tag – 11 ostataka<br />
• S-tag – 15 aminokiselina<br />
GM2005
Optimiranje fuzijske ekspresije<br />
u E. coli<br />
GM2005
Gdje nabaviti vektore?<br />
• VectorDB<br />
• http://vectordb.atcg.com<br />
• Invitrogen Vectors<br />
• http://www.invitrogen.com/vectors.html<br />
• Qiagen Vectors<br />
• http://www.qiagen.com/literature/vectors.asp<br />
• Stratagene Vectors<br />
• http://stratagene.com/vectors/vectors.htm<br />
GM2005
Faktori koji utječu na<br />
ekspresiju <strong>proteina</strong><br />
• Ograničenja uporabe kodona<br />
• Tip hranjivog medija<br />
• bogati medij naspram kemijski<br />
definiranog medija<br />
• Uvjeti ekspresije<br />
• Temperatura<br />
• Duljina ekspresije<br />
• Količina induktora<br />
• Starost kulture<br />
GM2005
Genetički kod je degeneriran<br />
GM2005
Uporaba kodona<br />
u E. coli<br />
• Kod “degeneriranih”<br />
aminokiselina neki se<br />
kodoni učestalije koriste<br />
• Uporaba kodona u svih<br />
gena E. coli<br />
• Uporaba kodona u gena<br />
eksprimiranih tijekom<br />
eksponencijalne faze<br />
rasta<br />
GM2005
Ograničenja uporabe kodona za<br />
arginin<br />
E. coli M. jannaschii H. sapiens<br />
AGA 2.7 AGA 27.5 AGA 11.2<br />
AGG 1.6 AGG 9.9 AGG 11.1<br />
Eubakterije<br />
(rijetko)<br />
Arhebakterije<br />
(prilično)<br />
Eukarioti<br />
(normalno)<br />
GM2005
• Mijenjanje<br />
nukleotidnog<br />
slijeda gena<br />
• Uporaba<br />
sojeva s<br />
vektorima<br />
koji kodiraju<br />
rijetke<br />
kodone<br />
Optimiranje ekspresije gena s<br />
obzirom na uporabu kodona<br />
GM2005
Ekspresija <strong>proteina</strong> sa i bez<br />
preferiranih kodona<br />
Kapust, R.B., Routzahn K.M., Waugh, D.S., Protein Expression and Purification (2002) 24:61-70.<br />
GM2005
Tip hranjivog medija<br />
Bogati<br />
• Sastav<br />
• tripton<br />
• Ekstrakt kvasca<br />
• NaCl<br />
• pufer (u nekim tipovima)<br />
• Primjeri<br />
• Luria-Bertani (LB)<br />
• 2xTY<br />
• TB (puferiran fosfatnim<br />
puferom)<br />
Kemijski definirani<br />
• Sastav<br />
• Fosfatni pufer<br />
• Izvor dušika (amonijev<br />
klorid ili amonijev sulfat)<br />
• Izvor ugljika (glukoza ili<br />
glicerol)<br />
• Metali u tragovima (Ca, Co,<br />
Cu, Fe, Mn, Mo, Se and Zn)<br />
• vitamini (biotin, tiamin,<br />
folat, riboflavin,<br />
niacinamid, PABA,<br />
pantotenat i piridoksin)<br />
GM<br />
GM2005
Bogati vs. minimalni medij<br />
Ekspresija gena<br />
At3g17210 - pET sustav<br />
Ekspresija gena<br />
At3g17210 - pQE sustav<br />
GM2005
Uzgoj u fermentoru ili u<br />
tikvici?<br />
• Dobivanje vrlo velikih količina<br />
<strong>proteina</strong> – bioterapeutici,<br />
industrijski važni proteini<br />
• Dobivanje <strong>proteina</strong> za<br />
znanstvena istraživanja<br />
GM2005
Membranski protein ili protein<br />
topljiv u vodenoj otopini?<br />
GM2005
Membranski protein ili protein<br />
topljiv u vodenoj otopini?<br />
• Lakše je istraživati proteine topljive u vodi<br />
• Membranske je proteine teško klonirati,<br />
eksprimirati i pročistiti – uporaba posebnih<br />
tehnika<br />
• Mogući problemi mogu se izbjeći ako znamo<br />
