Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici
Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici
Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
UNIVERZA V NOVI GORICI<br />
FAKULTETA ZA ZNANOSTI O OKOLJU<br />
RAZISKOVANJE GENETSKE DIVERZITETE<br />
VELIKEGA KLOBUČNJAKA (<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>) Z<br />
ORODJI MOLEKULARNE TAKSONOMIJE<br />
DIPLOMSKO DELO<br />
Kristina Turk<br />
Mentorica: doc. dr. Andreja Ramšak<br />
Nova Gorica, 2009
ZAHVALA<br />
Zahvaljujem se prof. dr. Alenki Malej, Katji Stopar, Almi Hvala ter drugim zaposlenim<br />
na Morski biološki postaji v Piranu, ki so mi pomagali pri laboratorijskem in<br />
terenskem delu, ter mi omogočili dostop do potrebnih podatkov.<br />
Iskreno se zahvaljujem vsem prijateljem, zlasti Manici Kodrič, Svetlani Kodrič in<br />
Jasni Besednjak ter Lei Bric za njihovo pomoč in podporo pri pisanju diplomske<br />
naloge. Posebna zahvala gre moji družini, ki mi je omogočila študij in potrpežljivo<br />
čakala na ta trenutek.<br />
Posebej se zahvaljujem mentorici doc. dr. Andreji Ramšak za svetovanje in<br />
usmerjanje ter hitre odgovore, ko sem jih potrebovala.<br />
I
POVZETEK<br />
Meduze velikega klobučnjaka (<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>) se pojavljajo skozi vse leto, a v<br />
zelo majhnem številu. V zadnjih letih je bilo v Tržaškem zalivu zabeleženih več<br />
množičnih pojavljanj velikega klobučnjaka v zimskem obdobju. Poleg te vrste so se<br />
množično pojavljale še druge klobučnjaške meduze kot so uhati klobučnjak (Aurelia<br />
aurita), v poletnih mesecih pa mesečinka (Pelagia noctiluca). Poznamo več<br />
dejavnikov, ki naj bi vplivali na njihovo množično pojavljanje, med katerimi so<br />
nekateri posledica človekove dejavnosti, nekatera nihanja v številčnosti pa so<br />
naravna nihanja.<br />
V diplomskem delu smo želeli raziskati filogenetsko povezanost meduz velikega<br />
klobučnjaka iz severnega Jadrana in Črnega morja. Filogenetsko povezanost smo<br />
raziskovali z analizo nukleotidnih zaporedij v genu za citokrom c oksidazo (COI), ki<br />
se nahaja na mitohondrijski DNA (mtDNA). Del tega gena (podenota I) smo<br />
pomnožili s PCR z univerzalnimi začetnimi oligonukleotidi za nevretenčarje. Iz<br />
pomnoženih fragmentov COI smo pridobili nukleotidna zaporedja. Na osnovi analize<br />
le teh smo analizirali filogenetske odnose med vzorčenimi osebki. S filogenetsko<br />
primerjavo nukleotidnih zaporedij COI iz velikega klobučnjaka v vzorcih iz Črnega<br />
morja in severnega Jadrana smo ugotovili, da je v nukleotidnih zaporedjih<br />
80 odstotkov ohranjenih mest. Veliki klobučnjaki iz Črnega morja in severnega<br />
Jadrana tvorijo dve ločeni filogenetski skupini, kar je razvidno iz filogenetskega<br />
drevesa. COI se je izkazal kot primeren genetski marker za razlikovanje med vzorci<br />
iz Črnega morja in severnega Jadrana. To je prva tovrstna študija, saj zaenkrat še ni<br />
nobenih javno dostopnih nukleotidnih zaporedij COI iz velikega klobučnjaka.<br />
Ključne besede: Scyphozoa, <strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>, mitohondrijska DNA (mtDNA),<br />
citokrom c oksidaza, filogeografija, antropogeni vplivi, množično pojavljanje<br />
SUMMARY<br />
Medusae of <strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong> are occurring throughout all year in small number. In<br />
recent years several mass appearances have been recorded in Trieste Bay during<br />
winter time. Except for this species other scyphozoan species have been appearing<br />
massively in Gulf of Trieste as well, such as moon jelly (Aurelia aurita), and also<br />
mauve stinger (Pelagia noctiluca) during summer. There are several factors<br />
affecting their mass occurrence due to anthropogenic activities and also natural<br />
origin.<br />
The aim of my diploma dissertation was to examine phylogenetic connections<br />
between medusae of <strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong> from the northern Adriatic Sea and of the<br />
Black Sea. The research of phylogenetic connection was carried out with an<br />
analysis of nucleotide sequences of the gene encoded cytochrome c oxidase<br />
subunit (COI) found in mitochondrial DNA (mtDNA). A part of this gene (subunit) has<br />
been amplified by PCR with universal oligonucleotide primers for invertebrates and<br />
sequenced with the same primer pair. On the basis of the nucleotide sequences<br />
analysis were performed phylogenetic relationships between sampled individuals<br />
were performed and estimation of gene flow and phylogenetic relationship were<br />
revealed. On the basis of phylogenetic comparison of COI nucleotide sequences of<br />
<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong> in the samples from the Black Sea and the northern Adriatic Sea<br />
we determined that nucleotide sequences contain 80 % of conserved sites.<br />
<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong> from the Black Sea and the Northern Adriatic Sea form two<br />
separated phylogenetic groups, as revealed by phylogenetic tree. COI proved to be<br />
a suitable genetic marker to distinguish between samples from the Black Sea and<br />
III
the northern Adriatic Sea. This is the first study of this kind, since there are no public<br />
accessible COI nucleotide sequences from <strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong> available yet.<br />
Key words: Scyphozoa, <strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>, mitochondrial DNA (mtDNA),<br />
cytochrome c oxidase , phylogeography, anthropogenic factors, massive<br />
occurrences.<br />
IV
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI<br />
A..........................................adenin<br />
ang.......................................angleško<br />
bp.........................................bazni par<br />
C..........................................citozin<br />
CTAB..................................cetrilmetilamonijev bromid<br />
DMSO…………………….dimetil sulfoksid<br />
DNA....................................deoksiribonukleinska kislina<br />
dNTP...................................2'-deoksinukleozid 5'-trifosfat<br />
EDTA..................................etilen-diamino-tetraocetna kislina<br />
EtBr…………………….....etidijev bromid<br />
F..........................................»forward primer«, vodilni začetni oligonukleotid,<br />
ki se prilega na matrično DNA v smeri 5`→3`<br />
G.........................................gvanin<br />
µ..........................................mikro<br />
LSU……………………….velika ribosomalna podenota<br />
Mg………………………...magnezij<br />
ng........................................nano gram<br />
PCR.....................................verižna reakcija s polimerazo<br />
pH........................................negativni logaritem koncentracije vodikovih ionov<br />
pufer TAE............................raztopina Trisa, acetata in EDTA<br />
R..........................................»reverse primer«, povratni začetni oligonukleotid,<br />
ki se<br />
prilega na matrično DNA v smeri 3`→5`<br />
rRNA….................……….. ribosomalna ribonukleinska kislina<br />
T...........................................timidin<br />
Taq DNA-polimeraza..........DNA-polimeraza, izolirana iz Thermus aquaticus<br />
tRNA……………………....prenašalna ribonukleinska kislina<br />
SSU………………………..mala ribosomalna podenota<br />
V
RH........................................<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong><br />
TRIS.....................................tris (hidroksimetil)aminometan<br />
COI......................................citokrom c oksidaza<br />
λ marker...............................Hind III λ marker<br />
100bp marker....................... GeneRuler 100bp DNA Ladder(100bp do<br />
1000bp, Fermentas)<br />
EtBr......................................etidijev bromid<br />
VI
KAZALO VSEBINE<br />
ZAHVALA........................................................................................................ I<br />
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ..........................................................................V<br />
1. UVOD ........................................................................................................1<br />
2. TEORETIČNE OSNOVE .......................................................................3<br />
2.1. Ožigalkarji in njihova telesna zgradba ...................................................3<br />
2.2. Klobučnjaki (Scyphozoa)..........................................................................4<br />
2.3. Množična pojavljanja klobučnjaških meduz..........................................4<br />
2.4. Klasična taksonomska uvrstitev velikega klobučnjaka (<strong>Rhizostoma</strong><br />
<strong>pulmo</strong>)................................................................................................................7<br />
2.4.1 Opis vrste veliki klobučnjak...................................................................8<br />
2.5. Uporaba mitohondrijske DNA v filogenetskih študijah........................9<br />
2.5.1. Zgradba mitohondrijske DNA pri klobučnjakih ................................9<br />
2.6. Sodobna filogenetska analiza klobučnjakov.........................................10<br />
2.7. PCR reakcija............................................................................................11<br />
2.8. Postopek ugotavljanja nukleotidnih zaporedij (sekvenciranje) .........12<br />
2.9. Agarozna elektroforeza ..........................................................................12<br />
3. EKSPERIMENTALNI DEL.................................................................14<br />
3.1. Označevanje vzorcev...............................................................................14<br />
3.2. Recepti za pripravo osnovnih raztopin in njihove koncentracije.......14<br />
3.2.1. Puferske raztopine ...............................................................................14<br />
3.2.2. Encimi: ..................................................................................................15<br />
3.2.3. Velikostni standardi DNA:..................................................................16<br />
3.2.4. Aparature..............................................................................................16<br />
3.3. Vzorčenje na terenu ................................................................................16<br />
3.4. Izolacija DNA ..........................................................................................17<br />
VII
3.4.1. Spektrofotometrične meritve.............................................................. 18<br />
3.5. Agarozna elektroforeza.......................................................................... 18<br />
3.5.1. Priprava agaroznega gela ................................................................... 18<br />
3.5.2. Nanašanje vzorcev ............................................................................... 18<br />
3.6. PCR reakcija za pomnoževanje mitohondrijske oksidaze C ............. 19<br />
3.6.1. Začetni oligonukleotidi........................................................................ 20<br />
3.6.2. Priprava vzorcev za PCR.................................................................... 20<br />
3.7. Določanje nukleotidnega zaporedja...................................................... 20<br />
3.8. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v podatkovni zbirki<br />
GenBank (algoritem BLAST) in poravnava nukleotidnih zaporedij....... 20<br />
3.9. Filogeografska analiza nukleotidnih zaporedij ................................... 21<br />
4. REZULTATI IN RAZPRAVA............................................................. 22<br />
4.1. Rezultati izolacije DNA iz tkiva velikega klobučnjaka....................... 23<br />
4.1.1. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v severnem Jadranskem morju<br />
......................................................................................................................... 23<br />
4.1.2. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v Črnem morju ........................ 27<br />
4.1.3. Rezultati spektrofotometričnih meritev genomske DNA ................ 29<br />
4.2. Rezultati pomnoževanja citokrom C oksidaze z reakcijo PCR ......... 30<br />
4.2.1. Reamplifikacija PCR........................................................................... 41<br />
4.2.2. Pomnoževanje COI pri višji temperaturi naleganja........................ 42<br />
4.3. Določevanje nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje)....................... 43<br />
4.3.1. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v GenBank (algoritem<br />
Blast) ............................................................................................................... 43<br />
4.3.2. Poravnava nukleotidnih zaporedji s programom Clustal ............... 44<br />
4.4. Filogeografska analiza............................................................................ 44<br />
5. ZAKLJUČKI ......................................................................................... 47<br />
6. VIRI ........................................................................................................ 48<br />
VIII
KAZALO SLIK<br />
Slika 1: Osnovna zgradba meduze in polipa.<br />
(Vir:http://images.suite101.com/131037_cnidariamedusaandpolyp.jpg)3<br />
Slika 2: Med kočarjenjem v slovenskem delu Tržaškega zaliva so ribiči<br />
1. oktobra 2003 ujeli ogromne količine velikih klobučnjakov<br />
(<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>) ........................................................................................6<br />
Slika 3: Risba meduze velikega klobučnjaka (<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>).........8<br />
Slika 4: Shematski prikaz verižne reakcije s polimerazo ........................12<br />
Slika 5: Zemljevid točk vzorčenja v severnem Jadranu in Črnem morju.<br />
..........................................................................................................................17<br />
Slika 6: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s kitom DNeasy Blood &<br />
Tissue Kit (QIAGEN). Oznake vzorcev (od levi proti desni): 12/06/RH1,<br />
12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3,<br />
11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6 (vzorci iz JV Tržaškega zaliva). Na<br />
vsako stezo smo nanesli 5 µl vzorca..........................................................24<br />
Slika 7: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood &<br />
Tissue Kit (QIAGEN). Prva steza: velikostni standard λ marke (5 µl),<br />
sledijo vzorci (od leve proti desni): 14/07/RH1, 14/07/RH2, 14/07/RH3,<br />
14/07/RH4, 14/07/RH5, 14/07/RH6, 14/07/RH7, 14/07/RH8,<br />
14/07/RH9, 14/07/RH10. Na vsaki stezi je nanešeno 5 µl vzorca. Slika<br />
5 je sestavljena iz dveh slik. ........................................................................25<br />
Slika 8: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood &<br />
Tissue Kit ( QIAGEN)....................................................................................26<br />
Slika 9: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood &<br />
Tissue Kit ( QIAGEN)....................................................................................27<br />
Slika 10: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood &<br />
Tissue Kit ( QIAGEN)....................................................................................28<br />
Slika 11: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...33<br />
Slika 12: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...34<br />
Slika 13: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...35<br />
Slika 14: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...36<br />
Slika 15: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz<br />
Koprskega zaliva. ..........................................................................................37<br />
Slika 16: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...38<br />
Slika 17: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...39<br />
Slika 18: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...40<br />
Slika 19: Reamplifikacija COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz<br />
Koprskega zaliva. ..........................................................................................41<br />
Slika 20: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...42<br />
Slika 21: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij velikega<br />
klobučnjaka iz Črnega morja in Koprskega zaliva. Merilo predstavlja<br />
število substitucij v analiziranih nukleotidnih zaporedjih.........................45<br />
IX
KAZALO TABEL<br />
Tabela 1. Razlike med vrstama veliki klobučnjak (R. <strong>pulmo</strong>) in R.<br />
