Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici

3.6.1. Začetni oligonukleotidi
Za PCR, s katerim smo pomnoževali COI in v asimetričnem PCR za določanje
nukleotidnega zaporedja v COI, smo uporabili enak par začetnih oligonukleotidov
(Folmer in sod., 1994). Številki ob imenu začetnih oligonukleotidov pomenita mesto
naleganja na mtDNA.
HCO 2198
5' - TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA- 3'
LCO 1490
5'- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC- 3'
3.6.2. Priprava vzorcev za PCR
Vzorce za PCR smo pripravili v laminariju, zato da smo preprečili kontaminacije s
pomnožki iz drugih PCR reakcij, ki so lahko v aerosolih. Delali smo na ledu, da smo
preprečili nespecifično pomnoževanje v PCR. Vsakokrat smo si pripravili potrebno
količino PCR mešanice brez matrične DNA v 1,5 ml epici in jo dobro premešali.
Mešanico smo nato razdelili v epice za PCR v ustreznih količinah, nato smo dodali
še matrično DNA v ustrezni koncentraciji (glej Tabelo 2). Vzorce za PCR smo dobro
premešali ter jih postavili v ciklični termostat PCR.
3.7. Določanje nukleotidnega zaporedja
Nukleotidna zaporedja smo določili v 12 osebkih iz Črnega morja in v 4 osebkih iz
Koprskega zaliva. Nukleotidna zaporedja vzorcev so bila narejena v podjetju
Macrogen (Koreja). Za PCR reakcijo za določanje nukleotidnih zaporedij smo
uporabili enake začetne oligonukleotide (LCO 1490 in HCO 2198 ) kot v prvem
pomnoževanju s PCR. Za uspešno asimetrično reakcijo PCR smo potrebovali 500
do 700 ng PCR produkta v 15 µl s koncentracijo 50 ng/µl. Potrebna koncentracija
začetnega oligonukleotida za en asimetričen PCR je bila 5 pmol v enem µl.
Nukleotidna zaporedja smo dobili v obliki kromatografskih zapisov in jih ročno
pregledali v programu ChromasPro 1,34 (Technelysium Pty Ltd). S pregledovanjem
smo našli mesta z nukleotidi, ki so bili označeni kot dvomljivi (ang. ambigous). Če je
bilo možno, smo določili pravi nukleotid, če to ni bilo možno, smo pustili originalen
zapis. Nato smo nukleotidna zaporedja obeh matričnih verig združili v eno
konsenzusno nukleotidno zaporedje, ki smo ga uporabili za nadaljne obdelave s
programom BioEdit (Hall, 1999).
.
3.8. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v podatkovni zbirki
GenBank (algoritem BLAST) in poravnava nukleotidnih zaporedij
Konsezusna nukleotidna zaporedja smo uredili v fasta format (glej priloga A) in
nato poiskali najbolj podobna nukleotidna zaporedja, ki so v podatkovni zbirki
20