Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici

UNIVERZA V NOVI GORICI 

FAKULTETA ZA ZNANOSTI O OKOLJU 

RAZISKOVANJE GENETSKE DIVERZITETE 

VELIKEGA KLOBUČNJAKA (Rhizostoma pulmo) Z 

ORODJI MOLEKULARNE TAKSONOMIJE 

DIPLOMSKO DELO 

Kristina Turk 

Mentorica: doc. dr. Andreja Ramšak 

Nova Gorica, 2009

ZAHVALA 

Zahvaljujem se prof. dr. Alenki Malej, Katji Stopar, Almi Hvala ter drugim zaposlenim 

na Morski biološki postaji v Piranu, ki so mi pomagali pri laboratorijskem in 

terenskem delu, ter mi omogočili dostop do potrebnih podatkov. 

Iskreno se zahvaljujem vsem prijateljem, zlasti Manici Kodrič, Svetlani Kodrič in 

Jasni Besednjak ter Lei Bric za njihovo pomoč in podporo pri pisanju diplomske 

naloge. Posebna zahvala gre moji družini, ki mi je omogočila študij in potrpežljivo 

čakala na ta trenutek. 

Posebej se zahvaljujem mentorici doc. dr. Andreji Ramšak za svetovanje in 

usmerjanje ter hitre odgovore, ko sem jih potrebovala. 

I

POVZETEK 

Meduze velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo) se pojavljajo skozi vse leto, a v 

zelo majhnem številu. V zadnjih letih je bilo v Tržaškem zalivu zabeleženih več 

množičnih pojavljanj velikega klobučnjaka v zimskem obdobju. Poleg te vrste so se 

množično pojavljale še druge klobučnjaške meduze kot so uhati klobučnjak (Aurelia 

aurita), v poletnih mesecih pa mesečinka (Pelagia noctiluca). Poznamo več 

dejavnikov, ki naj bi vplivali na njihovo množično pojavljanje, med katerimi so 

nekateri posledica človekove dejavnosti, nekatera nihanja v številčnosti pa so 

naravna nihanja. 

V diplomskem delu smo želeli raziskati filogenetsko povezanost meduz velikega 

klobučnjaka iz severnega Jadrana in Črnega morja. Filogenetsko povezanost smo 

raziskovali z analizo nukleotidnih zaporedij v genu za citokrom c oksidazo (COI), ki 

se nahaja na mitohondrijski DNA (mtDNA). Del tega gena (podenota I) smo 

pomnožili s PCR z univerzalnimi začetnimi oligonukleotidi za nevretenčarje. Iz 

pomnoženih fragmentov COI smo pridobili nukleotidna zaporedja. Na osnovi analize 

le teh smo analizirali filogenetske odnose med vzorčenimi osebki. S filogenetsko 

primerjavo nukleotidnih zaporedij COI iz velikega klobučnjaka v vzorcih iz Črnega 

morja in severnega Jadrana smo ugotovili, da je v nukleotidnih zaporedjih 

80 odstotkov ohranjenih mest. Veliki klobučnjaki iz Črnega morja in severnega 

Jadrana tvorijo dve ločeni filogenetski skupini, kar je razvidno iz filogenetskega 

drevesa. COI se je izkazal kot primeren genetski marker za razlikovanje med vzorci 

iz Črnega morja in severnega Jadrana. To je prva tovrstna študija, saj zaenkrat še ni 

nobenih javno dostopnih nukleotidnih zaporedij COI iz velikega klobučnjaka. 

Ključne besede: Scyphozoa, Rhizostoma pulmo, mitohondrijska DNA (mtDNA), 

citokrom c oksidaza, filogeografija, antropogeni vplivi, množično pojavljanje 

SUMMARY 

Medusae of Rhizostoma pulmo are occurring throughout all year in small number. In 

recent years several mass appearances have been recorded in Trieste Bay during 

winter time. Except for this species other scyphozoan species have been appearing 

massively in Gulf of Trieste as well, such as moon jelly (Aurelia aurita), and also 

mauve stinger (Pelagia noctiluca) during summer. There are several factors 

affecting their mass occurrence due to anthropogenic activities and also natural 

origin. 

The aim of my diploma dissertation was to examine phylogenetic connections 

between medusae of Rhizostoma pulmo from the northern Adriatic Sea and of the 

Black Sea. The research of phylogenetic connection was carried out with an 

analysis of nucleotide sequences of the gene encoded cytochrome c oxidase 

subunit (COI) found in mitochondrial DNA (mtDNA). A part of this gene (subunit) has 

been amplified by PCR with universal oligonucleotide primers for invertebrates and 

sequenced with the same primer pair. On the basis of the nucleotide sequences 

analysis were performed phylogenetic relationships between sampled individuals 

were performed and estimation of gene flow and phylogenetic relationship were 

revealed. On the basis of phylogenetic comparison of COI nucleotide sequences of 

Rhizostoma pulmo in the samples from the Black Sea and the northern Adriatic Sea 

we determined that nucleotide sequences contain 80 % of conserved sites. 

Rhizostoma pulmo from the Black Sea and the Northern Adriatic Sea form two 

separated phylogenetic groups, as revealed by phylogenetic tree. COI proved to be 

a suitable genetic marker to distinguish between samples from the Black Sea and 

III

the northern Adriatic Sea. This is the first study of this kind, since there are no public 

accessible COI nucleotide sequences from Rhizostoma pulmo available yet. 

Key words: Scyphozoa, Rhizostoma pulmo, mitochondrial DNA (mtDNA), 

cytochrome c oxidase , phylogeography, anthropogenic factors, massive 

occurrences. 

IV

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI 

A..........................................adenin 

ang.......................................angleško 

bp.........................................bazni par 

C..........................................citozin 

CTAB..................................cetrilmetilamonijev bromid 

DMSO…………………….dimetil sulfoksid 

DNA....................................deoksiribonukleinska kislina 

dNTP...................................2'-deoksinukleozid 5'-trifosfat 

EDTA..................................etilen-diamino-tetraocetna kislina 

EtBr…………………….....etidijev bromid 

F..........................................»forward primer«, vodilni začetni oligonukleotid, 

ki se prilega na matrično DNA v smeri 5`→3` 

G.........................................gvanin 

µ..........................................mikro 

LSU……………………….velika ribosomalna podenota 

Mg………………………...magnezij 

ng........................................nano gram 

PCR.....................................verižna reakcija s polimerazo 

pH........................................negativni logaritem koncentracije vodikovih ionov 

pufer TAE............................raztopina Trisa, acetata in EDTA 

R..........................................»reverse primer«, povratni začetni oligonukleotid, 

ki se 

prilega na matrično DNA v smeri 3`→5` 

rRNA….................……….. ribosomalna ribonukleinska kislina 

T...........................................timidin 

Taq DNA-polimeraza..........DNA-polimeraza, izolirana iz Thermus aquaticus 

tRNA……………………....prenašalna ribonukleinska kislina 

SSU………………………..mala ribosomalna podenota 

V

RH........................................Rhizostoma pulmo 

TRIS.....................................tris (hidroksimetil)aminometan 

COI......................................citokrom c oksidaza 

λ marker...............................Hind III λ marker 

100bp marker....................... GeneRuler 100bp DNA Ladder(100bp do 

1000bp, Fermentas) 

EtBr......................................etidijev bromid 

VI

KAZALO VSEBINE 

ZAHVALA........................................................................................................ I 

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ..........................................................................V 

1. UVOD ........................................................................................................1 

2. TEORETIČNE OSNOVE .......................................................................3 

2.1. Ožigalkarji in njihova telesna zgradba ...................................................3 

2.2. Klobučnjaki (Scyphozoa)..........................................................................4 

2.3. Množična pojavljanja klobučnjaških meduz..........................................4 

2.4. Klasična taksonomska uvrstitev velikega klobučnjaka (Rhizostoma 

pulmo)................................................................................................................7 

2.4.1 Opis vrste veliki klobučnjak...................................................................8 

2.5. Uporaba mitohondrijske DNA v filogenetskih študijah........................9 

2.5.1. Zgradba mitohondrijske DNA pri klobučnjakih ................................9 

2.6. Sodobna filogenetska analiza klobučnjakov.........................................10 

2.7. PCR reakcija............................................................................................11 

2.8. Postopek ugotavljanja nukleotidnih zaporedij (sekvenciranje) .........12 

2.9. Agarozna elektroforeza ..........................................................................12 

3. EKSPERIMENTALNI DEL.................................................................14 

3.1. Označevanje vzorcev...............................................................................14 

3.2. Recepti za pripravo osnovnih raztopin in njihove koncentracije.......14 

3.2.1. Puferske raztopine ...............................................................................14 

3.2.2. Encimi: ..................................................................................................15 

3.2.3. Velikostni standardi DNA:..................................................................16 

3.2.4. Aparature..............................................................................................16 

3.3. Vzorčenje na terenu ................................................................................16 

3.4. Izolacija DNA ..........................................................................................17 

VII

3.4.1. Spektrofotometrične meritve.............................................................. 18 

3.5. Agarozna elektroforeza.......................................................................... 18 

3.5.1. Priprava agaroznega gela ................................................................... 18 

3.5.2. Nanašanje vzorcev ............................................................................... 18 

3.6. PCR reakcija za pomnoževanje mitohondrijske oksidaze C ............. 19 

3.6.1. Začetni oligonukleotidi........................................................................ 20 

3.6.2. Priprava vzorcev za PCR.................................................................... 20 

3.7. Določanje nukleotidnega zaporedja...................................................... 20 

3.8. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v podatkovni zbirki 

GenBank (algoritem BLAST) in poravnava nukleotidnih zaporedij....... 20 

3.9. Filogeografska analiza nukleotidnih zaporedij ................................... 21 

4. REZULTATI IN RAZPRAVA............................................................. 22 

4.1. Rezultati izolacije DNA iz tkiva velikega klobučnjaka....................... 23 

4.1.1. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v severnem Jadranskem morju 

......................................................................................................................... 23 

4.1.2. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v Črnem morju ........................ 27 

4.1.3. Rezultati spektrofotometričnih meritev genomske DNA ................ 29 

4.2. Rezultati pomnoževanja citokrom C oksidaze z reakcijo PCR ......... 30 

4.2.1. Reamplifikacija PCR........................................................................... 41 

4.2.2. Pomnoževanje COI pri višji temperaturi naleganja........................ 42 

4.3. Določevanje nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje)....................... 43 

4.3.1. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v GenBank (algoritem 

Blast) ............................................................................................................... 43 

4.3.2. Poravnava nukleotidnih zaporedji s programom Clustal ............... 44 

4.4. Filogeografska analiza............................................................................ 44 

5. ZAKLJUČKI ......................................................................................... 47 

6. VIRI ........................................................................................................ 48 

VIII

KAZALO SLIK 

Slika 1: Osnovna zgradba meduze in polipa. 

(Vir:http://images.suite101.com/131037_cnidariamedusaandpolyp.jpg)3 

Slika 2: Med kočarjenjem v slovenskem delu Tržaškega zaliva so ribiči 

1. oktobra 2003 ujeli ogromne količine velikih klobučnjakov 

(Rhizostoma pulmo) ........................................................................................6 

Slika 3: Risba meduze velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo).........8 

Slika 4: Shematski prikaz verižne reakcije s polimerazo ........................12 

Slika 5: Zemljevid točk vzorčenja v severnem Jadranu in Črnem morju. 

..........................................................................................................................17 

Slika 6: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s kitom DNeasy Blood & 

Tissue Kit (QIAGEN). Oznake vzorcev (od levi proti desni): 12/06/RH1, 

12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 

11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6 (vzorci iz JV Tržaškega zaliva). Na 

vsako stezo smo nanesli 5 µl vzorca..........................................................24 

Slika 7: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & 

Tissue Kit (QIAGEN). Prva steza: velikostni standard λ marke (5 µl), 

sledijo vzorci (od leve proti desni): 14/07/RH1, 14/07/RH2, 14/07/RH3, 

14/07/RH4, 14/07/RH5, 14/07/RH6, 14/07/RH7, 14/07/RH8, 

14/07/RH9, 14/07/RH10. Na vsaki stezi je nanešeno 5 µl vzorca. Slika 

5 je sestavljena iz dveh slik. ........................................................................25 


Tissue Kit ( QIAGEN)....................................................................................26 





Slika 11: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka...33 




Slika 15: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz 

Koprskega zaliva. ..........................................................................................37 




Slika 19: Reamplifikacija COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz 

Koprskega zaliva. ..........................................................................................41 


Slika 21: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij velikega 

klobučnjaka iz Črnega morja in Koprskega zaliva. Merilo predstavlja 

število substitucij v analiziranih nukleotidnih zaporedjih.........................45 

IX

KAZALO TABEL 

Tabela 1. Razlike med vrstama veliki klobučnjak (R. pulmo) in R. 

octopus (prirejeno po Mayer, 1910)............................................................. 8 

Tabela 2: Seznam uporabljenih vzorcev za filogeografsko analizo 

velikega klobučnjaka. ................................................................................... 22 

Tabela 3: Izračun količine DNA v vzorcu. ................................................. 30 

Tabela 4: Količina dodane matrične DNA v posamezni PCR reakciji ter 

uspešnost pomnoževanja COI. .................................................................. 31 

Tabela 5: Seznam vzorcev z določenim nukleotidnim zaporedjem ..... 43 

X

1. UVOD 

Klobučnjaki (Scyphozoa) sodijo v evolucijsko zelo staro deblo ožigalkarjev 

(Cnidaria). Pri večini predstavnikov življenjski krog klobučnjakov zajema meduzo, ki 

se razmnožuje s spolno in nespolno generacijo, ki jo predstavlja pritrjen polip. Obe 

generaciji se lahko v določenih razmerah namnožita izjemno hitro in v velikem 

številu. Meduze klobučnjakov se pojavljajo sezonsko. Ko se pojavijo v izredno 

velikem številu, povzročajo gospodarsko škodo v ribištvu, na hladilnih sistemih 

jedrskih elektrarn, obratih za razsoljevanje, v turizmu (Purcell in sod., 2007). 

Opisanih je več dejavnikov, ki naj bi vplivali na njihovo množično pojavljanje, med 

katerimi prednjačijo posledice človekovih dejavnosti, kot so onesnaževanje, 

evtrofikacija, spremenjen prehranjevalni splet, v katerem na vrhu prehranjevalne 

verige prevladujejo klobučnjaške meduze namesto velikih plenilcev (Mills, 1995). 

Spremembe v populacijski gostoti meduznih populacij med leti so povezane z 

oscilacijami v Zalivskem toku v severnem Atlantiku in z intenzivnostjo pojava El Niňo 

(Purcell, 2005). Nekatera nihanja v številčnosti klobučnjaških meduz so naravna 

nihanja, kot na primer množična pojavljanja mesečinke v Sredozemskem morju 

(Goy in sod., 1989). V zadnjih nekaj letih se v Jadranskem morju vse številčneje 

pojavlja veliki klobučnjak (Rhizostoma pulmo) in uhati klobučnjak (Aurelia aurita). 

Meduza velikega klobučnjaka je razmeroma velika in čvrsta in, kadar se namnoži v 

velikem številu, povzroča gospodarsko škodo predvsem v ribištvu. Zelo resne 

težave pa veliki klobučnjak povzroča že desetletje v španski laguni Mar Menor, ki je 

zaradi intenzivnega kmetijstva v zaledju in industrializacije postala evtrofična in 

kemijsko onesnažena. Občasno velike agregacije meduz velikega klobučnjaka 

opazijo tudi v Črnem morju. Veliki klobučnjak ni neobičajna vrsta v Sredozemskem 

in v Črnem morju, zaskrbljujoče je njeno množično pojavljanje in možna povezava z 

negativnimi učinki človekove dejavnosti na morsko okolje. 

V zadnjem desetletju vse pogosteje poročajo z različnih koncev sveta o množičnih 

pojavljanjih različnih vrst klobučnjaških meduz. Poleg množičnega pojavljanja 

običajnih vrst za dano okolje, pa so raziskovalci našli tudi dokaze za prenos 

tujerodnih vrst klobučnjakov v nova okolja. Eden takih primerov je množično 

pojavljanje meduz uhatega klobučnjaka (Aurelia aurita) v Kaliforniji. Na osnovi 

sodobnih molekularno taksonomskih metod so ugotovili, da gre za neavtohtono 

populacijo (Dawson in sod., 2005), ki je bila najverjetneje prinešena z balastnimi 

vodami iz Japonske v Kalifornijo. 

Zaradi neobičajnega množičnega pojavljanja meduz velikega klobučnjaka v 

Sredozemskem in njemu sosednjih morjih (Črno morje in Atlantski ocean) ter 

gospodarske škode v ribištvu je naraslo zanimanje raziskovalcev in širše javnosti za 

omenjeno vrsto. Eden od osnovnih podatkov v biologiji je čimbolj natančen opis 

vrste in njena zanesljiva taksonomska uvrstitev. Opise vrst smo povzeli iz naslednjih 

monografij Medusae of the World (Mayer, 1910) in Synopsis of the medusae of the 

World (Kramp 1961). Velikemu klobučnjaku je morfološko zelo podobna vrsta 

Rhizostoma octopus, ki živi v Atlantiku, pri čemer se zastavlja vprašanje, kolikšna je 

sorodnost med opisanima vrstama in ali ju smemo zares smatrati kot dve vrsti 

(Mayer, 1910). Pri klasični determinaciji na osnovi morfoloških znakov naletimo pri 

klobučnjakih na velike težave pri razlikovanju zaradi razmeroma skromne makromorfološke 

diferenciacije meduz in plastičnosti oziroma variabilnosti teh znakov pri 

isti vrsti. Razlikovanje med vrstama veliki klobučnjak in R. octopus temelji na obliki 

in številu robnih krp, na dolžini zgornjega dela ustnih ramen in na dolžini in obliki 

terminalnih priveskov. Zaradi tega je na voljo malo diagnostičnih znakov za 

nedvoumno taksonomsko uvrstitev. V takih primerih so nam v pomoč novi pristopi v 

taksonomiji, kot so uporaba genetskih markerjev na genomski in izven 

kromosomalni DNA (Hillis in sod., 1996). 

