Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici

4.2.2. Pomnoževanje COI pri višji temperaturi naleganja
Ker smo iz nekaterih vzorcev pomnožili nespecifične produkte (temperatura
naleganja začetnih oligonukleotidov je bila 40ºC), smo zvišali temperaturo naleganja
začetnih oligonukleotidov na 50ºC, da bi zagotovili bolj specifično pomnoževanje.
Spremenjen temperaturni profil za pomnoževanje COI s temperaturo naleganja
začetnih oligonukleotidov 50ºC je bil :
95ºC 3min
94ºC 1min
50ºC 90 sek 35 ciklov
72ºC 1min
72ºC 7min
4ºC ∞
S spremembo temperature prileganja (glej sliko 20), smo uspeli pomnožiti
specifičen produkt COI v naslednjih vzorcih: 14/07/RH1, 14/07/RH3, 14/07/RH7,
14/07/RH8. V PCR smo povečali še število enot Taq polimeraze z 1,25 U na 2,5 U.
Za pozitivno kontrolo pomnoževanja smo uporabili DNA mesečinke (vzorec DNA
06/05/PN5). Negativna kontrola je bila PCR reakcijo, v kateri smo namesto matrične
DNA dodali sterilno destilirano vodo, ki smo jo uporabljali za PCR.
Slika 20: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka.
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 14/07/RH1,
14/07/RH3, 14/07/RH7, 14/07/RH8, 08/05/RH16 (stara red., redčitev 10:1),
08/05/RH1 (nova red.redčitev 10:1), 11/06/RH6, pozitivna kotrola (mesečinka),
negativna kontrola (H 2 O), velikostni standard 100bp DNA.
42