Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici

4.2.1. Reamplifikacija PCR
Pri vzorcih pri katerih smo v prvem PCR pomnožili premalo količino DNA smo
uporabili reamplifikacijo. To pomeni, da smo v PCR uporabili produkt prejšnjega
PCR kot matrično DNA. V PCR smo dodali alikvot neprečiščenega PCR produkta
5µl. Reamplifikacijo smo izvedli v vzorcih, ki se niso pomnožili v PCR z naslednjimi
pogoji: temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl 2 1,5 mM, koncentracija
začetnih oligonukleotidov 0,5 µM, smo poskušali ponovno namnožiti v PCR, v
katerem smo kot matrično DNA uporabili PCR produkt, ne pa izolirano DNA. Slika
19 prikazuje reamplifikacijo vzorcev iz PCR reakcije (glej sliko 15). Za
reamplifikacijo smo uporabili naslednje vzorce: 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3,
11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6. Z
reamplifikacijo smo uspeli v vseh vzorcih pomnožiti COI, vendar so se poleg DNA
namnožili še krajši nespecifični produkti.
Slika 19: Reamplifikacija COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz Koprskega
zaliva.
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 12/06/RH1,
12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5,
11/06/RH6, velikostni standard 100bpDNA.
Zaradi kratkoverižnih nespecifičnih produktov (Slika 19) je za nadaljno uporabo
potrebno iz gela izolirati specifičen produkt. Tega v okviru diplomske naloge nismo
opravili.
41