octopus (prirejeno po Mayer, 1910)............................................................. 8<br />
Tabela 2: Seznam uporabljenih vzorcev za filogeografsko analizo<br />
velikega klobučnjaka. ................................................................................... 22<br />
Tabela 3: Izračun količine DNA v vzorcu. ................................................. 30<br />
Tabela 4: Količina dodane matrične DNA v posamezni PCR reakciji ter<br />
uspešnost pomnoževanja COI. .................................................................. 31<br />
Tabela 5: Seznam vzorcev z določenim nukleotidnim zaporedjem ..... 43<br />
X
1. UVOD<br />
Klobučnjaki (Scyphozoa) sodijo v evolucijsko zelo staro deblo ožigalkarjev<br />
(Cnidaria). Pri večini predstavnikov življenjski krog klobučnjakov zajema meduzo, ki<br />
se razmnožuje s spolno in nespolno generacijo, ki jo predstavlja pritrjen polip. Obe<br />
generaciji se lahko v določenih razmerah namnožita izjemno hitro in v velikem<br />
številu. Meduze klobučnjakov se pojavljajo sezonsko. Ko se pojavijo v izredno<br />
velikem številu, povzročajo gospodarsko škodo v ribištvu, na hladilnih sistemih<br />
jedrskih elektrarn, obratih za razsoljevanje, v turizmu (Purcell in sod., 2007).<br />
Opisanih je več dejavnikov, ki naj bi vplivali na njihovo množično pojavljanje, med<br />
katerimi prednjačijo posledice človekovih dejavnosti, kot so onesnaževanje,<br />
evtrofikacija, spremenjen prehranjevalni splet, v katerem na vrhu prehranjevalne<br />
verige prevladujejo klobučnjaške meduze namesto velikih plenilcev (Mills, 1995).<br />
Spremembe v populacijski gostoti meduznih populacij med leti so povezane z<br />
oscilacijami v Zalivskem toku v severnem Atlantiku in z intenzivnostjo pojava El Niňo<br />
(Purcell, 2005). Nekatera nihanja v številčnosti klobučnjaških meduz so naravna<br />
nihanja, kot na primer množična pojavljanja mesečinke v Sredozemskem morju<br />
(Goy in sod., 1989). V zadnjih nekaj letih se v Jadranskem morju vse številčneje<br />
pojavlja veliki klobučnjak (<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>) in uhati klobučnjak (Aurelia aurita).<br />
Meduza velikega klobučnjaka je razmeroma velika in čvrsta in, kadar se namnoži v<br />
velikem številu, povzroča gospodarsko škodo predvsem v ribištvu. Zelo resne<br />
težave pa veliki klobučnjak povzroča že desetletje v španski laguni Mar Menor, ki je<br />
zaradi intenzivnega kmetijstva v zaledju in industrializacije postala evtrofična in<br />
kemijsko onesnažena. Občasno velike agregacije meduz velikega klobučnjaka<br />
opazijo tudi v Črnem morju. Veliki klobučnjak ni neobičajna vrsta v Sredozemskem<br />
in v Črnem morju, zaskrbljujoče je njeno množično pojavljanje in možna povezava z<br />
negativnimi učinki človekove dejavnosti na morsko okolje.<br />
V zadnjem desetletju vse pogosteje poročajo z različnih koncev sveta o množičnih<br />
pojavljanjih različnih vrst klobučnjaških meduz. Poleg množičnega pojavljanja<br />
običajnih vrst za dano okolje, pa so raziskovalci našli tudi dokaze za prenos<br />
tujerodnih vrst klobučnjakov v nova okolja. Eden takih primerov je množično<br />
pojavljanje meduz uhatega klobučnjaka (Aurelia aurita) v Kaliforniji. Na osnovi<br />
sodobnih molekularno taksonomskih metod so ugotovili, da gre za neavtohtono<br />
populacijo (Dawson in sod., 2005), ki je bila najverjetneje prinešena z balastnimi<br />
vodami iz Japonske v Kalifornijo.<br />
Zaradi neobičajnega množičnega pojavljanja meduz velikega klobučnjaka v<br />
Sredozemskem in njemu sosednjih morjih (Črno morje in Atlantski ocean) ter<br />
gospodarske škode v ribištvu je naraslo zanimanje raziskovalcev in širše javnosti za<br />
omenjeno vrsto. Eden od osnovnih podatkov v biologiji je čimbolj natančen opis<br />
vrste in njena zanesljiva taksonomska uvrstitev. Opise vrst smo povzeli iz naslednjih<br />
monografij Medusae of the World (Mayer, 1910) in Synopsis of the medusae of the<br />
World (Kramp 1961). Velikemu klobučnjaku je morfološko zelo podobna vrsta<br />
<strong>Rhizostoma</strong> octopus, ki živi v Atlantiku, pri čemer se zastavlja vprašanje, kolikšna je<br />
sorodnost med opisanima vrstama in ali ju smemo zares smatrati kot dve vrsti<br />
(Mayer, 1910). Pri klasični determinaciji na osnovi morfoloških znakov naletimo pri<br />
klobučnjakih na velike težave pri razlikovanju zaradi razmeroma skromne makromorfološke<br />
diferenciacije meduz in plastičnosti oziroma variabilnosti teh znakov pri<br />
isti vrsti. Razlikovanje med vrstama veliki klobučnjak in R. octopus temelji na obliki<br />
in številu robnih krp, na dolžini zgornjega dela ustnih ramen in na dolžini in obliki<br />
terminalnih priveskov. Zaradi tega je na voljo malo diagnostičnih znakov za<br />
nedvoumno taksonomsko uvrstitev. V takih primerih so nam v pomoč novi pristopi v<br />
taksonomiji, kot so uporaba genetskih markerjev na genomski in izven<br />
kromosomalni DNA (Hillis in sod., 1996).<br />
1
Primerjava nukleotidnih zaporedij je eno od orodij, ki nam omogoča ugotavljanje<br />
geografskega izvora vrste (tujerodna ali avtohtona vrsta). Okoljski ukrepi se lahko<br />
razlikujejo glede na izvor osebka. Pri vnosu tujerodne vrste najprej skušamo<br />
ugotoviti njen geografski izvor in način vnosa v novo okolje.<br />
V primeru množičnega pojavljanja avtohtone vrste skušamo najprej prepoznati<br />
spremembe v okolju, ki vodijo do množičnega pojavljanja, in dokazati njihovo<br />
vzročno povezavo s pojavljanjem. Predvsem se moramo vprašati, kaj v okolju se je<br />
spremenilo, da je do tega prišlo (vnos hranil, sprememba habitata ...)<br />
Če gre za vnos tujerodne vrste, se moramo najprej vprašati, kako je prišla v novo<br />
okolje. Glede na potrjen izvor osebka se potem lahko odločimo, kakšne okoljske<br />
ukrepe bomo izvajali<br />
Odločili smo se, da bomo analizirali nukleotidno zaporedje gena za citokrom c<br />
oksidazo podenota I (COI) v osebkih velikega klobučnjaka nabranih na različnih<br />
geografskih območjih. COI je uveljavljen genetski marker v filogeografskih študijah<br />
in je genetsko marker, na katerem sloni eden od pristopov v molekularni<br />
taksonomiji, ki ga bolj popularno imenujemo z angleškim izrazom »DNA barcoding«<br />
(Ratnasingham in Hebert, 2007). Podatki pridobljeni iz COI bi nam lahko odkrili,<br />
kakšna je sorodnost med vzorčenimi osebki. V diplomskem delu smo iz vzorčenih<br />
osebkov ekstrahirali DNA in nato optimizirali pomnoževanje COI s PCR. Iz<br />
pomnoženih fragmentov COI smo nato pridobili nukleotidna zaporedja. Na osnovi<br />
nukleotidnih zaporedij smo analizirali genetsko podobnost med vzorčenimi osebki in<br />
filogenetsko razdaljo med vzorčenima populacijama iz severnega Jadrana in Črnega<br />
morja.<br />
2
2. TEORETIČNE OSNOVE<br />
2.1. Ožigalkarji in njihova telesna zgradba<br />
Ožigalkarji so skoraj izključno morske živali in le nekateri trdoživnjaki naseljujejo tudi<br />
celinske vode. Glavne značilnosti ožigalkarjev so preprosta telesna zgradba in<br />
ožigalke ali nematociste, ki vsebujejo strupene snovi. Glede na zgradbo telesa in<br />
življenjski krog (prisotnost polipne in meduzne generacije), razlike v gastrovaskularni<br />
votlini delimo ožigalkarje na tri razrede: koralnjaki (Anthozoa), klobučnjaki<br />
(Scyphozoa) in trdoživnjaki (Hydrozoa).<br />
Telo ožigalkarjev je sestavljeno iz dveh zarodnih plasti endoderma in ektoderma.<br />
Gastroderm (izvorna plast endoderm) je plast celic, ki obdajajo telesno votlino,<br />
epiderm (zarodna plast ektoderm) je vrhnji sloj, ki vsebuje ožigalke. Med epidermom<br />
in gastrodermom je mezoglea, ki je lahko zelo tanka ali zelo debela želatinasta<br />
tvorba kot na primer pri klobučnjaških meduzah. V notranjosti telesa leži prebavna<br />
votlina z eno samo odprtino, ki jo imenujemo usta. Ta so pri polipih na zgornji, pri<br />
meduzah na spodnji strani telesa. Usta obkrožajo lovke ali tentakli, pri meduzah<br />
ustna ramena, ki pomagajo pri lovu hrane. Polipna generacija je pritrjena na podlago<br />
(sesilna) in je malo gibljiva. Meduzna generacija je prosto plavajoča. Polipi so<br />
nespolna generacija, ki se razmnožuje z brstenjem, meduze so spolna generacija, ki<br />
proizvaja spolne celice. Za klobučnjake je značilno, da ima večina predstavnikov<br />
menjavo generacij: spolno generacijo (meduza) in nespolno generacijo (polip). Ena<br />
od vrst brez polipne generacije je mesečinka (Pelagia noctiluca).<br />
Danes je poznanih približno 9000 vrst ožigalkarjev. Približno 340 vrst je opisanih v<br />
Sredozemskem morju, ocenjujejo pa, da v njem živi okrog 200 vrst ožigalkarjev.<br />
Slika 1: Osnovna zgradba meduze in polipa.<br />
(Vir:http://images.suite101.com/131037_cnidariamedusaandpolyp.jpg)<br />
3
2.2. Klobučnjaki (Scyphozoa)<br />
Klobučnjaki so razred morskih ožigalkarjev, pogosto z menjavo generacij med polipi<br />
(skifopolipi), ki se razmnožujejo nespolno, in prosto plavajočimi meduzami, ki se<br />
razmnožujejo spolno (skifomeduze). Meduze nekaterih vrst so lahko zelo velike s<br />
premerom klobuka enega do dva metra. V osnovni zgradbi so podobne meduzam<br />
trdoživnjakov (hidromeduze), razlikujejo se po odsotnosti krpastega naborka pod<br />
klobukom.<br />
Meduze in polipi imajo radialno simetrijo. Skifopolipi so zelo majhni (od 1 do 4 mm)<br />
in imajo različno število lovk. Polip velikega klobučnjaka ima do 24 lovk (Holst in<br />
Jarms, 2006). Klobuk meduz je poln želatinozne snovi (mezoglea), njegov rob je<br />
navadno razdeljen na režnje. Ustna ramena izhajajo izpod klobuka in so pri<br />
nekaterih vrstah precej velika.<br />
Gastrovaskularni sistem pri meduzah leži na spodnji strani klobuka (subumbrela) z<br />
manubrujem (ustni stožec), ki se nadaljuje v usta, posuta z ožigalkami.<br />
Gastrovaskularna votlina je predeljena na štiri prekate s pregradami iz gastroderma.<br />
Posamezni prekati so med seboj povezani z okroglimi odprtinami. Prosti robovi<br />
pregrad imajo močne septalne filamente, posute z ožigalkami in žleznimi celicami.<br />
Živčni sistem je slabo razvit in difuzen. Čutilne organe pri meduzah imenujemo<br />
ropaliji. Ropaliji imajo več različnih vlog, na posameznih delih meduze služijo za vid<br />
in kot čutilo za ravnotežje. Klobučnjaki so morske živali, do sedaj jih poznamo 200<br />
vrst (Arai, 1997).<br />
Spolno in nespolno razmnoževanje omogočata klobučnjakom izjemno hitro<br />
namnoževanje. Klobučnjaki se razmnožujejo s posebnim načinom nespolne delitve,<br />
ki mu pravimo strobilacija, pri čemer nastanejo majhne meduze ali efire iz polipa, ki<br />
nato rastejo v spolno zrele meduze. Strobilacije ni pri skupini kubomeduze, ampak<br />
se polip preobrazi v meduzo. Meduze so spolna generacija in imajo dobro razvite<br />
spolne žleze ali gonade ter so večinoma enospolne (Mayer, 1910). Po oploditvi<br />
nastane plavajoča omigetalčena ličinka planula, ki se nato pritrdi, ko najde primerno<br />
podlago, in se iz nje razvije polip. V zmernih klimatih poteka strobilacija v toplejšem<br />
delu leta, medtem ko se v tropih odvija celo leto (Lucas, 2001).<br />
2.3. Množična pojavljanja klobučnjaških meduz<br />
V novejšem času je vse več podatkov o množičnem pojavljanju meduz<br />
klobučnjakov, trdoživnjakov ter drugih skupin, kot so rebrače in plaščarji, ki jih glede<br />
na izgled imenujemo tudi želatinozni plankton. V našem opisovanju se bomo omejili<br />
na meduze klobučnjakov, ki jih bomo imenovali krajše meduze. Vse pogostejša<br />
dokumentirana opazovanja množičnih pojavljanj meduz klobučnjakov porajajo tudi<br />
ugibanja o možnih vzrokih. Raziskovalci najpogosteje omenjajo evtrofikacijo,<br />
prekomeren ribolov, invazije tujerodnih vrst in klimatske spremembe (Arai, 2001a).<br />
Medtem ko je ugibanj veliko, je zelo malo znanih čvrstih dokazov, ki bi trdno<br />
povezali množična pojavljanja z omenjenimi vzroki. Številne pojave, kot so<br />
evtrofikacija, hipoksija, motnost vodnega stolpca, spremembe slanosti, so stanja, ki<br />
jih meduze lažje prenašajo kakor ribe in druge morske živali. Spremembe v<br />
hidrološkem režimu zaradi jezov, nasipov in ostalih konstrukcij lahko spremenijo<br />
slanost in tako favorizirajo meduze. Porast številčnosti želationoznega planktona<br />
povezujejo tudi s klimatskimi spremembami. Študije, v katerih so analizirali okoljske<br />
4
spremembe v daljšem časovnem obdobju, so pokazale, da nihanje številčnosti<br />
ožigalkarjev in rebrač, ki živijo v zmerno toplih vodah sovpada z okoljskimi<br />
spremembami (Purcell, 2005). Vremenske spremembe (topla voda, suho vreme),<br />
spremembe v slanosti predstavljajo ugodne razmere za klobučnjake in drug<br />
želatinozni plankton (Molinero in sod., 2005).<br />
Pogosto so množična pojavljanja opažena v evtrofnih območjih, pa tudi tudi v<br />
predelih, ki niso pod neposrednim vplivom človekove aktivnosti (Purcell in sod.,<br />
2007). Množična pojavljanja so se pojavila po obsežnem spreminjanju življenjskega<br />
prostora, kot se je zgodilo v laguni Mar Menor v Španiji, kjer so pesek zamenjali z<br />
blatom. Najprej se je zgodila invazija alge Caulerpa porifera, ki je nadomestila<br />
morsko travo. Nato so v laguno vnesli ostrige, ki predstavljajo dodaten substrat za<br />
polipe. Evtrofikacija (Howarth in sod., 2002) pomeni povečevanje koncentracije<br />
hranil. Povečanje hranil pogosto vodi k večji biomasi v vseh trofičnih nivojih<br />
(Daskalov in sod., 2007), pri čemer lahko več razpoložljive hrane omogoča<br />
preživetje in razmnoževanje večjemu številu polipov in meduz (Purcell in sod.,<br />
1999). Povečana raba umetnih dušikovih gnojil po letu 1970 je lahko vzrok nedavnih<br />
množičnih pojavljanj klobučnjakov (Gilbert in sod., 2005). Takšno stanje so povezali<br />
z množičnim pojavljanjem dveh vrst, in sicer morske cvetače (Cotylorhiza<br />
tuberculata) in velikega klobučnjaka (<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>) v laguni Mar Menor.<br />
Podatki kažejo, da visoka koncentracija dušika lahko privede do množičnega<br />
pojavljanja meduz. (Pérez in sod., 2002). Od leta 1990 je do množičnega pojavljanja<br />
meduz prišlo vzdolž sredozemske obale (Malej, 1982 ).<br />
Na drugi strani evtrofikacija vodi v zmanjševanje koncentracije kisika in v takem<br />
okolju imajo klobučnjaki selektivno prednost pred drugimi organizmi (Arai, 2001b).<br />
Ribe se hipoksiji izognejo, če pa je kisika manj kot 2 mg/L pa poginejo. Veliko<br />
meduz je sposobnih preživeti v okoljih z nizko koncentracijo kisika (do < 1mg O 2 /L)<br />
(Purcell in Arai, 2001). Tudi polipi imajo toleranco do nizke koncentracije<br />
raztopljenega kisika in lahko preživijo v takem okolju (Ishii, 2006).<br />
Številni dejavniki, ki so povezani z industrializacijo in razvojem obalnih območij<br />
zmanjšujejo prozornost vode ter prehajanje svetlobe. V takem spremenjenem okolju<br />
lažje preživijo klobučnjaki kakor ribe.<br />
Posredno meduze vplivajo na ribištvo, saj se prehranjujejo z zooplanktonom in<br />
ihtoplanktonom (jajčeca rib in ličinke). Nekateri avtorji pravijo, da so zaradi prelova<br />
rib, meduze, ki so nižje na prehranjevalni verigi zasedle prehrambeno nišo, ki so jo<br />
zasedale ribe. Ribištvo odstranjuje ribe, ki jedo zooplankton ter plenilce meduz, in<br />
tako ostane meduzam na razpolago več hrane. Na drugi strani ob množičnem<br />
pojavljanju klobučnjaki tekmujejo za razpoložljive vire hrane z ribami. Zaradi<br />
hranjenja z zooplanktonom lahko zmanjšajo ter spremenijo zooplanktonske<br />
populacije, kar posledično lahko zmanjša količino hrane, ki je razpoložljiva ribam<br />
(Jackson in sod., 2001, Daskalov in sod., 2007). Nekateri avtorji poudarjajo<br />
pomembnost selektivne pašnje majhnih kopepodnih rakcev (Sommer in sod., 2002).<br />
V različnih delih sveta povzročajo težave v ribištvu množična pojavljanja<br />
klobučnjaških meduz. V Vzhodno kitajskem morju in v Rumenem morju so zabeležili<br />
količinsko zmanjševanje ulova (Cheng in sod., 2005). Na Japonskem se je<br />
populacija meduz uhatega klobučnjaka (Aurelia aurita) povečala po letu 1980 in se<br />
je v zadnjih dveh desetletjih številčno zelo povečala. Tako se je 65 odstotkov ribičev<br />
na Japonskem opredelilo, da je število meduz naraslo v zadnjih dvajsetih letih (Uye<br />
& Ueta, 2004). Tudi v Namibijskem morju so se po letu 1988 zmanjšali ulovi inčunov<br />
in sardel, glede na ulov od leta 1975 do 1988. V tem območju sedaj prevladujeta<br />
dve vrsti, klobučnjaška meduza Chrysaora hysoscella in trdoživnjaška meduza<br />
Aequorea forskalea (Lynam in sod., 2006). Zaradi velikega števila meduze zamašijo<br />
ribiške mreže in zmanjša se kvaliteta ulova. Tak problem so imeli predvsem na<br />
Japonskem od leta 1990 dalje, ko je populacija uhatega klobučnjaka narasla v Seto<br />
5
Inland Sea. Od leta 2002 se v japonskih obalnih morjih vsakoletno pojavljajo<br />
meduze vrste Nemopilema nomurai. Veliko škode so povzročili uhati klobučnjaki v<br />
