zoznam ÃºradnÃ½ch metÃ³d laboratÃ³rnej diagnostiky potravÃn a krmÃv

VESTNÍK 

Ministerstva pôdohospodárstva 

Slovenskej republiky 

Roèník XXXVIII 20. júl 2006 Èiastka 13 

O b s a h: 

41 Zoznam mechanizaèných prostriedkov 

42. Zoznam úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín a krmív èas RÔZNE - Doplnok è. 1/2006 

43. Zoznam úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín a krmív èas MIKROBIOLÓGIA 

44. Zoznam úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín a krmív èas CHÉMIA - Doplnok è. 1/2006 

45. Doplnok k Zoznamu registrovaných veterinárnych liekov schválených veterinárnych prípravkov 

od 1. apríla 2006 do 30. júna 2006 

46. Zverejnenie údajov zo žiadostí o zápis do zoznamu výrobkov zaruèených tradièných špecialít na úèely 

námietkového konania - Šunková saláma, Špekaèky, Bravèová domáca klobása, Inovecká trvanlivá 

saláma, Strážovská saláma, Spišské párky, Nitran, Lovecká saláma, Liptovská saláma, Ipe¾ská klobása 

47. Redakèné oznámenie o oprave zverejnenia údajov zo žiadostí o zápis do zoznamu výrobkov zaruèených 

tradièných špecialít 

48. Zoznam registrovaných prípravkov na ochranu rastlín a iných prípravkov 2006 - Doplnok 1/06 

49. Zoznam plodín a škodlivých organizmov 

41 

Z O Z N A M 

mechanizaèných prostriedkov 

Ministerstvo pôdohospodárstva Slovenskej republiky 

pod¾a § 15 zákona è. 193/2005 Z. z. o 

rastlinolekárskej starostlivosti na návrh Technického 

a skúšobného ústavu pôdohospodárskeho 

SKTC-106 Rovinka zverejòuje tento zoznam: 

Jednotlivé typy mechanizaèných prostriedkov 

pre aplikáciu prípravkov na ochranu rastlín a iných 

prípravkov (mechanizaèné prostriedky na ochranu 

rastlín) boli do zoznamu zaradené na základe skúšok 

vykonaných za úèelom ich schválenia alebo 

1

42 

Z O Z N A M 

ÚRADNÝCH METÓD LABORATÓRNEJ DIAGNOSTIKY 

POTRAVÍN A KRMÍV 

èas RÔZNE 

Doplnok è. 1/2006 


pod¾a § 5 písm. l) zákona è. 488/2002 Z. z. 

o veterinárnej starostlivosti a o zmene niektorých 

zákonov (ïalej len „zákon“) zverejòuje tento zoznam 

úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín 

a krmív – èas Rôzne (ïalej len „zoznam“) 

ako doplnok è. 1/2006 k zoznamu zverejnenému 

v èiastke è. 1 Vestníka Ministerstva pôdohospodárstva 

Slovenskej republiky z 9. januára 2004, 

ktorý pod¾a § 14 ods. 3 zákona vydáva hlavný 

veterinárny lekár: 

kód Názov metódy Èíslo predpisu 

R. 5. Dôkaz druhu mäsa zvierat v tepelne opracovanom úradné metódy laboratórnej diagnostiky 

mäse a v mäsových výrobkoch metódou ELISA potravín a krmív, príloha è. 1 – zmena 1 

R.11. Mikroskopický dôkaz a urèenie živoèíšnych 

zložiek v krmivách 

Smernica Komisie 2003/126/ES zo dòa 

23. decembra 2003 o analytickej metóde 

na stanovenie zložiek živoèíšneho pôvodu 

pre úradnú kontrolu krmív – zmena 1 

R.12. Metódy na vyšetrovanie trichinel Nariadenie Komisie (ES)è. 2075/2005 

z 5. decembra 2005, ktorým sa ustanovujú 

osobitné predpisy na úradné kontroly 

Trichinella v mäse – zmena 1 

R.13. Stanovenie množstva cudzej vody v mrazenej 

a v hlbokozmrazenej hydine odkvapkávacou 

metódou – celá hydina 

Nariadenie komisie (EHS) è.2891/93 z 

21. októbra 1993, ktorým sa mení a 

dopåòa nariadenie (EHS) è.1538/1991, 

ktorým sa zavádzajú podrobné pravidlá 

uplatòovania nariadenia (EHS) è.1906/ 

90 o niektorých obchodných normách 

pre hydinové mäso. Príloha V. - Stanovenie 

strát pri rozmrazení (odkvapkávací 

test) – zmena 1 

17


R.14. Stanovenie celkového množstva vody 

Nariadenie komisie (ES) è.1072/2000 z 

v hydinových dieloch chemickou metódou 19. mája 2000, ktorým sa mení a dopåòa 

– hydinové diely nariadenie (EHS) è.1538/91, ktorým sa 

zavádzajú podrobné pravidlá pre implementáciu 

nariadenia (EHS) è.1906/90 o 

urèitých normách predaja hydinového mäsa. 

Príloha VI.a - Stanovenie celkového obsahu 

vody v hydinových kusoch (chemický test). 

- zmena 1 

R.16. Stanovenie sóje v potravinách 

úradné metódy laboratórnej diagnostiky 

metódou ELISA potravín a krmív, príloha è. 9 

Metóda A 

R.17. Stanovenie sóje v potravinách 

úradné metódy laboratórnej diagnostiky 

metódou ELISA potravín a krmív, príloha è.10 

Metóda B 

Prof. MVDr. Jozef Bíreš, DrSc., v. r. 

hlavný veterinárny lekár 

18

Príloha è. 9 

k zoznamu úradných metód laboratórnej diagnostiky 

R. – 16 

Stanovenie sójového proteínu v potravinách metódou ELISA 

Metóda A 

1. Predmet a oblas použitia 

Táto metodika urèuje postup pre stanovenie sójových proteínov v potravinách metódou ELISA. 

2. Definícia 

Rastlinné proteíny sú èasto pridávané do potravín za úèelom vylepšenia ich zloženia, majú podiel pri 

zadržiavaní vody a tuku, prípadne sú náhradou za mäsové proteíny. Sójový proteín je jedným z najvýznamnejších 

a najèastejšie používaných rastlinných proteínov. 

3. Podstata skúšania 

Veratox Soy Flour Allergen Test je sendvièová ELISA. Sójový proteín je zo vzoriek extrahovaný 

pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS) trepaním v horúcom vodnom kúpeli s následnou centrifugáciou 

alebo filtráciou. Extrakt je pridávaný do jamiek pokrytých protilátkou, kde poèas inkubácie 

dochádza k naviazaniu sójového proteínu na protilátky. Nenaviazané zložky reakcie sa odstránia 

premytím. Množstvo sójových proteínov naviazaných v jamkách je urèené reakciou s konjugátom, po 

druhom premytí sa substrát za úèelom vizualizácie reakcie. 

4. Prístroje, pomôcky a kultivaèné médiá 

4.1 Súprava Veratox Soy Flour Allergen Test 

4.1.1 štandardy sójových proteínov s obsahom 0; 2,5; 5; 10; 25 ppm sójového proteínu (žlté) 

4.1.2 dve f¾aštièky s obsahom 5,0 ml konjugátu (modré etikety) 

4.1.3 jedna f¾aštièka s obsahom 24 ml substrátu (zelená etiketa) 

4.1.4 jedna f¾aštièka s obsahom 32 ml zastavovacieho roztoku (èervená etiketa) 

4.1.5 sáèky s obsahom 10 mM PBS, každý na prípravu 1 l extrakèného roztoku (pH 7,4) 

4.1.6 f¾aštièka s obsahom 40 ml 10 mM koncentrátu premývacieho roztoku PBS s Tweenom 

4.1.7 jedna f¾aštièka s obsahom 25 ml koncentrátu riedidla Type 1 

4.1.8 50 g extrakèného aditíva v samostatnej nádobe 

4.1.9 plastová naberaèka na dávkovanie extrakèného aditíva 

4.1.10 mikrotitraèná platòa s oddelite¾nými stripmi 

4.1.11 stripy so 4 x 12 jamkami pokrytými protilátkou 

4.1.12 stripy so 4 x 12 èervenými jamkami urèené na transfer reakèných roztokov 

Skladovanie a manipulácia so zložkami súpravy sa vykonáva pod¾a návodu výrobcu. 

19

4.2 Prístroje a pomôcky nedodávané so súpravou 

4.2.1 váhy a nádobky na váženie 

4.2.2 miešaè (150 ot./min) alebo homogenizátor 

4.2.3 chladnièka (teplotný rozsah + 2 °C až + 8 °C) 

4.2.4 odmerný valec s objemom 125 ml 

4.2.5 sklenené banky (250 ml) 

4.2.6 filtraèný papier Whatman è. 4 alebo ekvivalent 

4.2.7 vodný kúpe¾ s teplotou 60 °C (+/- 1 °C) 

4.2.8 centrufúga (volite¾ná) 

4.2.9 presné mikropipety s objemom 50 ml až 200 ml 

4.2.10 mikroplatnièkový ríder (filter s vlnovou dåžkou 650 nm) 

4.2.11 premývaèka mikroplatnièiek alebo viackanálová mikropipeta (pre 8 – 12 mikrošpièiek) 

4.2.12 vymenite¾né mikrošpièky (sterilné) 

4.2.13 nádoby s objemom 1 l na prípravu premývacieho a extrakèného roztoku 

4.2.14 parafilm alebo ekvivalent 

4.2.15 destilovaná alebo deionizovaná voda 

4.2.16 držiak stripov (rámik) 

4.2.17 reagenèné vanièky 

5. Príprava reagencií a roztokov 

Je potrebné zabezpeèi , aby všetky reagencie boli pred použitím vytemperované na laboratórnu teplotu. 