sadrži li protein jednu ili više<br />
transmembranskih uzvojnica i gdje su one<br />
smještene<br />
GM2005
Predviđanje topljivosti<br />
• Čak i ako protein nije trans-membranski, to<br />
ne upućuje nužno na njegovu topljivost<br />
• Topljivost ovisi o više čimbenika:<br />
• veličina (manji proteini su topljiviji)<br />
• hidrofobnost (prosječna i lokalna)<br />
• 3D struktura i interakcije s ligandima<br />
• ukupni naboj, površina dostupna otapalu<br />
• raspored i učestalost aminokiselina<br />
GM2005
Stabilnost <strong>proteina</strong><br />
• Čak i ako se protein dobro eksprimira i<br />
ostaje topljiv, moguće je da bude<br />
nestabilan (lako se razgrađuje<br />
proteazama)<br />
• Proteini bogati aminokiselinama prolin (P),<br />
glutaminska kiselina (E), serin (S) i treonin<br />
(T) ili proteini koji sadrže regije bogate<br />
navedenim aminokiselinama (PEST<br />
sljedovi) često imaju vrijeme poluživota<br />
oko 2 h<br />
GM2005
Lokalizacija <strong>proteina</strong><br />
• Bakterijska citoplazma nije povoljno okružje za<br />
stvaranje disulfidnih mostova<br />
• Pomoću signalnih sekvenci proteini se mogu<br />
usmjeravati u periplazmatski prostor bakterije<br />
(prostor između membrane i stanične stijenke) ili<br />
izvan stanice (izlučivanje u medij)<br />
• dodatna pogodnost – lakše pročišćavanje<br />
• Signalni sljedovi nakon kojih slijede mjesta<br />
prepoznavanja za proteaze često su dostupni su u<br />
komercijalnim ekspresijskim vektorima<br />
GM2005
Ekspresijski sustav pET<br />
• najsveobuhvatniji komercijalni ekspresijski sustav<br />
• koristi RNA polimerazu iz bakteriofaga T7<br />
integriranu u genom E. coli unutar lizogena DE3<br />
• T7 RNA polimeraza ne prepoznaje bakterijske<br />
promotore već samo vlastiti T7 promotor<br />
• uporaba vektora s T7 promotorom omogućava<br />
kontroliranu sintezu isključivo rekombinantnog <strong>proteina</strong><br />
• Ciljni protein može doseći udio od čak do 50%<br />
ukupnih <strong>proteina</strong> nakon nekoliko sati od indukcije<br />
• Velik broj dostupnih ekspresijskih vektora<br />
• Velik broj različitih domaćinskih sojeva<br />
GM2005
pET vektori nude mnogo različitih<br />
mogućnosti za kloniranje, ekspresiju i<br />
pročišćavanje <strong>proteina</strong><br />
...<br />
GM2005
Primjeri pET vektora:<br />
pET-25b(+)<br />
• pelB – signalni slijed za usmjeravanje u periplazmatski prostor<br />
• Mjesto prepoznavanja za signalnu peptidazu<br />
• HSV-tag – epitop za monoklonsko protutijelo (Western blot,<br />
imunofluorescencija)<br />
• His-tag – slijed od 6 histidinskih ostataka za afinitetno<br />
pročišćavanje na kolonama s niklom<br />
GM2005
Primjeri pET vektora:<br />
pET-33b(+)<br />
• His-tag –mogućnost ugradnje na N- i C-kraju <strong>proteina</strong><br />
• Mjesto prepoznavanje za trombin – za odstranjivanje N-terminalnog<br />
His-taga<br />
• T7-tag –epitop za monoklonsko protutijelo (pročišćavanje, Western<br />
blot, Imunoprecipitacija)<br />
• Mjesto prepoznavanja za protein kinazu A – in vitro fosforilacija<br />
GM<br />
GM2005