1

Primerjava nukleotidnih zaporedij je eno od orodij, ki nam omogoča ugotavljanje 

geografskega izvora vrste (tujerodna ali avtohtona vrsta). Okoljski ukrepi se lahko 

razlikujejo glede na izvor osebka. Pri vnosu tujerodne vrste najprej skušamo 

ugotoviti njen geografski izvor in način vnosa v novo okolje. 

V primeru množičnega pojavljanja avtohtone vrste skušamo najprej prepoznati 

spremembe v okolju, ki vodijo do množičnega pojavljanja, in dokazati njihovo 

vzročno povezavo s pojavljanjem. Predvsem se moramo vprašati, kaj v okolju se je 

spremenilo, da je do tega prišlo (vnos hranil, sprememba habitata ...) 

Če gre za vnos tujerodne vrste, se moramo najprej vprašati, kako je prišla v novo 

okolje. Glede na potrjen izvor osebka se potem lahko odločimo, kakšne okoljske 

ukrepe bomo izvajali 

Odločili smo se, da bomo analizirali nukleotidno zaporedje gena za citokrom c 

oksidazo podenota I (COI) v osebkih velikega klobučnjaka nabranih na različnih 

geografskih območjih. COI je uveljavljen genetski marker v filogeografskih študijah 

in je genetsko marker, na katerem sloni eden od pristopov v molekularni 

taksonomiji, ki ga bolj popularno imenujemo z angleškim izrazom »DNA barcoding« 

(Ratnasingham in Hebert, 2007). Podatki pridobljeni iz COI bi nam lahko odkrili, 

kakšna je sorodnost med vzorčenimi osebki. V diplomskem delu smo iz vzorčenih 

osebkov ekstrahirali DNA in nato optimizirali pomnoževanje COI s PCR. Iz 

pomnoženih fragmentov COI smo nato pridobili nukleotidna zaporedja. Na osnovi 

nukleotidnih zaporedij smo analizirali genetsko podobnost med vzorčenimi osebki in 

filogenetsko razdaljo med vzorčenima populacijama iz severnega Jadrana in Črnega 

morja. 

2

2. TEORETIČNE OSNOVE 

2.1. Ožigalkarji in njihova telesna zgradba 

Ožigalkarji so skoraj izključno morske živali in le nekateri trdoživnjaki naseljujejo tudi 

celinske vode. Glavne značilnosti ožigalkarjev so preprosta telesna zgradba in 

ožigalke ali nematociste, ki vsebujejo strupene snovi. Glede na zgradbo telesa in 

življenjski krog (prisotnost polipne in meduzne generacije), razlike v gastrovaskularni 

votlini delimo ožigalkarje na tri razrede: koralnjaki (Anthozoa), klobučnjaki 

(Scyphozoa) in trdoživnjaki (Hydrozoa). 

Telo ožigalkarjev je sestavljeno iz dveh zarodnih plasti endoderma in ektoderma. 

Gastroderm (izvorna plast endoderm) je plast celic, ki obdajajo telesno votlino, 

epiderm (zarodna plast ektoderm) je vrhnji sloj, ki vsebuje ožigalke. Med epidermom 

in gastrodermom je mezoglea, ki je lahko zelo tanka ali zelo debela želatinasta 

tvorba kot na primer pri klobučnjaških meduzah. V notranjosti telesa leži prebavna 

votlina z eno samo odprtino, ki jo imenujemo usta. Ta so pri polipih na zgornji, pri 

meduzah na spodnji strani telesa. Usta obkrožajo lovke ali tentakli, pri meduzah 

ustna ramena, ki pomagajo pri lovu hrane. Polipna generacija je pritrjena na podlago 

(sesilna) in je malo gibljiva. Meduzna generacija je prosto plavajoča. Polipi so 

nespolna generacija, ki se razmnožuje z brstenjem, meduze so spolna generacija, ki 

proizvaja spolne celice. Za klobučnjake je značilno, da ima večina predstavnikov 

menjavo generacij: spolno generacijo (meduza) in nespolno generacijo (polip). Ena 

od vrst brez polipne generacije je mesečinka (Pelagia noctiluca). 

Danes je poznanih približno 9000 vrst ožigalkarjev. Približno 340 vrst je opisanih v 

Sredozemskem morju, ocenjujejo pa, da v njem živi okrog 200 vrst ožigalkarjev. 

Slika 1: Osnovna zgradba meduze in polipa. 

(Vir:http://images.suite101.com/131037_cnidariamedusaandpolyp.jpg) 

3

2.2. Klobučnjaki (Scyphozoa) 

Klobučnjaki so razred morskih ožigalkarjev, pogosto z menjavo generacij med polipi 

(skifopolipi), ki se razmnožujejo nespolno, in prosto plavajočimi meduzami, ki se 

razmnožujejo spolno (skifomeduze). Meduze nekaterih vrst so lahko zelo velike s 

premerom klobuka enega do dva metra. V osnovni zgradbi so podobne meduzam 

trdoživnjakov (hidromeduze), razlikujejo se po odsotnosti krpastega naborka pod 

klobukom. 

Meduze in polipi imajo radialno simetrijo. Skifopolipi so zelo majhni (od 1 do 4 mm) 

in imajo različno število lovk. Polip velikega klobučnjaka ima do 24 lovk (Holst in 

Jarms, 2006). Klobuk meduz je poln želatinozne snovi (mezoglea), njegov rob je 

navadno razdeljen na režnje. Ustna ramena izhajajo izpod klobuka in so pri 

nekaterih vrstah precej velika. 

Gastrovaskularni sistem pri meduzah leži na spodnji strani klobuka (subumbrela) z 

manubrujem (ustni stožec), ki se nadaljuje v usta, posuta z ožigalkami. 

Gastrovaskularna votlina je predeljena na štiri prekate s pregradami iz gastroderma. 

Posamezni prekati so med seboj povezani z okroglimi odprtinami. Prosti robovi 

pregrad imajo močne septalne filamente, posute z ožigalkami in žleznimi celicami. 

Živčni sistem je slabo razvit in difuzen. Čutilne organe pri meduzah imenujemo 

ropaliji. Ropaliji imajo več različnih vlog, na posameznih delih meduze služijo za vid 

in kot čutilo za ravnotežje. Klobučnjaki so morske živali, do sedaj jih poznamo 200 

vrst (Arai, 1997). 

Spolno in nespolno razmnoževanje omogočata klobučnjakom izjemno hitro 

namnoževanje. Klobučnjaki se razmnožujejo s posebnim načinom nespolne delitve, 

ki mu pravimo strobilacija, pri čemer nastanejo majhne meduze ali efire iz polipa, ki 

nato rastejo v spolno zrele meduze. Strobilacije ni pri skupini kubomeduze, ampak 

se polip preobrazi v meduzo. Meduze so spolna generacija in imajo dobro razvite 

spolne žleze ali gonade ter so večinoma enospolne (Mayer, 1910). Po oploditvi 

nastane plavajoča omigetalčena ličinka planula, ki se nato pritrdi, ko najde primerno 

podlago, in se iz nje razvije polip. V zmernih klimatih poteka strobilacija v toplejšem 

delu leta, medtem ko se v tropih odvija celo leto (Lucas, 2001). 

2.3. Množična pojavljanja klobučnjaških meduz 

V novejšem času je vse več podatkov o množičnem pojavljanju meduz 

klobučnjakov, trdoživnjakov ter drugih skupin, kot so rebrače in plaščarji, ki jih glede 

na izgled imenujemo tudi želatinozni plankton. V našem opisovanju se bomo omejili 

na meduze klobučnjakov, ki jih bomo imenovali krajše meduze. Vse pogostejša 

dokumentirana opazovanja množičnih pojavljanj meduz klobučnjakov porajajo tudi 

ugibanja o možnih vzrokih. Raziskovalci najpogosteje omenjajo evtrofikacijo, 

prekomeren ribolov, invazije tujerodnih vrst in klimatske spremembe (Arai, 2001a). 

Medtem ko je ugibanj veliko, je zelo malo znanih čvrstih dokazov, ki bi trdno 

povezali množična pojavljanja z omenjenimi vzroki. Številne pojave, kot so 

evtrofikacija, hipoksija, motnost vodnega stolpca, spremembe slanosti, so stanja, ki 

jih meduze lažje prenašajo kakor ribe in druge morske živali. Spremembe v 

hidrološkem režimu zaradi jezov, nasipov in ostalih konstrukcij lahko spremenijo 

slanost in tako favorizirajo meduze. Porast številčnosti želationoznega planktona 

povezujejo tudi s klimatskimi spremembami. Študije, v katerih so analizirali okoljske 

4

spremembe v daljšem časovnem obdobju, so pokazale, da nihanje številčnosti 

ožigalkarjev in rebrač, ki živijo v zmerno toplih vodah sovpada z okoljskimi 

spremembami (Purcell, 2005). Vremenske spremembe (topla voda, suho vreme), 

spremembe v slanosti predstavljajo ugodne razmere za klobučnjake in drug 

želatinozni plankton (Molinero in sod., 2005). 

Pogosto so množična pojavljanja opažena v evtrofnih območjih, pa tudi tudi v 

predelih, ki niso pod neposrednim vplivom človekove aktivnosti (Purcell in sod., 

2007). Množična pojavljanja so se pojavila po obsežnem spreminjanju življenjskega 

prostora, kot se je zgodilo v laguni Mar Menor v Španiji, kjer so pesek zamenjali z 

blatom. Najprej se je zgodila invazija alge Caulerpa porifera, ki je nadomestila 

morsko travo. Nato so v laguno vnesli ostrige, ki predstavljajo dodaten substrat za 

polipe. Evtrofikacija (Howarth in sod., 2002) pomeni povečevanje koncentracije 

hranil. Povečanje hranil pogosto vodi k večji biomasi v vseh trofičnih nivojih 

(Daskalov in sod., 2007), pri čemer lahko več razpoložljive hrane omogoča 

preživetje in razmnoževanje večjemu številu polipov in meduz (Purcell in sod., 

1999). Povečana raba umetnih dušikovih gnojil po letu 1970 je lahko vzrok nedavnih 

množičnih pojavljanj klobučnjakov (Gilbert in sod., 2005). Takšno stanje so povezali 

z množičnim pojavljanjem dveh vrst, in sicer morske cvetače (Cotylorhiza 

tuberculata) in velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo) v laguni Mar Menor. 

Podatki kažejo, da visoka koncentracija dušika lahko privede do množičnega 

pojavljanja meduz. (Pérez in sod., 2002). Od leta 1990 je do množičnega pojavljanja 

meduz prišlo vzdolž sredozemske obale (Malej, 1982 ). 

Na drugi strani evtrofikacija vodi v zmanjševanje koncentracije kisika in v takem 

okolju imajo klobučnjaki selektivno prednost pred drugimi organizmi (Arai, 2001b). 

Ribe se hipoksiji izognejo, če pa je kisika manj kot 2 mg/L pa poginejo. Veliko 

meduz je sposobnih preživeti v okoljih z nizko koncentracijo kisika (do < 1mg O 2 /L) 

(Purcell in Arai, 2001). Tudi polipi imajo toleranco do nizke koncentracije 

raztopljenega kisika in lahko preživijo v takem okolju (Ishii, 2006). 

Številni dejavniki, ki so povezani z industrializacijo in razvojem obalnih območij 

zmanjšujejo prozornost vode ter prehajanje svetlobe. V takem spremenjenem okolju 

lažje preživijo klobučnjaki kakor ribe. 

Posredno meduze vplivajo na ribištvo, saj se prehranjujejo z zooplanktonom in 

ihtoplanktonom (jajčeca rib in ličinke). Nekateri avtorji pravijo, da so zaradi prelova 

rib, meduze, ki so nižje na prehranjevalni verigi zasedle prehrambeno nišo, ki so jo 

zasedale ribe. Ribištvo odstranjuje ribe, ki jedo zooplankton ter plenilce meduz, in 

tako ostane meduzam na razpolago več hrane. Na drugi strani ob množičnem 

pojavljanju klobučnjaki tekmujejo za razpoložljive vire hrane z ribami. Zaradi 

hranjenja z zooplanktonom lahko zmanjšajo ter spremenijo zooplanktonske 

populacije, kar posledično lahko zmanjša količino hrane, ki je razpoložljiva ribam 

(Jackson in sod., 2001, Daskalov in sod., 2007). Nekateri avtorji poudarjajo 

pomembnost selektivne pašnje majhnih kopepodnih rakcev (Sommer in sod., 2002). 

V različnih delih sveta povzročajo težave v ribištvu množična pojavljanja 

klobučnjaških meduz. V Vzhodno kitajskem morju in v Rumenem morju so zabeležili 

količinsko zmanjševanje ulova (Cheng in sod., 2005). Na Japonskem se je 

populacija meduz uhatega klobučnjaka (Aurelia aurita) povečala po letu 1980 in se 

je v zadnjih dveh desetletjih številčno zelo povečala. Tako se je 65 odstotkov ribičev 

na Japonskem opredelilo, da je število meduz naraslo v zadnjih dvajsetih letih (Uye 

& Ueta, 2004). Tudi v Namibijskem morju so se po letu 1988 zmanjšali ulovi inčunov 

in sardel, glede na ulov od leta 1975 do 1988. V tem območju sedaj prevladujeta 

dve vrsti, klobučnjaška meduza Chrysaora hysoscella in trdoživnjaška meduza 

Aequorea forskalea (Lynam in sod., 2006). Zaradi velikega števila meduze zamašijo 

ribiške mreže in zmanjša se kvaliteta ulova. Tak problem so imeli predvsem na 

Japonskem od leta 1990 dalje, ko je populacija uhatega klobučnjaka narasla v Seto 

5

Inland Sea. Od leta 2002 se v japonskih obalnih morjih vsakoletno pojavljajo 

meduze vrste Nemopilema nomurai. Veliko škode so povzročili uhati klobučnjaki v 

ribogojnicah ob škotski obali. Toksini, ki jih vsebujejo klobučnjaki, povzročijo pomore 

rib v kletkah, kadar se njihove meduze ob namnožitvi pojavijo tudi v kletkah 

(Johnston in sod., 2005). 

Slika 2: Med kočarjenjem v slovenskem delu Tržaškega zaliva so ribiči 1. oktobra 

2003 ujeli ogromne količine velikih klobučnjakov (Rhizostoma pulmo) 

Foto: Bojan Marčeta, Zavod za ribištvo R Slovenije. 

Gradnja struktur v morju kot so ribogojnice in ostale morske strukture predstavljajo 

ugodne življenjske prostore za polipe. Po eni strani jim ribogojnice omogočijo 

dodatno hrano, po drugi strani pa jim strukture v morju predstavljajo dodaten 

substrat, na katerem lahko polip živi (Johnston in sod., 2005). V obalnih morjih ob 

Arabskem polotoku je množično pojavljanje klobučnjaške meduze Crambionella 

orsini povzročilo težave v kroženju vode v elektrarnah in razsoljevalnicah 

(Daryanabard & Dawson, 2008). 

Vnos tujerodnih vrst klobučnjakov v ekosistem lahko prav tako privede do 

množičnega pojavljanja z resnimi posledicami za okolje. Velikokrat je uspešna 

invazija tujerodne vrste povezana tudi z drugimi antropogenimi vplivi v okolju. Eden 

od takih vnosov tujerodne populacije klobučnjaške meduze je vnos uhatega 

klobučnjaka iz Japonske v Kalifornijo ter še na nekaj drugih območij po svetu. 

Tujerodna vrsta je v novem okolju našla primerno nišo in povzročila populacijsko 

eksplozijo. Ker je potovanje izključno s tokovi prepočasno za tolikšno razdaljo, 

sklepajo, da je do vnosa prišlo z balastnimi vodami transportnih ladij (Dawson in 

6

sod., 2005). Na osnovi primerjalne analize nukleotidnih zaporedij v genu za COI so 

lahko ugotovili geografski izvor populacije uhatega klobučnjaka v Kaliforniji. Že prej 

so z analizo zapisa v genu za COI na mtDNA uhatega klobučnjaka ugotovili, da je 

vrsta uhati klobučnjak sestavljena iz več kriptičnih vrst (Dawson in Jacobs, 2001). Z 

najdenimi razlikami na nivoju mitohondrijske DNA sovpadajo tudi makro-morfološke 

razlike, ki so jih našli med analiziranimi populacijami kriptičnih vrst (Dawson, 2003) 

Primer tujerodne vrste vnesene v nov ekosistem je tudi vrsta Rhopilema nomadica v 

Sredozemskem morju. R. nomadica (premer klobuka do 80 cm) je klobučnjaška 

meduza, ki je v zadnjih dveh desetletjih vse bolj številčna v vzhodnem 

Sredozemskem morju. Njena prisotnost povzroča tveganje tako za ribiče, kot za 

kopalce, saj ima neprijeten ožig in je lahko prisotna v velikem številu. Prvič je bila 

zabeležena leta 1976 v Sredozemskem morju ter je od leta 1986 vsako poletje 

množično prisotna ob obali Izraela (Lotan in sod., 1993). R. nomadica naj bi prišla 

skozi Sueški kanal in je zelo redka v Rdečem morju. Še dve drugi klobučnjaški 

meduzi Phyllorhiza punctata, ki izvira iz zahodnega Pacifika, ter Indo- Pacifiška 

vrsta Cassiopea andromeda sta se v zadnjem času naselili v Sredozemskem morju. 

Populacijska dinamika teh dveh meduz še ni znana. 

Meduze klobučnjakov negativno vplivajo na turizem, saj povzročijo zelo neprijetne 

ožige (toksini nekaterih vrst, ki žive v toplejših morjih so lahko smrtno nevarni) 

kopalcem. Kadar je število meduz veliko, lahko povzročijo pravo epidemijo ožigov. 

Občasno se v Sredozemskem morju množično pojavlja mesečinka (Pelagia 

noctiluca) (Goy in sod., 1989, Molinero in sod., 2005), ki povzroča neprijetne ožige 

pri kopalcih. V nekaterih obmorskih krajih, kjer je veliko turistov in je število ožigov 

zelo veliko, so vpeljali redno spremljanje številčnosti meduz ter opozorilne sisteme 

za kopalce, ki vključujejo tudi napotke za prvo pomoč. Ožigi meduz predstavljajo 

prav tako nevarnost za ribiče (Purcell, 2005). 

