Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici

Black Sea
Adriatic Sea
Mediterranean Sea
Slika 5: Zemljevid točk vzorčenja v severnem Jadranu in Črnem morju.
3.4. Izolacija DNA
Izolacijo DNA smo opravili z DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). DNA smo
izolirali samo iz roba klobuka. Za eno izolacijo DNA smo potrebovali:
- 100 mg vzorčenega tkiva
- 180 µl pufra ATL
- 20 µl proteinaze K
- 200 µl pufra AL (vsebuje gvanidin hidroklorid)
- 200 µl 96% etanola
- 500 µl pufra AW1 (vsebuje gvanidin hidroklorid)
- 500 µl pufra AW2
- 100 ml pufra AE
- 1,5 ml epice
- 2 ml epice s silikatno membrano
Tkiva smo do izolacije DNA hranili na -80°C. S pinceto smo prenesli tkivo iz epic s
konzervansom in jih dali v sveže epice ter vsakemu vzorcu dodali 200µl pufra ATL in
20µl proteinaze K. Vsako epico smo dobro premešali, zavili v parafim in pustili v
vodni kopeli čez noč na temperaturi pri 65°C.
Naslednji dan smo vzeli vzorce iz vodne kopeli ter jih ponovno močno premešali,
dodali 200 µl pufra AL in 200 µl etanola ter še enkrat dobro premešali. Iz vsake
epice smo odpipetirali reakcijsko mešanico in jo dali v posebne epice s silikatno
membrano na katero se absorbirajo nukleinske kisline, ter centrifugirali pri 8000 rpm
eno minuto. Pod epico z membrano smo zbrali pufer za spiranje membrane in ga
zavrgli. Dodali smo 500µl pufra AW1 in centrifugirali eno minuto na 8000 rpm.
Absorbirano DNA na membrani smo spirali z 500 µl pufra AW2 in centrifugirali tri
minute na 14000 rpm. Nato smo v epico z membrano dodali 100 µl pufra AE s
katerim smo eluirali DNA z membrane. Pufer AE smo pustili na membrani eno
minuto ter nato centrifugirali eno minuto na 8000 rpm. Postopek smo ponovili
dvakrat, tako da smo dobili dve frakciji posameznega vzorca. Obeh frakcij nismo
združevali,
17