Regulacija ekspresije <strong>proteina</strong><br />
u sustavu pET<br />
GM2005
Regulacija proteinske<br />
ekspresije u sustavu pET<br />
• Ekspresijski soj E. coli sadrži kromosomsku kopiju gena za<br />
T7 RNA polimerazu pod kontrolom varijante lac promotora<br />
• Soj je lizogen bakteriofaga DE3 (derivat faga λ); DE3 se ne<br />
može prijeći u litički ciklus bez faga pomagača<br />
• Ciljni gen klonira se u pET vektor pod kontrolu T7<br />
promotora<br />
• <strong>Proizvodnja</strong> T7 RNA polimeraze inducira se dodatkom IPTG<br />
u hranidbeni medij<br />
• T7 RNA polimeraza prepoznaje isključivo T7 promotor na<br />
vektoru pa se tako uz dodatak IPTG proizvodi isključivo<br />
ciljni protein<br />
• Toksični proteini mogu se eksprimirati u soju koji sadrži<br />
plazmid pLysS ili pLysE koji kodiraju za lizozim – prirodni<br />
inhibitor T7 RNA polimeraze – izrazito kontrolirana<br />
ekspresija<br />
GM2005
Ograničenja sustava pET<br />
• Relativna nestabilnost – neki genski produkti mogu izazvati<br />
gubitak lizogena<br />
• u novije vrijeme – novi modificirani stabilniji domaćinski sojevi<br />
• Istovjetna mjesta za vezanje ribosoma (RBS) u svim vektorima<br />
– smanjena mogućnost kontrole razine ekspresije<br />
• novi ekspresijski sojevi omogućavaju kontrolu razine ekspresije<br />
mijenjanjem koncentracije induktora<br />
• Ekspresija ponekad nije dovoljno dobro kontrolirana<br />
(ekspresija <strong>proteina</strong> u odsutnosti induktora – promotor “curi”)<br />
–loše za toksične produkte<br />
• sojevi s vektorima koji kodiraju za lizozim – prirodni inhibitor T7 RNA<br />
polimeraze<br />
• upotrebljavati vrlo čiste pripravke hranidbenog medija<br />
GM2005
Ekspresija <strong>proteina</strong> u E. coli<br />
Klonirani (517 ukupno)<br />
eksprimirani (85%)<br />
topljivi (68%)<br />
M. th.= Methanobacter thermoautotrophicum<br />
E. coli = Escherichia coli<br />
S. ce. = Saccharomyces cerevisae<br />
Myx. = Myxoma virus<br />
T. ma. = Thermotoga maritima<br />
GM2005
Ekspresija <strong>proteina</strong> u kvascu<br />
• za prozvodnju <strong>proteina</strong> koriste se<br />
• Saccharomyces cerevisiae<br />
• Pichia pastoris<br />
• Schizosaccharomyces pombe<br />
• Hansela polymorpha<br />
• Kluyveromyces lactis itd.<br />
GM2005
Kolegij Genetičko inženjerstvo<br />
<strong>Proizvodnja</strong> <strong>rekombinantnih</strong> <strong>proteina</strong><br />
-nastavak<br />
doc. dr. sc. Gordana Maravić<br />
Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju<br />
Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta<br />
GM2005
Ekspresija <strong>proteina</strong> u kvascu<br />
• Prvi ekspresijski sustavi u kvascu razvijeni su za<br />
S. cerevisiae uz uporabu jakih promotora koji<br />
reguliraju ekspresiju glikolitičkih enzima –<br />
nakupljanje mRNA do 5% ukupne mRNA u stanici<br />
• Alkohol-dehidrogenaza (ADH1)<br />
• Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAP)<br />
• Galaktokinaza (GAL1) – danas se najviše koristi<br />
• GAL1 – inducibilni promotor; glukoza je represor<br />
– danas mutantni sojevi koji su neosjetljivi na<br />