ribogojnicah ob škotski obali. Toksini, ki jih vsebujejo klobučnjaki, povzročijo pomore<br />
rib v kletkah, kadar se njihove meduze ob namnožitvi pojavijo tudi v kletkah<br />
(Johnston in sod., 2005).<br />
Slika 2: Med kočarjenjem v slovenskem delu Tržaškega zaliva so ribiči 1. oktobra<br />
2003 ujeli ogromne količine velikih klobučnjakov (<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>)<br />
Foto: Bojan Marčeta, Zavod za ribištvo R Slovenije.<br />
Gradnja struktur v morju kot so ribogojnice in ostale morske strukture predstavljajo<br />
ugodne življenjske prostore za polipe. Po eni strani jim ribogojnice omogočijo<br />
dodatno hrano, po drugi strani pa jim strukture v morju predstavljajo dodaten<br />
substrat, na katerem lahko polip živi (Johnston in sod., 2005). V obalnih morjih ob<br />
Arabskem polotoku je množično pojavljanje klobučnjaške meduze Crambionella<br />
orsini povzročilo težave v kroženju vode v elektrarnah in razsoljevalnicah<br />
(Daryanabard & Dawson, 2008).<br />
Vnos tujerodnih vrst klobučnjakov v ekosistem lahko prav tako privede do<br />
množičnega pojavljanja z resnimi posledicami za okolje. Velikokrat je uspešna<br />
invazija tujerodne vrste povezana tudi z drugimi antropogenimi vplivi v okolju. Eden<br />
od takih vnosov tujerodne populacije klobučnjaške meduze je vnos uhatega<br />
klobučnjaka iz Japonske v Kalifornijo ter še na nekaj drugih območij po svetu.<br />
Tujerodna vrsta je v novem okolju našla primerno nišo in povzročila populacijsko<br />
eksplozijo. Ker je potovanje izključno s tokovi prepočasno za tolikšno razdaljo,<br />
sklepajo, da je do vnosa prišlo z balastnimi vodami transportnih ladij (Dawson in<br />
6
sod., 2005). Na osnovi primerjalne analize nukleotidnih zaporedij v genu za COI so<br />
lahko ugotovili geografski izvor populacije uhatega klobučnjaka v Kaliforniji. Že prej<br />
so z analizo zapisa v genu za COI na mtDNA uhatega klobučnjaka ugotovili, da je<br />
vrsta uhati klobučnjak sestavljena iz več kriptičnih vrst (Dawson in Jacobs, 2001). Z<br />
najdenimi razlikami na nivoju mitohondrijske DNA sovpadajo tudi makro-morfološke<br />
razlike, ki so jih našli med analiziranimi populacijami kriptičnih vrst (Dawson, 2003)<br />
Primer tujerodne vrste vnesene v nov ekosistem je tudi vrsta Rhopilema nomadica v<br />
Sredozemskem morju. R. nomadica (premer klobuka do 80 cm) je klobučnjaška<br />
meduza, ki je v zadnjih dveh desetletjih vse bolj številčna v vzhodnem<br />
Sredozemskem morju. Njena prisotnost povzroča tveganje tako za ribiče, kot za<br />
kopalce, saj ima neprijeten ožig in je lahko prisotna v velikem številu. Prvič je bila<br />
zabeležena leta 1976 v Sredozemskem morju ter je od leta 1986 vsako poletje<br />
množično prisotna ob obali Izraela (Lotan in sod., 1993). R. nomadica naj bi prišla<br />
skozi Sueški kanal in je zelo redka v Rdečem morju. Še dve drugi klobučnjaški<br />
meduzi Phyllorhiza punctata, ki izvira iz zahodnega Pacifika, ter Indo- Pacifiška<br />
vrsta Cassiopea andromeda sta se v zadnjem času naselili v Sredozemskem morju.<br />
Populacijska dinamika teh dveh meduz še ni znana.<br />
Meduze klobučnjakov negativno vplivajo na turizem, saj povzročijo zelo neprijetne<br />
ožige (toksini nekaterih vrst, ki žive v toplejših morjih so lahko smrtno nevarni)<br />
kopalcem. Kadar je število meduz veliko, lahko povzročijo pravo epidemijo ožigov.<br />
Občasno se v Sredozemskem morju množično pojavlja mesečinka (Pelagia<br />
noctiluca) (Goy in sod., 1989, Molinero in sod., 2005), ki povzroča neprijetne ožige<br />
pri kopalcih. V nekaterih obmorskih krajih, kjer je veliko turistov in je število ožigov<br />
zelo veliko, so vpeljali redno spremljanje številčnosti meduz ter opozorilne sisteme<br />
za kopalce, ki vključujejo tudi napotke za prvo pomoč. Ožigi meduz predstavljajo<br />
prav tako nevarnost za ribiče (Purcell, 2005).<br />
2.4. Klasična taksonomska uvrstitev velikega klobučnjaka (<strong>Rhizostoma</strong><br />
<strong>pulmo</strong>)<br />
Rod korenoustih klobučnjakov (<strong>Rhizostoma</strong>) spada v red Rhizostomea in v družino<br />
<strong>Rhizostoma</strong>tidae. V rodu korenoustih klobučnjakov so do sedaj opisali tri vrste: veliki<br />
klobučnjak (R. <strong>pulmo</strong> Macri, 1778), R. octopus (Linnaeus, 1788) in R. luteum (Quoy<br />
in Gaimard, 1827). Poudariti moramo, da nekateri avtorji dvomijo v obstoj vrste R.<br />
luteum (Mayer, 1910). Veliki klobučnjak naseljuje Sredozemsko in Črno morje, R.<br />
octopus je razširjena v Atlantskem oceanu, ob severozahodni obali Evrope, ob<br />
obalah Skandinavije, v Irskem morju, ob južnih in zahodnih obalah britanskih otokov<br />
in v južnem delu Severnega morja. R. luteum naseljuje morje ob obalah Portugalske<br />
v ožini Gibraltar in zahodni obali Afrike (Russell, 1970). Mayer (1910) in Kramp<br />
(1961) smatrata vrsto R. octopus za varieteto vrste R. <strong>pulmo</strong>. Če privzamemo, da je<br />
R. luteum legitimna vrsta, potemtakem nastane vrzel v distribuciji med vrstama R.<br />
octopus in R. <strong>pulmo</strong>, ki jo zapolnjuje R. luteum.<br />
Mayer (1910) v svojem delu obravnava druge opisane vrste iz rodu korenoustih<br />
klobučnjakov kot varietete tipske vrste velikega klobučnjaka, ki je bila opisana na<br />
osnovi osebkov iz Sredozemskega morja. Tipsko vrsto R. <strong>pulmo</strong> je opisal Luis<br />
Agassiz leta 1862. Vrsta veliki klobučnjak je bila najprej opisana kot Potta marina, ki<br />
jo je opisal Aldrovandi leta 1642 (povzeto po Mayer, 1910).<br />
7
Mayer v svojem delu Medusae of the World (1910) omenja varietete velikega<br />
klobučnjaka iz Sredozemskega morja, Rdečega morja, Atlantskega oceana vzdolž<br />
obale Evrope in Afrike. Opisane razlike med velikim klobučnjakom in R. octopus so<br />
v številu in obliki robnih krp, v dolžini zgornjega dela ustnih ramen, v dolžini in obliki<br />
terminalnih priveskov ter v razširjenosti. Opisane razlike so podrobneje opisane v<br />
Tabela 1. Razlike med vrstama veliki klobučnjak (R. <strong>pulmo</strong>) in R. octopus (prirejeno<br />
po Mayer, 1910).<br />
R. PULMO R. OCTOPUS<br />
Število robnih krp 80 96 do 112<br />
Oblika robnih krp Kratke in zaobljene Kratke, zašiljene<br />
Dolžina zgornjega dela ustnih Daljša od spodnjega dela Krajša od spodnjega dela<br />
ramen<br />
Dolžina in oblika terminalnih<br />
priveskov<br />
Krajši ali enaki kot zgornji del<br />
ustnih ramen, širši blizu na baze<br />
(proksimalno), zoženi na bazi, ni<br />
bazalnega peclja.<br />
Daljši kot zgornji del ustnih<br />
ramen z neznatnim bazalnim<br />
pecljem in zadebeljenim kijasto<br />
oblikovanim zunanjim delom.<br />
2.4.1 Opis vrste veliki klobučnjak<br />
Meduza velikega klobučnjaka je zvonaste oblike in čvrsta, brez tentaklov na robu<br />
klobuka, ustna ramena so zrasla med sabo in na njih je veliko majhnih sekundarnih<br />
ustnih odprtin. Na spodnji strani (subumbrela) je ustni stožec, na katerem so<br />
epolete, ki so videti kot trakasta nagubana struktura. Epolete s sekundarnimi ustnimi<br />
odprtinami so lahko obarvane oranžno rumeno do rjavkasto rdeče ali rjavo.Tako<br />
veliki klobučnjak kakor R. octopus imata premer klobuka od 15 do 60 centimetrov in<br />
drobno granulirano površino klobuka z nematocistami. Oblika robnih krp je pri<br />
velikem klobučnjaku polkrožne oblike, pri R.octopus pa ovalna. Razlika je tudi v<br />
številu robnih krp na osmino klobuka; pri velikem klobučnjaku jih je 8, medtem ko pri<br />
R. octopus to število variira okoli 10 robnih krp na osmino.<br />
Razlike med obema vrstama so še v dolžini in obliki končnih priveskov. Pri vrsti<br />
veliki klobučnjak so končni priveski krajši ali enako dolgi kot dolžina zgornjega dela<br />
ustnih ramen. Pri velikem klobučnjaku so končni priveski širši na proksimalnem delu<br />
(na stiku z ustnimi rameni), medtem ko so pri vrsti R. octopus ožji na proksimalnem<br />
delu, nabrekli in kijaste oblike. Barva klobuka je lahko pri obeh vrstah od mlečno<br />
rumene, do rdečkaste, medtem ko so robne krpe modrikaste do vijolične barve.<br />
Veliki klobučnjaki se hranijo s planktonom. Sekundarna usta obdajajo številne resice<br />
z nematocistami.<br />
Slika 3: Risba meduze velikega klobučnjaka (<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>).<br />
(Vir. M. Plantan diplomsko delo, 2008)<br />
8
2.5. Uporaba mitohondrijske DNA v filogenetskih študijah<br />
Mitohondrijska DNA (mtDNA) je uporabna v raziskavah živalskih populacij zaradi<br />
relativno preproste izolacije, relativno visoke frekvence mutacij v nekaterih delih<br />
mitohondrijskega genoma in dedovanja po materini strani. Zaradi načina dedovanja<br />
lahko sledimo materini liniji z mitohondrijskimi haplotipi.<br />
Za filogenetske raziskave se najpogosteje uporabljajo nukleotidna zaporedja velike<br />
(16S) in male (12S) rRNA, citokrom c oksidaze podenota I (COI) in citokroma b. Ti<br />
odseki mtDNA so precej dobro proučeni in znotraj teh nukleotidnih zaporedij so<br />
poznane bolj ali manj variabilne regije, na osnovi katerih je možna primerjava<br />
nukleotidnih zaporedij in izpeljava filogenetskih odnosov. Nukleotidno zaporedje<br />
gena za COI je eden izmed najbolj pogosto uporabljenih genetskih markerjev v<br />
filogenetskih raziskavah živalih. Številne študije so potrdile, da je odsek na 5' koncu<br />
COI gena (t.i. 5' Folmer del) primeren za rekonstrukcijo nižjenivojskih odnosov pri<br />
višjih živalih (Erpenbeck in sod., 2005). Navkljub nekaterim pomislekom so novejše<br />
študije potrdile primernost tega gena tudi v filogenetskih raziskavah klobučnjakov.<br />
Ugotovili so, da je variabilnost COI pri klobučnjakih enako kot pri višjih živalih<br />
(Huang in sod., 2008).<br />
Eden od temeljev uporabe mtDNA v filogenetskih analizah populacij je<br />
koalescenčna teorija, ki jo podpira nevtralni model evolucije. Koalescenca je<br />
združitev razvojnih linij iz preteklosti. Bolj kot so si organizmi in geni med seboj<br />
podobni, krajši je čas koalescence, čas do skupnega prednika. Čas koalescence<br />
mtDNA je za vsaj štirikrat krajši kot za jedrne gene, ker ima mitohondrijski genom<br />
eno samo kopijo (haploiden). Na filogenetskem drevesu vrstni red vej sovpada z<br />
vrstnim redom dogodkov koalescence in predstavlja kladistične odnose med<br />
nukleotidnimi zaporedji. Medtem ko dolžine vej, ki povezujejo nukleotidna zaporedja<br />
v drevesu, sovpadajo s časom koalescence (povzeto po Gorički, 2004).<br />
2.5.1. Zgradba mitohondrijske DNA pri klobučnjakih<br />
Mitohondriji so zelo številčni celični organeli namenjeni celičnemu dihanju. V<br />
matriksu mitohondrija je običajno 5 do 10 identičnih krožnih molekul mtDNA.<br />
Mitohondrijski genomi večceličnih živali se razlikujejo po velikosti in razporeditvi<br />
nekaterih genov v njem. Mitohondrijska DNA (mtDNA) je običajno kratka in<br />
dvoverižna krožna molekula velikosti približno 16 kbp. Na njej so zapisani geni, ki<br />
kodirajo različne beljakovine, ki sodelujejo v dihalni verigi, ribosomalne RNA (rRNA)<br />
in transportne RNA (tRNA). V eni od verig je več gvanina in tisto verigo imenujemo<br />
težka veriga, medtem ko drugo verigo imenujemo lahka. Večina genov je zapisana<br />
na težki verigi.<br />
Med ožigalkarji najbolje poznamo zgradbo mtDNA iz predstavnikov razreda<br />
koralnjakov. Šele v letu 2006 je bil objavljen celoten zapis mtDNA uhatega<br />
klobučnjaka (Shao in sod, 2006). Mitohondrijska DNA uhatega klobučnjaka je dolga<br />
16 937 bp in ni krožna molekula, kakor pri koralnjakih (Bridge in sod., 1995), ampak<br />
je linearna, kar je razmeroma redko med živalmi. Na mtDNA je zapis za 13<br />
beljakovin, za veliko in malo podenoto rRNA in za 2 tRNA (za metionin in triptofan).<br />
Na mtDNA sta dva odprta bralna okvirja za gene, ki kodirajo encime dihalne verige.<br />
Geni so organizirani v dve skupini in vsaka skupina se prepisuje v svoji smeri, smer<br />
prepisovanja DNA se spremeni na mestu, kjer je 93. nukleotid. Poleg linearnosti ima<br />
mitohondrijski genom uhatega klobučnjaka še nekaj posebnosti. Gena za<br />
ribosomalni RNA sta 7 kbp narazen in imata vsak svojo smer prepisovanja. Taka<br />
9
ureditev ribosomalnih genov je razmeroma redka v živalskih mitohondrijskih<br />
genomih. Običajno ribosomalni geni ležijo skupaj in imajo isto smer prepisovanja.<br />
Pri koralnjakih so opazili tudi razmeroma velike nekodirajoče regije, medtem ko so<br />
pri uhatem klobučnjaku nekodirajoča nukleotidna zaporedja med geni kratka.<br />
Nukleotidna zaporedja na obeh koncih linearne mtDNA so enaka, a obrnjena in ne<br />
tvorijo nobenih sekundarnih struktur ter ne vsebujejo nobenih telomeram podobnih<br />
ponovitev.<br />
Ožigalkarji pri translaciji bolj pogosto uporabljajo nekatere triplete (npr. triplet TGA<br />
za triptofan namesto TGG), zato imajo svoj značilen genetski kod. V vseh do sedaj<br />
znanih zaporedjih mtDNA ožigalkarjev sta samo dva gena za prenašalne RNA<br />
(tRNA), ki so potrebne za transkripcijo mitohondrijske DNA. Potrebne manjkajoče<br />
tRNA so zapisane v jedrnem genomu in se prenesejo iz jedra v mitohondrij. To<br />
pomeni, da se je z izgubo genov za tRNA na mtDNA v prednikih ožigalkarjev razvil<br />
prenašalni mehanizem za tRNA (Beaton in sod., 1998).<br />
Mitohondrijski genom klobučnjakov ima sposobnost vključitve in vgraditve tuje DNA<br />
v mitohondrijsko DNA ožigalkarjev. Takšen primer je homolog gena mut S, ki so ga<br />
našli v mtDNA v korali Sarcophyton glaucum in v morskem perescu Renilla kolikeri<br />
(Pont-Kingdon in sod., 1995, 1998), ter introni skupine I, ki so jih našli v morski<br />
anemoni Metridium senile (Beagley in sod., 1996). Prisotnost teh genov v<br />
mitohondrijskem genomu je redkost pri večceličnih živalih, kajti pri nobeni drugi<br />
skupini živali še niso našli tujih nemitohondrijskih genov. Na podlagi tega<br />
raziskovalci sklepajo na večjo izmenjavo med jedrnim in mitohondrijskim genomom<br />
ožigalkarjev v primerjavi z ostalimi skupinami živali. Za to obstajata dve razlagi:<br />
za vnos tuje DNA v mitohondrijski genom sta potrebni homologna in<br />
nehomologna rekombinacija. Zato je rekombinacija bolj pogosta v<br />
mitohondrijih ožigalkarjev kot v mitohondrijih ostalih živalih (Chevalier in<br />
Stoddard, 2001)<br />
obstoječi mehanizem za prenos tRNA pomaga tudi pri prenosu tuje DNA v<br />
mitohondrije (Shao in sod., 2006)<br />
2.6. Sodobna filogenetska analiza klobučnjakov<br />
Pri ožigalkarjih, zaradi skromne makro-morfološke diferenciacije (Mayer, 1910,<br />
Dawson, 2003) in velike pestrosti življenjskih ciklov, ostaja vprašanje, katera oblika<br />
je evolucijsko starejša (polip ali meduza). Prve filogenetske študije ožigalkarjev so<br />
bile narejene na osnovi ribosomalnih 16S rDNA in 18S rDNA (Bridge in sod. 1995).<br />
Skupine, ki imajo meduzno generacijo (trdoživnjaki, klobučnjaki in kubomeduze),<br />
tvorijo enotno monofiletsko skupino (izhajajo iz skupnega prednika) in jih imenujejo<br />
Medusozoa. Avtorji se nagibajo k teoriji, da je skupni prednik ožigalkarjev imel<br />
polipno fazo ter da je meduzna faza sinapomorfija klada Medusozoa. Collins in<br />
sodelavci (2006) so predlagali delitev ožigalkarjev na Anthozoa (koralnjaki) in<br />
Medusozoa. Predpostavljajo, da so se najprej razvili koralnjaki in nato še skupina, ki<br />
jo tvorijo kubomeduze ter klobučnjaki. Zadnji dve našteti skupini tvorita sestrski klad.<br />
Da bi poudarili, da ima razred pecljate meduze (Stauromedusae) ločeno evolucijsko<br />
zgodovino in da se razlikuje od ostalih razredov ožigalkarjev, sta Marques in Collins<br />
(2004) oblikovala nov razred Staurozoa. Molekularni in morfološki znaki kažejo, da<br />
so pecljate meduze sestrska skupina Medusozoa (Collins in sod., 2006).<br />
Strobilacija polipa in efire so sinapomorfni znaki za vse klobučnjake. V svoji študiji<br />
so Collins in sodelavci (2006) predpostavili, da red Rhizostomea izhaja iz prednikov<br />
reda Semaeostome zaradi podobnosti v sistemu radialnih kanalov, kar je v skladu s<br />
10
starejšimi morfološkimi študijami (Mayer, 1910; Hyman, 1940; Thiel, 1966). To<br />
hipotezo potrjujejo tudi študije primerjav majhne ribosomalne podenote (SSU)<br />
(Collins, 2002), kot tudi na veliki ribosomski podenoti (LSU). Izmed treh družin redu<br />
Semeostomeae - Cyaneidae, Ulmaridae in Pelagiidae naj bi se zadnja družina<br />
najprej ločila. Znotraj skupine Rhizostomeae obstajata dve glavni skupini taksonov:<br />
Cepheida in Rhizostomida (Stiasny, 1922; Thiel, 1970), za katere je Thiel (1970)<br />
predpostavil, da so se razvile iz predstavnikov znotraj skupine Semaeostomeae.<br />
Družini Cepheidae z rodovoma Cassiopea in Cotylorhiza ter<br />
<strong>Rhizostoma</strong>tidae z rodovoma Catostylus in Stomolophus tvorita monofiletsko<br />
skupino (Collins in sod., 2006). Filogenetska analiza je bila narejena na vrstah iz<br />
rodov, ki so omenjeni zgoraj.<br />
2.7. PCR reakcija<br />
Verižna reakcija s polimerazo, znana tudi pod angleško kratico PCR (Polymerase<br />