5.1 Substrát (zelená etiketa) 

Substrát je pripravený na použitie. Mal by byt’ èíry až svetlo modrej farby – vylejte ho, ak sa zafarbenie 

zmení na tmavo modré. Potrebný objem substrátu odlejte do reagenènej vanièky. Nepoužitý 

substrát nevracajte naspä do fI’aštièky. Roztok až do jeho použitia chráòte pred priamym slneèným 

svetlom. 

5.2 Konjugát (modrá etiketa) 

Konjugát dodaný v tejto súprave je pripravený na použitie. Obsah jednej fl’aštièky staèí na 24 jamiek. 

Roztok konjugátu chráòte pred priamym svetlom a kontaminantami prikrytím reagenènej 

vanièky. 

5.3 Príprava extrakèného roztoku 

Extrakèný roztok pripravte pridaním obsahu plastikového vrecka s extrakèným rozpúš adlom 10 mM 

PBS do 1 l destilovanej alebo deionizovanej vody. Krúživým pohybom dôkladne premiešajte 

a prikryte. Nepoužité diely skladujte v chladnièke pri 2 – 8 °C. 

5.4 Príprava premývacieho roztoku 

Premývací pufer pripravte preliatím celého koncentrátu pufru do prázdnej 1 l nádoby. Opláchnite 

fl’ašu od koncentrátu destilovanou vodou a prelejte do 1 l nádoby (zabezpeèíte tak, aby sa použil 

20

všetok koncentrát). Doplòte nádobu destilovanou vodou na objem 1 l, dôkladne premiešajte 

a prikryte. Nepoužitý podiel skladujte v chladnièke pri 2 – 8 °C. 

POZNÁMKA: Ak ste už spotrebovali ostatné zložky súpravy, vylejte nepoužité podiely 

extrakèného roztoku a oplachovacieho pufru. 

6. Príprava a extrakcia vzoriek 

Testovaná vzorka by sa mala odobra podl’a akceptovanej vzorkovacej techniky. Vzorka by sa mala 

pred extrakciou pomlie a dokonale zmixova . 

6.1 Pripravte extrakèný roztok pod¾a návodu opísaného v èasti Príprava reagencií a roztokov. 

6.2 Predhrejte extrakèný roztok na 60 °C. Ponorte fl’ašu s roztokom do vodného kúpel’a a nechajte 

vyhria na 60 °C. 

6.3 Použitím vašej vzorkovacej metódy by ste mali získa reprezentatívnu vzorku. Pomel’te ju na èo 

najjemnejšie èastice. 

6.4 Preneste 5 gramov alebo 5 ml vzorky do 250 ml Erlenmeyerovej banky. 

6.5 Pridajte 1 zarovnanú naberaèku extrakèného aditíva do vzorkovacej banky. 

6.6 Prilejte k tomu 125 ml 60 °C extrakèného roztoku. 

6.7 Uzavrite vzorkovaciu banku s Parafilmom, aby ste zabránili vyšplechnutiu poèas extrakcie. 

6.8 Extrahujte za stáleho miešania (150 ot./min) na vodnom kúpeli pri 60 °C 15 minút. Potom vyberte 

banku z kúpel’a. 

6.9 Kým prejdete k ïalšiemu kroku, nechajte materiál sedimentova aspoò 5 minút. 

6.10 Prefiltrujte minimálne 5 ml extraktu cez filtraèný papier (Whatman è. 4) a odoberte filtrát ako vzorku. 

ALTERNATÍVNE: Centrifugujte pri 14 000 ot./min 5 minút (20 minút pri nižšej rýchlosti). 

Ako vzorku odoberte èistý supernatant. 

6.11 Pred zaèatím analýzy nechajte extrakt vychladnú na teplotu laboratória. 

7. Postup skúšania 

7.1 Pred použitím zohrejte všetky reagencie na laboratórnu teplotu 18 – 30 °C. 

7.2 Vyberte stripy s èervenými jamkami – jednu èervenú jamku pre každú testovanú vzorku, plus 5 èervených 

jamiek pre štandardy. Umiestnite jamky do držiaka. 

21

7.3 Vyberte rovnaké množstvo protilátkou potiahnutých jamiek. Jamky, ktoré nebudete používa , ihneï 

vrá te do fóliového vrecka s vysušujúcimi kapsulami. Vrecko dobre uzavrite. Oznaète si jeden koniec 

stripu s protilátkami, aby sa jamky dali neskôr, po premývaní, identifikova . 

7.4 Pred použitím každý reagent vo fI’aštièke premiešajte krúživým pohybom. 

7.5 Napipetujte 150 ml zo štandardov (0 ppm; 2,5 ppm; 5 ppm; 10 ppm; 25 ppm) a vzoriek do èervených 

prenášacích jamiek. Vždy použite novú špièku. 

7.6 Použitím viackanálovej pipety preneste 100 ml do jamiek s protilátkou a premiešajte pohybom držiaka 

s jamkami na rovnej ploche tam a spä 20 sekúnd. Inkubujte 10 minút pri laboratórnej teplote. 

Použité èervené zmiešavacie jamky vyhoïte. 

7.7 Vylejte obsah jamiek s protilátkou. Naplòte všetky jamky premývacím pufrom (dajte pozor, neprelejte 

jamky) a potom pufer vylejte. Opakujte 5 krát, potom jamky otoète hore dnom a vyklepte zvyšky 

pufra na vrstvu sacieho papiera. 

7.8 Nalejte potrebné množstvo konjugátu z flaštièky s modrým štítkom do reagenènej vanièky. Použitím 

nových špièiek, preneste 100 ml konjugátu do jamiek. Premiešajte pohybom držiaka s jamkami na 

rovnej ploche tam a spä 20 sekúnd. Inkubujte 10 min. pri laboratórnej teplote. 

7.9 Opakujte postup v kroku 7. 

7.10 Nalejte potrebné množstvo substrátu z flaštièky so zeleným štítkom do reagenènej vanièky. Použitím 

nových špièiek, preneste 100 ml substrátu do jamiek. Premiešajte pohybom držiaka s jamkami na 

rovnej ploche tam a spä 20 sekúnd. Inkubujte 10 min. pri laboratórnej teplote. Neodhadzujte 

špièky. Prebytoèný substrát vylejte a reagenènú vanièku opláchnite vodou. 

7.11 Nalejte zastavovací roztok z fl’aštièky s èerveným štítkom do reagenènej vanièky (rovnaký objem 

ako bol objem substrátu). Použitím rovnakých špièiek ako sa použili pri pipetovaní substrátu, 

pridajte100 ml zastavovacieho roztoku do každej a jemne premiešajte pohybom tam a spä . Použité 

špièky vyhoïte. 

7.12 Utrite spodok jamiek suchou mäkkou handrièkou a zmerajte absorbanciu pomocou mikroplatnièkového 

rídra pri vlnovej dåžke 650 nm. 

8. Vyhodnotenie výsledkov 

Metodika umožòuje vyhodnotenie reakcie v rozsahu 2,5 ppm – 25 ppm, s detekèným limitom na 

úrovni 2,5 ppm. Z hodnôt absorbancií štandardov si pripravte kalibraènú krivku, do ktorej naneste 

hodnoty absorbancií vzoriek. 

Dôležité: Vzorku, ktorej absorbancia je nad úrovòou štandardu 25 ppm, je potrebné otestova 

ELISA súpravou s väèším rozsahom (napr. TEPNEL BioSystems, UK). 

9. Použitá literatúra 

Veratox Quantitative Soy Flour Allergen Test. Neogen Corporation, návod od výrobcu. 

22


k zoznamu úradných metód laboratórnej diagnostiky 

potravín a krmív – èas Rôzne 

R. – 17 

Stanovenie sójového proteínu v potravinách metódou ELISA 

Metóda B 

1. Urèenie metódy 

Táto metodika urèuje postup pre stanovenie sóje v potravinách metódou ELISA. 

2. Princíp metódy 

Mikrotitraèná platnièka (dno jamiek) je potiahnutá purifikovaným sójovým proteínom. Do jamky sa 

pridáva nariedený extrakt vzorky a špecifický králièí anti-sójový proteín. Pri zvýšenom obsahu sóje v 

extrakte sa znižuje množstvo špecifického králièieho anti-sójového proteínu naviazaného na dno jamky. 

Nenaviazaný materiál sa premývaním odstráni. Na naviazaný králièí proteín sa naviaže peroxidázový 

konjugát. Po inkubácii a premytí sa pridáva substrát, prièom vzniká za prítomnosti peroxidázy modré 

zafarbenie. Po pridaní stop roztoku sa zafarbenie mení na žlté. Intenzita zafarbenia je nepriamo úmerná 

koncentrácii sójového proteínu v riedenom extrakte. Množstvo proteínu sóje vo vzorke sa odèítava z 

kalibraènej krivky zostrojenej pod¾a štandardov so známymi koncentráciami sójového proteínu. 

