Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici

ampak smo jih shranili ločeni. Vzorce smo hranili v zamrzovalniku na temperaturi -
20°C do nadaljnjih analiz.
3.4.1. Spektrofotometrične meritve
Koncentracijo izolirane DNA v vzorcih smo določili spektrofotometrično. Vzorce DNA
smo redčili 1:100 v 10mM Tris pufru (pH 8,0) in nato izmerili absorbanco pri treh
valovnih dolžinah (260 nm, 280nm in 320nm). Koncentracijo smo izračunali po
formuli:
koncentracija DNA (µg/mL) = A 260 x 50 µg x faktor redčenja
Za računanje koncentracije DNA smo uporabili spletno aplikacijo
http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_03.html.
Kontaminacijo izolirane DNA z beljakovinami smo ovrednotili iz razmerja absorbcije
pri 260 nm in 280 nm. DNA, ki ima razmerje A 260 /A 280 v razponu od 1,7 do 2,0 je
primerna za nadaljnjo uporabo in smatramo, da ni kontaminirana z beljakovinami,
fenolom ali drugimi snovmi, ki absorbirajo ultraviolično svetlobo pri tej valovni
dolžini. Nekontaminirana dvoverižna DNA, ki ima OD 1 (en centimeter dolžina poti
žarka; 260 nm) vsebuje 50 µg mL -1 dvoverižne DNA. Na osnovi absorbcije pri 320
nm lahko ugotovimo ali je DNA kontaminirana s sestavinami iz kita za izolacijo DNA.
3.5. Agarozna elektroforeza
3.5.1. Priprava agaroznega gela
Po izolaciji z DNeasy Blood & Tissue Kit smo preverili količino in kvaliteto oborjene
DNA na agaroznih gelih. Za izolirane vzorce DNA smo pripravili 1,2% gel po
naslednjem postopku: zatehtali smo želeno količino agaroze in jo dali v
erlenmajerico. Dodali smo potrebno količino pufra 1xTAE. Agarozo smo segrevali po
1 minuto v mikrovalovni pečici na 750 W. Med segrevanjem smo jo večkrat
premešali. Segrevali smo jo toliko časa, da se je agaroza popolnoma stopila (da ni
bilo več videti zrnc agaroze). Ko se je agaroza ohladila na približno 50ºC, smo
dodali etidijev bromid (koncentracija založne raztopine 10mg/mL). Agarozo smo
ohladili in dodali 3µl EtBr. Pripravili smo banjico za gel z glavničkom, dodali agarozo
z EtBr ter pustili, da se strdi. Ko se je gel strdil, smo odstranili glavničke in gel na
podstavku vstavili v posodo za elektroforezo. Za ogled pomnoženih fragmentov COI
smo pripravili 1,8% agarozo v TAE pufru po zgoraj opisanem postopku.
3.5.2. Nanašanje vzorcev
Na parafilm smo nanesli 5µl nalagalnega pufra in mu dodali 5µl vzorca. Vzorec in
pufer smo premešali in nanesli v žepke na gelu. Poleg vzorcev smo nanesli še
ustrezen velikostni standard λ DNA/HindIII (Fermentas) za genomsko DNA ali 100
bp marker za PCR produkte (Fermentas). Na posodo za elektroforezo smo položili
pokrov ter priključili enosmerni električni tok. Naravnali smo željeno napetost
elektroforeze. Elektroforeza je potekala 60 minut pri 6V/cm. Po končani elektroforezi
18