Chain Reaction), je metoda, ki omogoča pomnoževanje odsekov DNA z encimom<br />
DNA polimeraza. Metoda posnema pomnoževanje DNA v celici. Za vsak fragment<br />
DNA, ki ga želimo pomnožiti s PCR, je potrebno poznavanje nukleotidnega<br />
zaporedja na obeh koncih tarčne verige DNA ter pripraviti ustrezen specifičen par<br />
začetnih oligonukleotidov. Temperaturni profil PCR je sestavljen iz ločitve obeh verig<br />
DNA (toplotna denaturacija), naleganja začetnih nukleotidov ter podaljševanja verig<br />
DNA. Pri optimizaciji protokola je potrebno upoštevati tudi druge dejavnike kot so<br />
koncentracije soli in nukleotidov, število kopij tarčne DNA, število ciklov ter čas<br />
trajanja posameznih ciklov (Suzuki in Giovannoni, 1996; Polz in Cavanaugh, 1998).<br />
Produkti pomnoževanja se v PCR eksponentno kopičijo.<br />
Ključnega pomena za PCR reakcijo je encim Taq polimeraza. Kratica Taq pomeni<br />
Thermus aquaticus, bakterijo, ki preživi in se razmnožuje v vročem okolju, ki je za<br />
druge organizme smrtno. V nasprotju z drugimi polimerazami je encim, ki izvira iz<br />
omenjene bakterije (in danes narejen iz genetsko spremenjene bakterije), stabilen<br />
pri visokih temperaturah zaradi česar lahko pomnoževanje poteka pri visokih<br />
temperaturah.<br />
11
Slika 4: Shematski prikaz verižne reakcije s polimerazo<br />
(Vir: K. Drobnič.Ugotavljanje identitete posameznika z uporabo genetskih informacij, metode verižne reakcije s<br />
polimerazo in računalniško podprte tehnologije).<br />
2.8. Postopek ugotavljanja nukleotidnih zaporedij (sekvenciranje)<br />
Za pripravo sekvenčne reakcije uporabljamo metodo asimetrični PCR. Z njo<br />
pomnožimo tarčno DNA in produkt takega pomnoževanja so enoverižne DNA, ki jih<br />
nato ločimo na visokoločljivostnih gelih. V PCR uporabimo le en začetni<br />
oligonukleotid, s čimer dosežemo, da se pomnožuje le ena veriga. Nukleotidi, ki jih<br />
damo v PCR so mešanica nukleotidov, ki so fosforilirani in nefosforilirani in le ti so<br />
označeni z fluorescentnim barvilom. Pomnoževanje se ustavi tam, kjer Taq<br />
polimeraza doda nefosforiliran označen nukleotid. Tako nastanejo različno dolge<br />
verige, ki se med seboj ločijo za en nukleotid. Nastale verige DNA ločimo na<br />
visokoločljivem gelu, kjer lahko ločimo verige DNA na en nukleotid natačno.<br />
Poznamo več tehnik sekvenciranja s PCR, poleg omenjene, kjer v reakcijo PCR<br />
damo nefosforilirane nukleotide s fluorokromi ali je s fluorokromom označen začetni<br />
nukleotid.<br />
2.9. Agarozna elektroforeza<br />
Agarozna elektroforeza je metoda, s katero specifično ločujemo nukleinske kisline<br />
na podlagi velikosti, naboja in drugih lastnosti (Bodlaj, 2001). Pri tem vzorec<br />
12
nanesemo na gel, ki je pripravljen iz agaroze v ustrezni koncentraciji v<br />
elektroforetskem pufru. Agarozni gel igra vlogo »molekularnega sita«, skozi<br />
katerega se prebijajo makromolekule. Nanešen vzorec izpostavimo električnemu<br />
polju določene napetosti in jakosti električnega toka. Nukleinske kisline zaradi<br />
različne molekulske mase ter oblike potujejo po gelu z različno hitrostjo. Nukleinske<br />
kisline obarvamo z fluorokromi, ki se vežejo na verigo ali med verigi (v primeru<br />
dvojnovijačne DNA). Pod svetlobo kratke valovne dolžine postanejo nukleinske<br />
kisline vidne zaradi flourescence vgrajenih barvil.<br />
13
3. EKSPERIMENTALNI DEL<br />
Eksperimentalni del naloge smo razdelili na več delov: vzorčenje na terenu,<br />
postopek izolacije DNA, pomnoževanje COI s PCR, agarozna elektroforeza in<br />
določanje nukleotidnega zaporedja ter filogeografska obdelava podatkov.<br />
3.1. Označevanje vzorcev<br />
Vzorce smo označili tako, da je iz oznake razvidno leto in mesec vzorčenja, vrsta<br />
klobučnjaka (RH- <strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>) ter zaporedna številka osebka.<br />
.<br />
Primer: 06/05/RH43<br />
06- leto vzorčenja<br />
05- mesec vzorčenja<br />
RH- <strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong><br />
43- zaporedna številka osebka<br />
3.2. Recepti za pripravo osnovnih raztopin in njihove koncentracije<br />
Raztopina za shranjevanje tkiv (20% DMSO nasičen z NaCl)<br />
DMSO 20 ml<br />
EDTA 50 ml 0,5M EDTA, pH 8,0<br />
NaCl 5,06g<br />
H 2 O do volumna 100 ml<br />
10 mM TRIS-Cl, pH 8,0l<br />
121, 1 g TRIS baze<br />
Dodamo dvakrat destilirano vodo do 800 ml in umerimo pH s koncentrirano HCl, ter<br />
dodamo destilirano vodo do 1000 ml<br />
3.2.1. Puferske raztopine<br />
> Shranjevalni pufer za Taq DNA-polimerazo (Fermentas)<br />
• 20 mM Tris-HCl (pH 8,0)<br />
• 0,1 mM EDTA<br />
• 100 mM KCl<br />
14
10-krat koncentrirani PCR-pufer (Fermentas)<br />
• 100 mm Tris-HCl (pH 8,8 pri 25°C)<br />
• 500 mM KCl<br />
• 0,8-odstotni neionski detergent P40<br />
> Sestava nalagalnega pufra za agarozni gel:<br />
• 0,05-odstotni bromofenolmodro<br />
• 0,05-odstotni ksilen cianid v formamidu<br />
• 40-odstotna (wt/vol) saharoza v dH 2 O<br />
> Sestava 1x TAE (tris acetatni pufer) za agarozno elektroforezo<br />
• 0,04 M Tris-acetat<br />
• 0,001 M EDTA<br />
• pH 8,0<br />
> Sestava TE pufra:<br />
• 10 mM Tris-HCl, pH 8<br />
• 1 mM EDTA, pH 8<br />
> Sestava 5-kratne založne raztopine TBE pufra:<br />
• 445 mM Tris<br />
• 445 mM borova kislina<br />
• 1 mM EDTA<br />
založna raztopina etidijevega bromida s koncentracijo 10 µg/ml<br />
kit za izolacijo DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN)<br />
3.2.2. Encimi:<br />
• Taq DNA-polimeraza (5U/µl, Fermentas)<br />
• Proteinaza K (Fermentas)<br />
15
3.2.3. Velikostni standardi DNA:<br />
• GeneRuler 100bp DNA Ladder (100-1000 bp, Fermentas)<br />
• Lambda DNA/Hind III Marker, 2 (Fermentas); 23130 bp-125 bp<br />
3.2.4. Aparature<br />
- centrifuga (Sigma)<br />
- ciklični termostat GeneAMP PCR system1400 (Perkin Elmer)<br />
- vodna kopel<br />
- napajalnik visoke napetosti za agarozno elektroforezo<br />
- kadičke za agarozno gelsko elektroforezo<br />
- modeli za agarozne gele<br />
- spektrofotometer Bio Quest, CE 2501 (Cecil Instruments Limited, UK)<br />
- detekcijski sistem za slikanje agaroznih gelov UVITEC (Cambridege, UK)<br />
3.3. Vzorčenje na terenu<br />
Opravili smo tri vzorčenja v Tržaškem zalivu v zimskem času (decembra 2006 in<br />
februarja leta 2007). Za vzorčenje velikih klobučnjakov smo uporabljali povlečno<br />
kočo, ki sta jo vlekli ribiški plovili Riba I in Riba II. Vzorčenje smo opravili tudi s<br />
plovilom Sagita, ki je last Morske biološke postaje Nacionalnega inštituta za<br />
biologijo. Pri vzorčenju s plovila Sagita smo si pomagali z mrežo za lovljenje meduz<br />
na daljši palici.<br />
Na plovilu smo vsako meduzo velikega klobučnjaka stehtali in izmerili premer<br />
klobuka. Takoj, ko smo opravili meritve, smo meduzi odrezali košček tkiva z roba<br />
klobuka in košček gonad s čisto pinceto in škarjami. Pinceto in škarje smo po<br />
rezanju dobro sprali z morsko vodo, da smo preprečili kontaminacijo med vzorci.<br />
Vsak košček tkiva smo shranili posebej v epici z konzervansom (20% DMSO<br />
nasičen z NaCl ali v 96% alkoholu). Epico smo zaprli, ustrezno označili z imenom<br />
vrste, datumom in lokacijo vzorčenja. Epice smo imeli ves čas v posodi z ledom,<br />
dokler jih nismo shranili v tekočem dušiku. Za daljše obdobje smo epice nato shranili<br />
globoko zamrznjene pri -80ºC. Pri vzorčenju smo si zaščitili roke z rokavicami iz<br />
lateksa ali gume.<br />
16
Black Sea<br />
Adriatic Sea<br />
Mediterranean Sea<br />
Slika 5: Zemljevid točk vzorčenja v severnem Jadranu in Črnem morju.<br />
3.4. Izolacija DNA<br />
Izolacijo DNA smo opravili z DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). DNA smo<br />
izolirali samo iz roba klobuka. Za eno izolacijo DNA smo potrebovali:<br />
- 100 mg vzorčenega tkiva<br />
- 180 µl pufra ATL<br />
- 20 µl proteinaze K<br />
- 200 µl pufra AL (vsebuje gvanidin hidroklorid)<br />
- 200 µl 96% etanola<br />
- 500 µl pufra AW1 (vsebuje gvanidin hidroklorid)<br />
- 500 µl pufra AW2<br />
- 100 ml pufra AE<br />
- 1,5 ml epice<br />
- 2 ml epice s silikatno membrano<br />
Tkiva smo do izolacije DNA hranili na -80°C. S pinceto smo prenesli tkivo iz epic s<br />
konzervansom in jih dali v sveže epice ter vsakemu vzorcu dodali 200µl pufra ATL in<br />
20µl proteinaze K. Vsako epico smo dobro premešali, zavili v parafim in pustili v<br />
vodni kopeli čez noč na temperaturi pri 65°C.<br />
Naslednji dan smo vzeli vzorce iz vodne kopeli ter jih ponovno močno premešali,<br />
dodali 200 µl pufra AL in 200 µl etanola ter še enkrat dobro premešali. Iz vsake<br />
epice smo odpipetirali reakcijsko mešanico in jo dali v posebne epice s silikatno<br />
membrano na katero se absorbirajo nukleinske kisline, ter centrifugirali pri 8000 rpm<br />
eno minuto. Pod epico z membrano smo zbrali pufer za spiranje membrane in ga<br />
zavrgli. Dodali smo 500µl pufra AW1 in centrifugirali eno minuto na 8000 rpm.<br />
Absorbirano DNA na membrani smo spirali z 500 µl pufra AW2 in centrifugirali tri<br />
minute na 14000 rpm. Nato smo v epico z membrano dodali 100 µl pufra AE s<br />
katerim smo eluirali DNA z membrane. Pufer AE smo pustili na membrani eno<br />
minuto ter nato centrifugirali eno minuto na 8000 rpm. Postopek smo ponovili<br />
dvakrat, tako da smo dobili dve frakciji posameznega vzorca. Obeh frakcij nismo<br />
združevali,<br />
17
ampak smo jih shranili ločeni. Vzorce smo hranili v zamrzovalniku na temperaturi -<br />
20°C do nadaljnjih analiz.<br />
3.4.1. Spektrofotometrične meritve<br />
Koncentracijo izolirane DNA v vzorcih smo določili spektrofotometrično. Vzorce DNA<br />
smo redčili 1:100 v 10mM Tris pufru (pH 8,0) in nato izmerili absorbanco pri treh<br />
valovnih dolžinah (260 nm, 280nm in 320nm). Koncentracijo smo izračunali po<br />
formuli:<br />
koncentracija DNA (µg/mL) = A 260 x 50 µg x faktor redčenja<br />
Za računanje koncentracije DNA smo uporabili spletno aplikacijo<br />
http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_03.html.<br />
Kontaminacijo izolirane DNA z beljakovinami smo ovrednotili iz razmerja absorbcije<br />
pri 260 nm in 280 nm. DNA, ki ima razmerje A 260 /A 280 v razponu od 1,7 do 2,0 je<br />
primerna za nadaljnjo uporabo in smatramo, da ni kontaminirana z beljakovinami,<br />
fenolom ali drugimi snovmi, ki absorbirajo ultraviolično svetlobo pri tej valovni<br />
dolžini. Nekontaminirana dvoverižna DNA, ki ima OD 1 (en centimeter dolžina poti<br />
žarka; 260 nm) vsebuje 50 µg mL -1 dvoverižne DNA. Na osnovi absorbcije pri 320<br />
nm lahko ugotovimo ali je DNA kontaminirana s sestavinami iz kita za izolacijo DNA.<br />
3.5. Agarozna elektroforeza<br />
3.5.1. Priprava agaroznega gela<br />
Po izolaciji z DNeasy Blood & Tissue Kit smo preverili količino in kvaliteto oborjene<br />
DNA na agaroznih gelih. Za izolirane vzorce DNA smo pripravili 1,2% gel po<br />
naslednjem postopku: zatehtali smo želeno količino agaroze in jo dali v<br />
erlenmajerico. Dodali smo potrebno količino pufra 1xTAE. Agarozo smo segrevali po<br />
1 minuto v mikrovalovni pečici na 750 W. Med segrevanjem smo jo večkrat<br />
premešali. Segrevali smo jo toliko časa, da se je agaroza popolnoma stopila (da ni<br />
bilo več videti zrnc agaroze). Ko se je agaroza ohladila na približno 50ºC, smo<br />
dodali etidijev bromid (koncentracija založne raztopine 10mg/mL). Agarozo smo<br />
ohladili in dodali 3µl EtBr. Pripravili smo banjico za gel z glavničkom, dodali agarozo<br />
z EtBr ter pustili, da se strdi. Ko se je gel strdil, smo odstranili glavničke in gel na<br />
podstavku vstavili v posodo za elektroforezo. Za ogled pomnoženih fragmentov COI<br />
smo pripravili 1,8% agarozo v TAE pufru po zgoraj opisanem postopku.<br />
3.5.2. Nanašanje vzorcev<br />
Na parafilm smo nanesli 5µl nalagalnega pufra in mu dodali 5µl vzorca. Vzorec in<br />
pufer smo premešali in nanesli v žepke na gelu. Poleg vzorcev smo nanesli še<br />
ustrezen velikostni standard λ DNA/HindIII (Fermentas) za genomsko DNA ali 100<br />
bp marker za PCR produkte (Fermentas). Na posodo za elektroforezo smo položili<br />
pokrov ter priključili enosmerni električni tok. Naravnali smo željeno napetost<br />
elektroforeze. Elektroforeza je potekala 60 minut pri 6V/cm. Po končani elektroforezi<br />
18
smo si gel ogledali na transiluminatorju, kjer smo ga presvetlili z UV svetlobo<br />
(325nm) in gele fotografirali ter slike shranili v digitalnem zapisu.<br />
3.6. PCR reakcija za pomnoževanje mitohondrijske oksidaze C<br />
Osnovna PCR mešanica je bila sestavljena iz matrične DNA, začetnih<br />
oligonukleotidov LCO 1490 in HCO 2198 (Folmer in sod., 1994), MgCl 2, Taq DNA<br />
polimeraze in dNTP-jev. V PCR reakcijo smo dali matrično DNA. Celoten volumen<br />
reakcijske mešanice za PCR je bil 50µl. Koncentracija vsakega posameznega<br />
dNTP-ja je znašala v PCR reakciji 0,2mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Kjer nismo<br />
uspeli pomnožiti COI pri pogojih, ki so opisani spodaj, smo spreminjali koncentracijo<br />
MgCl 2 in temperaturo prileganja začetnih oligonukleotidov.<br />
Prvotna reakcijska mešanica za PCR s končnim volumnom 50 µl je vsebovala<br />
naslednje sestavine v delovnih koncentracijah:<br />
<br />
<br />
5 enot Taq-polimeraze<br />
5 µl 10-krat koncentriranega pufra za PCR<br />
2,5 mM MgCl 2<br />
0,8 mM dNTP<br />
10 µl LCO 1490<br />
10 µl HCO 2198<br />
DNA v razponu od 100 ng do 500ng<br />
deionizirana in sterilna voda do 50 µl<br />
Temperaturni profil PCR<br />
Izhajali smo iz začetnega temperaturnega profila:<br />
začetna denaturacija: 95 C 3 minuti<br />
denaturacija: 94 C 1 minuta<br />
naleganje: 40 C 90 sekund 35 ciklov<br />
podaljševanje: 72°C 1 minuta<br />
podaljšana polimerizacija: 72°C 7 minut<br />
Izhajali smo iz zgoraj napisanega osnovnega temperaturnega profila. PCR je bil<br />
sestavljen iz 35 ciklov pomnoževanja. Pri denaturaciji se je reakcijska mešanica<br />
segrela nad 90°C, da smo dosegli prekinitve vodikovih vezi in s tem razklenitev<br />
dvojne vijačnice DNA. Tako je omogočeno začetnim oligonukleotidom, da najdejo<br />
komplementarna mesta prileganja na DNA. Prvi cikel denaturacije je bil daljši, do 5<br />
min, da smo popolnoma ločili obe verigi genomske DNA. Naleganje začetnih<br />
oligonukleotidov je trajalo od 20 sekund do 1 min. Nato je sledilo podaljševanje verig<br />
s Taq polimerazo pri optimalni temperaturi delovanja encima, ki je 72ºC. Naslednja<br />
faza je podaljšana polimerizacija, ki omogoči Taq polimerazi, da dokonča<br />
podaljševanje. Ta stopnja je še posebej pomembna, kadar pomnožujemo dolge<br />
fragmente DNA.<br />
19
3.6.1. Začetni oligonukleotidi<br />
Za PCR, s katerim smo pomnoževali COI in v asimetričnem PCR za določanje<br />
nukleotidnega zaporedja v COI, smo uporabili enak par začetnih oligonukleotidov<br />
(Folmer in sod., 1994). Številki ob imenu začetnih oligonukleotidov pomenita mesto<br />
naleganja na mtDNA.<br />
HCO 2198<br />
5' - TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA- 3'<br />
LCO 1490<br />
5'- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC- 3'<br />
3.6.2. Priprava vzorcev za PCR<br />
Vzorce za PCR smo pripravili v laminariju, zato da smo preprečili kontaminacije s<br />
pomnožki iz drugih PCR reakcij, ki so lahko v aerosolih. Delali smo na ledu, da smo<br />
preprečili nespecifično pomnoževanje v PCR. Vsakokrat smo si pripravili potrebno<br />
količino PCR mešanice brez matrične DNA v 1,5 ml epici in jo dobro premešali.<br />
Mešanico smo nato razdelili v epice za PCR v ustreznih količinah, nato smo dodali<br />
še matrično DNA v ustrezni koncentraciji (glej Tabelo 2). Vzorce za PCR smo dobro<br />
premešali ter jih postavili v ciklični termostat PCR.<br />
3.7. Določanje nukleotidnega zaporedja<br />
Nukleotidna zaporedja smo določili v 12 osebkih iz Črnega morja in v 4 osebkih iz<br />
Koprskega zaliva. Nukleotidna zaporedja vzorcev so bila narejena v podjetju<br />
Macrogen (Koreja). Za PCR reakcijo za določanje nukleotidnih zaporedij smo<br />
uporabili enake začetne oligonukleotide (LCO 1490 in HCO 2198 ) kot v prvem<br />
pomnoževanju s PCR. Za uspešno asimetrično reakcijo PCR smo potrebovali 500<br />
do 700 ng PCR produkta v 15 µl s koncentracijo 50 ng/µl. Potrebna koncentracija<br />
začetnega oligonukleotida za en asimetričen PCR je bila 5 pmol v enem µl.<br />
Nukleotidna zaporedja smo dobili v obliki kromatografskih zapisov in jih ročno<br />
pregledali v programu ChromasPro 1,34 (Technelysium Pty Ltd). S pregledovanjem<br />
smo našli mesta z nukleotidi, ki so bili označeni kot dvomljivi (ang. ambigous). Če je<br />
bilo možno, smo določili pravi nukleotid, če to ni bilo možno, smo pustili originalen<br />
zapis. Nato smo nukleotidna zaporedja obeh matričnih verig združili v eno<br />
konsenzusno nukleotidno zaporedje, ki smo ga uporabili za nadaljne obdelave s<br />
programom BioEdit (Hall, 1999).<br />
.<br />