3. Pomôcky 

3.1 Prístroje a pomôcky 

50,100 µl mikropipeta, trepaèka, laboratórne sklo, vodný kúpe¾, homogenizátor, spektrofotometer 

na mikrotitraèné platnièky 

3.2 Chemikálie 

- súèas súpravy: mikrotitraèná platnièka potiahnutá sójovým proteínom, štandardy (5 kusov s obsahom 

3,5, 7, 15, 35, 70 µg sójového proteínu/ml), kontrolný sójový proteín, králièí anti-sójový proteín, 

peroxidázový konjugát, TMB substrát, stop roztok, koncentrovaný premývací a riediaci roztok 

- potrebné doda : urea, dithiothreitol, Tris, metylamín, L-cystín, chlorid sodný, 1,0 M hydroxid sodný, 

1,0 M kyselina chlorovodíková 

4. Bezpeènos pri práci 

Súpravu je možné používa iba po dobu vyznaèenej expirácie. Nepipetova ústami. Pri práci dodržiava 

zásady správnej laboratórnej praxe! Stop roztok obsahuje kyselinu – zabráni požitiu a kontaktu s pokožkou 

a oèami. 

23

5. Skladovanie, dodržanie stability 

Súpravu skladujeme pri 2 -8 °C. Nesmie by zmrazovaná. 

Všetky nepoužité stripy je nutné vráti do originálneho obalu aj s desikaènými sáèkami. 

Jednotlivé zložky súpravy sa nesmú používa medzi súpravami iného výrobného èísla. 

6. Pracovný postup 

6.1. Príprava roztokov 

Extrakèné roztoky - pripravova v deò použitia! ( na 4 stripy ) 

6.1.1 Zásobný roztok 0,25 M TRIS-HCl pH 8,6 (200 ml) 

– naváži 6,06 g (± 0,06 g) Tris (hydroxymetyl metylamín) do 250 ml nádoby 

– prida 150 ml purifikovanej vody a premieša , kým sa Tris nezozpustí 

– upravi pH na 8,6 (± 0,2) pridaním 1,0 M HCl (maximálne 11-13 ml) 

– kvantitatívne prenies do 200 ml (± 2 ml) odmerného skla a doplni purifikovanou vodou do 

objemu 200 ml. 

6.1.2 0,05 M TRIS tlmivý roztok pH 8,6 ( 600 ml) 

riedi zásobný roztok 0,25 M Tris-HCl pH 8,6 purifikovanou vodou 1:4 (120 ml zásobného roztoku 

+ 480 ml vody) 

6.1.3 Urea-DTT extrakèný tlmivý roztok (100 ml) 

– naváži 80,0 g urei do 250 ml kónického skla 

– prida 20 ml (± 0,2 ml) zásobného 0,25 M Tris-HCl a 20 ml (± 0,2 ml) purifikovanej vody 

– za stáleho miešania nad kahanom opatrne zohrieva , kým sa urea nerozpustí 

– do horúceho roztoku urei prida 0,29 g (± 2 mg) DTT a mieša , kým sa nerozpustí 

– prenies sklo do vodného kúpe¾a zohriateho na 100 °C a necha v òom 

(roztok nesmie pred a poèas používania vykryštalizova !) 

6.1.4 Renaturaèný roztok (1000 ml) 

– naváži 1,8 g (± 0,02 g) L-cystínu do 50 ml skla 

– prida pipetou 20 ml (± 0,2 ml) 1,0 M NaOH a opatrným miešaním rozpusti 

– naváži 3,5 g (± 0,03 g) NaCl a rozpusti v 900 ml purifikovanej vody v 1 l nádobe 

– pri stálom miešaní prida 20 ml (± 0,2 ml) roztoku L-cystínu do roztoku NaCl 

– za stáleho miešania prida 8 ml (± 8 µl) 1,0 M roztoku HCl do roztoku L-cystín-NaCl 

– odmera a upravi pH na 9,0 pridaním 1,0 M HCl maximálne 1,5-3 ml 

– doplni objem purifikovanou vodou do 1,0 litra. 

6.1.5 Roztoky ELISA setu 

Premývací roztok: pripraví sa riedením koncentrátu 1:10 v demineralizovanej vode. 

(Na 4 stripy – 30 ml koncentrátu + 270 ml vody.) 

6.1.6 Riediaci roztok: pripraví sa riedením koncentrátu 1:5 v demineralizovanej vode. 

(Na 1 platnièku – 25 ml koncentrátu + 100 ml vody, na 4 stripy – 6,5 ml + 26 ml) 

24

6.2. Príprava vzorky 

6.2.1 Naváži 12,00 g vzorky (± 0,12 g) do miešacieho skla a zapísa skutoènú hmotnos ako m vzorky 

. 

6.2.2 Naváži 48,00 g (± 0,48 g) 0,05 M Tris-HCl tlmivý roztok pH 8,6 a zapísa skutoènú hmotnos 

ako m tris 

. 

6.2.3 Mieša vzorku, kým nevznikne celkom homogénna zmes. 

6.2.4 Kvantitatívne prenies do 100 ml nádoby tak, aby nezostali žiadne väèšia kúsky tkaniva. 

6.2.5 Mieša homogenizátorom, kým nevznikne hladká homogénna zmes, ktorú možno pipetova . 

6.2.6 Pipetou naváži 2,50 g homogenátu (± 0,02 g) do 50 ml varného skla (sklo je potrebné položi 

priamo na váhu a homogenát tesne pred pipetovaním mieša ). Zapísa hmotnos ako m 2,50 

. 

6.2.7 Umiestni sklo do vodného kúpe¾a vyhriateho na 50 °C ± 2 °C – predhria . 

Príprava kontrolného sójového proteínu: 

Naváži 40 mg kontrolného sójového proteínu (± 0,4 mg) do 50 ml skla a zapísa skutoènú hmotnos 

ako m 0,040 

. Prida 2,5 ml (± 25 µl) 0,05 M Tris-HCl tlmivý roztok pH 8,6, miešaním rozpusti 

a umiestni sklo do 50 °C* vodného kúpe¾a. Predhria rovnako ako vzorku. 

6.2.8 Napipetova 7,5 ml (± 0,1 ml) roztoku urea-DTT zohriateho na 100°C ± 2 °C a prida do vzorky 

aj kontroly, ktoré sú umiestnené v 50 °C vodnom kúpeli. ( Necha pipetu v roztoku urea-DTT, aby 

sa pri ochladení zabránilo vykryštalizovaniu urei v špièke pipety.) 

6.2.9 Sklo zazátkova , opatrne premieša (na dosiahnutie homogénnej suspenzie) a prenies do100 °C* 

vodného kúpe¾a. 

6.2.10 Inkubova 1 hodinu s èastým premiešavaním. 

6.2.11 Po inkubácii preloži sklá do 50 °C ± 2 °C vodného kúpe¾a. 

6.2.12 Pri stálom premiešavaní pomaly prida do každého skla 20 ml renaturaèného roztoku s teplotou 

50° C ± 2° C. Stále premiešava . 

6.2.13 Vybra sklá z kúpe¾a a kvantitatívne prenies s použitím 3 x 10 ml renaturaèného roztoku (50 °C 

± 2°C) do 100 ml skla. Premieša a necha ochladnú pri laboratórnej teplote. 

6.2.14 Doplni objem renaturaèným roztokom do 100 ml pri laboratórnej teplote. Premieša a prefiltrova 

cez papierový filter (Whatman è.1). Odloži prvých 10 ml (± 2 ml) filtrátu na vyšetrenie.(Filtráty 

je možné skladova pri 2 - 8 °C do 48 hodín, alebo zmrazené pri -20 °C nieko¾ko mesiacov.) 

25

6.3. ELISA 

1. Pred použitím všetky reagencie musia by vytemperované na laboratórnu teplotu (19-23) °C 

2. Pred ELISA testom je nutné nariedi vzorky a kontrolu (C) - filtráty riediacim roztokom 1:10 (pridaním 

900 µl riediaceho roztoku do 100 µl filtrátu). 

3. Napipetova 50 µl riediaceho roztoku do jamky A2 – maximálna väzba (M), jamka A1 ostáva 

prázdna – blank (B) 

4. Napipetova 50 µl kontrolného sójového proteínu (C) do jamiek B1 a B2 a štandardy (od 3,5 do 

70 µg/ml) do jamiek – C1-G1, C2-G2. 

5. Napipetova 50 µl nariedenej vzorky vždy duplicitne – vz.è.1 (H1, H2), vz.è.2 (A3,B3), vz.è.3 (C3, 

D3) …. 

6. Napipetova 50 µl králièieho anti-sójového proteínu do všetkých jamiek okrem blanku (A1). 

7. Obsah jamiek premieša , zakry platnièku a inkubova pri laboratórnej teplote na miešaèke 10 minút 

(alebo 20 minút za obèasného premiešavania). 

8. Obsah jamiek vytrias a premy 5-krát premývacím roztokom (zabráni vzniku bublín). 

9. Napipetova 100 µl konjugátu do všetkých jamiek okrem blanku (A1). 

10. Obsah jamiek premieša , zakry platnièku a inkubova pri laboratórnej teplote na miešaèke 10 minút 

(alebo 20 minút za obèasného premiešavania). 

11. Obsah jamiek vytrias a premy 5-krát premývacím roztokom (zabráni vzniku bublín). 

12. Napipetova 100 µl substrátu do všetkých jamiek (aj do A1). 

13. Obsah jamiek premieša a inkubova pri laboratórnej teplote na orbitálnej miešaèke 10 minút (alebo 

20 minút za obèasného premiešavania). 

14. Napipetova 50 µl stop roztoku do všetkých jamiek (zmení sa zafarbenie z modrého na žlté). 

15. Obsah jamiek premieša a do 30 minút odmera absorbanciu pri 450 nm. 

7. Vyhodnotenie výsledkov: 

Koncentrácia sójového proteínu vo vzorke (v µg/ml) sa odèítava z kalibraènej krivky zostrojenej pod¾a 

priemerných hodnôt všetkých 5 štandardov. 