2.4. Klasična taksonomska uvrstitev velikega klobučnjaka (Rhizostoma 

pulmo) 

Rod korenoustih klobučnjakov (Rhizostoma) spada v red Rhizostomea in v družino 

Rhizostomatidae. V rodu korenoustih klobučnjakov so do sedaj opisali tri vrste: veliki 

klobučnjak (R. pulmo Macri, 1778), R. octopus (Linnaeus, 1788) in R. luteum (Quoy 

in Gaimard, 1827). Poudariti moramo, da nekateri avtorji dvomijo v obstoj vrste R. 

luteum (Mayer, 1910). Veliki klobučnjak naseljuje Sredozemsko in Črno morje, R. 

octopus je razširjena v Atlantskem oceanu, ob severozahodni obali Evrope, ob 

obalah Skandinavije, v Irskem morju, ob južnih in zahodnih obalah britanskih otokov 

in v južnem delu Severnega morja. R. luteum naseljuje morje ob obalah Portugalske 

v ožini Gibraltar in zahodni obali Afrike (Russell, 1970). Mayer (1910) in Kramp 

(1961) smatrata vrsto R. octopus za varieteto vrste R. pulmo. Če privzamemo, da je 

R. luteum legitimna vrsta, potemtakem nastane vrzel v distribuciji med vrstama R. 

octopus in R. pulmo, ki jo zapolnjuje R. luteum. 

Mayer (1910) v svojem delu obravnava druge opisane vrste iz rodu korenoustih 

klobučnjakov kot varietete tipske vrste velikega klobučnjaka, ki je bila opisana na 

osnovi osebkov iz Sredozemskega morja. Tipsko vrsto R. pulmo je opisal Luis 

Agassiz leta 1862. Vrsta veliki klobučnjak je bila najprej opisana kot Potta marina, ki 

jo je opisal Aldrovandi leta 1642 (povzeto po Mayer, 1910). 

7

Mayer v svojem delu Medusae of the World (1910) omenja varietete velikega 

klobučnjaka iz Sredozemskega morja, Rdečega morja, Atlantskega oceana vzdolž 

obale Evrope in Afrike. Opisane razlike med velikim klobučnjakom in R. octopus so 

v številu in obliki robnih krp, v dolžini zgornjega dela ustnih ramen, v dolžini in obliki 

terminalnih priveskov ter v razširjenosti. Opisane razlike so podrobneje opisane v 

Tabela 1. Razlike med vrstama veliki klobučnjak (R. pulmo) in R. octopus (prirejeno 

po Mayer, 1910). 

R. PULMO R. OCTOPUS 

Število robnih krp 80 96 do 112 

Oblika robnih krp Kratke in zaobljene Kratke, zašiljene 

Dolžina zgornjega dela ustnih Daljša od spodnjega dela Krajša od spodnjega dela 

ramen 

Dolžina in oblika terminalnih 

priveskov 

Krajši ali enaki kot zgornji del 

ustnih ramen, širši blizu na baze 

(proksimalno), zoženi na bazi, ni 

bazalnega peclja. 

Daljši kot zgornji del ustnih 

ramen z neznatnim bazalnim 

pecljem in zadebeljenim kijasto 

oblikovanim zunanjim delom. 

2.4.1 Opis vrste veliki klobučnjak 

Meduza velikega klobučnjaka je zvonaste oblike in čvrsta, brez tentaklov na robu 

klobuka, ustna ramena so zrasla med sabo in na njih je veliko majhnih sekundarnih 

ustnih odprtin. Na spodnji strani (subumbrela) je ustni stožec, na katerem so 

epolete, ki so videti kot trakasta nagubana struktura. Epolete s sekundarnimi ustnimi 

odprtinami so lahko obarvane oranžno rumeno do rjavkasto rdeče ali rjavo.Tako 

veliki klobučnjak kakor R. octopus imata premer klobuka od 15 do 60 centimetrov in 

drobno granulirano površino klobuka z nematocistami. Oblika robnih krp je pri 

velikem klobučnjaku polkrožne oblike, pri R.octopus pa ovalna. Razlika je tudi v 

številu robnih krp na osmino klobuka; pri velikem klobučnjaku jih je 8, medtem ko pri 

R. octopus to število variira okoli 10 robnih krp na osmino. 

Razlike med obema vrstama so še v dolžini in obliki končnih priveskov. Pri vrsti 

veliki klobučnjak so končni priveski krajši ali enako dolgi kot dolžina zgornjega dela 

ustnih ramen. Pri velikem klobučnjaku so končni priveski širši na proksimalnem delu 

(na stiku z ustnimi rameni), medtem ko so pri vrsti R. octopus ožji na proksimalnem 

delu, nabrekli in kijaste oblike. Barva klobuka je lahko pri obeh vrstah od mlečno 

rumene, do rdečkaste, medtem ko so robne krpe modrikaste do vijolične barve. 

Veliki klobučnjaki se hranijo s planktonom. Sekundarna usta obdajajo številne resice 

z nematocistami. 

Slika 3: Risba meduze velikega klobučnjaka (Rhizostoma pulmo). 

(Vir. M. Plantan diplomsko delo, 2008) 

8

2.5. Uporaba mitohondrijske DNA v filogenetskih študijah 

Mitohondrijska DNA (mtDNA) je uporabna v raziskavah živalskih populacij zaradi 

relativno preproste izolacije, relativno visoke frekvence mutacij v nekaterih delih 

mitohondrijskega genoma in dedovanja po materini strani. Zaradi načina dedovanja 

lahko sledimo materini liniji z mitohondrijskimi haplotipi. 

Za filogenetske raziskave se najpogosteje uporabljajo nukleotidna zaporedja velike 

(16S) in male (12S) rRNA, citokrom c oksidaze podenota I (COI) in citokroma b. Ti 

odseki mtDNA so precej dobro proučeni in znotraj teh nukleotidnih zaporedij so 

poznane bolj ali manj variabilne regije, na osnovi katerih je možna primerjava 

nukleotidnih zaporedij in izpeljava filogenetskih odnosov. Nukleotidno zaporedje 

gena za COI je eden izmed najbolj pogosto uporabljenih genetskih markerjev v 

filogenetskih raziskavah živalih. Številne študije so potrdile, da je odsek na 5' koncu 

COI gena (t.i. 5' Folmer del) primeren za rekonstrukcijo nižjenivojskih odnosov pri 

višjih živalih (Erpenbeck in sod., 2005). Navkljub nekaterim pomislekom so novejše 

študije potrdile primernost tega gena tudi v filogenetskih raziskavah klobučnjakov. 

Ugotovili so, da je variabilnost COI pri klobučnjakih enako kot pri višjih živalih 

(Huang in sod., 2008). 

Eden od temeljev uporabe mtDNA v filogenetskih analizah populacij je 

koalescenčna teorija, ki jo podpira nevtralni model evolucije. Koalescenca je 

združitev razvojnih linij iz preteklosti. Bolj kot so si organizmi in geni med seboj 

podobni, krajši je čas koalescence, čas do skupnega prednika. Čas koalescence 

mtDNA je za vsaj štirikrat krajši kot za jedrne gene, ker ima mitohondrijski genom 

eno samo kopijo (haploiden). Na filogenetskem drevesu vrstni red vej sovpada z 

vrstnim redom dogodkov koalescence in predstavlja kladistične odnose med 

nukleotidnimi zaporedji. Medtem ko dolžine vej, ki povezujejo nukleotidna zaporedja 

v drevesu, sovpadajo s časom koalescence (povzeto po Gorički, 2004). 

2.5.1. Zgradba mitohondrijske DNA pri klobučnjakih 

Mitohondriji so zelo številčni celični organeli namenjeni celičnemu dihanju. V 

matriksu mitohondrija je običajno 5 do 10 identičnih krožnih molekul mtDNA. 

Mitohondrijski genomi večceličnih živali se razlikujejo po velikosti in razporeditvi 

nekaterih genov v njem. Mitohondrijska DNA (mtDNA) je običajno kratka in 

dvoverižna krožna molekula velikosti približno 16 kbp. Na njej so zapisani geni, ki 

kodirajo različne beljakovine, ki sodelujejo v dihalni verigi, ribosomalne RNA (rRNA) 

in transportne RNA (tRNA). V eni od verig je več gvanina in tisto verigo imenujemo 

težka veriga, medtem ko drugo verigo imenujemo lahka. Večina genov je zapisana 

na težki verigi. 

Med ožigalkarji najbolje poznamo zgradbo mtDNA iz predstavnikov razreda 

koralnjakov. Šele v letu 2006 je bil objavljen celoten zapis mtDNA uhatega 

klobučnjaka (Shao in sod, 2006). Mitohondrijska DNA uhatega klobučnjaka je dolga 

16 937 bp in ni krožna molekula, kakor pri koralnjakih (Bridge in sod., 1995), ampak 

je linearna, kar je razmeroma redko med živalmi. Na mtDNA je zapis za 13 

beljakovin, za veliko in malo podenoto rRNA in za 2 tRNA (za metionin in triptofan). 

Na mtDNA sta dva odprta bralna okvirja za gene, ki kodirajo encime dihalne verige. 

Geni so organizirani v dve skupini in vsaka skupina se prepisuje v svoji smeri, smer 

prepisovanja DNA se spremeni na mestu, kjer je 93. nukleotid. Poleg linearnosti ima 

mitohondrijski genom uhatega klobučnjaka še nekaj posebnosti. Gena za 

ribosomalni RNA sta 7 kbp narazen in imata vsak svojo smer prepisovanja. Taka 

9

ureditev ribosomalnih genov je razmeroma redka v živalskih mitohondrijskih 

genomih. Običajno ribosomalni geni ležijo skupaj in imajo isto smer prepisovanja. 

Pri koralnjakih so opazili tudi razmeroma velike nekodirajoče regije, medtem ko so 

pri uhatem klobučnjaku nekodirajoča nukleotidna zaporedja med geni kratka. 

Nukleotidna zaporedja na obeh koncih linearne mtDNA so enaka, a obrnjena in ne 

tvorijo nobenih sekundarnih struktur ter ne vsebujejo nobenih telomeram podobnih 

ponovitev. 

Ožigalkarji pri translaciji bolj pogosto uporabljajo nekatere triplete (npr. triplet TGA 

za triptofan namesto TGG), zato imajo svoj značilen genetski kod. V vseh do sedaj 

znanih zaporedjih mtDNA ožigalkarjev sta samo dva gena za prenašalne RNA 

(tRNA), ki so potrebne za transkripcijo mitohondrijske DNA. Potrebne manjkajoče 

tRNA so zapisane v jedrnem genomu in se prenesejo iz jedra v mitohondrij. To 

pomeni, da se je z izgubo genov za tRNA na mtDNA v prednikih ožigalkarjev razvil 

prenašalni mehanizem za tRNA (Beaton in sod., 1998). 

Mitohondrijski genom klobučnjakov ima sposobnost vključitve in vgraditve tuje DNA 

v mitohondrijsko DNA ožigalkarjev. Takšen primer je homolog gena mut S, ki so ga 

našli v mtDNA v korali Sarcophyton glaucum in v morskem perescu Renilla kolikeri 

(Pont-Kingdon in sod., 1995, 1998), ter introni skupine I, ki so jih našli v morski 

anemoni Metridium senile (Beagley in sod., 1996). Prisotnost teh genov v 

mitohondrijskem genomu je redkost pri večceličnih živalih, kajti pri nobeni drugi 

skupini živali še niso našli tujih nemitohondrijskih genov. Na podlagi tega 

raziskovalci sklepajo na večjo izmenjavo med jedrnim in mitohondrijskim genomom 

ožigalkarjev v primerjavi z ostalimi skupinami živali. Za to obstajata dve razlagi: 

za vnos tuje DNA v mitohondrijski genom sta potrebni homologna in 

nehomologna rekombinacija. Zato je rekombinacija bolj pogosta v 

mitohondrijih ožigalkarjev kot v mitohondrijih ostalih živalih (Chevalier in 

Stoddard, 2001) 

obstoječi mehanizem za prenos tRNA pomaga tudi pri prenosu tuje DNA v 

mitohondrije (Shao in sod., 2006) 

2.6. Sodobna filogenetska analiza klobučnjakov 

Pri ožigalkarjih, zaradi skromne makro-morfološke diferenciacije (Mayer, 1910, 

Dawson, 2003) in velike pestrosti življenjskih ciklov, ostaja vprašanje, katera oblika 

je evolucijsko starejša (polip ali meduza). Prve filogenetske študije ožigalkarjev so 

bile narejene na osnovi ribosomalnih 16S rDNA in 18S rDNA (Bridge in sod. 1995). 

Skupine, ki imajo meduzno generacijo (trdoživnjaki, klobučnjaki in kubomeduze), 

tvorijo enotno monofiletsko skupino (izhajajo iz skupnega prednika) in jih imenujejo 

Medusozoa. Avtorji se nagibajo k teoriji, da je skupni prednik ožigalkarjev imel 

polipno fazo ter da je meduzna faza sinapomorfija klada Medusozoa. Collins in 

sodelavci (2006) so predlagali delitev ožigalkarjev na Anthozoa (koralnjaki) in 

Medusozoa. Predpostavljajo, da so se najprej razvili koralnjaki in nato še skupina, ki 

jo tvorijo kubomeduze ter klobučnjaki. Zadnji dve našteti skupini tvorita sestrski klad. 

Da bi poudarili, da ima razred pecljate meduze (Stauromedusae) ločeno evolucijsko 

zgodovino in da se razlikuje od ostalih razredov ožigalkarjev, sta Marques in Collins 

(2004) oblikovala nov razred Staurozoa. Molekularni in morfološki znaki kažejo, da 

so pecljate meduze sestrska skupina Medusozoa (Collins in sod., 2006). 

Strobilacija polipa in efire so sinapomorfni znaki za vse klobučnjake. V svoji študiji 

so Collins in sodelavci (2006) predpostavili, da red Rhizostomea izhaja iz prednikov 

reda Semaeostome zaradi podobnosti v sistemu radialnih kanalov, kar je v skladu s 

10

starejšimi morfološkimi študijami (Mayer, 1910; Hyman, 1940; Thiel, 1966). To 

hipotezo potrjujejo tudi študije primerjav majhne ribosomalne podenote (SSU) 

(Collins, 2002), kot tudi na veliki ribosomski podenoti (LSU). Izmed treh družin redu 

Semeostomeae - Cyaneidae, Ulmaridae in Pelagiidae naj bi se zadnja družina 

najprej ločila. Znotraj skupine Rhizostomeae obstajata dve glavni skupini taksonov: 

Cepheida in Rhizostomida (Stiasny, 1922; Thiel, 1970), za katere je Thiel (1970) 

predpostavil, da so se razvile iz predstavnikov znotraj skupine Semaeostomeae. 

Družini Cepheidae z rodovoma Cassiopea in Cotylorhiza ter 

Rhizostomatidae z rodovoma Catostylus in Stomolophus tvorita monofiletsko 

skupino (Collins in sod., 2006). Filogenetska analiza je bila narejena na vrstah iz 

rodov, ki so omenjeni zgoraj. 

2.7. PCR reakcija 

Verižna reakcija s polimerazo, znana tudi pod angleško kratico PCR (Polymerase 

Chain Reaction), je metoda, ki omogoča pomnoževanje odsekov DNA z encimom 

DNA polimeraza. Metoda posnema pomnoževanje DNA v celici. Za vsak fragment 

DNA, ki ga želimo pomnožiti s PCR, je potrebno poznavanje nukleotidnega 

zaporedja na obeh koncih tarčne verige DNA ter pripraviti ustrezen specifičen par 

začetnih oligonukleotidov. Temperaturni profil PCR je sestavljen iz ločitve obeh verig 

DNA (toplotna denaturacija), naleganja začetnih nukleotidov ter podaljševanja verig 

DNA. Pri optimizaciji protokola je potrebno upoštevati tudi druge dejavnike kot so 

koncentracije soli in nukleotidov, število kopij tarčne DNA, število ciklov ter čas 

trajanja posameznih ciklov (Suzuki in Giovannoni, 1996; Polz in Cavanaugh, 1998). 

Produkti pomnoževanja se v PCR eksponentno kopičijo. 

Ključnega pomena za PCR reakcijo je encim Taq polimeraza. Kratica Taq pomeni 

Thermus aquaticus, bakterijo, ki preživi in se razmnožuje v vročem okolju, ki je za 

druge organizme smrtno. V nasprotju z drugimi polimerazami je encim, ki izvira iz 

omenjene bakterije (in danes narejen iz genetsko spremenjene bakterije), stabilen 

pri visokih temperaturah zaradi česar lahko pomnoževanje poteka pri visokih 

temperaturah. 

11

Slika 4: Shematski prikaz verižne reakcije s polimerazo 

(Vir: K. Drobnič.Ugotavljanje identitete posameznika z uporabo genetskih informacij, metode verižne reakcije s 

polimerazo in računalniško podprte tehnologije). 

2.8. Postopek ugotavljanja nukleotidnih zaporedij (sekvenciranje) 

Za pripravo sekvenčne reakcije uporabljamo metodo asimetrični PCR. Z njo 

pomnožimo tarčno DNA in produkt takega pomnoževanja so enoverižne DNA, ki jih 

nato ločimo na visokoločljivostnih gelih. V PCR uporabimo le en začetni 

oligonukleotid, s čimer dosežemo, da se pomnožuje le ena veriga. Nukleotidi, ki jih 

damo v PCR so mešanica nukleotidov, ki so fosforilirani in nefosforilirani in le ti so 

označeni z fluorescentnim barvilom. Pomnoževanje se ustavi tam, kjer Taq 

polimeraza doda nefosforiliran označen nukleotid. Tako nastanejo različno dolge 

verige, ki se med seboj ločijo za en nukleotid. Nastale verige DNA ločimo na 

visokoločljivem gelu, kjer lahko ločimo verige DNA na en nukleotid natačno. 