3.8. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v podatkovni zbirki<br />
GenBank (algoritem BLAST) in poravnava nukleotidnih zaporedij<br />
Konsezusna nukleotidna zaporedja smo uredili v fasta format (glej priloga A) in<br />
nato poiskali najbolj podobna nukleotidna zaporedja, ki so v podatkovni zbirki<br />
20
GenBank. Za iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij smo uporabili algoritem Blast,<br />
ki se nahaja na spletni strani podatkovne zbirke GenBank (Blast pognan 5.2.2008,<br />
glej priloga D).<br />
Vsa nukleotidna zaporedja velikega klobučnjaka in njemu podobna nukleotidna<br />
zaporedja, ki so bila rezultat iskanja v GenBank, smo nato poravnali s programom<br />
Clustal (Higgins in sod., 1988), ki je dostopen na spletu<br />
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html.<br />
Nastavitev programa nismo spreminjali. Iz poravnanih nukleotidnih zaporedij smo<br />
izrezali vrzeli (ang. gaps). Rezultat so poravnana nukleotidna zaporedja, ki smo jih<br />
nato uporabili za nadaljno obdelavo in izračune. Poravnana nuklotidna zaporedja so<br />
prikazana v prilogi B.<br />
3.9. Filogeografska analiza nukleotidnih zaporedij<br />
Filogeografsko analizo vzorcev velikega klobučnjaka iz Črnega morja (Modri zaliv) in<br />
severnega Jadranskega morja (Koprski zaliv) smo naredili v programu MEGA<br />
(Kumar in sod., 2004). Kot osnovo za izračune smo uporabili poravnana nukleotidna<br />
zaporedja narejena v programu Clustal (glej poglavje 3.7 in priloga B).<br />
Pri obdelavi podatkov iz nukleotidnih zaporedij in za izris filogenetskega drevesa<br />
smo uporabili dve metodi; metoda združevanja najbližjega soseda (ang. Neighbour-<br />
Joining (NJ)), ki sodi med nediskretne metode (metode razdalj) in za oblikovanje<br />
filogenetskega drevesa uporablja parna neskladja (med nukleotidi na istem mestu v<br />
DNA), ter Kimurino-2 parametersko metodo, s katero smo izračunali parne razdalje<br />
posameznih haplotipov (Kimura, 1980). Filogenetsko drevo smo narisali v programu<br />
MEGA. Za koreninjenje filogenetskega drevesa smo uporabili kot zunanjo skupino<br />
nukleotidno zaporedje iz vrste Nemopilema nomurai (AB243416).<br />
21
4. REZULTATI IN RAZPRAVA<br />
V diplomskem delu smo uporabili 21 vzorcev nabranih v severnem Jadranskem<br />
morju (Koprski in Piranski zaliv) in 25 vzorcev iz Črnega morja, ki nam jih je poslala<br />
dr. Tamara Shiganova (Shirshov inštitut za oceanologijo iz Moskve). Vzorci meduz<br />
velikega klobučnjaka, ki so bili nabrani v Tržaškem zalivu, so bili nabrani v<br />
novembru in decembru 2006 ter še januarja in februarja 2007. V Jadranskem morju<br />
je množično pojavljanje velikega klobučnjaka dokumentirano le v hladnem delu leta.<br />
V to obdobje sodijo tudi opažanja ribičev in naključnih obiskovalcev ob obali. Zelo<br />
obsežno množično pojavljanje velikega klobučnjaka v Tržaškem zalivu je bilo<br />
zabeleženo leta 2005.<br />
Podrobnejši podatki o vzorcih iz katerih smo izolirali DNA so opisani v Tabeli 2.<br />
Tabela 2: Seznam uporabljenih vzorcev za filogeografsko analizo velikega<br />
klobučnjaka.<br />
DATUM VZORČENJA MESTO VZORČENJA OZNAKA VZORCA<br />
15.12. 2006 Piranski zaliv (Bernardin) 12/06/RH1<br />
15.12. 2006 Piranski zaliv (Bernardin) 12/06/RH2<br />
15.12. 2006 Piranski zaliv (Bernardin) 12/06/RH3<br />
28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH1<br />
28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH2<br />
28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH3<br />
28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH4<br />
28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH5<br />
28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH6<br />
11.01.2007 Koprski zaliv 13/07/RH1<br />
11.01.2007 Koprski zaliv 13/07/RH2<br />
September, 2005 Črno morje 07/05/RH1<br />
September, 2005 Črno morje 07/05/RH2<br />
September, 2005 Črno morje 07/05/RH3<br />
September, 2005 Črno morje 07/05/RH4<br />
September, 2005 Črno morje 07/05/RH5<br />
September, 2005 Črno morje 07/05/RH6<br />
September, 2005 Črno morje 07/05/RH7<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH27<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH31<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH33<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH B<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH C<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH D<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH E<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH G<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH H<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH K<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH M<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH N<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH3<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH4<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH12<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH13<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH15<br />
Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH16<br />
01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH1<br />
01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH2<br />
01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH3<br />
01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH4<br />
01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH5<br />
01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH6<br />
01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH7<br />
22
DATUM VZORČENJA MESTO VZORČENJA OZNAKA VZORCA<br />
01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH8<br />
01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH9<br />
01.02.2007 Koprski zaliv 14/07/RH10<br />
4.1. Rezultati izolacije DNA iz tkiva velikega klobučnjaka<br />
DNA smo izolirali iz roba klobuka meduze velikega klobučnjaka po navodilih<br />
proizvajalca s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). Kvaliteto in količino DNA<br />
smo preverili na 1,2-dstotnem agaroznem gelu. Velikost izolirane DNA smo določili s<br />
primerjavo z velikostnim standardom Hind III λ marker (Fermentas). S primerjavo<br />
jakosti obarvanih fragmentov DNA smo približno določili njihovo koncentracijo.<br />
Rezultati izolacije DNA so prikazani na slikah: slika 6, slika 7, slika 8 in slika 9 .<br />
4.1.1. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v severnem Jadranskem morju<br />
Slika 6 prikazuje rezultat izolacije DNA iz 9 vzorcev, ki so bili nabrani v Piranskem in<br />
Koprskem zalivu (glej Tabelo 2) v obdobju od decembra 2006 do februarja 2007.<br />
Izolacijo DNA smo opravili iz roba klobuka. Izolacija DNA (prikazana na sliki 6) je<br />
bila uspešna v 8 primerih (11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6,<br />
11/06/RH2, 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3). Na stezi, kjer je nanešen vzorec<br />
11/06/RH1, ni vidna DNA, a smo s spektrofotometričnim merjenjem ugotovili, da je v<br />
vzorcu vseeno DNA v zelo nizki koncentraciji 30ng/µl (Tabela 3). Agarozna<br />
elektroforeza nam omogoča, da lahko ocenimo kakšne velikosti je izolirana DNA in<br />
približno oceno koncentracije DNA v vzorcu. Na sliki vidimo, da smo uspeli izolirati<br />
visoko molekularno DNA, katere velikost smo ocenili na 23 000 bp. Izolirana DNA je<br />
tudi delno razgrajena, kar je videti kot razmaz na stezi<br />
pod visoko molekularno DNA. Količina vzorca, ki smo jo nanesli v luknjico v gelu, je<br />
5 µl. Količina izolirane DNA med vzorci je različna in je odvisna predvsem od<br />
količine tkiva, ki je bila uporabljena za izolacijo.<br />
23
Slika 6: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit<br />
(QIAGEN). Oznake vzorcev (od levi proti desni): 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3,<br />
11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6 (vzorci iz JV<br />
Tržaškega zaliva). Na vsako stezo smo nanesli 5 µl vzorca.<br />
V Koprskem zalivu smo nabrali 18 osebkov velikega klobučnjaka. Nato smo iz 10<br />
meduz velikega klobučnjaka izolirali DNA. Iz vzorcev smo izolirali visokomolekularno<br />
DNA (14/07/RH1, 14/07/RH2, 14/07/RH3, 14/07/RH4, 14/07/RH7, 14/07/RH8,<br />
14/07/RH9) (glej Sliko 7). Koncentracija izolirane DNA je bila v razponu od 727<br />
ng/µl do 237 ng/µl (Tabela 3). Iz vzorcev 14/07/RH5, 14/07/RH6, 14/07/RH10 smo<br />
izolirali razgrajeno DNA v zelo nizki koncentraciji. Na agaroznem gelu je razkosana<br />
DNA videti kot razmaz na stezi.<br />
24
Slika 7: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit<br />
(QIAGEN). Prva steza: velikostni standard λ marke (5 µl), sledijo vzorci (od leve<br />
proti desni): 14/07/RH1, 14/07/RH2, 14/07/RH3, 14/07/RH4, 14/07/RH5, 14/07/RH6,<br />
14/07/RH7, 14/07/RH8, 14/07/RH9, 14/07/RH10. Na vsaki stezi je nanešeno 5 µl<br />
vzorca. Slika 5 je sestavljena iz dveh slik.<br />
25
Slika 8: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit (<br />
QIAGEN).<br />
Prva steza: velikostni standard λ marker (5 µl), sledijo vzorci (od leve proti desni):<br />
11/06RH7/1, 11/06RH7/2, 11/06RH1/1, 11/06RH1/2, 11/06RH2/1, 11/06RH2/2,<br />
11/06RH3/1, 11/06RH3/2, 12/06/RH1/1, 12/06/RH1/2, 12/06/RH2/1, 12/06/RH2/2,<br />
12/06/RH3/1, 12/06/RH3/2, 14/07/RH11/1, 14/07/RH11/2, 14/07/RH12/1,<br />
14/07/RH12/2, 14/07/RH14/1, 14/07/RH14/2, 14/07/RH15/1, 14/07/RH15/2,<br />
14/07/RH16/1, 14/07/RH16/2. Na vsako stezo smo nanesli 5 µl vzorca.<br />
Veliko količino DNA smo izolirali iz vzorcev 13/07/RH1 in 13/07/RH2, ki so bili<br />
nabrani v Tržaškem zalivu (glej Sliko 9). Izmerjena količina DNA je bila največja<br />
med vsemi vzorci in sicer 2000 ng/µl v vzorcu 13/07/RH1 in 2210 ng/µl v vzorcu<br />
13/07/RH2. Izolirana DNA je bila delno razgrajena, a še vedno dovolj kvalitetna za<br />
nadaljnje manipulacije.<br />
26
Slika 9: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit (<br />
QIAGEN).<br />
Prva steza: velikostni standard λ marker (5 µl) sledijo vzorci (od leve proti desni):<br />
07/05/RH1, 07/05/RH2, 07/05/RH3, 07/05/RH4, 07/05/RH5, 07/05/RH6, 07/05/<br />
RH7,vzorci iz Koprskega zaliva: 13/07/RH1, 13/07/RH2. Na vsaki stezi je nanešeno<br />
5 µl vzorca. Slika 9 je sestavljena iz dveh slik.<br />
4.1.2. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v Črnem morju<br />
Manj uspešna je bila izolacija DNA iz vzorcev, ki so bili nabrani v Črnem morju in so<br />
bili shranjeni dlje časa (nabrani v septembru 2005) v 20% DMSO nasičenem z NaCl.<br />
Za izolacijo DNA smo uporabili tkivo z roba klobuka. Kadar je tkivo shranjeno v tem<br />
konzervansu dlje časa, postane bolj tekoče (Dawson in sod., 1998), zato smo ga<br />
morali odpipetirati v epico, v kateri je potekala izolacija DNA. DNA zelo dobre<br />
kvalitete smo izolirali iz vzorcev 07/05/RH1 in 07/05/RH5 (Slika 9). Izolacija DNA ni<br />
uspela iz vzorcev 07/05/RH2 in 07/05/RH3, kar smo potrdili tudi z<br />
spektrofotometričnimi meritvami. Koncentracija DNA je bila v razponu 15 ng/µl do<br />
55 ng/µl, kar so bile najnižje izmerjene vrednosti izolirane DNA.<br />
27
Slika 10 prikazuje vzorce iz Črnega morja, iz katerih so že predhodno izolirali DNA<br />
na Morski biološki postaji v Piranu, in smo jih prav tako uporabili za pomnoževanje<br />
COI. DNA je bila izolirana z detergentom CTAB. Koncentracija izolirane DNA je bila<br />
v velikem velikostnem razponu. Najnižjo koncentracijo smo izmerili v vzorcu<br />
08/05/RH D in sicer 119 ng/µl, najvišjo koncentracijo smo izmerili v vzorcu<br />
08/05/RH H in sicer 4100ng/µl.<br />
Slika 10: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit (<br />
QIAGEN).<br />
Prva steza: velikostni standard λ marker (5 µl), sledijo vzorci (od leve proti desni):<br />
08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH B, 08/05/RH C, 08/05/RH D,<br />
08/05/RH E, 08/05/RH G, 08/05/RH H, 08/05/RH K, 08/05/RH N, 08/05/RH M,<br />
08/05/RH3, 08/05/RH4, 08/05/RH12, 08/05/RH13, 08/05/RH15, 08/05/RH16. Na<br />
vsaki stezi je nanešeno 5 µl vzorca. Slika 8 je sestavljena iz dveh slik.<br />
Kit DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) je primeren za izolacijo DNA iz meduz<br />
klobučnjakov. Tudi količina in kvaliteta izolirane DNA je bila zadovoljiva in je v<br />
glavnem odvisna od časa shranjevanja vzorcev v konzervansu. Primerjava izoliranih<br />
DNA pokaže, da je boljše kvalitete DNA, ki smo jo izolirali kmalu po vzorčenju (glej<br />
sliko 6). DNA, smo iz vseh vzorcev izolirali po enakem postopku s kitom DNeasy<br />
Blood & Tissue Kit ( QIAGEN), razen nekaj vzorcev iz Črnega morja, iz katerih je<br />
bila DNA izolirana že prej z detergentom CTAB. Daljši čas shranjevanja tkiva v<br />
konzervansu pomeni tudi večjo razgradnjo DNA v shranjenem tkivu. Najbolj<br />
zanesljivo je shranjevanje tkiv v tekočem dušiku takoj po odvzemu in nato na -80 C.<br />
Žal pa pri terenskem delu ni možno vedno zagotoviti takšnega načina shranjevanja.<br />
Raziskovalci so uporabili tudi klasične metode izolacije DNA in preverili, kolikšna je<br />
razgradnja DNA glede na čas shranjevanja. Ugotovili so, da mora biti tkivo<br />
shranjeno na čimbolj nizkih temperaturah in čim krajši čas. V študiji so primerjali<br />
različne pogoje shranjevanja in različne organizme. Največjo razgradnjo DNA so<br />
opazili pri uhatem klobučnjaku in manjšo pri drugih morskih nevretenčarjih, kot sta<br />
morski polž Astrea undosa in vetrnica Anthopleura xanthogrammica. Zaradi velike<br />
vsebnosti vode v tkivih morskih nevretenčarjev ni možno ohraniti DNA s hitrim<br />
sušenjem tkiva (Dawson in sod., 1998).<br />
28
Priporočena količina tkiva za izolacijo s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN)<br />
je 25mg in se nanaša na vrsto tkiva. Vsa omenjena tkiva vsebujejo večje število<br />
celic in zaradi tega več DNA. Klobučnjaki imajo v telesu meduze v glavnem<br />
mezoglejo, ki pa vsebuje zelo majhno število celic. Prav tako imajo klobučnjaki<br />
veliko vsebnost vode v telesu. Pri izolaciji smo morali zagotoviti zadosti tkiva, da<br />
pridobimo zadovoljivo količino DNA za nadaljne manipulacije, kakor tudi paziti, da s<br />
preveliko količino tkiva ne onemogočimo adsorbcije DNA na silikatno kolono.<br />
4.1.3. Rezultati spektrofotometričnih meritev genomske DNA<br />
Koncentracijo DNA smo ovrednotili na podlagi meritve absorbcije pri 260 nm in 280<br />
nm. Vzorce smo redčili v razmerju 1 proti 100 v pufru 10 mM Tris (pH 8,0). Iz<br />
vrednosti absorbcije pri 260 nm smo po opisani formuli izračunali koncentracijo<br />
DNA. Koncentracijo DNA smo podali v ng v enem mikrolitru. Izmerjene<br />
koncentracije so nizke. To smo nekako tudi pričakovali, saj je celotna meduza<br />
zgrajena v glavnem iz mezogleje, ki ne vsebuje veliko celic. Količina DNA v vzorcih<br />
je v razponu od najvišje vrednosti 4100ng/µl do 3,07 ng/µl. Izplen DNA iz roba<br />
klobuka meduze je mnogo manjši v primerjavi z izplenom iz drugih tkiv bolj bogatih s<br />
celicami, kadar uporabimo kit DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). Z istim kitom<br />
lahko iz tkiv, ki so bogata s celicami, izoliramo do 40 µg DNA iz 25 mg repka<br />
podgane ali do 30 µg DNA iz možgan. Izplen DNA iz plavutke ribe (pribl. 20 mg) z<br />
istim kitom znaša 10 do 20 µg DNA. Majhna količina DNA pomeni tudi manj možnih<br />
manipulacij, zato priporočamo zaradi majhnega izplena DNA iz roba klobuka, da se<br />
pri vzorčenju odvzame več koščkov tkiva. Tako je kasneje možno izpeljati več<br />
izolacij iz DNA istega osebka in pridobiti zadosti DNA za nadaljne delo.<br />
Zgodi se, da se DNA ne raztopi, ampak ostane neraztopljena v topilu. Zato je tudi<br />
možno, da vzamemo alikvot, v katerem ni veliko raztopljene DNA. Razlog, da se<br />
DNA ne raztopi popolnoma v topilu je predvsem v nečistočah, ki so vezane na DNA<br />
in so povezane z vrsto tkiva, iz katerega jo izoliramo ali pa na okolje, v katerem je<br />
tkivo kot na primer izolacija DNA iz mikrobnih vzorcev sedimenta, vampa ali prsti<br />
(Roe in sod., 1996).<br />
29
Tabela 3: Izračun količine DNA v vzorcu.<br />
OZNAKA VZORCA RAZMERJE (A 260: A 280) KONCENTRACIJA DNA<br />
V VZORCU (ng/µL)<br />
12/06/RH1 1,8 148<br />
12/06/RH2 2,02 232<br />
12/06/RH3 1,9 193<br />
11/06/RH1 1,2 29<br />
11/06/RH2 1,5 54<br />
11/06/RH3 1,8 108<br />
11/06/RH4 1,7 757<br />
11/06/RH5 1,7 74<br />
11/06/RH6 2,1 113<br />
13/07/RH1 1,9 2000<br />
13/07/RH2 1,7 2210<br />
07/05/RH1 11 55<br />
07/05/RH2 0 0<br />
07/05/RH3 0 0<br />
07/05/RH4 1,5 14<br />
07/05/RH5 2 39<br />
07/05/RH6 2 19<br />
07/05/RH7 1 10<br />
14/07/RH1 2 212<br />
14/07/RH2 2,1 559<br />
14/07/RH3 2,0 247<br />
14/07/RH4 2,1 480<br />
14/07/RH5 4,19 410<br />
14/07/RH6 2,3 430<br />
14/07/RH7 2 237<br />
14/07/RH8 1,9 242<br />
14/07/RH9 2,1 500<br />
14/07/RH10 2,1 727<br />
08/05/RH16 1,7 292<br />
08/05/RH B 1,8 1<br />
08/05/RH H 1,9 4100<br />
08/05/RHN 1,9 970<br />
08/05/RH3 1,8 3<br />
08/05/RH4 1,8 3<br />
08/05/RH27 1,8 787<br />