Tab. è. 1 Hodnoty na zostrojenie kalibraènej krivky (príklad) 

Štandardy sójového proteínu Absorbancia 

µg/ml 450 nm 

1.abs 2.abs Priemer 

3,5 1,596 1,706 1,651 

7,0 1,238 1,268 1,253 

15,0 0,897 0,954 0,926 

35,0 0,551 0,584 0,568 

70,0 0,361 0,377 0,369 

26

Obr. è. 1 Kalibraèná krivka zostrojená z hodnôt uvedených v tab. è. 1 

y 

(abs 450 nm) 

2,000 

1,500 

1,000 

Stanovenie sóje 

štandardná krivka 

y = -0,4271Ln(x) + 2,1246 

R 2 = 0,9887 

0,500 

0,000 

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 

x (mikrog sóje/ ml) 

Percentuálne vyjadrenie obsahu sójového proteínu vo vzorke sa vypoèíta pod¾a vz ahu: 

x 

exp 

y b 

a 

m vzorka 

+m tris 

m vzorka 

V 100 

m 2,50 

V 10 

V 1 

1 

10 6 100 

x obsah sójového proteínu vo vzorke v % 

y absorbancia pri 450 nm 

a,b parametre logaritmickej závislosti absorbancie od koncentrácie sójového proteínu 

m vzorka 

hmotnos navážky vzorky v g 

m tris 

hmotnos tlmivého roztoku v g 

m 2,50 

hmotnos homogenátu vzorky v g 

V 100 

objem, do ktorého sa homogenát doplnil v ml 

V 10 

/ V 1 

riedenie 

10 6 prepoèet m g na g 

100 prepoèet na % 

Percentuálne vyjadrenie obsahu sójového proteínu v kontrole (vý ažnos ) sa vypoèíta pod¾a vz ahu: 

c KSP 

exp 

y b 

a 

V 100 

m 0,040 

V 10 

V 1 

1 

10 6 1 

0,84 100 

c KSP 

obsah kontrolného sójového proteínu (vý ažnos ) % 

y absorbancia pri 450 nm 

a,b parametre logaritmickej závislosti absorbancie od koncentrácie sójového proteínu 

m 0,040 

hmotnos navážky kontrolného sójového proteínu v g 

V 100 

objem, do ktorého sa homogenát kontrolného sójového proteínu doplnil v ml 

V 10 

/V 1 

riedenie 

0,84 proteínová hodnota kontrolného sójového proteínu 

10 6 prepoèet m g na g 

100 prepoèet na % 

27

Tab. 2 Pracovný list (príklad) 

1. abs. 2. abs. Priemer m vzorka 

m tris 

m 2,50 

m 0,040 

x (%) c KSP 

(%) 

C Sój.kontrola 

(=0,84) 0,363 0,354 0,359 0,040 92,3 

M Max. väzba 1,555 

1 Vzorka è.1 0,326 0,296 0,311 12,06 48,06 2,535 8,02 

2 Vzorka è.2 0,658 0,637 0,648 11,92 48,08 2,502 1,83 

3 Vzorka è.3 0,994 1,010 1,002 11,95 48,22 2,524 < 0,70 

ELISA je vhodná na vyšetrenie vzoriek s obsahom sóje od 1 do 10 % hmotnosti vzorky. Vzorky, ktoré 

majú obsah sóje mimo tento rozsah, sa pripravujú nasledovne: 

Nad rozsah (2-20 %) - použi 5 g vzorky a 45 g 0,05M Tris-HCl tlmivý roztok 

Pod rozsah (0,5 – 5 %) - použi 24 g vzorky a 36 g 0,05 M Tris-HCl tlmivý roztok 

Vzorky, ktoré majú absorbanciu väèšiu ako hodnota štandardu 3,5 µg/ml - výsledok sa interpretuje ako 

obsah sóje < 0,70 % ak sa použilo 12 g vzorky, alebo < 0,35 % ak sa použilo 24 g vzorky. 

8. Validácia testu 

1. Maximálna väzba ( nulový štandard) 

Pri optimálnej laboratórnej teplote (19-23°C) je hodnota nulového štandardu >1,4. 

Pomer priemernej hodnoty absorbancie štandardu 3,5 µg/ml a maximálnej väzby je medzi 

0,5 – 0,67. 

2. Pri laboratórnej teplote nad 23 °C sa zvyšujú absorbanèné hodnoty, ale test je správny, ak hodnota 

štandardu 3,5 neprevýši 1,8 a pomer priemernej hodnoty štandardu 7 µg/ml a štandardu 3,5 µg/ml je 

medzi 0,6 – 0,85. 

3. Blank 

Blank jamka musí by bez vidite¾ného zafarbenia. Zafarbenie jamky svedèí o kontaminácii substrátu 

konjugátom alebo o prsknutí konjugátu do jamky pri práci. 

4. Kontrolný sójový proteín 

Vý ažnos kontrolného sójového proteínu (c %) sa má pohybova medzi 75-105 %. (Výrobca udáva 

vý ažnos 95 %.) Ak sú hodnoty vý ažnosti mimo tento rozsah, proces extrakcie je nesprávny. 

9. Špecifita 

ELISA súprava je špecifická pre sójový proteín a je štandardizovaná na èistú sóju Purina PP500E. 

10. Literatúra 

Návod na použitie výrobcu – TEPNEL BioSystems, UK 

28

43 

Z O Z N A M 



Èas MIKROBIOLÓGIA 





úradných metód laboratórnej diagnostiky 

potravín a krmív – èas Mikrobiológia, ktorý pod¾a 

§ 14 ods. 3 zákona vydáva hlavný veterinárny lekár: 


M 1. Stanovenie celkového poètu mikroorganizmov metódou STN EN ISO 4833 

poèítania kolónií v potravinách a krmivách (56 0083) 

M 2. Stanovenie celkového poètu mezofilných aeróbnych STN 56 0084 

a fakultatívne anaeróbnych mikroorganizmov metódou 

najpravdepodobnejšieho poètu v potravinách 

M 3. Stanovenie poètu koliformných baktérií metódou STN ISO 4831 

najpravdepodobnejšieho poètu v potravinách a krmivách (56 0086) 

M 4. Stanovenie poètu koliformných baktérií metódou poèítania STN ISO 4832 

kolónií v potravinách a krmivách (56 0085) 

M 5. Stanovenie poètu predpokladaných baktérií Escherichia coli STN ISO 7251 

metódou najpravdepodobnejšieho poètu v potravinách (56 0093) 

a krmivách 

M 6. Stanovenie poètu predpokladaných baktérií Escherichia coli STN ISO 11866-1 

metódou najpravdepodobnejšieho poètu v mlieku (57 0100) 

a mlieènych výrobkoch 

M 7. Stanovenie poètu predpokladaných baktérií STN ISO 11866-2 

Escherichia coli. metódou najpravdepodobnejšieho poètu (57 0100) 

s použitím 4-metylumbeliferyl-b -D-glukoronidu (MUG) 

v mlieku a mlieènych výrobkoch 

M 8. Stanovenie poètu predpokladaných baktérií Escherichia coli. STN ISO 11866-3 

metódou poèítania kolónií s použitím membrán v mlieku (57 0100) 

a mlieènych výrobkoch 

29


M 9. Metóda na dôkaz baktérií Escherichia coli 0 157 STN EN ISO 16654 

v potravinách a krmivách (56 0105) 

M 10. Stanovenie poètu kvasiniek a plesní metódou poèítania STN ISO 7954 

kolónií v potravinách a krmivách (56 0087) 

M 11. Dôkaz baktérií rodu Salmonella v potravinách a krmivách STN EN ISO 6579 

(56 0088) 

M 12. Stanovenie poètu koagulázopozitívnych stafylokokov STN EN ISO 6888-1/A1 

(Staphylococcus aureus a ïalšie druhy) metódou s použitím (56 0089) 

Bairdovho-Parkerovho agarového média v potravinách 

a krmivách Zmena 1 

M 13. Stanovenie poètu koagulázopozitívnych stafylokokov STN EN ISO 

(Staphylococcus aureus a ïalšie druhy) metódou s použitím 6888-2/A1 

agarového média s králièou plazmou a fibrinogénom (56 0089) 

v potravinách a v krmivách Zmena 1 

M 14. Stanovenie poètu koagulázopozitívnych stafylokokov STN EN ISO 6888-3 

(Staphylococcus aureus a ïalšie druhy) (56 0089) 

Èas 3: Dôkaz a stanovenie malých poètov metódou 

najpravdepodobnejšieho poètu (MPN) 

M 15. Dôkaz stafylokokového enterotoxínu reverznou pasívnou Úradné metódy 

latexovou aglutináciou 

laboratórnej diagnostiky 

potravín a krmív, 

príloha 1 

M 16. Dôkaz botulinických toxínov a Clostridium botulinum STN 56 0090 

v potravinách 

M 17. Stanovenie poètu baktérií Clostridium perfringens STN EN ISO 7937 

metódou poèítania kolónií v potravinách a krmivách (56 0091) 

M 18. Stanovenie poètu baktérií Bacillus cereus metódou STN EN ISO 7932 

poèítania kolónií v potravinách a krmivách (56 0092) 