Poznamo več tehnik sekvenciranja s PCR, poleg omenjene, kjer v reakcijo PCR 

damo nefosforilirane nukleotide s fluorokromi ali je s fluorokromom označen začetni 

nukleotid. 

2.9. Agarozna elektroforeza 

Agarozna elektroforeza je metoda, s katero specifično ločujemo nukleinske kisline 

na podlagi velikosti, naboja in drugih lastnosti (Bodlaj, 2001). Pri tem vzorec 

12

nanesemo na gel, ki je pripravljen iz agaroze v ustrezni koncentraciji v 

elektroforetskem pufru. Agarozni gel igra vlogo »molekularnega sita«, skozi 

katerega se prebijajo makromolekule. Nanešen vzorec izpostavimo električnemu 

polju določene napetosti in jakosti električnega toka. Nukleinske kisline zaradi 

različne molekulske mase ter oblike potujejo po gelu z različno hitrostjo. Nukleinske 

kisline obarvamo z fluorokromi, ki se vežejo na verigo ali med verigi (v primeru 

dvojnovijačne DNA). Pod svetlobo kratke valovne dolžine postanejo nukleinske 

kisline vidne zaradi flourescence vgrajenih barvil. 

13

3. EKSPERIMENTALNI DEL 

Eksperimentalni del naloge smo razdelili na več delov: vzorčenje na terenu, 

postopek izolacije DNA, pomnoževanje COI s PCR, agarozna elektroforeza in 

določanje nukleotidnega zaporedja ter filogeografska obdelava podatkov. 

3.1. Označevanje vzorcev 

Vzorce smo označili tako, da je iz oznake razvidno leto in mesec vzorčenja, vrsta 

klobučnjaka (RH- Rhizostoma pulmo) ter zaporedna številka osebka. 

. 

Primer: 06/05/RH43 

06- leto vzorčenja 

05- mesec vzorčenja 

RH- Rhizostoma pulmo 

43- zaporedna številka osebka 

3.2. Recepti za pripravo osnovnih raztopin in njihove koncentracije 

Raztopina za shranjevanje tkiv (20% DMSO nasičen z NaCl) 

DMSO 20 ml 

EDTA 50 ml 0,5M EDTA, pH 8,0 

NaCl 5,06g 

H 2 O do volumna 100 ml 

10 mM TRIS-Cl, pH 8,0l 

121, 1 g TRIS baze 

Dodamo dvakrat destilirano vodo do 800 ml in umerimo pH s koncentrirano HCl, ter 

dodamo destilirano vodo do 1000 ml 

3.2.1. Puferske raztopine 

> Shranjevalni pufer za Taq DNA-polimerazo (Fermentas) 

• 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) 

• 0,1 mM EDTA 

• 100 mM KCl 

14

10-krat koncentrirani PCR-pufer (Fermentas) 

• 100 mm Tris-HCl (pH 8,8 pri 25°C) 

• 500 mM KCl 

• 0,8-odstotni neionski detergent P40 

> Sestava nalagalnega pufra za agarozni gel: 

• 0,05-odstotni bromofenolmodro 

• 0,05-odstotni ksilen cianid v formamidu 

• 40-odstotna (wt/vol) saharoza v dH 2 O 

> Sestava 1x TAE (tris acetatni pufer) za agarozno elektroforezo 

• 0,04 M Tris-acetat 

• 0,001 M EDTA 

• pH 8,0 

> Sestava TE pufra: 

• 10 mM Tris-HCl, pH 8 

• 1 mM EDTA, pH 8 

> Sestava 5-kratne založne raztopine TBE pufra: 

• 445 mM Tris 

• 445 mM borova kislina 

• 1 mM EDTA 

založna raztopina etidijevega bromida s koncentracijo 10 µg/ml 

kit za izolacijo DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN) 

3.2.2. Encimi: 

• Taq DNA-polimeraza (5U/µl, Fermentas) 

• Proteinaza K (Fermentas) 

15

3.2.3. Velikostni standardi DNA: 

• GeneRuler 100bp DNA Ladder (100-1000 bp, Fermentas) 

• Lambda DNA/Hind III Marker, 2 (Fermentas); 23130 bp-125 bp 

3.2.4. Aparature 

- centrifuga (Sigma) 

- ciklični termostat GeneAMP PCR system1400 (Perkin Elmer) 

- vodna kopel 

- napajalnik visoke napetosti za agarozno elektroforezo 

- kadičke za agarozno gelsko elektroforezo 

- modeli za agarozne gele 

- spektrofotometer Bio Quest, CE 2501 (Cecil Instruments Limited, UK) 

- detekcijski sistem za slikanje agaroznih gelov UVITEC (Cambridege, UK) 

3.3. Vzorčenje na terenu 

Opravili smo tri vzorčenja v Tržaškem zalivu v zimskem času (decembra 2006 in 

februarja leta 2007). Za vzorčenje velikih klobučnjakov smo uporabljali povlečno 

kočo, ki sta jo vlekli ribiški plovili Riba I in Riba II. Vzorčenje smo opravili tudi s 

plovilom Sagita, ki je last Morske biološke postaje Nacionalnega inštituta za 

biologijo. Pri vzorčenju s plovila Sagita smo si pomagali z mrežo za lovljenje meduz 

na daljši palici. 

Na plovilu smo vsako meduzo velikega klobučnjaka stehtali in izmerili premer 

klobuka. Takoj, ko smo opravili meritve, smo meduzi odrezali košček tkiva z roba 

klobuka in košček gonad s čisto pinceto in škarjami. Pinceto in škarje smo po 

rezanju dobro sprali z morsko vodo, da smo preprečili kontaminacijo med vzorci. 

Vsak košček tkiva smo shranili posebej v epici z konzervansom (20% DMSO 

nasičen z NaCl ali v 96% alkoholu). Epico smo zaprli, ustrezno označili z imenom 

vrste, datumom in lokacijo vzorčenja. Epice smo imeli ves čas v posodi z ledom, 

dokler jih nismo shranili v tekočem dušiku. Za daljše obdobje smo epice nato shranili 

globoko zamrznjene pri -80ºC. Pri vzorčenju smo si zaščitili roke z rokavicami iz 

lateksa ali gume. 

16

Black Sea 

Adriatic Sea 

Mediterranean Sea 

Slika 5: Zemljevid točk vzorčenja v severnem Jadranu in Črnem morju. 

3.4. Izolacija DNA 

Izolacijo DNA smo opravili z DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). DNA smo 

izolirali samo iz roba klobuka. Za eno izolacijo DNA smo potrebovali: 

- 100 mg vzorčenega tkiva 

- 180 µl pufra ATL 

- 20 µl proteinaze K 

- 200 µl pufra AL (vsebuje gvanidin hidroklorid) 

- 200 µl 96% etanola 

- 500 µl pufra AW1 (vsebuje gvanidin hidroklorid) 

- 500 µl pufra AW2 

- 100 ml pufra AE 

- 1,5 ml epice 

- 2 ml epice s silikatno membrano 

Tkiva smo do izolacije DNA hranili na -80°C. S pinceto smo prenesli tkivo iz epic s 

konzervansom in jih dali v sveže epice ter vsakemu vzorcu dodali 200µl pufra ATL in 

20µl proteinaze K. Vsako epico smo dobro premešali, zavili v parafim in pustili v 

vodni kopeli čez noč na temperaturi pri 65°C. 

Naslednji dan smo vzeli vzorce iz vodne kopeli ter jih ponovno močno premešali, 

dodali 200 µl pufra AL in 200 µl etanola ter še enkrat dobro premešali. Iz vsake 

epice smo odpipetirali reakcijsko mešanico in jo dali v posebne epice s silikatno 

membrano na katero se absorbirajo nukleinske kisline, ter centrifugirali pri 8000 rpm 

eno minuto. Pod epico z membrano smo zbrali pufer za spiranje membrane in ga 

zavrgli. Dodali smo 500µl pufra AW1 in centrifugirali eno minuto na 8000 rpm. 

Absorbirano DNA na membrani smo spirali z 500 µl pufra AW2 in centrifugirali tri 

minute na 14000 rpm. Nato smo v epico z membrano dodali 100 µl pufra AE s 

katerim smo eluirali DNA z membrane. Pufer AE smo pustili na membrani eno 

minuto ter nato centrifugirali eno minuto na 8000 rpm. Postopek smo ponovili 

dvakrat, tako da smo dobili dve frakciji posameznega vzorca. Obeh frakcij nismo 

združevali, 

17

ampak smo jih shranili ločeni. Vzorce smo hranili v zamrzovalniku na temperaturi - 

20°C do nadaljnjih analiz. 

3.4.1. Spektrofotometrične meritve 

Koncentracijo izolirane DNA v vzorcih smo določili spektrofotometrično. Vzorce DNA 

smo redčili 1:100 v 10mM Tris pufru (pH 8,0) in nato izmerili absorbanco pri treh 

valovnih dolžinah (260 nm, 280nm in 320nm). Koncentracijo smo izračunali po 

formuli: 

koncentracija DNA (µg/mL) = A 260 x 50 µg x faktor redčenja 

Za računanje koncentracije DNA smo uporabili spletno aplikacijo 

http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_03.html. 

Kontaminacijo izolirane DNA z beljakovinami smo ovrednotili iz razmerja absorbcije 

pri 260 nm in 280 nm. DNA, ki ima razmerje A 260 /A 280 v razponu od 1,7 do 2,0 je 

primerna za nadaljnjo uporabo in smatramo, da ni kontaminirana z beljakovinami, 

fenolom ali drugimi snovmi, ki absorbirajo ultraviolično svetlobo pri tej valovni 

dolžini. Nekontaminirana dvoverižna DNA, ki ima OD 1 (en centimeter dolžina poti 

žarka; 260 nm) vsebuje 50 µg mL -1 dvoverižne DNA. Na osnovi absorbcije pri 320 

nm lahko ugotovimo ali je DNA kontaminirana s sestavinami iz kita za izolacijo DNA. 

3.5. Agarozna elektroforeza 

3.5.1. Priprava agaroznega gela 

Po izolaciji z DNeasy Blood & Tissue Kit smo preverili količino in kvaliteto oborjene 

DNA na agaroznih gelih. Za izolirane vzorce DNA smo pripravili 1,2% gel po 

naslednjem postopku: zatehtali smo želeno količino agaroze in jo dali v 

erlenmajerico. Dodali smo potrebno količino pufra 1xTAE. Agarozo smo segrevali po 

1 minuto v mikrovalovni pečici na 750 W. Med segrevanjem smo jo večkrat 

premešali. Segrevali smo jo toliko časa, da se je agaroza popolnoma stopila (da ni 

bilo več videti zrnc agaroze). Ko se je agaroza ohladila na približno 50ºC, smo 

dodali etidijev bromid (koncentracija založne raztopine 10mg/mL). Agarozo smo 

ohladili in dodali 3µl EtBr. Pripravili smo banjico za gel z glavničkom, dodali agarozo 

z EtBr ter pustili, da se strdi. Ko se je gel strdil, smo odstranili glavničke in gel na 

podstavku vstavili v posodo za elektroforezo. Za ogled pomnoženih fragmentov COI 

smo pripravili 1,8% agarozo v TAE pufru po zgoraj opisanem postopku. 

3.5.2. Nanašanje vzorcev 

Na parafilm smo nanesli 5µl nalagalnega pufra in mu dodali 5µl vzorca. Vzorec in 

pufer smo premešali in nanesli v žepke na gelu. Poleg vzorcev smo nanesli še 

ustrezen velikostni standard λ DNA/HindIII (Fermentas) za genomsko DNA ali 100 

bp marker za PCR produkte (Fermentas). Na posodo za elektroforezo smo položili 

pokrov ter priključili enosmerni električni tok. Naravnali smo željeno napetost 

elektroforeze. Elektroforeza je potekala 60 minut pri 6V/cm. Po končani elektroforezi 

18

smo si gel ogledali na transiluminatorju, kjer smo ga presvetlili z UV svetlobo 

(325nm) in gele fotografirali ter slike shranili v digitalnem zapisu. 

3.6. PCR reakcija za pomnoževanje mitohondrijske oksidaze C 

Osnovna PCR mešanica je bila sestavljena iz matrične DNA, začetnih 

oligonukleotidov LCO 1490 in HCO 2198 (Folmer in sod., 1994), MgCl 2, Taq DNA 

polimeraze in dNTP-jev. V PCR reakcijo smo dali matrično DNA. Celoten volumen 

reakcijske mešanice za PCR je bil 50µl. Koncentracija vsakega posameznega 

dNTP-ja je znašala v PCR reakciji 0,2mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Kjer nismo 

uspeli pomnožiti COI pri pogojih, ki so opisani spodaj, smo spreminjali koncentracijo 

MgCl 2 in temperaturo prileganja začetnih oligonukleotidov. 

Prvotna reakcijska mešanica za PCR s končnim volumnom 50 µl je vsebovala 

naslednje sestavine v delovnih koncentracijah: 

 

 

5 enot Taq-polimeraze 

5 µl 10-krat koncentriranega pufra za PCR 

2,5 mM MgCl 2 

0,8 mM dNTP 

10 µl LCO 1490 

10 µl HCO 2198 

DNA v razponu od 100 ng do 500ng 

deionizirana in sterilna voda do 50 µl 

Temperaturni profil PCR 

Izhajali smo iz začetnega temperaturnega profila: 

začetna denaturacija: 95 C 3 minuti 

denaturacija: 94 C 1 minuta 

naleganje: 40 C 90 sekund 35 ciklov 

podaljševanje: 72°C 1 minuta 

podaljšana polimerizacija: 72°C 7 minut 

Izhajali smo iz zgoraj napisanega osnovnega temperaturnega profila. PCR je bil 

sestavljen iz 35 ciklov pomnoževanja. Pri denaturaciji se je reakcijska mešanica 

segrela nad 90°C, da smo dosegli prekinitve vodikovih vezi in s tem razklenitev 

dvojne vijačnice DNA. Tako je omogočeno začetnim oligonukleotidom, da najdejo 

komplementarna mesta prileganja na DNA. Prvi cikel denaturacije je bil daljši, do 5 

min, da smo popolnoma ločili obe verigi genomske DNA. Naleganje začetnih 

oligonukleotidov je trajalo od 20 sekund do 1 min. Nato je sledilo podaljševanje verig 

s Taq polimerazo pri optimalni temperaturi delovanja encima, ki je 72ºC. Naslednja 

faza je podaljšana polimerizacija, ki omogoči Taq polimerazi, da dokonča 

podaljševanje. Ta stopnja je še posebej pomembna, kadar pomnožujemo dolge 

fragmente DNA. 

19

3.6.1. Začetni oligonukleotidi 

Za PCR, s katerim smo pomnoževali COI in v asimetričnem PCR za določanje 

nukleotidnega zaporedja v COI, smo uporabili enak par začetnih oligonukleotidov 

(Folmer in sod., 1994). Številki ob imenu začetnih oligonukleotidov pomenita mesto 

naleganja na mtDNA. 

HCO 2198 

5' - TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA- 3' 

LCO 1490 

5'- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAAC- 3' 

3.6.2. Priprava vzorcev za PCR 

Vzorce za PCR smo pripravili v laminariju, zato da smo preprečili kontaminacije s 

pomnožki iz drugih PCR reakcij, ki so lahko v aerosolih. Delali smo na ledu, da smo 

preprečili nespecifično pomnoževanje v PCR. Vsakokrat smo si pripravili potrebno 

količino PCR mešanice brez matrične DNA v 1,5 ml epici in jo dobro premešali. 

Mešanico smo nato razdelili v epice za PCR v ustreznih količinah, nato smo dodali 

še matrično DNA v ustrezni koncentraciji (glej Tabelo 2). Vzorce za PCR smo dobro 

premešali ter jih postavili v ciklični termostat PCR. 

3.7. Določanje nukleotidnega zaporedja 

Nukleotidna zaporedja smo določili v 12 osebkih iz Črnega morja in v 4 osebkih iz 

Koprskega zaliva. Nukleotidna zaporedja vzorcev so bila narejena v podjetju 

Macrogen (Koreja). Za PCR reakcijo za določanje nukleotidnih zaporedij smo 

uporabili enake začetne oligonukleotide (LCO 1490 in HCO 2198 ) kot v prvem 

pomnoževanju s PCR. Za uspešno asimetrično reakcijo PCR smo potrebovali 500 

do 700 ng PCR produkta v 15 µl s koncentracijo 50 ng/µl. Potrebna koncentracija 

začetnega oligonukleotida za en asimetričen PCR je bila 5 pmol v enem µl. 

Nukleotidna zaporedja smo dobili v obliki kromatografskih zapisov in jih ročno 

pregledali v programu ChromasPro 1,34 (Technelysium Pty Ltd). S pregledovanjem 

smo našli mesta z nukleotidi, ki so bili označeni kot dvomljivi (ang. ambigous). Če je 

bilo možno, smo določili pravi nukleotid, če to ni bilo možno, smo pustili originalen 

zapis. Nato smo nukleotidna zaporedja obeh matričnih verig združili v eno 

konsenzusno nukleotidno zaporedje, ki smo ga uporabili za nadaljne obdelave s 

programom BioEdit (Hall, 1999). 

. 

3.8. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v podatkovni zbirki 

GenBank (algoritem BLAST) in poravnava nukleotidnih zaporedij 

Konsezusna nukleotidna zaporedja smo uredili v fasta format (glej priloga A) in 

nato poiskali najbolj podobna nukleotidna zaporedja, ki so v podatkovni zbirki 

20

GenBank. Za iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij smo uporabili algoritem Blast, 

ki se nahaja na spletni strani podatkovne zbirke GenBank (Blast pognan 5.2.2008, 

glej priloga D). 

Vsa nukleotidna zaporedja velikega klobučnjaka in njemu podobna nukleotidna 

zaporedja, ki so bila rezultat iskanja v GenBank, smo nato poravnali s programom 

Clustal (Higgins in sod., 1988), ki je dostopen na spletu 

http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. 

Nastavitev programa nismo spreminjali. Iz poravnanih nukleotidnih zaporedij smo 

izrezali vrzeli (ang. gaps). Rezultat so poravnana nukleotidna zaporedja, ki smo jih 

nato uporabili za nadaljno obdelavo in izračune. Poravnana nuklotidna zaporedja so 

prikazana v prilogi B. 