08/05/RH31 2,2 153<br />
08/05/RH33 2,2 188<br />
08/05/RHC 1,9 613<br />
08/05/RHD 1,8 118<br />
08/05/RHE 1,9 153<br />
08/05/RHG 2,0 999<br />
08/05/RHK 1,9 371<br />
08/05/RHM 1,7 108<br />
08/05/RH12 1,8 732<br />
08/05/RH13 1,9 920<br />
08/05/RH15 1,9 970<br />
4.2. Rezultati pomnoževanja citokrom C oksidaze z reakcijo PCR<br />
V reakciji PCR smo pomnoževali zapis za encim citokrom oksidazo C in sicer za<br />
podenoto I (COI) s parom začetnih oligonukleotidov LCO 1490 in HCO 2198 (Folmer in<br />
sod., 1994 ). Za PCR reakcijo smo uporabili temperaturni profil in reakcijsko<br />
mešanico, ki sta opisana v poglavju 3.5. in 3.5.2. Reakcijske mešanice so se<br />
razlikovale po količini dodane matrične DNA (glej Tabelo 3).<br />
30
Najprej smo pripravili ustrezne redčine izoliranih DNA po naslednji shemi :5µl DNA +<br />
45 µl sterilne vode (glej tabelo 3). Količine dodane matrične DNA v PCR reakciji so<br />
razvidne iz Tabele 4. Vzorcev, kjer smo izolirali malo DNA, nismo redčili.<br />
Pomnožili smo 700bp dolg fragment COI, ki smo ga uspeli pomnožiti v 16-ih vzorcih.<br />
Pomnoževanje je bilo uspešno v slabi tretjini vzorcev (27 odstotkih). Velikost<br />
pomnoženih produktov smo določili s primerjavo z velikostnim standardom<br />
GeneRuler 100bp DNA Ladder ((100–1000 bp) Fermentas na agaroznem gelu.<br />
Tabela 4: Količina dodane matrične DNA v posamezni PCR reakciji ter uspešnost<br />
pomnoževanja COI.<br />
OZNAKA<br />
VZORCA<br />
REDČITEV<br />
MATRIČNE<br />
DNA<br />
KONCENTRACIJA<br />
REDČENE DNA<br />
(ng/µl)<br />
KOLIČINA<br />
MATRIČNE<br />
DNA (µL)<br />
KONCENTRACIJA<br />
MATRIČNE DNA V<br />
PCR (ng)<br />
06/05/RH43 1:10 Ni izmerjena 15 - +<br />
06/05/RH46 1:10 Ni izmerjena 15 - +<br />
08/05/RH16 292 10 2920 +<br />
08/05/RH B 1 10 18 +<br />
08/05/RH H 4100 10 41000 +<br />
08/05/RH N 970 10 9702 +<br />
07/05/RH3 0 3 0 +<br />
06/05/RH43 10 - -<br />
06/05/RH46 10 - -<br />
07/05/RH3 1:10 0 5 0 -<br />
07/05/RH4 1:10 1 5 7 -<br />
08/05/RH4 1:10 0 5 1 -<br />
08/05/RH27 1:10 78 10 787 +<br />
08/05/RH31 1:10 15 5 76 +<br />
08/05/RH33 1:10 18 5 94 +<br />
08/05/RH D 1:10 11 10 118 +<br />
08/05/RH E 1:10 15 5 76 +<br />
08/05/RH G 1:10 99 5 499 +<br />
08/05/RH K 1:10 37 5 185 -<br />
08/05/RH M 1:10 10 5 54 -<br />
08/05/RH12 732 7 5128 -<br />
08/05/RH13 920 10 9207 -<br />
08/05/RH15 970 10 9702 -<br />
08/05/RH16 292 5 1460 -<br />
07/05/RH6 19 5 99 +<br />
12/06/RH1 148 1 148 -<br />
12/06/RH2 232 1 232 +<br />
12/06/RH3 193 1 193 +<br />
11/06/RH1 29 1 29 -<br />
11/06/RH2 54 1 54 -<br />
11/06/RH3 108 1 108 +<br />
11/06/RH4 757 1 757 -<br />
11/06/RH5 74 1 74 -<br />
11/06/RH6 113 1 113 -<br />
11/06/RH5<br />
redčina<br />
11/06/RH6<br />
redčina<br />
1:10 7 5 37 -<br />
1:10 11 5 56 -<br />
USPEŠNOST<br />
POMNOŽEVAN<br />
JA COI<br />
31
OZNAKA<br />
VZORCA<br />
REDČITEV<br />
MATRIČNE<br />
DNA<br />
KONCENTRACIJA<br />
REDČENE DNA<br />
(NG/ΜL)<br />
KOLIČINA<br />
MATRIČNE<br />
DNA (µL)<br />
KONCENTRACIJA<br />
MATRIČNE DNA V<br />
PCR (NG)<br />
07/05/RH3 1:10 0 5 0 -<br />
08/05/RH16 292 5 1460 -<br />
08/05/RH B 1 5 5 -<br />
08/05/RH H 4100 5 20500 -<br />
08/05/RH N 970 5 4851 -<br />
08/05/RH27 1:10 78 10 787 -<br />
08/05/RH31 1:10 15 10 153 -<br />
08/05/RH33 1:10 18 10 188 -<br />
08/05/RH C 1:10 61 10 613 -<br />
08/05/RH D 1:10 11 5 59 -<br />
08/05/RH E 1:10 15 5 76 -<br />
08/05/RH G 1:10 99 5 499 -<br />
11/06/RH7 10 - -<br />
11/06/RH1 29 10 297 -<br />
11/06/RH2 54 10 544 -<br />
12/06/RH1 148 10 1485 -<br />
12/06/RH2 232 10 2326 -<br />
12/06/RH3 193 10 1930 +<br />
14/07/RH1 212 1 212 +<br />
14/07/RH3 247 1 247 +<br />
14/07/RH7 237 1 237 -<br />
14/07/RH8 242 1 242 +<br />
14/07/RH11 7 - +<br />
14/07/RH12 7 - +<br />
14/07/RH14 7 - +<br />
14/07/RH15 10 - +<br />
14/07/RH16 10 - -<br />
Legenda<br />
: + uspešno pomnožen COI,<br />
- neuspešno pomnožen COI<br />
USPEŠNOST<br />
POMNOŽEVAN<br />
JA COI<br />
Rezultati pomnoževanja COI so prikazani na spodnjih slikah. Produkte<br />
pomnoževanja smo nanesli na 1,8 % agarozni gel, ki smo ga pripravili, kot je<br />
opisano v poglavju 3.4.1 in 3.4.2.<br />
COI smo uspeli pomnožiti v vzorcih (glej sliko 10): 06/05/RH43, 06/05/RH46,<br />
07/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N. Jakost pomnoženih<br />
fragmentov je bila različna, učinkovitost pomnoževanja v PCR je bila verjetno<br />
odvisna od količine in kvalitete izolirane DNA. Vzorci 08/05/RH16, 08/05/RH B,<br />
08/05/RH H, 08/05/RH N, 07/05/RH3 imajo na agaroznem gelu zelo močan signal,<br />
zato lahko sklepamo na visoko koncentracijo pomnoženega produkta. V vsak vzorec<br />
smo dodali 5µl matrične DNA.<br />
COI v vzorcih 06/05/RH43, 06/05/RH46 smo pomnožili v PCR pri naslednjih pogojih:<br />
temperaturi naleganja 40º C, koncentracija MgCl 2 je bila 1,5 mM ter koncentracija<br />
obeh začetnih oligonukleotidov je znašala 0,5µM.<br />
32
Slika 11: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka.<br />
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 06/05/RH43,<br />
06/05/RH46, 07/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N,<br />
velikostni standard 100bp DNA<br />
Vzorca (glej sliko 11) 06/05/RH43 in 06/05/RH46 smo ponovno namnožili<br />
(reamplificirali), kar pomeni da smo za matrično DNA uporabili neprečiščen PCR<br />
produkt iz predhodnega pomnoževanja s PCR. PCR reakcije, iz katerih smo<br />
uporabili PCR produkt so prikazane na sliki 11. V obeh vzorcih (06/05/RH43,<br />
06/05/RH46) smo s ponovnim pomnoževanjem uspešno namnožili COI. Uspešno<br />
smo pomnožili COI tudi v vzorcih: 07/05/RH3, 08/05/RH3 in 08/05/RH4. Jakost<br />
pomnoženih fragmentov je bila različna. Poleg DNA so se v vseh vzorcih pomnožili<br />
še drugi nespecifični produkti, ki so vidni kot razmaz na stezi. Pomnoženi produkti<br />
COI niso specifični in tudi po velikosti (ker so manjši od 700bp) ne ustrezajo pravim<br />
velikostim COI. V vzorcu 07/05/RH4 se ni pomnožil COI, ampak je videti, kot da je v<br />
njem veliko visokomolekularne DNA. To je videti iz primerjave s sliko, na kateri je<br />
izolirana DNA tega vzorca. Velike količine DNA prav tako lahko inhibirajo<br />
pomnoževanje v PCR.<br />
Pogoji, pri katerih smo pomnožili COI, so bili: temperatura naleganja 40º C,<br />
koncentracija MgCl 2 je bila 1,5 mM, ter koncentracija začetnih oligonukleotidov je<br />
znašala 0,5µM.<br />
33
Slika 12: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka.<br />
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami ( od leve proti desni): 06/05/RH43,<br />
06/05/RH46, 07/05/RH3, 07/05/RH4, 08/05/RH3, 08/05/RH4, 100bp DNA. Slika 12<br />
je sestavljena iz dveh slik.<br />
COI smo uspešno pomnožili devetih vzorcih iz Črnega morja (08/05/RH27,<br />
08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G,<br />
08/05/RH K, 08/05/RH M). Rezultati pomnoževanja so prikazani na sliki 12. Jakost<br />
pomnoženih fragmentov je bila različna in verjetno odvisna od količine in kvalitete<br />
izolirane DNA. Pomnoževanje vzorcev 08/05/RH27, 08/05/RH D, 08/05/RH E,<br />
08/05/RH G je bilo zelo učinkovito in na gelu smo videli močno obarvane pomnožke<br />
DNA. V vzorcih 08/05/RH K, 08/05/RH M smo namnožili produkte, ki po velikosti ne<br />
ustrezajo velikosti COI in smo jih zato ovrednotili kot nespecifične produkte.<br />
Pogoji pomnoževanja COI so bili temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl 2<br />
je bila 1,5 mM ter koncentracija začetnih oligonukleotidov je znašala 0,5µM.<br />
34
Slika 13: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka.<br />
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 08/05/RH27,<br />
08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G,<br />
08/05/RH K, 08/05/RH M , velikostni standard 100bp DNA. Slika 13 je sestavljena iz<br />
dveh slik<br />
35
. COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 14) tudi v vzorcu 08/05/RH12. V vzorcih<br />
07/05/RH6, 08/05/RH C, 08/05/RH16, 08/05/RH15, 08/05/RH13,nam COI ni uspelo<br />
namnožiti.<br />
Slika 14: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka.<br />
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 07/05/RH6,<br />
08/05/RH C, 08/05/RH16, 08/05/RH15, 08/05/RH13, 08/05/RH12 ,velikostni<br />
standard 100bp DNA. Slika 14 je sestavljena iz več posameznih slik agaroznih<br />
gelov.<br />
36
COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 15) v vseh vzorcih: 12/06/RH2, 12/06/RH3,<br />
11/06/RH1, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5 (vzorci iz Koprskega zaliva). Na gelu<br />
smo videli, da je količina pomnožene DNA majhna. DNA, ki smo jo uporabili za<br />
matrično DNA, je bila slabe kvalitete in nizke koncentracije. Jakost pomnoženih<br />
fragmentov je nizka, količina in kvaliteta izolirane DNA slaba (glej Tabela 4). Pri<br />
vzorcih 12/06/RH1 ter 11/06/RH6 nam COI ni uspelo namnožiti.<br />
Slika 15: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz Koprskega<br />
zaliva.<br />
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 12/06/RH1,<br />
12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5,<br />
11/06/RH6, velikostni standard 100bp DNA.<br />
37
Pomnoževanje COI v naslednjih vzorcih iz Koprskega zaliva (11/06/RH5,<br />
11/06/RH6, 11/06/RH5 redčenje (1:10), 11/06/RH6 redčenje (1:10) in v vzorcih iz<br />
Črnega morja (08/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N,<br />
08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E,<br />
08/05/RH G) ni bilo uspešno. Rezultat pomnoževanja so nespecifični pomnožki, ki<br />
so na sliki vidni kot lise. Pogoji pomnoževanja so bili naslednji: temperatura<br />
naleganja 40º C, koncentraciji MgCl 2 1,5 mM in koncentracija začetnih<br />
oligonukleotidov 0,5µM.<br />
Slika 16: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka.<br />
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 11/06/RH5,<br />
11/06/RH6, 11/06/RH5 redčenje (1:10), 11/06/RH6 redčenje (1:10), 08/05/RH3,<br />
08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 08/05/RH27, 08/05/RH31,<br />
08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G, velikostni standard<br />
100bp DNA.<br />
COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 17) vzorcih: 07/05/RH3, 08/05/RH B,<br />
08/05/RH H, 08/05/RH N, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH K.<br />
Jakost pomnoženih fragmentov je bila različna in odvisna od količine in kvalitete<br />
izolirane DNA (glej Tabela 3). V ostalih vzorcih nismo uspeli pomnožiti COI. V<br />
vzorcih smo pomnožili tudi nespecifične produkte. COI smo pomnožili pri pogojih:<br />
temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl 2 1,5 mM, koncentracija začetnih<br />
oligonukleotidov 0,5 µM.<br />
38
Slika 17: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka<br />
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 07/05/RH3,<br />
08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 08/05/RH3, 08/05/RH4,<br />
08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E,<br />
08/05/RH G, 08/05/RH K, 06/05/RH40, 06/05/RH43, 06/05/RH45, velikostni<br />
standard 100bp DNA.<br />
39
Slika 18: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka<br />
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 11/06/RH7,<br />
11/06/RH1, 11/06/RH2, 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3,14/07/RH11,<br />
14/07/RH12, 14/07/RH14, 14/07/RH15, 14/07/RH16, 10/06/RH1/2, 10/06/RH2/1,<br />
10/06/RH3/1, 10/06/RH4/2, 10/06/RH6/2, 10/06/RH7/1, 10/06/RH8/1, 10/06/RH9/2,<br />
velikostni standard 100bp DNA.<br />
40
4.2.1. Reamplifikacija PCR<br />
Pri vzorcih pri katerih smo v prvem PCR pomnožili premalo količino DNA smo<br />
uporabili reamplifikacijo. To pomeni, da smo v PCR uporabili produkt prejšnjega<br />
PCR kot matrično DNA. V PCR smo dodali alikvot neprečiščenega PCR produkta<br />
5µl. Reamplifikacijo smo izvedli v vzorcih, ki se niso pomnožili v PCR z naslednjimi<br />
pogoji: temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl 2 1,5 mM, koncentracija<br />
začetnih oligonukleotidov 0,5 µM, smo poskušali ponovno namnožiti v PCR, v<br />
katerem smo kot matrično DNA uporabili PCR produkt, ne pa izolirano DNA. Slika<br />
19 prikazuje reamplifikacijo vzorcev iz PCR reakcije (glej sliko 15). Za<br />
reamplifikacijo smo uporabili naslednje vzorce: 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3,<br />
11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6. Z<br />
reamplifikacijo smo uspeli v vseh vzorcih pomnožiti COI, vendar so se poleg DNA<br />
namnožili še krajši nespecifični produkti.<br />
Slika 19: Reamplifikacija COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz Koprskega<br />
zaliva.<br />
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 12/06/RH1,<br />
12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5,<br />
11/06/RH6, velikostni standard 100bpDNA.<br />
Zaradi kratkoverižnih nespecifičnih produktov (Slika 19) je za nadaljno uporabo<br />
potrebno iz gela izolirati specifičen produkt. Tega v okviru diplomske naloge nismo<br />
opravili.<br />
41
4.2.2. Pomnoževanje COI pri višji temperaturi naleganja<br />
Ker smo iz nekaterih vzorcev pomnožili nespecifične produkte (temperatura<br />
naleganja začetnih oligonukleotidov je bila 40ºC), smo zvišali temperaturo naleganja<br />
začetnih oligonukleotidov na 50ºC, da bi zagotovili bolj specifično pomnoževanje.<br />
Spremenjen temperaturni profil za pomnoževanje COI s temperaturo naleganja<br />
začetnih oligonukleotidov 50ºC je bil :<br />
95ºC 3min<br />
94ºC 1min<br />
50ºC 90 sek 35 ciklov<br />
72ºC 1min<br />
72ºC 7min<br />
4ºC ∞<br />
S spremembo temperature prileganja (glej sliko 20), smo uspeli pomnožiti<br />
specifičen produkt COI v naslednjih vzorcih: 14/07/RH1, 14/07/RH3, 14/07/RH7,<br />
14/07/RH8. V PCR smo povečali še število enot Taq polimeraze z 1,25 U na 2,5 U.<br />
Za pozitivno kontrolo pomnoževanja smo uporabili DNA mesečinke (vzorec DNA<br />
06/05/PN5). Negativna kontrola je bila PCR reakcijo, v kateri smo namesto matrične<br />
DNA dodali sterilno destilirano vodo, ki smo jo uporabljali za PCR.<br />
Slika 20: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka.<br />
Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 14/07/RH1,<br />
14/07/RH3, 14/07/RH7, 14/07/RH8, 08/05/RH16 (stara red., redčitev 10:1),<br />
08/05/RH1 (nova red.redčitev 10:1), 11/06/RH6, pozitivna kotrola (mesečinka),<br />
negativna kontrola (H 2 O), velikostni standard 100bp DNA.<br />
42
COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 20) v vzorcih: 11/06/RH7, 11/06/RH1,<br />
11/06/RH2, 12/06/RH1, 12/06/RH2, 14/07/RH12, 10/06/RH1/2. Jakost pomnoženih<br />
fragmentov je bila različna in verjetno odvisna od količine in kvalitete izolirane DNA.<br />
V vzorcih 10/06/RH2/1, 10/06/RH3/1 in 10/06/RH4/2 smo poleg DNA pomnožili<br />
nespecifične produkte, ki so vidni kot razmaz na stezi. V ostalih desetih vzorcih nam<br />
COI ni uspelo namnožiti. COI smo pomnožili pri temperaturi naleganja 40º C,<br />
koncentracija in koncentracija MgCl 2 je bila 1,5 mM ter koncentracija začetnih<br />
oligonukleotidov je znašala 0,5 µM.<br />
4.3. Določevanje nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje)<br />
Nukleotidno zaporedje smo določili v desetih vzorcih (glej Tabelo 4). Za določevanje<br />
nukleotidnega zaporedja smo uporabili začetna oligonukleotida LCO 1490 in HCO 2198 .<br />
Vzorce, ki smo jim določili nukleotidna zaporedja, smo preimenovali. Novo ime je<br />
sestavljeno iz številke vzorca in zaporedne številke osebka v tem vzorcu. Najprej<br />
smo naročili določitev nukleotidnega zaporedja ene verige in nato še določitev<br />
nukleotidnega zaporedja druge verige. Za določanje nukleotidnega zaporedja smo<br />
pripravili 16 vzorcev (glej Tabela 5). Nukleotidna zaporedja smo pridobili iz 7<br />
vzorcev iz Črnega morja in iz dveh vzorcev iz Tržaškega zaliva. Iz 7 vzorcev nismo<br />
uspeli pridobiti nukleotidnega zaporedja zaradi premalo PCR produkta. Dolžina<br />
nukleotidnih zaporedij je bila od 660 bp do 680 bp in je ustrezala pričakovani<br />
velikosti COI.<br />
Tabela 5: Seznam vzorcev z določenim nukleotidnim zaporedjem<br />
MESTO<br />
VZORČENJA<br />
OZNAKA VZORCA NOVA OZNAKA<br />
VZORCA<br />
Črno Morje 08/05/RH27 0801 -<br />
Črno Morje 08/05/RH31 0802 -<br />
Črno Morje 08/05/RH33 0803 -<br />
Črno Morje 08/05/RH C 0804 -<br />
Črno Morje 08/05/RH D 0805 670<br />
Črno Morje 08/05/RH E 0806 -<br />
Črno Morje 08/05/RH G 0807 670<br />
Črno Morje 07/05/RH33 0703 660<br />
Črno Morje 08/05/RH16 0808 670<br />
Črno Morje 08/05/RH B 0809 670<br />
Črno Morje 08/05/RH H 0810 670<br />
Črno Morje 08/05/RH N 0811 670<br />
Koprski zaliv 14/07/RH4 1404 680<br />
Koprski zaliv 14/07/RH3 1403 670<br />
Koprski zaliv 14/07/RH2 1402 -<br />
Koprski zaliv 14/07/RH1 1401 -<br />
Legenda: - nukleotidnega zaporedja nismo uspeli določiti<br />
DOLŽINA<br />
NUKLEOTIDNEGA<br />
ZAPOREDJA<br />
(ŠT. BAZNIH PAROV)<br />