glukozu pa se dodatkom galaktoze u medij<br />
inducira do 1000 puta veća ekspresija ciljnog<br />
gena<br />
GM2005
Pichia pastoris<br />
• Pichia pastoris – danas najviše korišteni<br />
kvasac za ekspresiju <strong>proteina</strong><br />
• Može koristiti metanol kao jedini izvor<br />
ugljika pomoću enzima alkohol oksidaze<br />
• Sadrži izuzetno jaki promotor za alkohol<br />
oksidazu (AOX) koji omogućava postizanje<br />
razine ciljnog <strong>proteina</strong> do ~30% ukupnih<br />
<strong>proteina</strong> stanice (indukcija metanolom)<br />
GM2005
Kloniranje u P. pastoris<br />
• Koristi se shuttle<br />
vektor<br />
• Kloniranje i<br />
manipulacija u E. coli<br />
• Ishodište replikacije<br />
ColE1 i selektivni biljeg<br />
Kan R<br />
• Ugradnja u genom i<br />
ekspresija <strong>proteina</strong> u<br />
P. Pastoris<br />
• Kontrolni sljedovi (AOX<br />
promotor, slijed za<br />
terminaciju<br />
transkripcije TT) i<br />
selektivni biljeg HIS4<br />
GM<br />
GM2005
Kloniranje u P. pastoris<br />
his4 -<br />
GM2005
Kloniranje u P. pastoris<br />
• Nakon ugradnje ciljnog gena, vektor se mora<br />
linearizirati<br />
• Linearizirani vektor uvodi se u stanice P. pastoris<br />
• Vektor sadrži sljedove 5’-AOX1 (promotor) i 3’-<br />
AOX1 koji prirodno omeđuju nativni gen za<br />
alkohol-oksidazu<br />
• Homolognom rekombinacijom ciljni gen se<br />
ugrađuje u kromosom P. pastoris na mjesto gena<br />
za alkohol-oksidazu<br />
• Gen je sada pod konrolom jakog AOX promotora<br />
GM2005
Prednosti Pichia sustava<br />
• Brzi rast (8 h za proizvodnju <strong>proteina</strong>)<br />
• Vrlo visok prinos <strong>proteina</strong> (50-5000 mg/L – 10-<br />
100 puta više nego u S. cerevisiae)<br />
• Jeftin hranidbeni medij (jednostavni sastojci)<br />
• Niska cijena uzgoja u fermentoru<br />
• Moguća ekspresija velikih <strong>proteina</strong> (>50 kDa)<br />
• Glikozilacija i odstranjivanje signalnog peptida<br />
• Dovoljno šaperona za smatanje problematičnih<br />
<strong>proteina</strong><br />
• Moguća tvorba disulfidnih mostova u citoplazmi<br />
GM2005
Bakulovirusni sustav<br />
• Bakulovirus<br />
inficira<br />
stanice<br />
insekata<br />
• Tijekom infekcije virusne čestice su pakirane unutar<br />
polihedrona – inkluzijska tijela smještena u jezgri<br />
stanica i građena pretežito od <strong>proteina</strong> polihedrina<br />
GM<br />
GM2005
Životni ciklus bakulovirusa<br />
• Rana faza:<br />
• 0-6 h nakon infekcije<br />
• Virusna DNA ulazi u jezgru<br />
• Srednja faza:<br />
• 6-20 h nakon infekcije<br />
• Replikacija virusa<br />
• Nukleokapside se vraćaju natrag u citoplazmu i pupaju<br />
• Kasna faza:<br />
• >20 h nakon infekcije<br />
• Ekspresija gena za polihedrin – ogromne količine<br />
polihedrina (do 50% ukupnih <strong>proteina</strong> inficirane stanice)<br />
GM2005
Gen za polihedrin nije<br />
esencijalan<br />
Promotor<br />
ATG<br />
Stop<br />
Strana DNA zamjenjuje kodirajući<br />
slijed za polihedrin<br />
• Polihedroni su nužni za infekciju insekata, ali ne i<br />
za održavanje infekcije stanica u kulturi<br />