3.9. Filogeografska analiza nukleotidnih zaporedij 

Filogeografsko analizo vzorcev velikega klobučnjaka iz Črnega morja (Modri zaliv) in 

severnega Jadranskega morja (Koprski zaliv) smo naredili v programu MEGA 

(Kumar in sod., 2004). Kot osnovo za izračune smo uporabili poravnana nukleotidna 

zaporedja narejena v programu Clustal (glej poglavje 3.7 in priloga B). 

Pri obdelavi podatkov iz nukleotidnih zaporedij in za izris filogenetskega drevesa 

smo uporabili dve metodi; metoda združevanja najbližjega soseda (ang. Neighbour- 

Joining (NJ)), ki sodi med nediskretne metode (metode razdalj) in za oblikovanje 

filogenetskega drevesa uporablja parna neskladja (med nukleotidi na istem mestu v 

DNA), ter Kimurino-2 parametersko metodo, s katero smo izračunali parne razdalje 

posameznih haplotipov (Kimura, 1980). Filogenetsko drevo smo narisali v programu 

MEGA. Za koreninjenje filogenetskega drevesa smo uporabili kot zunanjo skupino 

nukleotidno zaporedje iz vrste Nemopilema nomurai (AB243416). 

21

4. REZULTATI IN RAZPRAVA 

V diplomskem delu smo uporabili 21 vzorcev nabranih v severnem Jadranskem 

morju (Koprski in Piranski zaliv) in 25 vzorcev iz Črnega morja, ki nam jih je poslala 

dr. Tamara Shiganova (Shirshov inštitut za oceanologijo iz Moskve). Vzorci meduz 

velikega klobučnjaka, ki so bili nabrani v Tržaškem zalivu, so bili nabrani v 

novembru in decembru 2006 ter še januarja in februarja 2007. V Jadranskem morju 

je množično pojavljanje velikega klobučnjaka dokumentirano le v hladnem delu leta. 

V to obdobje sodijo tudi opažanja ribičev in naključnih obiskovalcev ob obali. Zelo 

obsežno množično pojavljanje velikega klobučnjaka v Tržaškem zalivu je bilo 

zabeleženo leta 2005. 

Podrobnejši podatki o vzorcih iz katerih smo izolirali DNA so opisani v Tabeli 2. 

Tabela 2: Seznam uporabljenih vzorcev za filogeografsko analizo velikega 

klobučnjaka. 

DATUM VZORČENJA MESTO VZORČENJA OZNAKA VZORCA 

15.12. 2006 Piranski zaliv (Bernardin) 12/06/RH1 



28.11.2006 Koprski zaliv 11/06/RH1 








September, 2005 Črno morje 07/05/RH1 







Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH27 



Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH B 

Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH C 

Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH D 

Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH E 

Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH G 

Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH H 

Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH K 

Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH M 

Junij, 2005 Črno morje 08/05/RH N 














22

DATUM VZORČENJA MESTO VZORČENJA OZNAKA VZORCA 




4.1. Rezultati izolacije DNA iz tkiva velikega klobučnjaka 

DNA smo izolirali iz roba klobuka meduze velikega klobučnjaka po navodilih 

proizvajalca s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). Kvaliteto in količino DNA 

smo preverili na 1,2-dstotnem agaroznem gelu. Velikost izolirane DNA smo določili s 

primerjavo z velikostnim standardom Hind III λ marker (Fermentas). S primerjavo 

jakosti obarvanih fragmentov DNA smo približno določili njihovo koncentracijo. 

Rezultati izolacije DNA so prikazani na slikah: slika 6, slika 7, slika 8 in slika 9 . 

4.1.1. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v severnem Jadranskem morju 

Slika 6 prikazuje rezultat izolacije DNA iz 9 vzorcev, ki so bili nabrani v Piranskem in 

Koprskem zalivu (glej Tabelo 2) v obdobju od decembra 2006 do februarja 2007. 

Izolacijo DNA smo opravili iz roba klobuka. Izolacija DNA (prikazana na sliki 6) je 

bila uspešna v 8 primerih (11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6, 

11/06/RH2, 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3). Na stezi, kjer je nanešen vzorec 

11/06/RH1, ni vidna DNA, a smo s spektrofotometričnim merjenjem ugotovili, da je v 

vzorcu vseeno DNA v zelo nizki koncentraciji 30ng/µl (Tabela 3). Agarozna 

elektroforeza nam omogoča, da lahko ocenimo kakšne velikosti je izolirana DNA in 

približno oceno koncentracije DNA v vzorcu. Na sliki vidimo, da smo uspeli izolirati 

visoko molekularno DNA, katere velikost smo ocenili na 23 000 bp. Izolirana DNA je 

tudi delno razgrajena, kar je videti kot razmaz na stezi 

pod visoko molekularno DNA. Količina vzorca, ki smo jo nanesli v luknjico v gelu, je 

5 µl. Količina izolirane DNA med vzorci je različna in je odvisna predvsem od 

količine tkiva, ki je bila uporabljena za izolacijo. 

23

Slika 6: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit 

(QIAGEN). Oznake vzorcev (od levi proti desni): 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3, 

11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6 (vzorci iz JV 

Tržaškega zaliva). Na vsako stezo smo nanesli 5 µl vzorca. 

V Koprskem zalivu smo nabrali 18 osebkov velikega klobučnjaka. Nato smo iz 10 

meduz velikega klobučnjaka izolirali DNA. Iz vzorcev smo izolirali visokomolekularno 

DNA (14/07/RH1, 14/07/RH2, 14/07/RH3, 14/07/RH4, 14/07/RH7, 14/07/RH8, 

14/07/RH9) (glej Sliko 7). Koncentracija izolirane DNA je bila v razponu od 727 

ng/µl do 237 ng/µl (Tabela 3). Iz vzorcev 14/07/RH5, 14/07/RH6, 14/07/RH10 smo 

izolirali razgrajeno DNA v zelo nizki koncentraciji. Na agaroznem gelu je razkosana 

DNA videti kot razmaz na stezi. 

24

Slika 7: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit 

(QIAGEN). Prva steza: velikostni standard λ marke (5 µl), sledijo vzorci (od leve 

proti desni): 14/07/RH1, 14/07/RH2, 14/07/RH3, 14/07/RH4, 14/07/RH5, 14/07/RH6, 

14/07/RH7, 14/07/RH8, 14/07/RH9, 14/07/RH10. Na vsaki stezi je nanešeno 5 µl 

vzorca. Slika 5 je sestavljena iz dveh slik. 

25

Slika 8: DNA izolacija iz velikega klobučnjaka s DNeasy Blood & Tissue Kit ( 

QIAGEN). 

Prva steza: velikostni standard λ marker (5 µl), sledijo vzorci (od leve proti desni): 

11/06RH7/1, 11/06RH7/2, 11/06RH1/1, 11/06RH1/2, 11/06RH2/1, 11/06RH2/2, 

11/06RH3/1, 11/06RH3/2, 12/06/RH1/1, 12/06/RH1/2, 12/06/RH2/1, 12/06/RH2/2, 

12/06/RH3/1, 12/06/RH3/2, 14/07/RH11/1, 14/07/RH11/2, 14/07/RH12/1, 

14/07/RH12/2, 14/07/RH14/1, 14/07/RH14/2, 14/07/RH15/1, 14/07/RH15/2, 

14/07/RH16/1, 14/07/RH16/2. Na vsako stezo smo nanesli 5 µl vzorca. 

Veliko količino DNA smo izolirali iz vzorcev 13/07/RH1 in 13/07/RH2, ki so bili 

nabrani v Tržaškem zalivu (glej Sliko 9). Izmerjena količina DNA je bila največja 

med vsemi vzorci in sicer 2000 ng/µl v vzorcu 13/07/RH1 in 2210 ng/µl v vzorcu 

13/07/RH2. Izolirana DNA je bila delno razgrajena, a še vedno dovolj kvalitetna za 

nadaljnje manipulacije. 

26


QIAGEN). 

Prva steza: velikostni standard λ marker (5 µl) sledijo vzorci (od leve proti desni): 

07/05/RH1, 07/05/RH2, 07/05/RH3, 07/05/RH4, 07/05/RH5, 07/05/RH6, 07/05/ 

RH7,vzorci iz Koprskega zaliva: 13/07/RH1, 13/07/RH2. Na vsaki stezi je nanešeno 

5 µl vzorca. Slika 9 je sestavljena iz dveh slik. 

4.1.2. Izolacija DNA iz vzorcev nabranih v Črnem morju 

Manj uspešna je bila izolacija DNA iz vzorcev, ki so bili nabrani v Črnem morju in so 

bili shranjeni dlje časa (nabrani v septembru 2005) v 20% DMSO nasičenem z NaCl. 

Za izolacijo DNA smo uporabili tkivo z roba klobuka. Kadar je tkivo shranjeno v tem 

konzervansu dlje časa, postane bolj tekoče (Dawson in sod., 1998), zato smo ga 

morali odpipetirati v epico, v kateri je potekala izolacija DNA. DNA zelo dobre 

kvalitete smo izolirali iz vzorcev 07/05/RH1 in 07/05/RH5 (Slika 9). Izolacija DNA ni 

uspela iz vzorcev 07/05/RH2 in 07/05/RH3, kar smo potrdili tudi z 

spektrofotometričnimi meritvami. Koncentracija DNA je bila v razponu 15 ng/µl do 

55 ng/µl, kar so bile najnižje izmerjene vrednosti izolirane DNA. 

27

Slika 10 prikazuje vzorce iz Črnega morja, iz katerih so že predhodno izolirali DNA 

na Morski biološki postaji v Piranu, in smo jih prav tako uporabili za pomnoževanje 

COI. DNA je bila izolirana z detergentom CTAB. Koncentracija izolirane DNA je bila 

v velikem velikostnem razponu. Najnižjo koncentracijo smo izmerili v vzorcu 

08/05/RH D in sicer 119 ng/µl, najvišjo koncentracijo smo izmerili v vzorcu 

08/05/RH H in sicer 4100ng/µl. 


QIAGEN). 

Prva steza: velikostni standard λ marker (5 µl), sledijo vzorci (od leve proti desni): 

08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH B, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 

08/05/RH E, 08/05/RH G, 08/05/RH H, 08/05/RH K, 08/05/RH N, 08/05/RH M, 

08/05/RH3, 08/05/RH4, 08/05/RH12, 08/05/RH13, 08/05/RH15, 08/05/RH16. Na 

vsaki stezi je nanešeno 5 µl vzorca. Slika 8 je sestavljena iz dveh slik. 

Kit DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) je primeren za izolacijo DNA iz meduz 

klobučnjakov. Tudi količina in kvaliteta izolirane DNA je bila zadovoljiva in je v 

glavnem odvisna od časa shranjevanja vzorcev v konzervansu. Primerjava izoliranih 

DNA pokaže, da je boljše kvalitete DNA, ki smo jo izolirali kmalu po vzorčenju (glej 

sliko 6). DNA, smo iz vseh vzorcev izolirali po enakem postopku s kitom DNeasy 

Blood & Tissue Kit ( QIAGEN), razen nekaj vzorcev iz Črnega morja, iz katerih je 

bila DNA izolirana že prej z detergentom CTAB. Daljši čas shranjevanja tkiva v 

konzervansu pomeni tudi večjo razgradnjo DNA v shranjenem tkivu. Najbolj 

zanesljivo je shranjevanje tkiv v tekočem dušiku takoj po odvzemu in nato na -80 C. 

Žal pa pri terenskem delu ni možno vedno zagotoviti takšnega načina shranjevanja. 

Raziskovalci so uporabili tudi klasične metode izolacije DNA in preverili, kolikšna je 

razgradnja DNA glede na čas shranjevanja. Ugotovili so, da mora biti tkivo 

shranjeno na čimbolj nizkih temperaturah in čim krajši čas. V študiji so primerjali 

različne pogoje shranjevanja in različne organizme. Največjo razgradnjo DNA so 

opazili pri uhatem klobučnjaku in manjšo pri drugih morskih nevretenčarjih, kot sta 

morski polž Astrea undosa in vetrnica Anthopleura xanthogrammica. Zaradi velike 

vsebnosti vode v tkivih morskih nevretenčarjev ni možno ohraniti DNA s hitrim 

sušenjem tkiva (Dawson in sod., 1998). 

28

Priporočena količina tkiva za izolacijo s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN) 

je 25mg in se nanaša na vrsto tkiva. Vsa omenjena tkiva vsebujejo večje število 

celic in zaradi tega več DNA. Klobučnjaki imajo v telesu meduze v glavnem 

mezoglejo, ki pa vsebuje zelo majhno število celic. Prav tako imajo klobučnjaki 

veliko vsebnost vode v telesu. Pri izolaciji smo morali zagotoviti zadosti tkiva, da 

pridobimo zadovoljivo količino DNA za nadaljne manipulacije, kakor tudi paziti, da s 

preveliko količino tkiva ne onemogočimo adsorbcije DNA na silikatno kolono. 

4.1.3. Rezultati spektrofotometričnih meritev genomske DNA 

Koncentracijo DNA smo ovrednotili na podlagi meritve absorbcije pri 260 nm in 280 

nm. Vzorce smo redčili v razmerju 1 proti 100 v pufru 10 mM Tris (pH 8,0). Iz 

vrednosti absorbcije pri 260 nm smo po opisani formuli izračunali koncentracijo 

DNA. Koncentracijo DNA smo podali v ng v enem mikrolitru. Izmerjene 

koncentracije so nizke. To smo nekako tudi pričakovali, saj je celotna meduza 

zgrajena v glavnem iz mezogleje, ki ne vsebuje veliko celic. Količina DNA v vzorcih 

je v razponu od najvišje vrednosti 4100ng/µl do 3,07 ng/µl. Izplen DNA iz roba 

klobuka meduze je mnogo manjši v primerjavi z izplenom iz drugih tkiv bolj bogatih s 

celicami, kadar uporabimo kit DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN). Z istim kitom 

lahko iz tkiv, ki so bogata s celicami, izoliramo do 40 µg DNA iz 25 mg repka 

podgane ali do 30 µg DNA iz možgan. Izplen DNA iz plavutke ribe (pribl. 20 mg) z 

istim kitom znaša 10 do 20 µg DNA. Majhna količina DNA pomeni tudi manj možnih 

manipulacij, zato priporočamo zaradi majhnega izplena DNA iz roba klobuka, da se 

pri vzorčenju odvzame več koščkov tkiva. Tako je kasneje možno izpeljati več 

izolacij iz DNA istega osebka in pridobiti zadosti DNA za nadaljne delo. 

Zgodi se, da se DNA ne raztopi, ampak ostane neraztopljena v topilu. Zato je tudi 

možno, da vzamemo alikvot, v katerem ni veliko raztopljene DNA. Razlog, da se 

DNA ne raztopi popolnoma v topilu je predvsem v nečistočah, ki so vezane na DNA 

in so povezane z vrsto tkiva, iz katerega jo izoliramo ali pa na okolje, v katerem je 

tkivo kot na primer izolacija DNA iz mikrobnih vzorcev sedimenta, vampa ali prsti 

(Roe in sod., 1996). 

29

Tabela 3: Izračun količine DNA v vzorcu. 

OZNAKA VZORCA RAZMERJE (A 260: A 280) KONCENTRACIJA DNA 

V VZORCU (ng/µL) 

12/06/RH1 1,8 148 

12/06/RH2 2,02 232 

12/06/RH3 1,9 193 

11/06/RH1 1,2 29 

11/06/RH2 1,5 54 

11/06/RH3 1,8 108 

11/06/RH4 1,7 757 

11/06/RH5 1,7 74 

11/06/RH6 2,1 113 

13/07/RH1 1,9 2000 

13/07/RH2 1,7 2210 

07/05/RH1 11 55 

07/05/RH2 0 0 

07/05/RH3 0 0 

07/05/RH4 1,5 14 

07/05/RH5 2 39 

07/05/RH6 2 19 

07/05/RH7 1 10 

14/07/RH1 2 212 

14/07/RH2 2,1 559 

14/07/RH3 2,0 247 

14/07/RH4 2,1 480 

14/07/RH5 4,19 410 

14/07/RH6 2,3 430 

14/07/RH7 2 237 

14/07/RH8 1,9 242 

14/07/RH9 2,1 500 

14/07/RH10 2,1 727 

08/05/RH16 1,7 292 

08/05/RH B 1,8 1 

08/05/RH H 1,9 4100 

08/05/RHN 1,9 970 

08/05/RH3 1,8 3 

08/05/RH4 1,8 3 

08/05/RH27 1,8 787 

08/05/RH31 2,2 153 

08/05/RH33 2,2 188 

08/05/RHC 1,9 613 

08/05/RHD 1,8 118 

08/05/RHE 1,9 153 

08/05/RHG 2,0 999 

08/05/RHK 1,9 371 

08/05/RHM 1,7 108 

08/05/RH12 1,8 732 

08/05/RH13 1,9 920 

08/05/RH15 1,9 970 

4.2. Rezultati pomnoževanja citokrom C oksidaze z reakcijo PCR 

V reakciji PCR smo pomnoževali zapis za encim citokrom oksidazo C in sicer za 

podenoto I (COI) s parom začetnih oligonukleotidov LCO 1490 in HCO 2198 (Folmer in 

sod., 1994 ). Za PCR reakcijo smo uporabili temperaturni profil in reakcijsko 

mešanico, ki sta opisana v poglavju 3.5. in 3.5.2. Reakcijske mešanice so se 

razlikovale po količini dodane matrične DNA (glej Tabelo 3). 

30

Najprej smo pripravili ustrezne redčine izoliranih DNA po naslednji shemi :5µl DNA + 

45 µl sterilne vode (glej tabelo 3). Količine dodane matrične DNA v PCR reakciji so 

razvidne iz Tabele 4. Vzorcev, kjer smo izolirali malo DNA, nismo redčili. 

Pomnožili smo 700bp dolg fragment COI, ki smo ga uspeli pomnožiti v 16-ih vzorcih. 