4.3.1. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v GenBank (algoritem Blast)<br />
Z algoritmom Blast smo poiskali podobna nukleotidna zaporedja s tistimi v<br />
podatkovni banki GenBank. Ugotovili smo, da nukleotidnih zaporedij COI iz velikega<br />
klobučnjaka ali iz rodu <strong>Rhizostoma</strong> ob času iskanja ni bilo v GenBank. Nukleotidna<br />
43
zaporedja iz velikega klobučnjaka so bila najbolj podobna zaporedjem iz mtDNA A.<br />
aurita (DQ787873.1).<br />
4.3.2. Poravnava nukleotidnih zaporedji s programom Clustal<br />
Poravnavo nukleotidnih zaporedij smo naredili v programu Clustal (glej prilogo B)<br />
in vanjo vključili osem nukleotidnih zaporedij iz velikega klobučnjaka, ki smo jih<br />
pridobili v okviru diplomske naloge (RH805, RH811, RH807, RH808, RH703,<br />
RH810, RH809, RH801). Poleg smo vključili še nukleotidno zaporedje N. nomurai<br />
(AB243426). V poravnanih nukleotidnih zaporedjih smo našli nekaj vrzeli, najdaljša<br />
vrzel je bila dva nukleotida. Vrzeli smo izrezali pred nadaljno obdelavo in nato<br />
nukleotidna zaporedja ročno poravnali na obeh skrajnih koncih. Poravnana<br />
nukleotidna zaporedja smo vnesli v program MEGA, kjer smo dodali nukleotidno<br />
zaporedje N. nomurai (dolgo 529bp) in jih še enkrat ročno poravnali. Poravnana<br />
nukleotidna zaporedja so bila dolga 659 baz.<br />
4.4. Filogeografska analiza<br />
Filogenetsko drevo smo narisali s programom MEGA (Kumar in sod., 2004). Za izris<br />
filogenetskega drevesa (slika 19) smo uporabili metodo združevanja najbližjega<br />
soseda (Neighbour-Joining (NJ)) in Kimurino-2 paramersko metodo, s katero smo<br />
izračunali parne razlike med posameznimi haplotipi. Našli smo 170 variabilnih mest,<br />
487 ohranjenih mest, 123 filogenetsko informativnih mest, na katerih temelji<br />
filogenetska analiza. Ohranjena mesta so identična v vseh nukleotidnih zaporedjih,<br />
medtem ko informativna mesta vsebujejo substitucije. Substitucije so mutacije, ki so<br />
se ohranile skozi naravni izbor. Substitucije označujejo spremembo baznega para<br />
na tretjem mestu v kodonu. Merilo ob filogenetskem drevesu prikazuje število<br />
substitucij. Za koreninjenje drevesa smo uporabili nukleotidno zaporedje N. nomurai<br />
(AB243426), ker je najbližji sorodnik velikega klobučnjaka z določenim nukleotidnim<br />
zaporedjem. Za statistično ovrednotenje vejišč smo uporabili metodo vezanja (ang.<br />
Bootstrap) in sicer 1000 ponovitev.<br />
44
11<br />
98<br />
RH805<br />
RH811<br />
RH807<br />
RH808<br />
RH703<br />
RH810<br />
RH809<br />
RH801<br />
99<br />
Črno morje<br />
Nemopilema<br />
nomurai(AB243426).<br />
RH1403<br />
RH1404<br />
Koprski<br />
zaliv<br />
0.05 substitucij<br />
Slika 21: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij velikega klobučnjaka iz Črnega<br />
morja in Koprskega zaliva. Merilo predstavlja število substitucij v analiziranih<br />
nukleotidnih zaporedjih.<br />
Filogenetska analiza narejena na nukleotidnih zaporedjih COI je pokazala, da<br />
nukleotidna zaporedja velikih klobučnjakov iz Črnega morja tvorijo svojo<br />
filogenetsko skupino, ki je jasno ločena od velikih klobučnjakov nabranih v<br />
Tržaškem zalivu. Ločitev obeh skupin podpirajo tudi rezultati metode vezanja.<br />
Visoke vrednosti (98%) podpirajo združevanje vzorcev iz Črnega morja v enotno<br />
skupino. Enako visoke vrednosti (99%) podpirajo združevanje vzorcev iz Koprskega<br />
zaliva v enotno skupino. Med analiziranimi osebki velikih klobučnjakov iz Črnega<br />
morja smo našli pet različnih haplotipov med osmimi osebki. Trije osebki (RH807,<br />
RH703, RH805, RH810) imajo enak haplotip. Izračunane vrednosti genetske<br />
razdalje z Kimurino-2 paramersko metodo so enake 0 in pomenijo, da med<br />
nukleotidnimi zaporedji ni razlik. Kimurina-2-parameterska metoda pri izračunu<br />
upošteva obe možni vrsti substitucij (tranzicije in transverzije) in da v danem<br />
nukleotidnem zaporedju ni razlik v pogostosti substitucij. Majhno odstopanje smo<br />
opazili pri vzorcu RH811, ki pa ni statistično podprto z metodo vezanja (11%). Vse<br />
vrednosti metode vezanja, ki so pod mejo 50%, so statistično neznačilne.<br />
Izračunane genetske razdalje med vzorci nabranimi v Tržaškem zalivu in Črnem<br />
morju so večje in znašajo od 0,2279 do 0,2306.<br />
Ugotovitve pridobljene s filogenetsko analizo lahko verjetno navežemo na življenjski<br />
cikel in način razmnoževanja velikega klobučnjaka. Nespolno razmnoževanje<br />
velikega klobučnjaka poteka s strobilacijo polipa. Do sedaj je bila opazovana<br />
strobilacija samo pri vrsti R. octopus v laboratoriju (Holst in sod., 2007). Prav tako<br />
nimamo podatkov o sposobnosti razširjanja meduz velikega klobučnjaka. Glede na<br />
veliko geografsko oddaljenost med vzorčenima populacijama lahko sklepamo, da je<br />
genski pretok med njima omejen. Omejujejo ga pa tudi kratka življenjska doba<br />
meduze in geografske bariere, ki so med sevenim Jadranskim morjem in vzorčenim<br />
mestom v Črnem morju. Na osnovi nukleotidnih zaporedij iz COI je možno<br />
razlikovanje na nivoju vrst kakor tudi na nižjih nivojih zaradi zadostne variabilnosti v<br />
nukleotidnih zaporedjih COI (Hebert in Gregory, 2005). Uspešno uporabo takega<br />
pristopa pa predstavlja tudi podatkovna zbirka BOLD (Ratnasingham in Hebert,<br />
45
2007). Do sedaj se je izkazalo, da je variabilnost znotraj COI majhna edinole pri<br />
koralnjakih (Anthozoa), medtem ko je variabilnost pri klobučnjakih primerljiva z<br />
drugimi skupinami večceličnih živali (Huang in sod., 2008). Pri uhatem klobučnjaku<br />
(ki je še vedno opredeljen kot kozmopolitska vrsta) je medvrstna divergenca v<br />
razponu od 13-odstotkov do 24-odstotkov (Dawson in Jacobs, 2001). Podoben<br />
razpon divergence so izračunali tudi med domnevnima vrstama Cyanea capillata<br />
(Dawson, 2005) in Cassiopea (Holland in sod., 2004). Divergenca, ki smo jo<br />
izračunali med nukleotidnimi zaporedji iz osebkov velikega klobučnjaka iz<br />
Jadranskega morja in Črnega morja, je v podobnem razponu in znaša 18,5<br />
odstotkov. Glede na pridobljene rezultate menimo, da je možno uporabiti<br />
nukleotidna zaporedja iz COI velikega klobučnjaka za razlikovanje geografsko<br />
oddaljenih populacij.<br />
46
5. ZAKLJUČKI<br />
Od leta 2003 so v Tržaškem zalivu zabeležili masovno pojavljanje nekaterih<br />
klobučnjaških meduz, kot so veliki klobučnjak (<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>), uhati klobučnjak<br />
(Aurelia aurita), medtem ko je masovno pojavljanje mesečinke (Pelagia noctiluca) že<br />
znan pojav. Razlogi za množično pojavljanje različnih vrst klobučnjaških meduz, ki<br />
so običajno prisotne v majhnem številu, še niso znani. Raziskovalci navajajo<br />
različne vzroke povezane z antropogenimi vplivi (evtrofikacija, hipoksija povezana z<br />
evtrofikacijo, klimatske spremembe, porušeno prehranjevalno verigo v morjih zaradi<br />
prelova nekaterih vrst rib), ki naj bi povzročili masovna pojavljanja.<br />
V teku diplomske naloge smo opravili vzorčenje s plovilom Sagita. Pri vzorčenju<br />
smo morali biti pozorni predvsem na to, da vzorca nismo kontaminirali ter da smo<br />
vzorce pravilno označili in shranili. Vzorce smo shranili v epicah s konzervansom, da<br />
smo tkivo zavarovali pred razgradnjo.<br />
Iz 36 osebkov smo izolirali DNA s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN), ki<br />
se je izkazala kot zelo učinkovita in preprosta metoda. DNA nam je uspelo izolirati iz<br />
večine vzorcev. Količina in kvaliteta izolirane DNA je bila odvisna od časa<br />
shranjevanja vzorcev v konzervansu. Daljši čas shranjevanja je pomenil večjo<br />
razgradnjo DNA v shranjenem tkivu. Tkivo je potrebno shranjevati na zelo nizkih<br />
temperaturah čim krajši čas. Količina izolirane DNA v vzorcih je v razponu od<br />
4100ng/µl do 3,07 ng/µl.<br />
Cilj diplomskega dela je bil proučiti genetsko diverziteto velikega klobučnjaka. Za<br />
raziskovanje diverzitete smo uporabili genetski marker citokrom oksidazo C<br />
podenoto I (COI). Najprej smo optimizirali pomnoževanje genetskih markerjev s<br />
PCR in nato pridobili njihova nukleotidna zaporedja.<br />
Z reakcijo PCR smo pomnoževali zapis za encim COI s parom začetnih<br />
oligonukleotidov LCO 1490 in HCO 2198 (Folmer in sod., 1994 ). Izkazalo se je, da<br />
univerzalni oligonukleotidi omogočajo pomnoževanje tudi na velikem klobučnjaku<br />
(<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>), saj nam je uspelo pomnožiti specifičen PCR produkt v zadostni<br />
količini za nadaljne postopke. PCR reakcija je bila uspešna v 27 odstotkih (16<br />
osebkov).<br />
Nukleotidna zaporedja smo določili 8 osebkom iz Črnega morja, ki so si med seboj<br />
zelo podobna in 2 osebkoma iz Koprskega zaliva. Vzorci iz Črnega morja tvorijo<br />
svojo, ločeno filogenetsko skupino od vzorcev iz Tržaškega zaliva. Izračunane<br />
filogenetske razdalje med posameznimi nukleotidnimi zaporedji v vzorcih iz Črnega<br />
morja kažejo, da so si ti vzorci zelo podobni (izračunane vrednosti z Kimura -2<br />
paramersko metodo so enake 0). Mnogo večje so izračunane genetske razdalje<br />
med nukleotidnimi zaporedji iz vzorcev iz Tržaškega zaliva v primerjavi z vzorci iz<br />
Črnega morja(od 0,2279 do 0,2306).<br />
47
6. VIRI<br />
Arai, M. N. 1997. A Functional Biology of Scyphozoa. Chapman and Hall, London,<br />
68-206.<br />
Arai M.N., 2001a. Pelagic coelenterates and eutrophication: a review, Kluwer<br />
Academic publishers, Hydrobiologia 451: 69-87.<br />
Arai M.N., 2001b. Predation on pelagic coelenterates: a review. J. Mar Biol. Assoc.<br />
UK 85: 523- 536.<br />
Beagley, C.T., Okada, N.A., Wolstenholme, D.R., 1996. Two mitochondrial group I<br />
introns in a metazoan, the sea anemone Metridium senile: one intron contains<br />
genes for subunits 1 and 3 of NADH dehydrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.<br />
93, 5619–5623.<br />
Beaton, M.J., Roger, A.J., Cavalier-Smith, T., 1998. Sequence analysis of the<br />
mitochondrial genome of Sarcophyton glaucum: conserved gene order among<br />
octocorals. J. Mol. Evol. 47, 697–708.<br />
Bodlaj, J. 2001. Metoda PCR/Polymerase Chain Reaction. Seminar. MF, Ljubljana.<br />
Bridge, D., Cunningham, C.W., DeSalle, R., Buss, L.W., 1995. Class-level<br />
relationships in the phylum Cnidaria: molecular and morphological evidence. Mol.<br />
Biol. Evol. 12, 679–689.<br />
Cheng J.H., Ding F.Y., Li S.F., Yan L.P., Ling J.Z., Li J.S., 2005. A study on the<br />
quantity distribution of macro-jellyfish and its relationship to seawater temperature<br />
and salinity in the East China Sea Region. Ecol Sin 25: 440- 455.<br />
Chevalier, B.S., Stoddard, B.L., 2001. Homing endonucleases: structural and<br />
functional insight into the catalysts of intron/intein mobility. Nucleic Acids Res. 29,<br />
3757–3774.<br />
Collins, A.G., 2002. Phylogeny of Medusozoa and the evolution of cnidarian life<br />
cycles. J. Evol. Biol. 15, 418–432.<br />
Collins A.G., Schuchert P., Marques A.C., Jankowski T., Medina M. and<br />
Schierwater B., 2006. Medusozoan Phylogeny and Character Evolution Clarified by<br />
New Large and Small Subunit rDNA Data and an Assessment of the Utility of<br />
Phylogenetic Mixture Models. Syst. Biol. 55(1):97–115, 2006.<br />
Daryanabard R., Dawson M.N. (in press). Jellyfish blooms: Crambionella orsini (<br />
Scyphozoa, Rhizostomeae) in the Gulf of Oman, Iran 2008. J. Mar. Biol. Assoc UK.<br />
Daskalov G.M., Grishin A.N., Rodionov s., Mihneva V., 2007. Trophic cascades<br />
triggered by overfishing reveal possible mechanisms of ecosystem regime shift.<br />
Proc. Natl. Acad. Sci USA 104: 10518- 10523.<br />
Dawson, M.N, Jacobs D.K., 2001. Molecular evidence for cryptic species of Aurelia<br />
aurita (Cnidaria, Scyphozoa). Biol. Bull. 200: 92-96.<br />
48
Dawson M.N., 2003. Macro-morphological variation among cryptic species of the<br />
moon jellyfish, Aurelia (Cnidaria: Scyphozoa),. Mar. Biol. 143:369-379. Erratum:<br />
Mar. Biol. 144:203.<br />
Dawson M.N., Gupta A.S., England M.H., 2005. Coupled biophysical global ocean<br />
model and molecular genetic analyses identify multiple introductions of cryptogenic<br />
species, PNAS, Vol. 102, No 34: 11968–11973.<br />
Dawson M.N., 2005 . Cyanea capillata is not a cosmopolitan jellyfish: morphological<br />
and molecular evidence for C. annaskala and C. rosea<br />
(Scyphozoa:Semaeostomeae:Cyanidae) in south-eastern Australia. Invertbr Syst<br />
19:361-370.<br />
Drobnič K., 2007. Ugotavljanje identitete posameznika z uporabo genetskih<br />
informacij, metode verižne reakcije s polimerazo in računalniško podprte tehnologije.<br />
Erpenbeck D, Parra-Velandia FJ, Breeuwer JAJ, Van Soest R.W.M.,2005.<br />
Speculation with spiculation? – Three independent gene fragments and biochemical<br />
characters versus morphology in demosponge higher classification. Molecular<br />
Phylogenetics and Evolution , in press. doi: 10.1016/j.ympev.2005.11.001.<br />
Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., and Vrijenhoek R.,1994. DNA primers for<br />
amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan<br />
invertebrates, Molecular Marine Biology and Biotechnology 3 (5): 294-299.<br />
Gilbert P.M., Seitzinger S., Heil C.A., Burkholder J.M., Parrow M.W., Codispoti L.A.,<br />
Kelly V., 2005. The role of eutrophication in the global proliferation of harmful algal<br />
blooms: new perspectives and new approaches. Oceanography 18: 198- 209.<br />
Gorički Š., 2004. Ugotavljane genetske strukture diferenciacije močerila (Proteus<br />
anguinus) z analizo zaporedji mitohondrijske DNA. Magistrsko delo, <strong>Univerza</strong> v<br />
Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo.<br />
Goy J., Morand P.,Etienne M. 1989. Long term fluctuations of Pelagia noctiluca (<br />
Cnidaria, Scyphomedusa) in the western Mediterranian Sea. Prediction by climatic<br />
variables. Deep-Sea Research, Vol. 36, No .2, 269-279.<br />
Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and<br />
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.<br />
Hebert, P.N.D. and T.R.Gregory., 2005. The promise of DNA barcoding for<br />
taxonomy. Systematic Biology;54 (5):852-859.<br />
Higgins D.G., Sharp P.M., 1988. CLUSTAL: a package for performing multiple<br />
sequence alignment on a microcomputer. Gene, Vol. 73, Issue 1, 237-244.<br />
Hillis D.M., Moritz C.,1996. Maple Molecular Systematics, 2nd edition., Sinauer<br />
Press.<br />
Hillis D:M, Dixon M.T., 1991. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic<br />
interference. Quarterly Review of Biology 66: 411-453.<br />
49
Holland S., Dawson M.N., Crow G.L., Hofmann D.K. 2004. Global phylogeography<br />
of Cassiopea (Scyphozoa:Rhizostomeae): molecular evidence for cryptic species<br />
and multiple invasions of the Hawaiian Islands. Mar Biol 145:1119-1128.<br />
Holst S., Jarms G., 2006. Substrate choice and settlementpreferences of planula<br />
larvae of five Scyphozoa (Cnidaria)from German Bight, North Sea. Mar Biol. DOI:<br />
10.1007/s00227-006-0530-y.<br />
Howarth R.W., Sharpley A., Walker D., 2002. Sources of nutrient pollution to coastal<br />
waters in the United States: implication for achieving coastal water quality goals.<br />
Estuaries 25: 656- 676.<br />
Hyman, L. H. 1940. The invertebrates. Volume 1. Protozoa through Ctenophora.<br />
McGraw-Hill, New York.<br />
Huang D., Meier R., Todd P.A., Chou L.M., 2008. Slow Mitochondrial COI Sequence<br />
Evolution at the Base of the Metazoan Tree and Its Implications for DNA Barcoding.<br />
J. Mol. Evol. 66:167-174.<br />
Ishii H., 2006. Adaptation to coastal environmental changes in the polyp stage in<br />
relation to jellyfish blooms in Tokyo Bay. PICES XV, Yokohama, Japan, 13 Oct.<br />
2006, Abstract S2- 3117.<br />
Jackson J.B.C., Kirby M.X., Berger W.H., Bjorndal K.A., Botsford L.W., Bourque<br />
B.J., Bradbury R.H., Cooke R., Erlandson J., Estes J.A., Hughes T.P., Kidwell S.,<br />
Lange C.B., Lenihan H.S., Pandolfi J.M., Peterson C.H., Steneck R.S., Tegner M.J.,<br />
Warner R.R., 2001. Historical overfishing and the recent collapse of coastal<br />
ecosystems. Science 293: 629- 638.<br />
Johnston B.D., Irvine H., Sötje I., Pierce G.J., Secombes C.J., 2005. Ecological<br />
toxicology and effects of mass occurrences of gelatinous zooplankton on teleosts in<br />
enclosed coastal ecosystems. Am. Soc. Limnol. Oceanogr. Meet, June 2005,<br />
Abstract.<br />
Kimura, M, 1980 A simple method for estimating evolutionary rate of base<br />
substitutions through comparative studies of nucleotide sequencies. Journal of<br />
Molecular Evolution, 16: 111-120.<br />
Kramp P.L. 1961. Synopsis of the medusae of the World. J. Mar. Biol. Assoc. UK<br />
40.<br />
Kumar S, Tamura K, Nei M., 2004. Mega 3: integrated software for molecular<br />
evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics 5<br />
, 150–163.<br />
Lotan A., Ben- Hiller R., Loya Y., 1993. Aggregation and dispersal of Rhopilema<br />
