Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici

More documents

Recommendations

Info

3.6.1. Začetni oligonukleotidi Za PCR, s katerim smo pomnoževali COI in v asimetričnem PCR za določanje nukleotidnega zaporedja v COI, smo uporabili enak par začetnih oligonukleotidov (Folmer in sod., 1994). Številki ob imenu začetnih oligonukleotidov pomenita mesto naleganja na mtDNA. HCO 2198 5' - TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA- 3' LCO 1490 5'- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC- 3' 3.6.2. Priprava vzorcev za PCR Vzorce za PCR smo pripravili v laminariju, zato da smo preprečili kontaminacije s pomnožki iz drugih PCR reakcij, ki so lahko v aerosolih. Delali smo na ledu, da smo preprečili nespecifično pomnoževanje v PCR. Vsakokrat smo si pripravili potrebno količino PCR mešanice brez matrične DNA v 1,5 ml epici in jo dobro premešali. Mešanico smo nato razdelili v epice za PCR v ustreznih količinah, nato smo dodali še matrično DNA v ustrezni koncentraciji (glej Tabelo 2). Vzorce za PCR smo dobro premešali ter jih postavili v ciklični termostat PCR. 3.7. Določanje nukleotidnega zaporedja Nukleotidna zaporedja smo določili v 12 osebkih iz Črnega morja in v 4 osebkih iz Koprskega zaliva. Nukleotidna zaporedja vzorcev so bila narejena v podjetju Macrogen (Koreja). Za PCR reakcijo za določanje nukleotidnih zaporedij smo uporabili enake začetne oligonukleotide (LCO 1490 in HCO 2198 ) kot v prvem pomnoževanju s PCR. Za uspešno asimetrično reakcijo PCR smo potrebovali 500 do 700 ng PCR produkta v 15 µl s koncentracijo 50 ng/µl. Potrebna koncentracija začetnega oligonukleotida za en asimetričen PCR je bila 5 pmol v enem µl. Nukleotidna zaporedja smo dobili v obliki kromatografskih zapisov in jih ročno pregledali v programu ChromasPro 1,34 (Technelysium Pty Ltd). S pregledovanjem smo našli mesta z nukleotidi, ki so bili označeni kot dvomljivi (ang. ambigous). Če je bilo možno, smo določili pravi nukleotid, če to ni bilo možno, smo pustili originalen zapis. Nato smo nukleotidna zaporedja obeh matričnih verig združili v eno konsenzusno nukleotidno zaporedje, ki smo ga uporabili za nadaljne obdelave s programom BioEdit (Hall, 1999). . 3.8. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v podatkovni zbirki GenBank (algoritem BLAST) in poravnava nukleotidnih zaporedij Konsezusna nukleotidna zaporedja smo uredili v fasta format (glej priloga A) in nato poiskali najbolj podobna nukleotidna zaporedja, ki so v podatkovni zbirki 20
GenBank. Za iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij smo uporabili algoritem Blast, ki se nahaja na spletni strani podatkovne zbirke GenBank (Blast pognan 5.2.2008, glej priloga D). Vsa nukleotidna zaporedja velikega klobučnjaka in njemu podobna nukleotidna zaporedja, ki so bila rezultat iskanja v GenBank, smo nato poravnali s programom Clustal (Higgins in sod., 1988), ki je dostopen na spletu http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Nastavitev programa nismo spreminjali. Iz poravnanih nukleotidnih zaporedij smo izrezali vrzeli (ang. gaps). Rezultat so poravnana nukleotidna zaporedja, ki smo jih nato uporabili za nadaljno obdelavo in izračune. Poravnana nuklotidna zaporedja so prikazana v prilogi B. 3.9. Filogeografska analiza nukleotidnih zaporedij Filogeografsko analizo vzorcev velikega klobučnjaka iz Črnega morja (Modri zaliv) in severnega Jadranskega morja (Koprski zaliv) smo naredili v programu MEGA (Kumar in sod., 2004). Kot osnovo za izračune smo uporabili poravnana nukleotidna zaporedja narejena v programu Clustal (glej poglavje 3.7 in priloga B). Pri obdelavi podatkov iz nukleotidnih zaporedij in za izris filogenetskega drevesa smo uporabili dve metodi; metoda združevanja najbližjega soseda (ang. Neighbour- Joining (NJ)), ki sodi med nediskretne metode (metode razdalj) in za oblikovanje filogenetskega drevesa uporablja parna neskladja (med nukleotidi na istem mestu v DNA), ter Kimurino-2 parametersko metodo, s katero smo izračunali parne razdalje posameznih haplotipov (Kimura, 1980). Filogenetsko drevo smo narisali v programu MEGA. Za koreninjenje filogenetskega drevesa smo uporabili kot zunanjo skupino nukleotidno zaporedje iz vrste Nemopilema nomurai (AB243416). 21
Page 1: UNIVERZA V NOVI GORICI FAKULTETA ZA
Page 5 and 6: POVZETEK Meduze velikega klobučnja
Page 7 and 8: OKRAJŠAVE IN SIMBOLI A............
Page 9 and 10: KAZALO VSEBINE ZAHVALA.............
Page 11 and 12: KAZALO SLIK Slika 1: Osnovna zgradb
Page 13 and 14: 1. UVOD Klobučnjaki (Scyphozoa) so
Page 15 and 16: 2. TEORETIČNE OSNOVE 2.1. Ožigalk
Page 17 and 18: spremembe v daljšem časovnem obdo
Page 19 and 20: sod., 2005). Na osnovi primerjalne
Page 21 and 22: 2.5. Uporaba mitohondrijske DNA v f
Page 23 and 24: starejšimi morfološkimi študijam
Page 25 and 26: nanesemo na gel, ki je pripravljen
Page 27 and 28: 10-krat koncentrirani PCR-pufer (Fe
Page 29 and 30: Black Sea Adriatic Sea Mediterranea
Page 31: smo si gel ogledali na transilumina
Page 35 and 36: DATUM VZORČENJA MESTO VZORČENJA O
Page 37 and 38: Slika 7: DNA izolacija iz velikega
Page 39 and 40: Slika 9: DNA izolacija iz velikega
Page 41 and 42: Priporočena količina tkiva za izo
Page 43 and 44: Najprej smo pripravili ustrezne red
Page 45 and 46: Slika 11: Pomnoževanje COI s PCR v
Page 49 and 50: COI smo uspešno pomnožili (glej s
Page 53 and 54: 4.2.1. Reamplifikacija PCR Pri vzor
Page 55 and 56: COI smo uspešno pomnožili (glej s
Page 57 and 58: 11 98 RH805 RH811 RH807 RH808 RH703
Page 59 and 60: 5. ZAKLJUČKI Od leta 2003 so v Tr
Page 61 and 62: Dawson M.N., 2003. Macro-morphologi
Page 63 and 64: Lynam C.P., Gibbons M.J., Axelsen B
Page 65: PRILOGE 53
Page 68 and 69: tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcaaaataa
Page 71: Priloga B: Poravnava nukleotidnih z
Page 75 and 76: Priloga D: Podobnost med nukleotidn

Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?