Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici
Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici
Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
smo si gel ogledali na transiluminatorju, kjer smo ga presvetlili z UV svetlobo<br />
(325nm) in gele fotografirali ter slike shranili v digitalnem zapisu.<br />
3.6. PCR reakcija za pomnoževanje mitohondrijske oksidaze C<br />
Osnovna PCR mešanica je bila sestavljena iz matrične DNA, začetnih<br />
oligonukleotidov LCO 1490 in HCO 2198 (Folmer in sod., 1994), MgCl 2, Taq DNA<br />
polimeraze in dNTP-jev. V PCR reakcijo smo dali matrično DNA. Celoten volumen<br />
reakcijske mešanice za PCR je bil 50µl. Koncentracija vsakega posameznega<br />
dNTP-ja je znašala v PCR reakciji 0,2mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Kjer nismo<br />
uspeli pomnožiti COI pri pogojih, ki so opisani spodaj, smo spreminjali koncentracijo<br />
MgCl 2 in temperaturo prileganja začetnih oligonukleotidov.<br />
Prvotna reakcijska mešanica za PCR s končnim volumnom 50 µl je vsebovala<br />
naslednje sestavine v delovnih koncentracijah:<br />
<br />
<br />
5 enot Taq-polimeraze<br />
5 µl 10-krat koncentriranega pufra za PCR<br />
2,5 mM MgCl 2<br />
0,8 mM dNTP<br />
10 µl LCO 1490<br />
10 µl HCO 2198<br />
DNA v razponu od 100 ng do 500ng<br />
deionizirana in sterilna voda do 50 µl<br />
Temperaturni profil PCR<br />
Izhajali smo iz začetnega temperaturnega profila:<br />
začetna denaturacija: 95 C 3 minuti<br />
denaturacija: 94 C 1 minuta<br />
naleganje: 40 C 90 sekund 35 ciklov<br />
podaljševanje: 72°C 1 minuta<br />
podaljšana polimerizacija: 72°C 7 minut<br />
Izhajali smo iz zgoraj napisanega osnovnega temperaturnega profila. PCR je bil<br />
sestavljen iz 35 ciklov pomnoževanja. Pri denaturaciji se je reakcijska mešanica<br />
segrela nad 90°C, da smo dosegli prekinitve vodikovih vezi in s tem razklenitev<br />
dvojne vijačnice DNA. Tako je omogočeno začetnim oligonukleotidom, da najdejo<br />
komplementarna mesta prileganja na DNA. Prvi cikel denaturacije je bil daljši, do 5<br />
min, da smo popolnoma ločili obe verigi genomske DNA. Naleganje začetnih<br />
oligonukleotidov je trajalo od 20 sekund do 1 min. Nato je sledilo podaljševanje verig<br />
s Taq polimerazo pri optimalni temperaturi delovanja encima, ki je 72ºC. Naslednja<br />
faza je podaljšana polimerizacija, ki omogoči Taq polimerazi, da dokonča<br />
podaljševanje. Ta stopnja je še posebej pomembna, kadar pomnožujemo dolge<br />
fragmente DNA.<br />
19
Change language