M 19. Stanovenie poètu baktérií rodu Lactobacillus v potravinách STN 56 0094 

M 20. Stanovenie poètu slizotvorných baktérií rodu Leuconostoc STN 56 0095 

30


M 21. Dôkaz baktérií èelade Enterobacteriaceae s neselektívnym STN ISO 8523 

množením v potravinách a krmivách 56 0097 

M 22. Stanovenie poètu baktérií èelade Enterobacteriaceae STN ISO 7402 

bez resuscitácie metódou najpravdepodobnejšieho poètu 56 0096 

a metódou poèítania kolónií v potravinách a krmivách 

M 23. Dôkaz baktérií Vibrio parahaemolyticus v potravinách STN ISO 8914 

a krmivách (56 0098) 

M 24. Dôkaz predpokladaných patogénnych baktérií STN EN ISO 10273 

Yersinia enterocolitica (56 0099) 

M 25. Dôkaz termotolerantných baktérií rodu Campylobacter STN EN ISO 10272 

v potravinách a krmivách (56 0108) 

M 26. Stanovenie mezofilných aeróbnych a fakultatívne anaeróbnych STN 57 0161 

mikroorganizmov v konzervách 

M 27. Stanovenie mezofilných anaeróbnych mikroorganizmov STN 57 0162 

v konzervách 

M 28. Stanovenie termofilných aeróbnych a fakultatívne anaeróbnych STN 57 0163 

mikroorganizmov v konzervách 

M 29. Stanovenie termofilných anaeróbnych mikroorganizmov STN 57 0164 

v konzervách 

M 30. Dôkaz baktérií Listeria monocytogenes v mlieku STN ISO 10560 

a mlieènych výrobkoch 57 0103 

M 31. Dôkaz baktérií Listeria monocytogenes v potravinách STN EN ISO 11290-1 


M 32. Stanovenie poètu Listeria monocytogenes v potravinách STN EN ISO 11290-2 


M 33. Stanovenie poètu jednotiek tvoriacich kolónie STN ISO 6730 

psychrotrofných mikroorganizmov metódou poèítania (57 0102) 

kolónií vykultivovaných pri 6,5 o C v mlieku 

M 34. Stanovenie poètu baktérií rodu Pseudomonas v mäse STN ISO 13720 

a v a mäsových výrobkoch (57 6021) 

31


M 35. Stanovenie poètu Brochotrix thermosphacta v mäse STN ISO 13722 

a v a mäsových výrobkoch (57 6041) 

M 36. Dôkaz baktérií rodu Brucella v mlieku Úradné metódy 

a v mlieènych výrobkoch 



príloha 2. 

M 37. Stanovenie poètu enterokokov v potravinách STN 56 0100 

Èl. 80, èas 6 

M 38. Stanovenie poètu Pseudomonas aeruginosa v potravinách STN 56 0100 

Èl. 83 

M. 38 a. Stanovenie poètu osmofilných kvasiniek v potravinách STN 56 0100 

Èl.86 

M. 39. Stanovenie poètu b-hemolytických streptokokov v potravinách STN 56 0100 

Èl.96 

M 40. Stanovenie poètu koagulázopozitívnych stafylokokov STN EN ISO 6888-3 

(Staphylococcus aureus a ïalšie druhy) (56 0089) 

Èas 3: Dôkaz a stanovenie malých poètov metódou 

najpravdepodobnejšieho poètu (MPN) 

M 41. Dôkaz stafylokokového enterotoxínu metódou ELISA Úradné metódy 



príloha è. 3 

M 42. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal ISO 16649-3 

method for the enumeration of - b glucoronidase-positive 

Escherichia coli Part 3: Most probable number technigue 

using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-glucuronide 

M 43. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal ISO 21528-1 

methods for the detection and enumeration 

of Enterobacteriaceae — Part 1: Detection and enumeration 

by MPN technique with pre-enrichment 

M 44. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal ISO 21528-2 

methods for the detection and enumeration 

of Enterobacteriaceae — Part 1: Detection and enumeration 

by MPN technique with pre-enrichment 

32



method for the enumeration of – b- glucoronidase-positive 

Escherichia coli Part 1: Colony –count technigue at 44 o C 

using membranes and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl 

b-D- glucoronide 


method for the enumeration of - b glucoronidase-positive 

Escherichia coli part 2: Colony –count technigue at 44 o C 

using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl b-D- glucoronide 

M 47. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Carcass ISO 17604 

sampling for microbiological analysis 

M 48. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal ISO 18593 

methods for sampling techniques from surfaces using contact 

plates and swabes 

M 49. Polymerázová re azová reakcia (PCR) na dôkaz patogénov STN EN ISO 22174 

v potravinách 56 0110 

M 50. Dôkaz stafylokokových enterotoxínov pomocou TECRA Úradné metódy 

modulov laboratórnej diagnostiky 


príloha è. 4 

Zrušuje sa zoznam úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín a krmív – èas Mikrobiológia 

zverejnený v èiastke è. 23 Vestníka Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 13. novembra 

2003. 



33


k zoznamu úradných metód 

laboratórnej diagnostiky potravín a krmív – èas Mikrobiológia 

M - 15 

MIKROBIOLÓGIA POTRAVÍN 

Dôkaz enterotoxínu Staphylococcus aureus metódou reverznej pasívnej latexovej 

aglutinácie (RPLA) 


Táto metodika urèuje referenèný postup pre dôkaz stafylokokového enterotoxínu A, B, C, D v potravinách 

a vo filtrátoch kultúr. 

2. Definícia 

Stafylokokový enterotoxín je pomerne jednoduchý polypeptid s molekulárnou hmotnos ou asi 35 000 

daltonov. Pod¾a antigénnych vlastností je známych 8 typov, oznaèených A,B,C (s tromi podtypmi 

C 1 

,C 2 

a C 3 

), D, E, G, H a I. Najèastejšie produkujú kmene enterotoxín typ A (asi 45 % z 

enterotoxinogénnych kmeòov).Niektoré kmene Staphylococcus aureus produkujú viac typov 

enterotoxínu. Enterotoxín spôsobuje najtypickejšiu bakteriálnu intoxikáciu - stafylokokovú enterotoxikózu. 

Pre vyvolanie ochorenia dospelého èloveka staèí jeden mikrogram purifikovaného toxínu. 


Podstatou skúšania je reverzná pasívna aglutinácia na latexe (RPLA). Pri tejto metóde protilátka naviazaná 

na partikuly reaguje so solubilným antigénom. Partikuly (v tomto prípade èastice latexu) sami o sebe 

nehrajú rolu v tejto reakcii a preto sú pasívne. Väzba latexových èastíc pri špecifickej reakcii antigénu 

s protilátkou vyústi do vidite¾nej latex - aglutinaènej reakcie. 

4. Krátky popis 

Polystyrénové latexové partikuly sú senzibilizované purifikovaným antisérom odobratým z králikov 

osobitne imunizovaných individuálne purifikovanými stafylokokovými enterotoxínmi A, B, C a D. Tieto 

latexové partikuly aglutinujú v prítomnosti príslušného enterotoxínu. Súèas ou testu je aj kontrolný 

reagent z latexových partikulí senzibilizovaných globulínami neimunizovaných králikov. Test sa robí na 

mikrotitraèných platniach s V-jamkami. Riedenie extraktov z potravín alebo z bakteriálnych kultúr sa 

robí v piatich radoch jamiek, potom sa pridá primerané množstvo latexovej suspenzie do každej jamky 

34

a obsah sa premieša. Ak sú prítomné stafylokokové enterotoxíny typu A, B, C a D, dôjde k aglutinácii, 

ktorá sa zvidite¾ní vytvorením mriežkovej štruktúry. Po ustálení sa vytvorí difúzna vrstva na báze jamky. 

Ak enterotoxín nie je prítomný alebo je jeho koncentrácia nízka, latexová vrstva sa nevytvorí a v jamke 

je vidite¾ný malý plný krúžok. K testu je pridávané riedidlo, ktoré obsahuje hexamatafosfát sodný, 

ktorý redukuje výskyt nešpecifických reakcií s niektorými zložkami potravín. 

5. Prístroje, pomôcky, chemikálie a kultivaèné médiá 

5.1 Súprava RPLA 

5.1.1 TD 901 Latex sensibilizovaný antienterotoxínom A 

Latexová suspenzia sensibilizovaná špecifickými králièími IgG pritilátkami proti stafylokokovému 

enterotoxínu A 

5.1.2 TD 902 Latex sensibilizovaný antienterotoxínom B 


enterotoxínu B 

5.1.3 TD 903 Latex sensibilizovaný antienterotoxínom C 


enterotoxínu C 

5.1.4 TD 904 Latex sensibilizovaný antienterotoxínom D 


enterotoxínu D 

5.1.5 TD 905 latexová kontrola 

latexová suspezia sensibilizovaná neimúnnym králièím globulínom 

5.1.6 TD 906 kontrolný roztok stafylokokového enterotoxínu A 

5.1.7 TD 907 kontrolný roztok stafylokokového enterotoxínu B 

5.1.8 TD 908 kontrolný roztok stafylokokového enterotoxínu C 

5.1.9 TD 909 kontrolný roztok stafylokokového enterotoxínu D 

fosfátový pufrovaný solný roztok s obsahom albumínu z bovinného séra a hexametafosfátu sodného 

Súpravy RPLA sa skladujú a manipuluje sa s nimi pod¾a pokynov výrobcu. 

5.2 miešaè alebo homogenizátor 

5.3 odstredivka s otáèkami 3 000 ot/min. 