• Virusna DNA može poslužiti kao ekspresijski vektor<br />
za proizvodnju stranih <strong>proteina</strong> – gen za<br />
polihedrin zamjenjuje se stranom DNA i ugrađuje<br />
pod kontrolu jakog promotora za polihedrin<br />
• 36-48 sati nakon infekcije – proizvodnja velike<br />
količine ciljnog <strong>proteina</strong><br />
GM2005
Bakulovirusni vektor<br />
Ciljni gen<br />
Sljedovi koji omeđuju<br />
ciljni gen, a homologni<br />
su s virusnom DNA<br />
• Bakulovirusni genom je prevelik za izravnu manipulaciju<br />
(88-200 kb) – ugradnja strane DNA obavlja se putem<br />
pomoćnog prijenosnog vektora<br />
• Prijenosni vektor temelji se na plazmidu za E. coli koji<br />
sadrži promotor gena za polihedrin i ostale regulacijske<br />
elemente za translaciju<br />
GM2005
Homologna rekombinacija između<br />
prijenosnog vektora i<br />
bakulovirusnog genoma<br />
Prijenosni vektor<br />
Ciljni gen<br />
homologna<br />
rekombinacija<br />
Ciljni gen<br />
Bakulovirusni<br />
genom<br />
Gen za<br />
polihedrin<br />
Rekombinantni<br />
bakulovirusni genom<br />
GM2005
Protokol za proizvodnju <strong>proteina</strong><br />
u bakulovirusnom sustavu<br />
• Klonirati ciljni gen u prijenosni vektor<br />
• Umnožiti rekombinantni prijenosni vektor u E. coli<br />
• Inficirati stanice insekata bakulovirusom<br />
• Ubaciti rekombinantni prijenosni vektor u inficirane<br />
stanice<br />
• Identificirati stanice u kojima je došlo do homologne<br />
rekombinacije<br />
• Izolirati rekombinantnu virusnu DNA<br />
• Inficirati nove insektne stanice s rekombinantnim<br />
virusom<br />
• Skupiti stanice s velikom količinom proizvedenog<br />
<strong>proteina</strong> 36-48 h nakon infekcije<br />
GM2005
Prednosti i nedostaci<br />
bakulovirusnog sustava<br />
Prednosti:<br />
• Eukariotsko okružje za<br />
proizvodnju <strong>proteina</strong><br />
• Stvaranje disulfidnih mostova<br />
• Eukariotske posttranslacijske<br />
modifikacije<br />
• Izuzetno visok stupanj<br />
ekspresije (do 1mg/10 6<br />
stanica)<br />
• Kapacitet za velike insercije<br />
(100 kb)<br />
• Virus je siguran, inficira samo<br />
određene vrste insekata<br />
Nedostaci:<br />
• Kultura stanica insekata<br />
je skupa<br />
• Bakulovirusni sustav<br />
ubija stanicu nakon 4-5<br />
dana – nema<br />
kontinuirane<br />
proizvodnje<br />
• Neki se proteini ne<br />
smataju ispravno<br />
GM2005
Ekspresija <strong>proteina</strong> u kulturi<br />
stanica sisavaca<br />
• Prednosti:<br />
• Stanična biologija (lokalizacija, stanični ciklus itd.)<br />
• Posttranslacijske modifikacije<br />
• Sve bolji ekspresijski vektori i metode transfekcije<br />
• Nedostaci:<br />
• Mali prinos <strong>proteina</strong><br />
• Teško dobiti stabilnu ekspresiju<br />
• Relativno skupo<br />
• Ograničen izbor domaćina<br />
GM2005
Proteinski llijekovi proizvedeni<br />
u eukariotskoj staničnoj kulturi<br />
Protein<br />
Faktor IX i VIIIc<br />
CD4 receptor<br />
eritropoetin<br />
Interferoni β i γ<br />
Interleukin-2<br />
Hormon rasta<br />
Aktivator tkivnog plazminogena<br />
površinski antigen hepatitisa B<br />