Pomnoževanje je bilo uspešno v slabi tretjini vzorcev (27 odstotkih). Velikost 

pomnoženih produktov smo določili s primerjavo z velikostnim standardom 

GeneRuler 100bp DNA Ladder ((100–1000 bp) Fermentas na agaroznem gelu. 

Tabela 4: Količina dodane matrične DNA v posamezni PCR reakciji ter uspešnost 

pomnoževanja COI. 

OZNAKA 

VZORCA 

REDČITEV 

MATRIČNE 

DNA 

KONCENTRACIJA 

REDČENE DNA 

(ng/µl) 

KOLIČINA 

MATRIČNE 

DNA (µL) 

KONCENTRACIJA 

MATRIČNE DNA V 

PCR (ng) 

06/05/RH43 1:10 Ni izmerjena 15 - + 

06/05/RH46 1:10 Ni izmerjena 15 - + 

08/05/RH16 292 10 2920 + 

08/05/RH B 1 10 18 + 

08/05/RH H 4100 10 41000 + 

08/05/RH N 970 10 9702 + 

07/05/RH3 0 3 0 + 

06/05/RH43 10 - - 

06/05/RH46 10 - - 

07/05/RH3 1:10 0 5 0 - 

07/05/RH4 1:10 1 5 7 - 

08/05/RH4 1:10 0 5 1 - 

08/05/RH27 1:10 78 10 787 + 

08/05/RH31 1:10 15 5 76 + 

08/05/RH33 1:10 18 5 94 + 

08/05/RH D 1:10 11 10 118 + 

08/05/RH E 1:10 15 5 76 + 

08/05/RH G 1:10 99 5 499 + 

08/05/RH K 1:10 37 5 185 - 

08/05/RH M 1:10 10 5 54 - 

08/05/RH12 732 7 5128 - 

08/05/RH13 920 10 9207 - 

08/05/RH15 970 10 9702 - 

08/05/RH16 292 5 1460 - 

07/05/RH6 19 5 99 + 

12/06/RH1 148 1 148 - 

12/06/RH2 232 1 232 + 

12/06/RH3 193 1 193 + 

11/06/RH1 29 1 29 - 

11/06/RH2 54 1 54 - 

11/06/RH3 108 1 108 + 

11/06/RH4 757 1 757 - 

11/06/RH5 74 1 74 - 

11/06/RH6 113 1 113 - 

11/06/RH5 

redčina 

11/06/RH6 

redčina 

1:10 7 5 37 - 

1:10 11 5 56 - 

USPEŠNOST 

POMNOŽEVAN 

JA COI 

31

OZNAKA 

VZORCA 

REDČITEV 

MATRIČNE 

DNA 

KONCENTRACIJA 

REDČENE DNA 

(NG/ΜL) 

KOLIČINA 

MATRIČNE 

DNA (µL) 

KONCENTRACIJA 

MATRIČNE DNA V 

PCR (NG) 

07/05/RH3 1:10 0 5 0 - 

08/05/RH16 292 5 1460 - 

08/05/RH B 1 5 5 - 

08/05/RH H 4100 5 20500 - 

08/05/RH N 970 5 4851 - 

08/05/RH27 1:10 78 10 787 - 

08/05/RH31 1:10 15 10 153 - 

08/05/RH33 1:10 18 10 188 - 

08/05/RH C 1:10 61 10 613 - 

08/05/RH D 1:10 11 5 59 - 

08/05/RH E 1:10 15 5 76 - 

08/05/RH G 1:10 99 5 499 - 

11/06/RH7 10 - - 

11/06/RH1 29 10 297 - 

11/06/RH2 54 10 544 - 

12/06/RH1 148 10 1485 - 

12/06/RH2 232 10 2326 - 

12/06/RH3 193 10 1930 + 

14/07/RH1 212 1 212 + 

14/07/RH3 247 1 247 + 

14/07/RH7 237 1 237 - 

14/07/RH8 242 1 242 + 

14/07/RH11 7 - + 

14/07/RH12 7 - + 

14/07/RH14 7 - + 

14/07/RH15 10 - + 

14/07/RH16 10 - - 

Legenda 

: + uspešno pomnožen COI, 

- neuspešno pomnožen COI 

USPEŠNOST 

POMNOŽEVAN 

JA COI 

Rezultati pomnoževanja COI so prikazani na spodnjih slikah. Produkte 

pomnoževanja smo nanesli na 1,8 % agarozni gel, ki smo ga pripravili, kot je 

opisano v poglavju 3.4.1 in 3.4.2. 

COI smo uspeli pomnožiti v vzorcih (glej sliko 10): 06/05/RH43, 06/05/RH46, 

07/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N. Jakost pomnoženih 

fragmentov je bila različna, učinkovitost pomnoževanja v PCR je bila verjetno 

odvisna od količine in kvalitete izolirane DNA. Vzorci 08/05/RH16, 08/05/RH B, 

08/05/RH H, 08/05/RH N, 07/05/RH3 imajo na agaroznem gelu zelo močan signal, 

zato lahko sklepamo na visoko koncentracijo pomnoženega produkta. V vsak vzorec 

smo dodali 5µl matrične DNA. 

COI v vzorcih 06/05/RH43, 06/05/RH46 smo pomnožili v PCR pri naslednjih pogojih: 

temperaturi naleganja 40º C, koncentracija MgCl 2 je bila 1,5 mM ter koncentracija 

obeh začetnih oligonukleotidov je znašala 0,5µM. 

32

Slika 11: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka. 

Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami (od leve proti desni): 06/05/RH43, 

06/05/RH46, 07/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 

velikostni standard 100bp DNA 

Vzorca (glej sliko 11) 06/05/RH43 in 06/05/RH46 smo ponovno namnožili 

(reamplificirali), kar pomeni da smo za matrično DNA uporabili neprečiščen PCR 

produkt iz predhodnega pomnoževanja s PCR. PCR reakcije, iz katerih smo 

uporabili PCR produkt so prikazane na sliki 11. V obeh vzorcih (06/05/RH43, 

06/05/RH46) smo s ponovnim pomnoževanjem uspešno namnožili COI. Uspešno 

smo pomnožili COI tudi v vzorcih: 07/05/RH3, 08/05/RH3 in 08/05/RH4. Jakost 

pomnoženih fragmentov je bila različna. Poleg DNA so se v vseh vzorcih pomnožili 

še drugi nespecifični produkti, ki so vidni kot razmaz na stezi. Pomnoženi produkti 

COI niso specifični in tudi po velikosti (ker so manjši od 700bp) ne ustrezajo pravim 

velikostim COI. V vzorcu 07/05/RH4 se ni pomnožil COI, ampak je videti, kot da je v 

njem veliko visokomolekularne DNA. To je videti iz primerjave s sliko, na kateri je 

izolirana DNA tega vzorca. Velike količine DNA prav tako lahko inhibirajo 

pomnoževanje v PCR. 

Pogoji, pri katerih smo pomnožili COI, so bili: temperatura naleganja 40º C, 

koncentracija MgCl 2 je bila 1,5 mM, ter koncentracija začetnih oligonukleotidov je 

znašala 0,5µM. 

33


Rezultat PCR reakcije vzorcev z oznakami ( od leve proti desni): 06/05/RH43, 

06/05/RH46, 07/05/RH3, 07/05/RH4, 08/05/RH3, 08/05/RH4, 100bp DNA. Slika 12 

je sestavljena iz dveh slik. 

COI smo uspešno pomnožili devetih vzorcih iz Črnega morja (08/05/RH27, 

08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G, 

08/05/RH K, 08/05/RH M). Rezultati pomnoževanja so prikazani na sliki 12. Jakost 

pomnoženih fragmentov je bila različna in verjetno odvisna od količine in kvalitete 

izolirane DNA. Pomnoževanje vzorcev 08/05/RH27, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 

08/05/RH G je bilo zelo učinkovito in na gelu smo videli močno obarvane pomnožke 

DNA. V vzorcih 08/05/RH K, 08/05/RH M smo namnožili produkte, ki po velikosti ne 

ustrezajo velikosti COI in smo jih zato ovrednotili kot nespecifične produkte. 

Pogoji pomnoževanja COI so bili temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl 2 

je bila 1,5 mM ter koncentracija začetnih oligonukleotidov je znašala 0,5µM. 

34



08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G, 

08/05/RH K, 08/05/RH M , velikostni standard 100bp DNA. Slika 13 je sestavljena iz 

dveh slik 

35

. COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 14) tudi v vzorcu 08/05/RH12. V vzorcih 

07/05/RH6, 08/05/RH C, 08/05/RH16, 08/05/RH15, 08/05/RH13,nam COI ni uspelo 

namnožiti. 



08/05/RH C, 08/05/RH16, 08/05/RH15, 08/05/RH13, 08/05/RH12 ,velikostni 

standard 100bp DNA. Slika 14 je sestavljena iz več posameznih slik agaroznih 

gelov. 

36

COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 15) v vseh vzorcih: 12/06/RH2, 12/06/RH3, 

11/06/RH1, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5 (vzorci iz Koprskega zaliva). Na gelu 

smo videli, da je količina pomnožene DNA majhna. DNA, ki smo jo uporabili za 

matrično DNA, je bila slabe kvalitete in nizke koncentracije. Jakost pomnoženih 

fragmentov je nizka, količina in kvaliteta izolirane DNA slaba (glej Tabela 4). Pri 

vzorcih 12/06/RH1 ter 11/06/RH6 nam COI ni uspelo namnožiti. 

Slika 15: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz Koprskega 

zaliva. 


12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 

11/06/RH6, velikostni standard 100bp DNA. 

37

Pomnoževanje COI v naslednjih vzorcih iz Koprskega zaliva (11/06/RH5, 

11/06/RH6, 11/06/RH5 redčenje (1:10), 11/06/RH6 redčenje (1:10) in v vzorcih iz 

Črnega morja (08/05/RH3, 08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 

08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 

08/05/RH G) ni bilo uspešno. Rezultat pomnoževanja so nespecifični pomnožki, ki 

so na sliki vidni kot lise. Pogoji pomnoževanja so bili naslednji: temperatura 

naleganja 40º C, koncentraciji MgCl 2 1,5 mM in koncentracija začetnih 

oligonukleotidov 0,5µM. 



11/06/RH6, 11/06/RH5 redčenje (1:10), 11/06/RH6 redčenje (1:10), 08/05/RH3, 

08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 08/05/RH27, 08/05/RH31, 

08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH G, velikostni standard 

100bp DNA. 

COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 17) vzorcih: 07/05/RH3, 08/05/RH B, 

08/05/RH H, 08/05/RH N, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 08/05/RH K. 

Jakost pomnoženih fragmentov je bila različna in odvisna od količine in kvalitete 

izolirane DNA (glej Tabela 3). V ostalih vzorcih nismo uspeli pomnožiti COI. V 

vzorcih smo pomnožili tudi nespecifične produkte. COI smo pomnožili pri pogojih: 

temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl 2 1,5 mM, koncentracija začetnih 

oligonukleotidov 0,5 µM. 

38

Slika 17: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka 


08/05/RH16, 08/05/RH B, 08/05/RH H, 08/05/RH N, 08/05/RH3, 08/05/RH4, 

08/05/RH27, 08/05/RH31, 08/05/RH33, 08/05/RH C, 08/05/RH D, 08/05/RH E, 

08/05/RH G, 08/05/RH K, 06/05/RH40, 06/05/RH43, 06/05/RH45, velikostni 

standard 100bp DNA. 

39

Slika 18: Pomnoževanje COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka 


11/06/RH1, 11/06/RH2, 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3,14/07/RH11, 

14/07/RH12, 14/07/RH14, 14/07/RH15, 14/07/RH16, 10/06/RH1/2, 10/06/RH2/1, 

10/06/RH3/1, 10/06/RH4/2, 10/06/RH6/2, 10/06/RH7/1, 10/06/RH8/1, 10/06/RH9/2, 

velikostni standard 100bp DNA. 

40

4.2.1. Reamplifikacija PCR 

Pri vzorcih pri katerih smo v prvem PCR pomnožili premalo količino DNA smo 

uporabili reamplifikacijo. To pomeni, da smo v PCR uporabili produkt prejšnjega 

PCR kot matrično DNA. V PCR smo dodali alikvot neprečiščenega PCR produkta 

5µl. Reamplifikacijo smo izvedli v vzorcih, ki se niso pomnožili v PCR z naslednjimi 

pogoji: temperatura naleganja 40º C, koncentracija MgCl 2 1,5 mM, koncentracija 

začetnih oligonukleotidov 0,5 µM, smo poskušali ponovno namnožiti v PCR, v 

katerem smo kot matrično DNA uporabili PCR produkt, ne pa izolirano DNA. Slika 

19 prikazuje reamplifikacijo vzorcev iz PCR reakcije (glej sliko 15). Za 

reamplifikacijo smo uporabili naslednje vzorce: 12/06/RH1, 12/06/RH2, 12/06/RH3, 

11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 11/06/RH6. Z 

reamplifikacijo smo uspeli v vseh vzorcih pomnožiti COI, vendar so se poleg DNA 

namnožili še krajši nespecifični produkti. 

Slika 19: Reamplifikacija COI s PCR v vzorcih velikega klobučnjaka iz Koprskega 

zaliva. 


12/06/RH2, 12/06/RH3, 11/06/RH1, 11/06/RH2, 11/06/RH3, 11/06/RH4, 11/06/RH5, 

11/06/RH6, velikostni standard 100bpDNA. 

Zaradi kratkoverižnih nespecifičnih produktov (Slika 19) je za nadaljno uporabo 

potrebno iz gela izolirati specifičen produkt. Tega v okviru diplomske naloge nismo 

opravili. 

41

4.2.2. Pomnoževanje COI pri višji temperaturi naleganja 

Ker smo iz nekaterih vzorcev pomnožili nespecifične produkte (temperatura 

naleganja začetnih oligonukleotidov je bila 40ºC), smo zvišali temperaturo naleganja 

začetnih oligonukleotidov na 50ºC, da bi zagotovili bolj specifično pomnoževanje. 

Spremenjen temperaturni profil za pomnoževanje COI s temperaturo naleganja 

začetnih oligonukleotidov 50ºC je bil : 

95ºC 3min 

94ºC 1min 

50ºC 90 sek 35 ciklov 

72ºC 1min 

72ºC 7min 

4ºC ∞ 

S spremembo temperature prileganja (glej sliko 20), smo uspeli pomnožiti 

specifičen produkt COI v naslednjih vzorcih: 14/07/RH1, 14/07/RH3, 14/07/RH7, 

14/07/RH8. V PCR smo povečali še število enot Taq polimeraze z 1,25 U na 2,5 U. 

Za pozitivno kontrolo pomnoževanja smo uporabili DNA mesečinke (vzorec DNA 

06/05/PN5). Negativna kontrola je bila PCR reakcijo, v kateri smo namesto matrične 

DNA dodali sterilno destilirano vodo, ki smo jo uporabljali za PCR. 



14/07/RH3, 14/07/RH7, 14/07/RH8, 08/05/RH16 (stara red., redčitev 10:1), 

08/05/RH1 (nova red.redčitev 10:1), 11/06/RH6, pozitivna kotrola (mesečinka), 

negativna kontrola (H 2 O), velikostni standard 100bp DNA. 

42

COI smo uspešno pomnožili (glej sliko 20) v vzorcih: 11/06/RH7, 11/06/RH1, 

11/06/RH2, 12/06/RH1, 12/06/RH2, 14/07/RH12, 10/06/RH1/2. Jakost pomnoženih 

fragmentov je bila različna in verjetno odvisna od količine in kvalitete izolirane DNA. 

V vzorcih 10/06/RH2/1, 10/06/RH3/1 in 10/06/RH4/2 smo poleg DNA pomnožili 

nespecifične produkte, ki so vidni kot razmaz na stezi. V ostalih desetih vzorcih nam 

COI ni uspelo namnožiti. COI smo pomnožili pri temperaturi naleganja 40º C, 

koncentracija in koncentracija MgCl 2 je bila 1,5 mM ter koncentracija začetnih 

oligonukleotidov je znašala 0,5 µM. 

4.3. Določevanje nukleotidnega zaporedja (sekvenciranje) 

Nukleotidno zaporedje smo določili v desetih vzorcih (glej Tabelo 4). Za določevanje 

nukleotidnega zaporedja smo uporabili začetna oligonukleotida LCO 1490 in HCO 2198 . 

Vzorce, ki smo jim določili nukleotidna zaporedja, smo preimenovali. Novo ime je 

sestavljeno iz številke vzorca in zaporedne številke osebka v tem vzorcu. Najprej 

smo naročili določitev nukleotidnega zaporedja ene verige in nato še določitev 

nukleotidnega zaporedja druge verige. Za določanje nukleotidnega zaporedja smo 

pripravili 16 vzorcev (glej Tabela 5). Nukleotidna zaporedja smo pridobili iz 7 

vzorcev iz Črnega morja in iz dveh vzorcev iz Tržaškega zaliva. Iz 7 vzorcev nismo 

uspeli pridobiti nukleotidnega zaporedja zaradi premalo PCR produkta. Dolžina 

nukleotidnih zaporedij je bila od 660 bp do 680 bp in je ustrezala pričakovani 

velikosti COI. 

Tabela 5: Seznam vzorcev z določenim nukleotidnim zaporedjem 

MESTO 

VZORČENJA 

OZNAKA VZORCA NOVA OZNAKA 

VZORCA 

Črno Morje 08/05/RH27 0801 - 

Črno Morje 08/05/RH31 0802 - 

Črno Morje 08/05/RH33 0803 - 

Črno Morje 08/05/RH C 0804 - 

Črno Morje 08/05/RH D 0805 670 

Črno Morje 08/05/RH E 0806 - 

Črno Morje 08/05/RH G 0807 670 

Črno Morje 07/05/RH33 0703 660 

Črno Morje 08/05/RH16 0808 670 

Črno Morje 08/05/RH B 0809 670 

Črno Morje 08/05/RH H 0810 670 

Črno Morje 08/05/RH N 0811 670 

Koprski zaliv 14/07/RH4 1404 680 

Koprski zaliv 14/07/RH3 1403 670 

Koprski zaliv 14/07/RH2 1402 - 

Koprski zaliv 14/07/RH1 1401 - 

Legenda: - nukleotidnega zaporedja nismo uspeli določiti 

DOLŽINA 

NUKLEOTIDNEGA 

ZAPOREDJA 

(ŠT. BAZNIH PAROV) 

4.3.1. Iskanje podobnih nukleotidnih zaporedij v GenBank (algoritem Blast) 

Z algoritmom Blast smo poiskali podobna nukleotidna zaporedja s tistimi v 

podatkovni banki GenBank. Ugotovili smo, da nukleotidnih zaporedij COI iz velikega 

klobučnjaka ali iz rodu Rhizostoma ob času iskanja ni bilo v GenBank. Nukleotidna 

43

zaporedja iz velikega klobučnjaka so bila najbolj podobna zaporedjem iz mtDNA A. 

aurita (DQ787873.1). 