5.4 mikromixér 

5.5 membránová filtraèná jednotka s jednorazovými nízkoproteínovými filtrami s poréznos ou 

0,2 - 0,45 mm (napr. Millipore SLGV) 

5.6 vlhká komôrka 

5.7 mikrotitraèné platne s V-jamkou s krytom 

5.8 fixná alebo vymenite¾ná pipeta s hrotmi na 25 ml 

5.9 25 ml kvapadlo 

5.10 0,85 % roztok chloridu sodného 

5.11 roztok hypochloritu sodného (nad 1,3 % w/w) 

5.12 tryptónový sójový bujón (napr. Oxoid CM 129) 

35

6. Vzorky 

6.1 Vzorky potravín 

Je možné testova široký okruh potravín, ale príprava extraktov urèitých potravín môže vyžadova 

urèité modifikácie. Hlavnou požiadavkou je získa nezakalený beztukový extrakt. Je potrebné zachova 

nízky faktor zriedenia kvôli optimálnej citlivosti testu. Ak si povaha vzorky vyžaduje vyššie 

zriedenie, výsledok môže by ovplyvnený nižšou citlivos ou testu. 

Citlivos testu sa uvádza pre koncentráciu enterotoxínu 0,5 ng/ml skúšaného extraktu. Ak je extrakt 

z potraviny pripravený pri riedení 1:1 riedidlom, je následne citlivos 1 ng/g pôvodneho potravinového 

základu. Limit detekcie sa bude meni v závislosti od špecifických požiadaviek na riedenie tej-ktorej 

vzorky potraviny alebo suroviny. Koncentrácia enterotoxínu v extrakte môže by ovplyvnená 

rôznorodos ou použitých metód. 

6.1.1 Príprava extraktu 

6.1.2 Vzorky s hmotnos ou 10 g rozmixova s 10 ml 0,85 % roztokom chloridu sodného v miešaèi alebo 

v homogenizátore. 

6.1.3 Rozmixovanú vzorku odstredi pri 900 g 4 o C 30 minút. Ak nie je k dispozícii odstredivka s 

chladením, treba pred odstredením vzorku zchladi na 4 o C 

6.1.4 Supernatant filtrova cez 0,2-0,45 mm filter s membránou, viazúcou proteín a získaný filtrát použi 

na stanovenie enterotoxínu 

6.2 Filtráty z kultúr 

6.2.1 Stafylokoky získané z potravín metódou pod¾a STN ISO 6888 Mikrobiológia. Všeobecné pokyny 

na stanovenie poètu baktérií Staphylococcus aureus. Metóda poèítania kolónií. 

6.2.2 Izolované typické bakteriálne kolónie inokulova do tryptónového sójového bujónu 

6.2.3 Inkubova pri 37 o C18-24 hodín s miešaním 

6.2.4 Po pomnožení odstredi pri 900 g 20 minút pri 4 o C alebo filtrova cez 0,2-0,45 mm filter s membránou, 

viazúcou proteín a získaný filtrát použi na stanovenie enterotoxínu 

6.3 Kontrolná vzorka 

Každá rekonštituovaná toxínová kontrola spôsobí aglutináciu s príslušným senzibilizovaným latexom. 

Použitie latexových kontrol poslúži ako referenèná pozitívna kontrola pri interpretácii výsledkov testu. 

Tieto kontroly možno používa z èasu na èas aj na zis ovanie správnej funkènosti latexu. Toxínové 

kontroly nemajú špecifikovanú hladinu a preto nemôžu by použité pre kvantifikáciu obsahu toxínu 

vo vyšetrovanej vzorke. 


7.1 Pred použitím dôkladne premieša latexové èinidlá a riedidlo, aby sa získala homogénna suspenzia . 

Na rekonštitúciu kontrolných èinidiel prida po 0,5 ml riedidla (TD 910) do každej nádobky, jemne 

mieša až do rozpustenia obsahu. 

7.2 Platòu nachysta tak, aby každý rad obsahoval 8 jamiek. Pre každú vzorku je potrebných 5 radov. 

36

7.3 Pomocou pipety alebo kvapkadla da do každej jamky z piatich radov riedidlo po 25 ml. 

7.4 Prida po 25 ml vyšetrovanej vzorky do prvej jamky vo všetkých piatich radoch. 

7.5 Za použitia zriedovaèa alebo pipety poènúc prvou jamkou každej rady zobra 25 ml obsahu a 

prenáša do každej jamky vo všetkých piatich radoch až po siedmu jamku, tak, aby ostala posledná 

jamka s obsahom len riedidla. Robíme tak dvojnásobné riedenie. 

7.6 Do každej jamky v prvom rade prida 25 ml latexu sensibilizovaného antienterotoxínom A. 

7.7 Do každej jamky v druhom rade prida 25 ml latexu sensibilizovaného antienterotoxínom B. 

7.8. Do každej jamky v tre om rade prida 25 ml latexu sensibilizovaného antienterotoxínom C. 

7.9 Do každej jamky v štvrtom rade prida 25 ml latexu sensibilizovaného antienterotoxínom D. 

7.10 Do každej jamky v piatom rade prida 25 ml latexovej kontroly. 

7.11 Platne dôkladne premieša otáèaním v mikromixéri, alebo v ruke. Z jamiek sa nesmie niè vylia . 

7.12 Na zabránenie vyparovania zakry platòu krytom. Je vhodné umiestni platòu do vlhkej komôrky. 

Ponecha platòu v k¾ude, na rovnej ploche bez otrasov pri izbovej teplote po dobu 20-24 hodín. 

Pre dobré odèítanie je vhodné položi poèas inkubácie platòu na èierny papier. 

7.13 Centrifugaèné skúmavky, membránové filtre, platne, kryty a špièky do pipiet sterilizova v atokláve 

pri 121 o C alebo dezinfikova v hypochloritovom roztoku (nad 1,3 % w/w). 

7.14 Extrakty z kultúr, z potravín a toxínové kultúry vloži do hypochloritového roztoku (nad 1,3 % w/w). 

8. Vyhodnotenie 

Stanovi prítomnos alebo neprítomnos aglutinácie každej jamky v každom rade oproti èiernemu 

pozadiu. 

9. Vyjadrenie výsledkov 

Vzh¾ad výslednej aglutinácie posúdi pod¾a nasledovnej ilustrácie: 

– výsledky vyhodnotené ako +, ++ a +++ sú pozitívne 

– výsledky z radov s jamkami obsahujúcimi latexovú kontrolu musia by negatívne 

– pri nešpecifickej aglutinácii posúdi výsledok ako pozitívny za predpokladu, že reakcia so 

senzibilizovaným latexom bola pozitívna pri vyššom riedení skúšanej vzorky, ako je pri latexovej kontrole 

– posledné jamky v každom rade musia by negatívne, ak sa vyskytne pozitívna reakcia v niektorej z 

týchto jamiek, reakcia sa považuje za chybnú. 

37

10. Protokol o skúške 

V protokole o skúške sa musí uvies použitá metóda skúšania a získané výsledky a jednoznaène 

uvedený použitý spôsob ich vyjadrenia. Protokol musí obsahova aj všetky podrobnosti pracovného 

postupu, ktoré nie sú uvedené v tomto pokyne, alebo sú považované za volite¾né a ïalej všetky 

podrobnosti o okolnostiach, ktoré by mohli ma vplyv na výsledky skúšania. 

Protokol o skúške musí obsahova všetky informácie potrebné na úplnú identifikáciu vzorky. 

38




M-36 

MIKROBIOLÓGIA POTRAVÍN 

Metóda pre dôkaz baktérií rodu Brucella v mlieku a v mlieènych výrobkoch 


Táto metodika urèuje všeobecné pokyny pre metódu na dôkaz baktérií rodu Brucella v surovom 

kravskom, ovèom a kozom mlieku a v syroch zo surového kravského, ovèieho a kozieho mlieka. Metóda 

je založená na technike získania charakteristických kolónií narastených na selektívnom médiu po 

inkubácii pri teplote 37 o C. Bola vypracovaná na základe publikácií: KLEER,J.: Untersuchungen zum 

Brucellose-Infektionsrisiko durch Weibkäse-Kultureller Erregernachweis-Erhitzungsnachweis, 

Technologische Aspekte. Dizertaèná práca, Berlín 1988 a KLEER,J.,P.TEUFEL,P.,H-J.SINELL: 

Kultureller Nachweis von Brucella spp.in Salzlake-Weibkäsen. Zborník z odborného seminára, 

Garmisch-Partenkirchen, 29. 9.-1. 10. 1999. 

2. Odkazy na normy 

STN ISO 7218 Mikrobiológia potravín a krmív. Všeobecné pokyny na mikrobiologické skúšanie. 

3. Termíny a definícia 

Pre úèely tejto metodiky sa používajú tieto definície: 

3.1 suspektná brucella - sú baktérie, ktoré vytvárajú na selektívnom tuhom médiu charakteristické kolónie 

a ktoré vykazujú pri osvetlení charakteristické zafarbenie a popísané biochemické a sérologické 

vlastnosti, ak sú testy vykonané pod¾a tejto metódy. 

3.2 Brucella – suspektná brucella, ktorá bola biochemicky a sérologicky identifikovaná referenèným 

laboratóriom. 

3.3 Dôkaz rodu Brucella – urèenie prítomnosti alebo neprítomnosti týchto baktérií v definovanom množstve 

výrobku, ak sú testy vykonané pod¾a tejto metódy. 


Dôkaz baktérií rodu Brucella vyžaduje 5 po sebe nasledujúcich fáz (pozri aj tabu¾ku è.1). 