monoklonska protutijela<br />
Bolest<br />
hemofilija<br />
AIDS<br />
rak<br />
rak<br />
rak<br />
patuljasti rast<br />
srčani udar<br />
vakcina<br />
različito<br />
GM2005
Prolazna (transientna)<br />
transfekcija<br />
• Uvođenje episomalnog ekspresijskog vektora u stanice sisavaca<br />
u kulturi za kratkotrajne ekspresijske pokuse<br />
• Ekspresijski vektor je shuttle vektor za propagaciju i kloniranje<br />
u E. coli, dok se ekspresija <strong>proteina</strong> odvija isključivo u<br />
stanicama sisavaca<br />
transfekcija<br />
• Učinkovitost transfekcije varira ovisno o staničnoj liniji i od<br />
pokusa do pokusa<br />
• Ekspresijski vektor replicira se neovisno o genomu domaćina<br />
GM<br />
GM2005
Stabilna transfekcija<br />
transfekcija<br />
replikacija<br />
transkripcija<br />
translacija<br />
• Vektor se ugrađuje u genom stanice i replicira zajedno s<br />
kromosomom<br />
• Ugradnja je nasumična i može se dogoditi na više mjesta i<br />
uzastopno<br />
• Vektorska DNA može biti utišana strukturom kromatina<br />
GM2005
• Shuttle vektori<br />
• Ishodište replikacije<br />
za stanice sisavaca<br />
• Uglavnom potječe iz<br />
životinjskih virusa<br />
(SV40)<br />
• Promotori<br />
• Iz životinjskih virusa ili<br />
od visoko eksprimiranih<br />
gena sisavaca<br />
• SV40, citomegalovirus<br />
(CMV), herpes simplex<br />
virus (HSV) itd.<br />
Ekspresijski vektori za<br />
stanice sisavaca<br />
GM2005
Neki eukariotski selektivni<br />
biljezi<br />
Agens Djelovanje Gen biljeg<br />
Blasticidin S inhibira sintezu <strong>proteina</strong> Blasticidin S-deaminaza<br />
G-418 inhibira sintezu <strong>proteina</strong> Neomicin fosfotransferaza<br />
MSX<br />
inhibira sintezu glutamina Glutamin sintetaza<br />
MTX inhibira sintezu DNA Dihidrofolat-reductaza<br />
G-418 – geneticin<br />
MSX – metionin-sulfoksimin<br />
MTX – metotreksat<br />
GM2005
Zadatak 1<br />
• Želite proučavati izozim piruvat-kinaze specifičan<br />
za jetru. Enzim je pročišćen (Mw 62 000) i<br />
dobiven je peptidni slijed amino-kraja <strong>proteina</strong>.<br />
Razgradnjom kimotripsinom dobiven je kraći oblik<br />
enzima vrlo slične veličine (Mw 60 000), kao i<br />
slijed još jednog oligopeptida. Koristeći navedene<br />
informacije predložite sondu koja bi se mogla<br />
koristiti za pretraživanje knjižnice i nalaženje<br />
gena za piruvat-kinazu. Objasnite vaš izbor.<br />
• Peptid 1 : Met-Ala-His-Val-Arg-Arg-Ala-Ser-Val<br />
• Peptid 2: Glu-Ser-Arg-Trp<br />
GM2005
Rješenje zadatka 1<br />
Peptid 1 :<br />
Met-Ala-His-Val-Arg-Arg-Ala-Ser-Val<br />
Br. kodona: 1 4 2 4 6 6 4 4 4<br />
Peptid 2:<br />
Glu-Ser-Arg-Trp<br />
Br. kodona: 2 4 6 1<br />
Dio peptida 1 - manji broj mogućih kombinacija za<br />
odabir oligonukleotida<br />
GM2005
Zadatak 2<br />
• Koimunoprecipitacijom želite istražiti koji<br />
dio molekule imunoglobulina (Ig) stupa u<br />
interakciju s ciljnim proteinom te ste stoga<br />
izradili nekoliko delecijskih mutanata<br />
molekule Ig uz dodatak Flag epitopa na N-<br />
kraj <strong>proteina</strong>. Koja je svrha dodavanja Flag<br />