4.3.2. Poravnava nukleotidnih zaporedji s programom Clustal 

Poravnavo nukleotidnih zaporedij smo naredili v programu Clustal (glej prilogo B) 

in vanjo vključili osem nukleotidnih zaporedij iz velikega klobučnjaka, ki smo jih 

pridobili v okviru diplomske naloge (RH805, RH811, RH807, RH808, RH703, 

RH810, RH809, RH801). Poleg smo vključili še nukleotidno zaporedje N. nomurai 

(AB243426). V poravnanih nukleotidnih zaporedjih smo našli nekaj vrzeli, najdaljša 

vrzel je bila dva nukleotida. Vrzeli smo izrezali pred nadaljno obdelavo in nato 

nukleotidna zaporedja ročno poravnali na obeh skrajnih koncih. Poravnana 

nukleotidna zaporedja smo vnesli v program MEGA, kjer smo dodali nukleotidno 

zaporedje N. nomurai (dolgo 529bp) in jih še enkrat ročno poravnali. Poravnana 

nukleotidna zaporedja so bila dolga 659 baz. 

4.4. Filogeografska analiza 

Filogenetsko drevo smo narisali s programom MEGA (Kumar in sod., 2004). Za izris 

filogenetskega drevesa (slika 19) smo uporabili metodo združevanja najbližjega 

soseda (Neighbour-Joining (NJ)) in Kimurino-2 paramersko metodo, s katero smo 

izračunali parne razlike med posameznimi haplotipi. Našli smo 170 variabilnih mest, 

487 ohranjenih mest, 123 filogenetsko informativnih mest, na katerih temelji 

filogenetska analiza. Ohranjena mesta so identična v vseh nukleotidnih zaporedjih, 

medtem ko informativna mesta vsebujejo substitucije. Substitucije so mutacije, ki so 

se ohranile skozi naravni izbor. Substitucije označujejo spremembo baznega para 

na tretjem mestu v kodonu. Merilo ob filogenetskem drevesu prikazuje število 

substitucij. Za koreninjenje drevesa smo uporabili nukleotidno zaporedje N. nomurai 

(AB243426), ker je najbližji sorodnik velikega klobučnjaka z določenim nukleotidnim 

zaporedjem. Za statistično ovrednotenje vejišč smo uporabili metodo vezanja (ang. 

Bootstrap) in sicer 1000 ponovitev. 

44

11 

98 

RH805 

RH811 

RH807 

RH808 

RH703 

RH810 

RH809 

RH801 

99 

Črno morje 

Nemopilema 

nomurai(AB243426). 

RH1403 

RH1404 

Koprski 

zaliv 

0.05 substitucij 

Slika 21: Filogenetsko drevo nukleotidnih zaporedij velikega klobučnjaka iz Črnega 

morja in Koprskega zaliva. Merilo predstavlja število substitucij v analiziranih 

nukleotidnih zaporedjih. 

Filogenetska analiza narejena na nukleotidnih zaporedjih COI je pokazala, da 

nukleotidna zaporedja velikih klobučnjakov iz Črnega morja tvorijo svojo 

filogenetsko skupino, ki je jasno ločena od velikih klobučnjakov nabranih v 

Tržaškem zalivu. Ločitev obeh skupin podpirajo tudi rezultati metode vezanja. 

Visoke vrednosti (98%) podpirajo združevanje vzorcev iz Črnega morja v enotno 

skupino. Enako visoke vrednosti (99%) podpirajo združevanje vzorcev iz Koprskega 

zaliva v enotno skupino. Med analiziranimi osebki velikih klobučnjakov iz Črnega 

morja smo našli pet različnih haplotipov med osmimi osebki. Trije osebki (RH807, 

RH703, RH805, RH810) imajo enak haplotip. Izračunane vrednosti genetske 

razdalje z Kimurino-2 paramersko metodo so enake 0 in pomenijo, da med 

nukleotidnimi zaporedji ni razlik. Kimurina-2-parameterska metoda pri izračunu 

upošteva obe možni vrsti substitucij (tranzicije in transverzije) in da v danem 

nukleotidnem zaporedju ni razlik v pogostosti substitucij. Majhno odstopanje smo 

opazili pri vzorcu RH811, ki pa ni statistično podprto z metodo vezanja (11%). Vse 

vrednosti metode vezanja, ki so pod mejo 50%, so statistično neznačilne. 

Izračunane genetske razdalje med vzorci nabranimi v Tržaškem zalivu in Črnem 

morju so večje in znašajo od 0,2279 do 0,2306. 

Ugotovitve pridobljene s filogenetsko analizo lahko verjetno navežemo na življenjski 

cikel in način razmnoževanja velikega klobučnjaka. Nespolno razmnoževanje 

velikega klobučnjaka poteka s strobilacijo polipa. Do sedaj je bila opazovana 

strobilacija samo pri vrsti R. octopus v laboratoriju (Holst in sod., 2007). Prav tako 

nimamo podatkov o sposobnosti razširjanja meduz velikega klobučnjaka. Glede na 

veliko geografsko oddaljenost med vzorčenima populacijama lahko sklepamo, da je 

genski pretok med njima omejen. Omejujejo ga pa tudi kratka življenjska doba 

meduze in geografske bariere, ki so med sevenim Jadranskim morjem in vzorčenim 

mestom v Črnem morju. Na osnovi nukleotidnih zaporedij iz COI je možno 

razlikovanje na nivoju vrst kakor tudi na nižjih nivojih zaradi zadostne variabilnosti v 

nukleotidnih zaporedjih COI (Hebert in Gregory, 2005). Uspešno uporabo takega 

pristopa pa predstavlja tudi podatkovna zbirka BOLD (Ratnasingham in Hebert, 

45

2007). Do sedaj se je izkazalo, da je variabilnost znotraj COI majhna edinole pri 

koralnjakih (Anthozoa), medtem ko je variabilnost pri klobučnjakih primerljiva z 

drugimi skupinami večceličnih živali (Huang in sod., 2008). Pri uhatem klobučnjaku 

(ki je še vedno opredeljen kot kozmopolitska vrsta) je medvrstna divergenca v 

razponu od 13-odstotkov do 24-odstotkov (Dawson in Jacobs, 2001). Podoben 

razpon divergence so izračunali tudi med domnevnima vrstama Cyanea capillata 

(Dawson, 2005) in Cassiopea (Holland in sod., 2004). Divergenca, ki smo jo 

izračunali med nukleotidnimi zaporedji iz osebkov velikega klobučnjaka iz 

Jadranskega morja in Črnega morja, je v podobnem razponu in znaša 18,5 

odstotkov. Glede na pridobljene rezultate menimo, da je možno uporabiti 

nukleotidna zaporedja iz COI velikega klobučnjaka za razlikovanje geografsko 

oddaljenih populacij. 

46

5. ZAKLJUČKI 

Od leta 2003 so v Tržaškem zalivu zabeležili masovno pojavljanje nekaterih 

klobučnjaških meduz, kot so veliki klobučnjak (Rhizostoma pulmo), uhati klobučnjak 

(Aurelia aurita), medtem ko je masovno pojavljanje mesečinke (Pelagia noctiluca) že 

znan pojav. Razlogi za množično pojavljanje različnih vrst klobučnjaških meduz, ki 

so običajno prisotne v majhnem številu, še niso znani. Raziskovalci navajajo 

različne vzroke povezane z antropogenimi vplivi (evtrofikacija, hipoksija povezana z 

evtrofikacijo, klimatske spremembe, porušeno prehranjevalno verigo v morjih zaradi 

prelova nekaterih vrst rib), ki naj bi povzročili masovna pojavljanja. 

V teku diplomske naloge smo opravili vzorčenje s plovilom Sagita. Pri vzorčenju 

smo morali biti pozorni predvsem na to, da vzorca nismo kontaminirali ter da smo 

vzorce pravilno označili in shranili. Vzorce smo shranili v epicah s konzervansom, da 

smo tkivo zavarovali pred razgradnjo. 

Iz 36 osebkov smo izolirali DNA s kitom DNeasy Blood & Tissue Kit ( QIAGEN), ki 

se je izkazala kot zelo učinkovita in preprosta metoda. DNA nam je uspelo izolirati iz 

večine vzorcev. Količina in kvaliteta izolirane DNA je bila odvisna od časa 

shranjevanja vzorcev v konzervansu. Daljši čas shranjevanja je pomenil večjo 

razgradnjo DNA v shranjenem tkivu. Tkivo je potrebno shranjevati na zelo nizkih 

temperaturah čim krajši čas. Količina izolirane DNA v vzorcih je v razponu od 

4100ng/µl do 3,07 ng/µl. 

Cilj diplomskega dela je bil proučiti genetsko diverziteto velikega klobučnjaka. Za 

raziskovanje diverzitete smo uporabili genetski marker citokrom oksidazo C 

podenoto I (COI). Najprej smo optimizirali pomnoževanje genetskih markerjev s 

PCR in nato pridobili njihova nukleotidna zaporedja. 

Z reakcijo PCR smo pomnoževali zapis za encim COI s parom začetnih 

oligonukleotidov LCO 1490 in HCO 2198 (Folmer in sod., 1994 ). Izkazalo se je, da 

univerzalni oligonukleotidi omogočajo pomnoževanje tudi na velikem klobučnjaku 

(Rhizostoma pulmo), saj nam je uspelo pomnožiti specifičen PCR produkt v zadostni 

količini za nadaljne postopke. PCR reakcija je bila uspešna v 27 odstotkih (16 

osebkov). 

Nukleotidna zaporedja smo določili 8 osebkom iz Črnega morja, ki so si med seboj 

zelo podobna in 2 osebkoma iz Koprskega zaliva. Vzorci iz Črnega morja tvorijo 

svojo, ločeno filogenetsko skupino od vzorcev iz Tržaškega zaliva. Izračunane 

filogenetske razdalje med posameznimi nukleotidnimi zaporedji v vzorcih iz Črnega 

morja kažejo, da so si ti vzorci zelo podobni (izračunane vrednosti z Kimura -2 

paramersko metodo so enake 0). Mnogo večje so izračunane genetske razdalje 

med nukleotidnimi zaporedji iz vzorcev iz Tržaškega zaliva v primerjavi z vzorci iz 

Črnega morja(od 0,2279 do 0,2306). 

47

6. VIRI 

Arai, M. N. 1997. A Functional Biology of Scyphozoa. Chapman and Hall, London, 

68-206. 

Arai M.N., 2001a. Pelagic coelenterates and eutrophication: a review, Kluwer 

Academic publishers, Hydrobiologia 451: 69-87. 

Arai M.N., 2001b. Predation on pelagic coelenterates: a review. J. Mar Biol. Assoc. 

UK 85: 523- 536. 

Beagley, C.T., Okada, N.A., Wolstenholme, D.R., 1996. Two mitochondrial group I 

introns in a metazoan, the sea anemone Metridium senile: one intron contains 

genes for subunits 1 and 3 of NADH dehydrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 

93, 5619–5623. 

Beaton, M.J., Roger, A.J., Cavalier-Smith, T., 1998. Sequence analysis of the 

mitochondrial genome of Sarcophyton glaucum: conserved gene order among 

octocorals. J. Mol. Evol. 47, 697–708. 

Bodlaj, J. 2001. Metoda PCR/Polymerase Chain Reaction. Seminar. MF, Ljubljana. 

Bridge, D., Cunningham, C.W., DeSalle, R., Buss, L.W., 1995. Class-level 

relationships in the phylum Cnidaria: molecular and morphological evidence. Mol. 

Biol. Evol. 12, 679–689. 

Cheng J.H., Ding F.Y., Li S.F., Yan L.P., Ling J.Z., Li J.S., 2005. A study on the 

quantity distribution of macro-jellyfish and its relationship to seawater temperature 

and salinity in the East China Sea Region. Ecol Sin 25: 440- 455. 

Chevalier, B.S., Stoddard, B.L., 2001. Homing endonucleases: structural and 

functional insight into the catalysts of intron/intein mobility. Nucleic Acids Res. 29, 

3757–3774. 

Collins, A.G., 2002. Phylogeny of Medusozoa and the evolution of cnidarian life 

cycles. J. Evol. Biol. 15, 418–432. 

Collins A.G., Schuchert P., Marques A.C., Jankowski T., Medina M. and 

Schierwater B., 2006. Medusozoan Phylogeny and Character Evolution Clarified by 

New Large and Small Subunit rDNA Data and an Assessment of the Utility of 

Phylogenetic Mixture Models. Syst. Biol. 55(1):97–115, 2006. 

Daryanabard R., Dawson M.N. (in press). Jellyfish blooms: Crambionella orsini ( 

Scyphozoa, Rhizostomeae) in the Gulf of Oman, Iran 2008. J. Mar. Biol. Assoc UK. 

Daskalov G.M., Grishin A.N., Rodionov s., Mihneva V., 2007. Trophic cascades 

triggered by overfishing reveal possible mechanisms of ecosystem regime shift. 

Proc. Natl. Acad. Sci USA 104: 10518- 10523. 

Dawson, M.N, Jacobs D.K., 2001. Molecular evidence for cryptic species of Aurelia 

aurita (Cnidaria, Scyphozoa). Biol. Bull. 200: 92-96. 

48

Dawson M.N., 2003. Macro-morphological variation among cryptic species of the 

moon jellyfish, Aurelia (Cnidaria: Scyphozoa),. Mar. Biol. 143:369-379. Erratum: 

Mar. Biol. 144:203. 

Dawson M.N., Gupta A.S., England M.H., 2005. Coupled biophysical global ocean 

model and molecular genetic analyses identify multiple introductions of cryptogenic 

species, PNAS, Vol. 102, No 34: 11968–11973. 

Dawson M.N., 2005 . Cyanea capillata is not a cosmopolitan jellyfish: morphological 

and molecular evidence for C. annaskala and C. rosea 

(Scyphozoa:Semaeostomeae:Cyanidae) in south-eastern Australia. Invertbr Syst 

19:361-370. 

Drobnič K., 2007. Ugotavljanje identitete posameznika z uporabo genetskih 

informacij, metode verižne reakcije s polimerazo in računalniško podprte tehnologije. 

Erpenbeck D, Parra-Velandia FJ, Breeuwer JAJ, Van Soest R.W.M.,2005. 

Speculation with spiculation? – Three independent gene fragments and biochemical 

characters versus morphology in demosponge higher classification. Molecular 

Phylogenetics and Evolution , in press. doi: 10.1016/j.ympev.2005.11.001. 

Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., and Vrijenhoek R.,1994. DNA primers for 

amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan 

invertebrates, Molecular Marine Biology and Biotechnology 3 (5): 294-299. 

Gilbert P.M., Seitzinger S., Heil C.A., Burkholder J.M., Parrow M.W., Codispoti L.A., 

Kelly V., 2005. The role of eutrophication in the global proliferation of harmful algal 

blooms: new perspectives and new approaches. Oceanography 18: 198- 209. 

Gorički Š., 2004. Ugotavljane genetske strukture diferenciacije močerila (Proteus 

anguinus) z analizo zaporedji mitohondrijske DNA. Magistrsko delo, Univerza v 

Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo. 

Goy J., Morand P.,Etienne M. 1989. Long term fluctuations of Pelagia noctiluca ( 

Cnidaria, Scyphomedusa) in the western Mediterranian Sea. Prediction by climatic 

variables. Deep-Sea Research, Vol. 36, No .2, 269-279. 

Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and 

analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98. 

Hebert, P.N.D. and T.R.Gregory., 2005. The promise of DNA barcoding for 

taxonomy. Systematic Biology;54 (5):852-859. 

Higgins D.G., Sharp P.M., 1988. CLUSTAL: a package for performing multiple 

sequence alignment on a microcomputer. Gene, Vol. 73, Issue 1, 237-244. 

Hillis D.M., Moritz C.,1996. Maple Molecular Systematics, 2nd edition., Sinauer 

Press. 

Hillis D:M, Dixon M.T., 1991. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic 

interference. Quarterly Review of Biology 66: 411-453. 

49

Holland S., Dawson M.N., Crow G.L., Hofmann D.K. 2004. Global phylogeography 

of Cassiopea (Scyphozoa:Rhizostomeae): molecular evidence for cryptic species 

and multiple invasions of the Hawaiian Islands. Mar Biol 145:1119-1128. 

Holst S., Jarms G., 2006. Substrate choice and settlementpreferences of planula 

larvae of five Scyphozoa (Cnidaria)from German Bight, North Sea. Mar Biol. DOI: 

10.1007/s00227-006-0530-y. 

Howarth R.W., Sharpley A., Walker D., 2002. Sources of nutrient pollution to coastal 

waters in the United States: implication for achieving coastal water quality goals. 

Estuaries 25: 656- 676. 

Hyman, L. H. 1940. The invertebrates. Volume 1. Protozoa through Ctenophora. 

McGraw-Hill, New York. 

Huang D., Meier R., Todd P.A., Chou L.M., 2008. Slow Mitochondrial COI Sequence 

Evolution at the Base of the Metazoan Tree and Its Implications for DNA Barcoding. 

J. Mol. Evol. 66:167-174. 

Ishii H., 2006. Adaptation to coastal environmental changes in the polyp stage in 

relation to jellyfish blooms in Tokyo Bay. PICES XV, Yokohama, Japan, 13 Oct. 

2006, Abstract S2- 3117. 