4.1 Selektívne množenie v tekutom médiu 

39

Skúšaná vzorka sa oèkuje do bujónu pre množenie brucel a inkubuje sa v mikroaeróbnom prostredí 

(5 až 10 % CO 2 

) pri 37 o C po dobu 3 až 5 dní 

4.2. Izolácia - Vyoèkovanie na tuhé selektívne médium pre zis ovanie prítomnosti suspektných kolónií. 

Každá z kultúr získaných pod¾a 4.1 sa vyoèkuje na predpísané tuhé selektívne médium, t.j. na agar 

pod¾a FARRELLa. Po inkubácii pri 37 o C po dobu 3 až 5 dní v mikroaeróbnom prostredí (5 až 10 % 

CO 2 

) sa zis uje prítomnos kolónií suspektných ako kolónie brucel. 

4.3 Skríning na základe morfologických znakov a potvrdenie suspektných brucel 

4.3.1 Skríning na základe morfologických znakov 

4.3.2 Skríning na základe osvetlenia 

4.4 Subkultivácia suspektných kolónií získaných pod¾a 4.3 na selektívne tuhé médium, Brucella agar pri 

37 o C po dobu 3 dní na potvrdenie príslušnosti k brucelám 

4.4.1 Katalázový test 

4.4.2 Farbenie pod¾a Grama 

4.4.3 Mikroskopické vyšetrenie 

4.4.4 Sklíèková aglutinácia s monošpecifickými A a M –antisérami 

4.4.5 Aglutinácia s 0,1 % vodným roztokom akriflavínu 

4.5 Odovzdanie na identifikáciu do referenèného laboratória 

Kultúru, ktorá vykazuje znaky svedèiace pre rod Brucella oznaèí laboratórium ako suspektnú brucelu 

a odovzdá na ïalšiu identifikáciu referenènému laboratóriu, napr. laboratóriu klinickej mikrobiológie. 

5. Kultivaèné médiá a èinidlá 

5.1 Všeobecne 

Bežnú laboratórnu prax pozri v STN ISO 7218 Mikrobiológia. Všeobecné pokyny pre mikrobiologické 

skúšanie. 

5. 2 Médium pre selektívne množenie – Bujón pod¾a Farrella pre množenie brucel 

5.2.1 Základ média: Bacto Brucella bouillon (DIFCO), alebo Brucella bujón 

5.2.1.1 Zloženie: 

tryptón 

mäsový peptón získaný peptickým trávením 

glukóza 

kvasnièný extrakt 

chlorid sodný (NaCl) 

hydrosirièitan sodný (NaHSO 3 

) 

voda 

10,0 g 

10,0 g 

1,0 g 

2,0 g 

5,0 g 

0,1 g 

1 000 ml 

40

5.2.1.2 Príprava 

Zložky média alebo kompletné dehydrované médium sa rozpustí vo vode, ak je to potrebné 

varom. Hodnota pH sa upraví tak, aby po sterilizácií bola 7,0 ± 0,2. 

Sterilizuje sa v autokláve pri teplote 121 0 C 15 minút. 

5.2.2 Výživné prídavky: 

konské sérum 5 % v/v - suplement OXOID SR 35 

roztok antibiotík – suplement OXOID SR 83 

cycloheximid 

nystatin 

bacitracin 

polymyxin B 

vancomycin 

kyselina nalidixinová 

100(mg/l) 

100 000 IU/l 

25 000 IU/l 

5 000 IU/l 

20 mg/l 

5 mg/l 

5.3 Selektívne tuhé médium pod¾a Farrella 

5.3.1 Základ média: 

Brucella-agar –basis - OXOID CM 169 

Pozn.: Firma OXOID ponúka aj Blod agar base è.2 (CM 271), alebo Columbia agar base (CM 

331) alebo Brucella Base (CM 691) 

Príprava médií pod¾a návodu výrobcu. 

výživné prídavky: 

konské sérum 5 % v/v - OXOID SR 35 

roztok antibiotík - suplement - OXOID SR 83 

cycloheximid 

nystatin 

bacitracin 

polymyxin B 

vancomycin 

kyselina nalidixinová 

100(mg/l) 

100 000 IU/l 

25 000 IU/l 

5 000 IU/l 

20 mg/l 

5 mg/l 

Obsah flaštièky so suplementom treba riedi s 10 ml zmesi vody a etanolu 1:1. 

5.3.2 Príprava roztokov pre suplement: 

cycloheximid (Sigma) 

1,0 g rozpusti v 5 ml acetónu, zriedi destilovanou vodou v pomere 1:20, 

10 ml=100 mg 

nystatin (Sigma, 4.800 IU/mg) 

208,3 mg sa rozpustí v 2 ml dimetylformamidu, pred použitím zriedi s destilovanou vodou v pomere 

1:10 

1 ml=5 000 IU 

41

acitracin (Serva, 55 000-65 000 IU/g) 

4,167 g sa rozpustí v 50 ml destilovanej vody 

1 ml = 5 000 IU (4584-5417 IU) 

polymyxín B (polymyxin B-sulfat, Sigma) 

6,3 mg sa rozpustí v 10 ml destilovanej vody, 

1 ml = 5 000 IU 

vankomycín (Vancomycin-hydrochlorid, Sigma) 

50 mg sa rozpustí v 10 ml destilovanej vody 

1 ml = 5 mg 

kyselina nalidixinová (Sigma) 

500 mg sa rozpustí v 10 ml 0,5 N NaOH 

bezprostredne pred použitím sa zriedi s destilovanou vodou v pomere 1:10 

1 ml pracovného roztoku = 5 mg 

Poznámka - Agar a bujón pod¾a Farella ve¾mi dobre potláèajú rast stafylokokov, aeromonád, streptokokov, 

baktérie z èelade Enterobacteriaceae a ostatných gram-negatívnych tyèiniek. 

6. Prístroje a pomôcky 

Poznámka - Jednorazové pomôcky, pokia¾ majú vhodnú špecifikáciu, sú prijate¾nými náhradami za 

pomôcky sklenené. 

Základné vybavenie mikrobiologického laboratória (pozri STN ISO 7218) 

6.1 Prístroj na sterilizáciu horúcim vzduchom (sušiareò) alebo parou (autokláv) 

6.2 Termostat s možnos ou udržiavania teploty na 37 o C ± 1 o C 

6.3 Vodný kúpe¾ alebo termostat s možnos ou udržiavania teploty na 40 o C ± 1 o C 

6.4 pH meter s presnos ou merania ± 0,1 jednotky pH pri teplote 25 o C 

6.5 Anaerostat vybavený katalyzátorom a vyvíjaèom plynov (Gaspak) pre vytvorenie prostredia s 5 

-10 % CO 2 

6.6 Banky, skúmavky alebo f¾aše s vhodným objemom 

6.7 Odmerné valce 

6.8 Delené pipety s objemom 10 ml s delením 0,5 ml a s objemom 1 ml s delením 0,1 ml 

6.9 Bakteriologické k¾uèky vyrobené zo zliatiny platiny a irídia alebo zo zliatiny chrómu a niklu s priemerom 

približne 3 mm 

6.10 Petriho misky s priemerom od 90 mm do 100 mm 

7. Odber vzoriek 

Je dôležité, aby laboratórium dostalo vzorku, ktorá je skutoène reprezentatívna a nebola poèas prepravy 

a uskladnenia poškodená alebo zamenená. 

Odber vzoriek nie je súèas ou metódy špecifikovanej v tomto metodickom pokyne. Ak neexistuje 

špecifická medzinárodná norma na odber vzoriek skúšaného výrobku, odporúèa sa, aby sa zúèastnené 

strany na tomto postupe dohodli. 

42

8. Príjem a uchovávanie vzoriek 

Príprava analytickej vzorky sa vykonáva pod¾a špecifickej normy vhodnej pre skúšaný výrobok. Ak 

takáto špecifická medzinárodná norma neexistuje, odporúèa sa, aby sa zúèastnené strany na tomto 

postupe dohodli. 


(Pozri schému v tabu¾ke ) 

9.1 Skúšobná vzorka 

Pozri STN ISO 6887 a niektorú špecifickú medzinárodnú normu vhodnú pre skúšaný výrobok 

9.2 Selektívne množenie 

Vzorka o hmotnosti 25 g sa zhomogenizuje s 225 ml bujónu pod¾a Farrella o teplote 40 o C po dobu 

2 minút. Potom sa suspenzia inkubuje 3 až 5 dní pri 37 o C. 

Odporúèa sa používa 1,5 l Erlenmayerove banky, ktoré umožòujú ve¾kou povrchovou plochou 

výmenu plynov a tým zabraòujú disociácii brucel. Ïalej sa odporúèa aeróbna inkubácia a paralelne 

s mikroaeróbnou s pridaním 5 až 10% CO 2, 

najmä pri prvej izolácii a pre druh B.abortus. 

9.3 Oèkovanie na tuhé selektívne médium a zis ovanie prítomnosti suspektných kolónií 

Po ukonèení stupòa množenia v selektívnej tekutej pôde sa kultúra premieša (obsahom banky sa 

pomaly zakrúži), z hladiny sa odoberie plná oèkovacia k¾uèka a inokulum sa prenesie na povrch 

tuhého média pod¾a Farrella. Inkubuje sa 3-5 dní pri 37 o C. Ïalej sa odporúèa aeróbna inkubácia a 

paralelne s mikroaeróbnou s pridaním 5 až 10 % CO 2, 

najmä pri prvej izolácii a pre druh B.abortus. 

Poznámka - Odporúèame používa na prenesie inokula namiesto k¾uèky pipety pre jednorázové 

použitie alebo nedelené 1 ml pipety a odobera po jednej kvapke (obvyklý objem je jedna dvadsatina 

ml). 

Inokulum sa rozoèkuje tak, aby sa vytvorili dobre izolované kolónie. 

