Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici
Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici
Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Black Sea<br />
Adriatic Sea<br />
Mediterranean Sea<br />
Slika 5: Zemljevid točk vzorčenja v severnem Jadranu in Črnem morju.<br />
3.4. Izolacija DNA<br />
Izolacijo DNA smo opravili z DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). DNA smo<br />
izolirali samo iz roba klobuka. Za eno izolacijo DNA smo potrebovali:<br />
- 100 mg vzorčenega tkiva<br />
- 180 µl pufra ATL<br />
- 20 µl proteinaze K<br />
- 200 µl pufra AL (vsebuje gvanidin hidroklorid)<br />
- 200 µl 96% etanola<br />
- 500 µl pufra AW1 (vsebuje gvanidin hidroklorid)<br />
- 500 µl pufra AW2<br />
- 100 ml pufra AE<br />
- 1,5 ml epice<br />
- 2 ml epice s silikatno membrano<br />
Tkiva smo do izolacije DNA hranili na -80°C. S pinceto smo prenesli tkivo iz epic s<br />
konzervansom in jih dali v sveže epice ter vsakemu vzorcu dodali 200µl pufra ATL in<br />
20µl proteinaze K. Vsako epico smo dobro premešali, zavili v parafim in pustili v<br />
vodni kopeli čez noč na temperaturi pri 65°C.<br />
Naslednji dan smo vzeli vzorce iz vodne kopeli ter jih ponovno močno premešali,<br />
dodali 200 µl pufra AL in 200 µl etanola ter še enkrat dobro premešali. Iz vsake<br />
epice smo odpipetirali reakcijsko mešanico in jo dali v posebne epice s silikatno<br />
membrano na katero se absorbirajo nukleinske kisline, ter centrifugirali pri 8000 rpm<br />
eno minuto. Pod epico z membrano smo zbrali pufer za spiranje membrane in ga<br />
zavrgli. Dodali smo 500µl pufra AW1 in centrifugirali eno minuto na 8000 rpm.<br />
Absorbirano DNA na membrani smo spirali z 500 µl pufra AW2 in centrifugirali tri<br />
minute na 14000 rpm. Nato smo v epico z membrano dodali 100 µl pufra AE s<br />
katerim smo eluirali DNA z membrane. Pufer AE smo pustili na membrani eno<br />
minuto ter nato centrifugirali eno minuto na 8000 rpm. Postopek smo ponovili<br />
dvakrat, tako da smo dobili dve frakciji posameznega vzorca. Obeh frakcij nismo<br />
združevali,<br />
17