epitopa? Zašto ne koristiti samo anti-Ig<br />
protutijela za koimunoprecipitaciju?<br />
GM2005
Rješenje zadatka 2<br />
• Flag epitop omogućava specifično prepoznavanje<br />
<strong>rekombinantnih</strong> mutantnih oblika molekule Ig<br />
• Anti-Ig protutijela bi se mogla vezati na epitope<br />
koji stupaju u interakciju s ciljnim proteinom te<br />
tako onemogućiti stvaranje kompleksa – lažni<br />
negativni rezultat<br />
• Delecijom pojedinih dijelova molekule Ig gube se<br />
pojedini epitopi pa postoji mogućnost da anti-Ig<br />
protutijela ne prepoznaju neki od mutanata<br />
GM2005
Zadatak 3<br />
Nedavno ste klonirali Idh gen iz laboratorijskog štakora i<br />
pokušavate identificirati isti gen u vrsti divljeg glodavca<br />
iz južne Amerike. Kojim ćete redoslijedom provesti<br />
sljedeće postupke?<br />
A. Odabrati klon koji hibridizira sa sondom koja se temelji na<br />
nukleotidnom slijedu štakorskog gena Idh<br />
B. Uzgojiti transformirane stanice na selektivnom mediju<br />
C. Povezati genomsku i vektorsku DNA uporabom DNA ligaze<br />
D. Pokidati genomsku i vektorsku DNA restrikcijskim enzimom<br />
E. Hibridizirati klonove obilježenom sondom koja se temelji na<br />
nukleotidnom slijedu štskorskog gena Idh<br />
F. transformirati bakterijske stanice rekombinantnim<br />
plazmidima<br />
Odgovor:<br />
D -C -F -B -E -A<br />
GM2005
Zadatak 4<br />
• Plazmid pBR322 često se koristi kao vektor za kloniranje.<br />
Sadrži gene za rezistenciju na ampicilin i tetraciklin kao<br />
selektivne biljege. U jednom je pokusu gen ubačen u<br />
restrikcijsko mjesto unutar gena za rezistenciju na<br />
ampicilin i stanice E. coli su transformirane<br />
rekombinantnim vektorom. Da bi se odredilo koje stanice<br />
sadrže vektor s kloniranim genom kolonije su uzgajane na<br />
mediju sa i bez antibiotika. Dobiveni su sljedeći rezultati:<br />
bez antibiotika<br />
+ tetraciklin + tetraciklin+ampicilin<br />
GM<br />
GM2005
Zadatak 4<br />
• Koje kolonije ne sadrže ni “prazni” niti plazmid s<br />
ugrađenim genom? Zašto?<br />
Kolonije 3, 5 i 7 jer rastu isključivo na podlozi bez<br />
antibiotika što ukazuje na nedostatak gena za rezistenciju<br />
na antibiotike, a time i na nedostatak plazmida.<br />
• Koje kolonije sadrže samo “prazni” plazmid? Objasnite!<br />
Kolonije 2, 4, 8 i 9 jer im gen za ampicilin nije inaktiviran<br />
ugradnjom strane DNA pa mogu rasti na podlozi s oba<br />
antibiotika.<br />
• Koje kolonije sadrže plazmid s ugrađenim genom? Zašto?<br />
Kolonije 1 i 6 jer rastu na podlozi s tetraciklinom dok na<br />
podlozi s oba antibiotika ne mogu rasti jer im je gen za<br />
rezistenciju na ampicilin inaktiviran ugradnjom strane DNA.<br />
GM2005
Zadatak 5<br />
• Plazmid je razgrađen restrikcijskim enzimima EcoRI<br />
i HindIII. Razgradnja s EcoRI daje fragmente veličine<br />
30, 15 i 5 kb, razgradnja s HindIII daje fragment<br />
veličine 50 kb, a razgradnja s oba enzima daje<br />
fragmente veličine 20, 15, 10 i 5 kb. Odredite<br />
položaj restrikcijskih mjesta na plazmidu.<br />
2 mogućnosti:<br />
GM2005
Change language