Jackson J.B.C., Kirby M.X., Berger W.H., Bjorndal K.A., Botsford L.W., Bourque 

B.J., Bradbury R.H., Cooke R., Erlandson J., Estes J.A., Hughes T.P., Kidwell S., 

Lange C.B., Lenihan H.S., Pandolfi J.M., Peterson C.H., Steneck R.S., Tegner M.J., 

Warner R.R., 2001. Historical overfishing and the recent collapse of coastal 

ecosystems. Science 293: 629- 638. 

Johnston B.D., Irvine H., Sötje I., Pierce G.J., Secombes C.J., 2005. Ecological 

toxicology and effects of mass occurrences of gelatinous zooplankton on teleosts in 

enclosed coastal ecosystems. Am. Soc. Limnol. Oceanogr. Meet, June 2005, 

Abstract. 

Kimura, M, 1980 A simple method for estimating evolutionary rate of base 

substitutions through comparative studies of nucleotide sequencies. Journal of 

Molecular Evolution, 16: 111-120. 

Kramp P.L. 1961. Synopsis of the medusae of the World. J. Mar. Biol. Assoc. UK 

40. 

Kumar S, Tamura K, Nei M., 2004. Mega 3: integrated software for molecular 

evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics 5 

, 150–163. 

Lotan A., Ben- Hiller R., Loya Y., 1993. Aggregation and dispersal of Rhopilema 

nomadica, a tropical immigrant medusa in the Mediterranean Sea. Isr J. Zool. 39: 

67-68. 

Lucas, C. H., 2001. Reproduction and life history strategies of the common jellyfish, 

Aurelia aurita, in relation to its ambient environment. Hydrobiologia 451 (Dev. 

Hydrobiol. 155): 229–246. 

50

Lynam C.P., Gibbons M.J., Axelsen B.E., Sparks C.A.J., Coetzee J., Heywood B.G., 

Brierley A.S., 2006. Jellyfish overtake fish in heavily fished ecosystem. Curr. Biol. 16 

(13): R492- R493. 

Malej A., 1982. Unusual occurance of Pelagia noctiluca in the Adriatic. Aota Adriat., 

let. 23, št1/2, str. 97- 102. 

Mayer A.G. 1910. Medusae of the World, III: the Scyphomedusae. Carnegie 

Institute, Washington. 

Marques, A. C., and. Collins A. G., 2004. Cladistic analysis of Medusozoa and 

cnidarian evolution. Invert. Biol. 123:23–42. 

Mianzan H. & Cornelius P.F.S., 1999. Cubomedusae and Scyphomedusae. In: 

South Atlantic Zooplankton (D. Boltovskoy ed.), BACKHUYS Publishers, Leiden 

(The Netherlands): 513-559. 

Mills, C. E., 1995. Medusae, siphonophores and ctenophores as planktivorous 

predators in changing global ecosystems. ICES J. mar. Sci. 52: 575–581. 

Mills C.E., 2001. Jellyfish blooms: are populations increasing globally in response to 

changing ocean conditions?, Kluwer Academic publishers, Hydrobiologia 451: 55- 

68. 

Molinero J.C., Ibanez F., Nival P., Buecher E., Sopissi S., 2005. North Atlantic 

climate and northwestern Mediterranean plankton variability. Limnol. Oceanogr. 50: 

1213- 1220. 

Pérez- Ruzafa A., Gilabert J., Gutiérrez J.M., Fernández A.I., Marcos C., Sabah S., 

2002. Evidence of a planktonic food web response to changes in nutrient input 

dynamics in the Mar Menor coastal lagoon, Spain. Hydrobiologia 475/476: 359- 369. 

Plantan M,.2008. Optimizacija mikrosatelitnih lokusov pri morskem klobuku 

(Rhizostoma pulmo) : diplomsko delo : univerzitetni študij . Optimization of 

microsatellite loci in barrel jellyfish (Rhizostoma pulmo). Graduation thesis : 

university studies. Ljubljana: [M. Plantan], 2008. X, 48 f., ilustr., graf. prikazi, pril. + 

CD. [COBISS.SI-ID 1878351]. 

Polz M.F. and Cavanaugh C.M., 1998. Bias in Template-to-Product Ratios in 

Multitemplate PCR. Applied and Environmental Microbiology, October 1998, , Vol. 

64, No. 10, p. 3724-3730. 

Pont-Kingdon, G., Okada N.A., Macfarlane J.L., Beagley C.T., Watkins-Sims C:D., 

Cavalier-Smith T., Clarck-Walker G., Wolstenholme R. , 1998. Mitochondrial DNA of 

the coral Sarcophyton glaucum contains a gene for a homologue of bacterial MutS: 

a possible case of gene transfer from the nucleus to the mitochondrion. J. Mol. Evol. 

46, 419–431. 

Pont-Kingdon, G.A., Okada N.A., Macfarlane J.L., Beagley C.T., Wolstenholme 

R:D., Cavalier-Smith T., Clarck-Walker G.B, 1995. A coral mitochondrial mutS gene. 

Nature 375, 109–111. 

Purcell J. E., White J. R., Nemazie D. A. & Wright D. A., 1999. Temperature, salinity 

and food effects on asexual reproduction and abundance of the scyphozoan 

Chrysaora quinquecirrha. Mar. Ecol. Prog. Ser. 180: 187–196. 

51

Purcell J.E. & Arai M.N, 2001. Interactions of pelagic cnidarians and ctenophores 

with fish: a review, Kluwer Academic publishers, Hydrobiologia 451: 27-44. 

Purcell J.E. 2005. Climate effects on formation of jellyfish and ctenophore blooms: a 

review. Journal of the Marine Biological Association of United Kingdom 85:461-476. 

Purcell J.E., Decker M.B., 2005. Effects of climate on relative predation by 

scyphomedusae and ctenophores on copepods in Cheasapeake Bay during 1987- 

2000. Limnol. Oceanogr. 50: 376- 387. 

Purcell J.E., Uye S.I, Lo W.T, 2007. Antropogenic causes of jellyfish blooms and 

their direct consequences of humans: a review, Marine ecology progress series, 

Vol.350: 153-174. 

Ratnasingham and P.D.N., Hebert. 2007. BOLD:The Barcode of Life Data System 

(www.barcodinglife.org), Molecular Ecology Notes7,355-364. 

Roe B.A., Crabtree J.S., Khan, A., 1996. Methods for DNA Isolation. S. 42 do 72. V: 

DNA isolation and Sequencing. John Wiley & Sons. 

Russell F.S. ,1970. The medusae of the British Isles II. Pelagic Scyphozoa with a 

supplement to the first volume on hydromedusae. Cambridge University Press, 

Cambridge. 

Shao Z., Graf S., Chaga O.Y., Lavrov D.V., 2006. Mitochondrial genome of the 

moon jelly Aurelia aurita (Cindaria, Scyphozoa): A linear DNA molecule encoding a 

putative DNA- de. 

Sommer U., Stibor H., Katechakis A., Sommer F., Hansen T., 2002. Pelagic food 

web configurations at different levels of nutrient richness and their implications for 

the ratio fish production: primary production. Hydrobiologia 484: 11- 20. 

Stiasny D.G., 1922. Ein neues System der Rhizostomeen. Verhandlungen der 

Deutschen Zoologischen Gesellschaft E. V. 27:84–85. 

Suzuki, M., and S. J. Giovannoni. 1996. Bias caused by template annealing in the 

amplification of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62:625-630. 

Thiel, H. 1966. The evolution of the Scyphozoa, a review. Pages 77–117 in Cnidaria 

and their Evolution (W. J. Rees, ed.). Academic Press, London. 

Thiel M.E., 1970. U¨ ber den zweifachen stammesgeschichtlichen (‘‘biphyletischen’’) 

Ursprung der Rhizostomae (Scyphomedusae) und ihre Aufteilung in die zwei neuen 

Ordnungen Cepheida und Rhizostomida. Abh. Verh. naturwiss Ver. Hamburg NF 

14:145–168. 

Uye S., Ueta Y., 2004. Recent increase of jellyfish populations and their nuisance to 

fisheries in the Inland Sea of Japan. Bull. Jpn. Soc. Fish Oceanogr. 68:9- 19 (in 

Japanese with English abstract). 

- http://images.suite101.com/131037_cnidariamedusaandpolyp. 

52

PRILOGE 

53

Priloga A: Nukleotidna zaporedja v fasta formatu 

>0703 Črno morje 

tttaaacttccagggtgaccaaaaaatcaaaaymratagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtc 

aaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaa 

taataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatatt 

taaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccata 

tctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttc 

tataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaag 

gccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacgaaa 

aagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctggg 

cctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaatatawtaaktat 

agtgttccaatatcttttgatttgggtgaaccaaaaaa 


tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcaaamyrwatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggt 

caaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaaca 

ataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcata 

tttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggcca 

tatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgt 

tctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaa 

aggccatatctggagctcctatatataggggaactagccagtttccaaatccccctatcaaaacgggcattacga 

aaaagaaaatcattataagagcatgagcggtcactacaacgttatatagttgatcgtcccccaacatggatcctgg 

gcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaatattaaktat 

anngtgttccaatatctttatgaantgggtgaaccaaaa 


tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcaaaataaakgtataggwrkatgtattggatctcctcccccagcaggg 

tcaaagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaac 

aataataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcat 

atttaaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggcc 

atatctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttg 

ttctataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaa 



gcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccacymkggcggaaaaagcaccaaatattaagtt 

attagtgttccaatatctttatagttggnntggaaccaaaa 


tttaaactttcagggtgaccaaaaaatcaaaataatatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtca 

aagaaggatgtgttgaaatttctatcagtcaacaacatggtaattgccccagctaatacgggtaaggacaacaat 

aataagattgcagtaactaatacagatcatacgaataaaggtattctatccatggtcataccaggggctctcatattt 

aaaatagtggtaataaagttaatagcacccataatagaggaagctcctgctaaatgaagactaaatatggccatat 

ctactgaacccccagaatgagcttgtattgaacttaaaggagggtaaatggttcaaccagtacctgctccttgttct 

ataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaag 



cctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaattawtaakw 

awagtgttccaatatctttatagtgggngtgaaccaaannnaa 

>0801Črno morje

tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcaaaataaatgttggtattrtrgatatttggatctcctcccccagcagggt 








gcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaaatawtatrg 

tatagtgttccaatatctttatgaatggggtgaccaaaa 


tttaaacttttncaggtgaccaaaaaatcaaaaymwatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggt 








gcctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaattawtwag 

tawangtgttccaatatctttatgaatgggngtgaacaaaa 


tttaaacttncagggtgaccaaaaaatcarrmyawatgttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtca 





ataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaataatcagaaactgatattgttaagccttggaaag 



cctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaatatawtaagtat 

tagtgttccaatatctttatgaatgggttgacccaaaanaa 


tttaaacttcagggtgaccaaaaaatcaaarkawatagttggaatagtattggatctcctcccccagcagggtca 





ataagggaagaccctaataatagtaataaagctggaggtaatagtcagaaactgatattgttaagccttggaaag 



cctgatagttccagtcttataatcatactgaaggcagttcccaccatggcggaaaaagcaccaaatattaagtaatt 

wgtgttccaatatctttatgattggcgtgaaccaaannnaa 

>1404 Koprski zaliv 

ggagggatgagggggtaggagggaggggagggtgggagagaggataggggagagagagagttaagggg 

aggggggtagaaagtagggtgattaggtaaaaaggagggggggaggatggtaaagtggaatggaaggggg

gaggggggggggtggttaaacttcagggtgaccaaaaaatcaaaacaaatgytkaccamtgagaatactatg 

gatstcctmctmccgctaggrtcgaagarasmagtattaaaatttctatctgtaagtagcattgtaatagcccca 

gctaaaacaggtaaggacaataacaataatattgctgtgactagaacagaccatacaaacaaaggaattttatcta 

tagtcataccgggagccctcatattcaagatagtagtaatgaaattaatagctcccattatagaggaagctcctgct 

aagtgtaaactgaagatggccatatccacagaacctcctgaatgggcctggatcgaacttagaggaggataaat 

tgtccaacctgttcccgcaccttgttctacaagagaagaacctagcaatagtagtagtgcaggaggaagtaatca 

aaaactaatattattcaaccttgggaaggccatgtctggtgcccctatatataaaggaactaaccagtttccaaaac 

ctcctatcaacactggcataacaaagaaaaatatcataatcaatgcgtgggckgtcactacaacattatatagttg 

atcatcacccaacatggatcctggaccagataattctaatcttataatcatwytgaaatgcagttcctaymatagc 

ggaraaggctccatcatatatyataatatagtgttccaatatctttatgatgttgttgaccaaaa 

>1403 Koprski zaliv 

ggatttgagaaaggtgggagggaggtggggagtggtgaggtttagagagagagagtggaaggggaggggg 

gagagaggggaagaaagagagttgggggataatagaggggggattaatgatcagttatgttgtgggcttataa 

gtttttaaacttgggggtgaccaaaaaatcaaaacaaaggytkacccaatagagaaaatwggatstccymctc 

ycgckrggrtcgrakarasmagtattaaaatttctatctgtaagtagcattgtaatagccccagctaaaacaggta 

aggacaataacaataatatkgctgtgactagaacagrccatacaaacaaaggaattttatccatagtcataccgg 

gagccctcatattcaagatagtagtaatgaaattaatagctcccattatagaggaagctcctgctaagtgtaaactg 

aagatggccatatccacagaacctcctgaatgggcctggatcgaacttagaggaggataaattgtccaacctgtt 

cccgcmccttgttctacaagagaagaacctagcaatagtagtagtgcaggaggaagtaatcaaaaactaatatt 

atttaaccttgggaaggccatgtctggtgcccctatatataaaggaactaaccagtttccaaaacctcctatcaaca 

ckggcatamcaaagaaaaatatcataatcaatgsgtgggctgtcactacaacattatatagttgatcatcaccca 

acakggatcctggaccaagakratctctaatgcttataatcataytkaaattgcagytcstmtmakagsggaaa 

aggctccacaataywaaawactwgtgttccaatatctttatgattggttgaccaaa

Priloga B: Poravnava nukleotidnih zaporedji s programom Clustal

Priloga C: Izračun genetskih razdalij med posameznimi nukleotidnimi 

zaporedji v programu MEGA

Priloga D: Podobnost med nukleotidnim zaporedjem COI iz velikega 

klobučnjaka (Rhizostoma pulmo) in COI iz uhatega klobučnjaka (Aurelia 

aurita) 

Poizvedba narejena v GenBank dne 17. 6. 2008. 

> gb|DQ787873.1| Aurelia aurita mitochondrion, complete genome 

Length=16937 

Score = 1205 bits (652), Expect = 0.0 

Identities = 654/655 (99%), Gaps = 0/655 (0%) 

Strand=Plus/Plus 

Query 1 

ACTATACTTAATATTTGGTGCTTTTTCCGCCATGGTGGGAACTGCCTTCAGTATGATTAT 60 

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 11964 

ACTATACTTAATATTTGGTGCTTTTTCCGCCATGGTGGGAACTGCCTTCAGTATGATTAT 12023 

Query 61 

AAGACTGGAACTATCAGGCCCAGGATCCATGTTGGGGGACGATCAACTATATAACGTTGT 120 

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 12024 

AAGACTGGAACTATCAGGCCCAGGATCCATGTTGGGGGACGATCAACTATATAACGTTGT 12083 

Query 121 

AGTGACCGCTCATGCTCTTATAATGATTTTCTTTTTCGTAATGCCCGTTTTGATAGGGGG 180 

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 12084 

AGTGACCGCTCATGCTCTTATAATGATTTTCTTTTTCGTAATGCCCGTTTTGATAGGGGG 12143 

Query 181 

ATTTGGAAACTGGCTAGTTCCCCTATATATAGGAGCTCCAGATATGGCCTTTCCAAGGCT 240 

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 12144 

ATTTGGAAACTGGCTAGTTCCCCTATATATAGGAGCTCCAGATATGGCCTTTCCAAGGCT 12203 

Query 241 

TAACAATATCAGTTTCTGATTATTACCTCCAGCTTTATTACTATTATTAGGGTCTTCCCT 300 

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 12204 

TAACAATATCAGTTTCTGATTATTACCTCCAGCTTTATTACTATTATTAGGGTCTTCCCT 12263 

Query 301 

TATAGAACAAGGAGCAGGTACTGGTTGAACCATTTACCCTCCTTTAAGTTCAATACAAGC 360 

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 12264 

TATAGAACAAGGAGCAGGTACTGGTTGAACCATTTACCCTCCTTTAAGTTCAATACAAGC 12323 

Query 361 

TCATTCTGGGGGTTCAGTAGATATGGCCATATTTAGTCTTCATTTAGCAGGAGCTTCCTC 420 

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 12324 

TCATTCTGGGGGTTCAGTAGATATGGCCATATTTAGTCTTCATTTAGCAGGAGCTTCCTC 12383

Query 421 

TATTATGGGTGCTATTAACTTTATTACCACTATTTTAAATATGAGAGCCCCTGGTATGAC 480 

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 12384 

TATTATGGGTGCTATTAACTTTATTACCACTATTTTAAATATGAGAGCCCCTGGTATGAC 12443 

Query 481 

CATGGATAGAATACCTTTATTCGTATGATCTGTATTAGTTACTGCAATCTTATTATTGTT 540 

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 12444 

CATGGATAGAATACCTTTATTCGTATGATCTGTATTAGTTACTGCAATCTTATTATTGTT 12503 

Query 541 

GTCCTTACCCGTATTAGCTGGGGCAATTACCATGTTGTTGACTGATAGAAATTTCAACAC 600 

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 12504 

GTCCTTACCCGTATTAGCTGGGGCAATTACCATGTTGTTGACTGATAGAAATTTCAACAC 12563 

Query 601 

ATCCTTCTTTGACCCTGCTGGGGGAGGAGATCCAATACTATTCCAACATTTATTT 655 

||||||||||||||||||||| 

||||||||||||||||||||||||||||||||| 

Sbjct 12564 

ATCCTTCTTTGACCCTGCTGGAGGAGGAGATCCAATACTATTCCAACATTTATTT 12618

Rhizostoma pulmo - Univerza v Novi Gorici

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?