nomadica, a tropical immigrant medusa in the Mediterranean Sea. Isr J. Zool. 39:<br />
67-68.<br />
Lucas, C. H., 2001. Reproduction and life history strategies of the common jellyfish,<br />
Aurelia aurita, in relation to its ambient environment. Hydrobiologia 451 (Dev.<br />
Hydrobiol. 155): 229–246.<br />
50
Lynam C.P., Gibbons M.J., Axelsen B.E., Sparks C.A.J., Coetzee J., Heywood B.G.,<br />
Brierley A.S., 2006. Jellyfish overtake fish in heavily fished ecosystem. Curr. Biol. 16<br />
(13): R492- R493.<br />
Malej A., 1982. Unusual occurance of Pelagia noctiluca in the Adriatic. Aota Adriat.,<br />
let. 23, št1/2, str. 97- 102.<br />
Mayer A.G. 1910. Medusae of the World, III: the Scyphomedusae. Carnegie<br />
Institute, Washington.<br />
Marques, A. C., and. Collins A. G., 2004. Cladistic analysis of Medusozoa and<br />
cnidarian evolution. Invert. Biol. 123:23–42.<br />
Mianzan H. & Cornelius P.F.S., 1999. Cubomedusae and Scyphomedusae. In:<br />
South Atlantic Zooplankton (D. Boltovskoy ed.), BACKHUYS Publishers, Leiden<br />
(The Netherlands): 513-559.<br />
Mills, C. E., 1995. Medusae, siphonophores and ctenophores as planktivorous<br />
predators in changing global ecosystems. ICES J. mar. Sci. 52: 575–581.<br />
Mills C.E., 2001. Jellyfish blooms: are populations increasing globally in response to<br />
changing ocean conditions?, Kluwer Academic publishers, Hydrobiologia 451: 55-<br />
68.<br />
Molinero J.C., Ibanez F., Nival P., Buecher E., Sopissi S., 2005. North Atlantic<br />
climate and northwestern Mediterranean plankton variability. Limnol. Oceanogr. 50:<br />
1213- 1220.<br />
Pérez- Ruzafa A., Gilabert J., Gutiérrez J.M., Fernández A.I., Marcos C., Sabah S.,<br />
2002. Evidence of a planktonic food web response to changes in nutrient input<br />
dynamics in the Mar Menor coastal lagoon, Spain. Hydrobiologia 475/476: 359- 369.<br />
Plantan M,.2008. Optimizacija mikrosatelitnih lokusov pri morskem klobuku<br />
(<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>) : diplomsko delo : univerzitetni študij . Optimization of<br />
microsatellite loci in barrel jellyfish (<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>). Graduation thesis :<br />
university studies. Ljubljana: [M. Plantan], 2008. X, 48 f., ilustr., graf. prikazi, pril. +<br />
CD. [COBISS.SI-ID 1878351].<br />
Polz M.F. and Cavanaugh C.M., 1998. Bias in Template-to-Product Ratios in<br />
Multitemplate PCR. Applied and Environmental Microbiology, October 1998, , Vol.<br />
64, No. 10, p. 3724-3730.<br />
Pont-Kingdon, G., Okada N.A., Macfarlane J.L., Beagley C.T., Watkins-Sims C:D.,<br />
Cavalier-Smith T., Clarck-Walker G., Wolstenholme R. , 1998. Mitochondrial DNA of<br />
the coral Sarcophyton glaucum contains a gene for a homologue of bacterial MutS:<br />
a possible case of gene transfer from the nucleus to the mitochondrion. J. Mol. Evol.<br />
46, 419–431.<br />
Pont-Kingdon, G.A., Okada N.A., Macfarlane J.L., Beagley C.T., Wolstenholme<br />
R:D., Cavalier-Smith T., Clarck-Walker G.B, 1995. A coral mitochondrial mutS gene.<br />
Nature 375, 109–111.<br />
Purcell J. E., White J. R., Nemazie D. A. & Wright D. A., 1999. Temperature, salinity<br />
and food effects on asexual reproduction and abundance of the scyphozoan<br />
Chrysaora quinquecirrha. Mar. Ecol. Prog. Ser. 180: 187–196.<br />
51
Purcell J.E. & Arai M.N, 2001. Interactions of pelagic cnidarians and ctenophores<br />
with fish: a review, Kluwer Academic publishers, Hydrobiologia 451: 27-44.<br />
Purcell J.E. 2005. Climate effects on formation of jellyfish and ctenophore blooms: a<br />
review. Journal of the Marine Biological Association of United Kingdom 85:461-476.<br />
Purcell J.E., Decker M.B., 2005. Effects of climate on relative predation by<br />
scyphomedusae and ctenophores on copepods in Cheasapeake Bay during 1987-<br />
2000. Limnol. Oceanogr. 50: 376- 387.<br />
Purcell J.E., Uye S.I, Lo W.T, 2007. Antropogenic causes of jellyfish blooms and<br />
their direct consequences of humans: a review, Marine ecology progress series,<br />
Vol.350: 153-174.<br />
Ratnasingham and P.D.N., Hebert. 2007. BOLD:The Barcode of Life Data System<br />
(www.barcodinglife.org), Molecular Ecology Notes7,355-364.<br />
Roe B.A., Crabtree J.S., Khan, A., 1996. Methods for DNA Isolation. S. 42 do 72. V:<br />
DNA isolation and Sequencing. John Wiley & Sons.<br />
Russell F.S. ,1970. The medusae of the British Isles II. Pelagic Scyphozoa with a<br />
supplement to the first volume on hydromedusae. Cambridge University Press,<br />
Cambridge.<br />
Shao Z., Graf S., Chaga O.Y., Lavrov D.V., 2006. Mitochondrial genome of the<br />
moon jelly Aurelia aurita (Cindaria, Scyphozoa): A linear DNA molecule encoding a<br />
putative DNA- de.<br />
Sommer U., Stibor H., Katechakis A., Sommer F., Hansen T., 2002. Pelagic food<br />
web configurations at different levels of nutrient richness and their implications for<br />
the ratio fish production: primary production. Hydrobiologia 484: 11- 20.<br />
Stiasny D.G., 1922. Ein neues System der Rhizostomeen. Verhandlungen der<br />
Deutschen Zoologischen Gesellschaft E. V. 27:84–85.<br />
Suzuki, M., and S. J. Giovannoni. 1996. Bias caused by template annealing in the<br />
amplification of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62:625-630.<br />
Thiel, H. 1966. The evolution of the Scyphozoa, a review. Pages 77–117 in Cnidaria<br />
and their Evolution (W. J. Rees, ed.). Academic Press, London.<br />
Thiel M.E., 1970. U¨ ber den zweifachen stammesgeschichtlichen (‘‘biphyletischen’’)<br />
Ursprung der <strong>Rhizostoma</strong>e (Scyphomedusae) und ihre Aufteilung in die zwei neuen<br />
Ordnungen Cepheida und Rhizostomida. Abh. Verh. naturwiss Ver. Hamburg NF<br />
14:145–168.<br />
Uye S., Ueta Y., 2004. Recent increase of jellyfish populations and their nuisance to<br />
fisheries in the Inland Sea of Japan. Bull. Jpn. Soc. Fish Oceanogr. 68:9- 19 (in<br />
Japanese with English abstract).<br />
- http://images.suite101.com/131037_cnidariamedusaandpolyp.<br />
52
PRILOGE<br />
53
Priloga A: Nukleotidna zaporedja v fasta formatu<br />
>0703 Črno morje<br />
tttaaacttccagggtgaccaaaaaatcaaaaymratagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtc<br />
aaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaa<br />
taataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatatt<br />
taaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccata<br />
tctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttc<br />
tataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaag<br />
gccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaa<br />
aagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctggg<br />
cctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaatatawtaaktat<br />
agtgttccaatatcttttgatttgggtgaaccaaaaaa<br />
>0805 Črno morje<br />
tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcaaamyrwatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggt<br />
caaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaaca<br />
ataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcata<br />
tttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggcca<br />
tatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgt<br />
tctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaa<br />
aggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacga<br />
aaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgg<br />
gcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaatattaaktat<br />
anngtgttccaatatctttatgaantgggtgaaccaaaa<br />
>0808 Črno morje<br />
tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcaaaataaakgtataggwrkatgtattggatctcctcccccagcaggg<br />
tcaaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaac<br />
aataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcat<br />
atttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggcc<br />
atatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttg<br />
ttctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaa<br />
aggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacga<br />
aaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgg<br />
gcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccacymkggcggaaaaagcaccaaatattaagtt<br />
attagtgttccaatatctttatagttggnntggaaccaaaa<br />
>0810 Črno morje<br />
tttaaactttcagggtgaccaaaaaatcaaaataatatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtca<br />
aagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaat<br />
aataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatattt<br />
aaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatat<br />
ctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttct<br />
ataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaag<br />
gccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaa<br />
aagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctggg<br />
cctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaattawtaakw<br />
awagtgttccaatatctttatagtgggngtgaaccaaannnaa<br />
>0801Črno morje
tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcaaaataaatgttggtattrtrgatatttggatctcctcccccagcagggt<br />
caaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaaca<br />
ataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcata<br />
tttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggcca<br />
tatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgt<br />
tctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaa<br />
aggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacga<br />
aaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgg<br />
gcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaaatawtatrg<br />
tatagtgttccaatatctttatgaatggggtgaccaaaa<br />
>0807 Črno morje<br />
tttaaacttttncaggtgaccaaaaaatcaaaaymwatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggt<br />
caaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaaca<br />
ataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcata<br />
tttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggcca<br />
tatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgt<br />
tctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaa<br />
aggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacga<br />
aaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgg<br />
gcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaattawtwag<br />
tawangtgttccaatatctttatgaatgggngtgaacaaaa<br />
>0809 Črno morje<br />
tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcarrmyawatgttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtca<br />
aagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaat<br />
aataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatattt<br />
aaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatat<br />
ctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttct<br />
ataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaag<br />
gccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaa<br />
aagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctggg<br />
cctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaatatawtaagtat<br />
tagtgttccaatatctttatgaatgggttgacccaaaanaa<br />
>0811 Črno morje<br />
tttaaacttcagggtgaccaaaaaatcaaarkawatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtca<br />
aagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaat<br />
aataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatattt<br />
aaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatat<br />
ctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttct<br />
ataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaatagtcagaaactgatattgttaagccttggaaag<br />
gccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaa<br />
aagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctggg<br />
cctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaatattaagtaatt<br />
wgtgttccaatatctttatgattggcgtgaaccaaannnaa<br />
>1404 Koprski zaliv<br />
ggagggatgagggggtaggagggaggggagggtgggagagaggataggggagagagagagttaagggg<br />
aggggggtagaaagtagggtgattaggtaaaaaggagggggggaggatggtaaagtggaatggaaggggg
gaggggggggggtggttaaacttcagggtgaccaaaaaatcaaaacaaatgytkaccamtgagaatactatg<br />
gatstcctmctmccgctaggrtcgaagarasmagtattaaaatttctatctgtaagtagcattgtaatagcccca<br />
gctaaaacaggtaaggacaataacaataatattgctgtgactagaacagaccatacaaacaaaggaattttatcta<br />
tagtcataccgggagccctcatattcaagatagtagtaatgaaattaatagctcccattatagaggaagctcctgct<br />
aagtgtaaactgaagatggccatatccacagaacctcctgaatgggcctggatcgaacttagaggaggataaat<br />
tgtccaacctgttcccgcaccttgttctacaagagaagaacctagcaatagtagtagtgcaggaggaagtaatca<br />
aaaactaatattattcaaccttgggaaggccatgtctggtgcccctatatataaaggaactaaccagtttccaaaac<br />
ctcctatcaacactggcataacaaagaaaaatatcataatcaatgcgtgggckgtcactacaacattatatagttg<br />
atcatcacccaacatggatcctggaccagataattctaatcttataatcatwytgaaatgcagttcctaymatagc<br />
ggaraaggctccatcatatatyataatatagtgttccaatatctttatgatgttgttgaccaaaa<br />
>1403 Koprski zaliv<br />
ggatttgagaaaggtgggagggaggtggggagtggtgaggtttagagagagagagtggaaggggaggggg<br />
gagagaggggaagaaagagagttgggggataatagaggggggattaatgatcagttatgttgtgggcttataa<br />
gtttttaaacttgggggtgaccaaaaaatcaaaacaaaggytkacccaatagagaaaatwggatstccymctc<br />
ycgckrggrtcgrakarasmagtattaaaatttctatctgtaagtagcattgtaatagccccagctaaaacaggta<br />
aggacaataacaataatatkgctgtgactagaacagrccatacaaacaaaggaattttatccatagtcataccgg<br />
gagccctcatattcaagatagtagtaatgaaattaatagctcccattatagaggaagctcctgctaagtgtaaactg<br />
aagatggccatatccacagaacctcctgaatgggcctggatcgaacttagaggaggataaattgtccaacctgtt<br />
cccgcmccttgttctacaagagaagaacctagcaatagtagtagtgcaggaggaagtaatcaaaaactaatatt<br />
atttaaccttgggaaggccatgtctggtgcccctatatataaaggaactaaccagtttccaaaacctcctatcaaca<br />
ckggcatamcaaagaaaaatatcataatcaatgsgtgggctgtcactacaacattatatagttgatcatcaccca<br />
acakggatcctggaccaagakratctctaatgcttataatcataytkaaattgcagytcstmtmakagsggaaa<br />
aggctccacaataywaaawactwgtgttccaatatctttatgattggttgaccaaa
Priloga B: Poravnava nukleotidnih zaporedji s programom Clustal
Priloga C: Izračun genetskih razdalij med posameznimi nukleotidnimi<br />
zaporedji v programu MEGA
Priloga D: Podobnost med nukleotidnim zaporedjem COI iz velikega<br />
klobučnjaka (<strong>Rhizostoma</strong> <strong>pulmo</strong>) in COI iz uhatega klobučnjaka (Aurelia<br />
aurita)<br />
Poizvedba narejena v GenBank dne 17. 6. 2008.<br />
> gb|DQ787873.1| Aurelia aurita mitochondrion, complete genome<br />
Length=16937<br />
Score = 1205 bits (652), Expect = 0.0<br />
Identities = 654/655 (99%), Gaps = 0/655 (0%)<br />
Strand=Plus/Plus<br />
Query 1<br />
ACTATACTTAATATTTGGTGCTTTTTCCGCCATGGTGGGAACTGCCTTCAGTATGATTAT 60<br />
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 11964<br />
ACTATACTTAATATTTGGTGCTTTTTCCGCCATGGTGGGAACTGCCTTCAGTATGATTAT 12023<br />
Query 61<br />
AAGACTGGAACTATCAGGCCCAGGATCCATGTTGGGGGACGATCAACTATATAACGTTGT 120<br />
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 12024<br />
AAGACTGGAACTATCAGGCCCAGGATCCATGTTGGGGGACGATCAACTATATAACGTTGT 12083<br />
Query 121<br />
AGTGACCGCTCATGCTCTTATAATGATTTTCTTTTTCGTAATGCCCGTTTTGATAGGGGG 180<br />
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 12084<br />
AGTGACCGCTCATGCTCTTATAATGATTTTCTTTTTCGTAATGCCCGTTTTGATAGGGGG 12143<br />
Query 181<br />
ATTTGGAAACTGGCTAGTTCCCCTATATATAGGAGCTCCAGATATGGCCTTTCCAAGGCT 240<br />
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 12144<br />
ATTTGGAAACTGGCTAGTTCCCCTATATATAGGAGCTCCAGATATGGCCTTTCCAAGGCT 12203<br />
Query 241<br />
TAACAATATCAGTTTCTGATTATTACCTCCAGCTTTATTACTATTATTAGGGTCTTCCCT 300<br />
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 12204<br />
TAACAATATCAGTTTCTGATTATTACCTCCAGCTTTATTACTATTATTAGGGTCTTCCCT 12263<br />
Query 301<br />
TATAGAACAAGGAGCAGGTACTGGTTGAACCATTTACCCTCCTTTAAGTTCAATACAAGC 360<br />
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 12264<br />
TATAGAACAAGGAGCAGGTACTGGTTGAACCATTTACCCTCCTTTAAGTTCAATACAAGC 12323<br />
Query 361<br />
TCATTCTGGGGGTTCAGTAGATATGGCCATATTTAGTCTTCATTTAGCAGGAGCTTCCTC 420<br />
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 12324<br />
TCATTCTGGGGGTTCAGTAGATATGGCCATATTTAGTCTTCATTTAGCAGGAGCTTCCTC 12383
Query 421<br />
TATTATGGGTGCTATTAACTTTATTACCACTATTTTAAATATGAGAGCCCCTGGTATGAC 480<br />
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 12384<br />
TATTATGGGTGCTATTAACTTTATTACCACTATTTTAAATATGAGAGCCCCTGGTATGAC 12443<br />
Query 481<br />
CATGGATAGAATACCTTTATTCGTATGATCTGTATTAGTTACTGCAATCTTATTATTGTT 540<br />
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 12444<br />
CATGGATAGAATACCTTTATTCGTATGATCTGTATTAGTTACTGCAATCTTATTATTGTT 12503<br />
Query 541<br />
GTCCTTACCCGTATTAGCTGGGGCAATTACCATGTTGTTGACTGATAGAAATTTCAACAC 600<br />
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 12504<br />
GTCCTTACCCGTATTAGCTGGGGCAATTACCATGTTGTTGACTGATAGAAATTTCAACAC 12563<br />
Query 601<br />
ATCCTTCTTTGACCCTGCTGGGGGAGGAGATCCAATACTATTCCAACATTTATTT 655<br />
|||||||||||||||||||||<br />
|||||||||||||||||||||||||||||||||<br />
Sbjct 12564<br />
ATCCTTCTTTGACCCTGCTGGAGGAGGAGATCCAATACTATTCCAACATTTATTT 12618