9.4. Skríning suspektných kolónií 

Suspektné kolónie: priemer 2 – 4 mm, drobné, hladké, lesklé, ploché, okrúhlej kontúry, mierne zakalené, 

niekedy medovej farby, neskoršie majú svetlohnedé sfarbenie. Rast v primokultúre je pomalší, 

vidite¾ný na 3-4 deò, niekedy až 5.deò. Pri pozorovaní proti svetlu sú prieh¾adné, svetlomedovej 

farby. Pri pozorovaní v odrazenom svetle sú belasej až modrasto-sivej farby, slabo neprieh¾adné. 

9.4.1 Subkultivácia suspektných kolónií 

Pre potvrdenie sa z každej Petriho misky vyberie najmenej po piatich kolóniách, ktoré sa považujú 

pod¾a 9.4 za suspektné. 

Pokia¾ je na jednej miske menej suspektných kolónií ako pä , vyberú sa na potvrdenie všetky 

suspektné kolónie. 

43

Každá z vybraných kolónií sa rozoèkuje na povrch misiek s predsušeným živným agarom, Brucella 

agar, tak, aby sa umožnil rast dobre izolovaných kolónií. 

Inkubuje sa 3 dni pri 37 o C. Po 3 dòoch sa testujú na príslušnos k brucelám. 

9.4.2 Potvrdenie príslušnosti k rodu Brucella 

9.4.2.1 Katalázová reakcia 

Typická kolónia sa suspenduje na sklíèku v 3% roztoku peroxidu vodíka (roztok peroxidu vodíka, 

3 % obj.). Katalázopozitívne kmene sa vyznaèujú tvorbou bubliniek plynu. 

9.4.2.2 Farbenie pod¾a Grama 

S typickou kolóniou sa vykoná farbenie pod¾a Grama. Brucella sp. sú gramnegatívne èasto 

kokovité, krátke (èasto bipolárne sa farbiace) pleomorfné tyèinky, ve¾kosti 0,2 x 0,8 mm. 

9.4.2.3 Sklíèková aglutinácia s monošpecifickými A a M –antisérami 

Na dôkaz prítomnosti antigénu A a M baktérií rodu Brucella sa použije aglutinácia kolónie èistej 

kultúry s vhodnými sérami na podložnom skle po vylúèení spontánne aglutinujúcich baktérií v 

0,1 % roztoku akriflavínu. 

9.4.2.4 Aglutinácia s èerstvým roztokom akriflavínu 

Pre vylúèenie spontánne aglutinujúcich kmeòov sa použije 0,1 % vodný roztok akriflavínu 

9.5 Odovzdanie na identifikáciu do referenèného laboratória 

Kultúru, ktorá vykazuje skríningové znaky pod¾a 9.4 a pod¾a 9.4.2 oznaèí laboratótrium mikrobiológie 

potravín ako suspektnú brucelu a odovzdá ju na druhovú identifikáciu do referenèného laboratória, 

napr. laboratóriu klinickej mikrobiológie. Súèasne s kmeòmi odovzdá laboratórium mikrobiológie 

potravín sprievodnú správu, ktorá musí obsahova zistené vlastnosti pod¾a 9.4. a pod¾a 9.4.2 a 

všetky ostatné informácie potrebné pre úplnú identifikáciu vzorky. 

10. Vyjadrenie výsledku 

V súlade s výsledkami referenèného laboratória sa vyjadrí prítomnos alebo neprítomnos baktérií 

rodu Brucella v skúšobnej vzorke s hmotnos ou 25 g alebo 25 ml skúšaného výrobku. 


V protokole o skúške sa musí uvies použitá metóda skúšania, doba inkubácie a získané výsledky a 

použitý spôsob ich vyjadrenia. Protokol musí obsahova aj všetky podrobnosti pracovného postupu, 

ktoré nie sú uvedené v tomto pokyne, alebo sú považované za volite¾né a ïalej všetky podrobnosti o 

okolnostiach, ktoré by mohli ma vplyv na výsledky skúšania. 

Protokol o skúške musí obsahova všetky informácie potrebné na úplnú identifikáciu vzorky. 

44

Schéma postupu skúšky 

Selektívne pomnoženie 

25 ml mlieka/homogenizácia 25 g syra s 225 ml bujónu od¾a Farrella pri 40 o C 

Inkubácia: 3 až 5 dní 37 o C, mikroaeróbne (5 až 10 % CO 2 

) 

Izolácia 

frakciované rozoèkovanie k¾uèkou na agar pod¾a Farrella 

Inkubácia: 3 až 5 dní 37 o C, mikroaeróbne (5 až 10 % CO 2 

) 

Preskúšanie suspektných kolónií 

morfológia kolónií (po 4-dòovej inkubácii): 

ø 2-4 mm, okrúhle, hladké okraje, povrch hladký, lesklý 

pozorovanie proti svetlu: priesvitné, svetlomedová farba 

v odrazenom svetle: belavé až svetlosivé, slabo priesvitné 

o 

Subkultivácia suspektných kolónií na brucelovom agare (37 C, 3 dni) 

Katalázový test (pozitívny) 

Farbenie pod¾a Grama (gramnegatívne krátke tyèinky) 

Mikroskopické vyšetrenie stereomikroskopom: (6-20 x zväèšenie), dôležitá 

paralelná pozitívna kontrola 

Sklíèková aglutinácia s monošpecifickými A a M –antisérami 

Aglutinácia s 0,1 % vodným roztokom akriflavínu 

45




M – 41 

Dôkaz stafylokokového enterotoxínu metódou 

ELISA 


Kit Transia Plate Staphylococcal Enterotoxins je urèený na detekciu stafylokokových enterotoxínov 

A, B, C, D a E v potravinách a vo filtrátoch kultúr Staphylococcus aureus. 

Poznámka: Transia Plate Staphylococcal Enterotoxins je kvalitatívny test. Pomocou tohto testu nie je 

možné robi kvantifikáciu enterotoxínu. 

2. Definícia 

Stafylokokový enterotoxín je pomerne jednoduchý polypeptid s molekulárnou hmotnos ou asi 35 000 

daltonov. Pod¾a antigénnych vlastností je známych 8 typov, ktoré sú oznaèené A, B, C (s troma podtypmi 

C 1 

, C C ,) D, E, G, H a I. Najèastejšie produkujú kmene Staphylococcus aureus enterotoxín typu A 

2, 3 

(asi 45 % z enteotoxinogénnych kmeòov). Niektoré kmene produkujú viac ako jeden typ enterotoxínu. 

Enterotoxín spôsobuje najtypickejšiu bakteriálnu intoxikáciu - stafylokokovú enterotoxikózu. Pre vyvolanie 

ochorenia u dospelého èloveka staèí jeden mikrogram purifikovaného toxínu. 


Transia Plate Staphylococcal enterotoxins je založený na sendvièovej ELISA – metóde (Enzyme 

Linked Immunio Sorbent Assay). Reakcia prebieha na mikrotitraènej platnièke s oddelite¾nými stripmi 

pokrytými protilátkami špecifickými pre stafylokokové enterotoxíny. 

4. Prístroje, pomôcky, chemikálie a kultivaèné médiá 

4.1 Kit Transia Plate 

4.1.1 mikrotitraèná platòa, oddelite¾né stripy 96 jamiek (12 stripov x 8 jamiek) 

4.1.2 vieèko na mikrotitraènú platòu – 1 ks 

4.1.3 ampulka 1: negatívna kontrola – 1 x 4 ml 

4.1.4 ampulka 2: pozitívna kontrola: stafylokokový enterotoxín A, koncentrovaný 50 x – 1x 0,8 ml 

používajte rukavice! 

4.1.5 ampulka 3: premývací pufer – koncentrovaný 30 x – 1 x 60 ml 

46

4.1.6 ampulka 4: konjugát: zmes proti látok proti stafylokokovým enterotoxínom konjugovaným ku 

peroxidáze – na priame použitie – 1 x 15 ml 

4.1.7 ampulka 5: substrát: moèovina – H 2 

O 2 

- 1 x 10 ml 

4.1.8 ampulka 6: chromogén: TMB 1 x 10 ml 

4.1.9 ampulka 7: zastavovací roztok: H 2 

SO 4 

- 1 x 10 ml 

Skladovanie kitov a manipulácia s nimi sa vykonáva pod¾a návodu výrobcu. 

4. 2 Prístroje a pomôcky 

4.2.1 váhy a vážne nádobky 

4.2.2 homogenizátor alebo mixér 

4.2.3 rukavice 

4.2.4 laboratórna centrifúga (3000 g minimum) a centrifugaèné skúmavky, filtraèný papier alebo Speed 

Vac systém 

4.2.5 magnetické miešadlo 

4.2.6 pH meter alebo pH papier 

4.2.7 plastový kontajner (minimálny objem 100 ml) 

4.2.8 plastové skúmavky – 5 ml 

4.2.9 filtre,ve¾kos porov – 0,2 mm 

4.2.10 dialyzaèné skúmavky SPECTRA/POR STANDARD regenerovaná celulóza:SPECTRA/POR 1 

s MWCO max 6-8000 da (MWCO-Molecular weight cut off ). 

4.2.11 vrchnáèiky na dialyzaèné skúmavky 

4.2.12 objemná f¾aška 1 L, sklená f¾aška 1 L 

4.2.13 pH meter 

4.2.14 Vortex 

4.2.15 plastická f¾aška na premývanie alebo mikroplatòový premývací systém 

4.2.16 absorpèný papier 

4.2.17 trepaèka – cca 600 rpm 

4.2.18 mikropipeta 100 – 1000 ml 

4.2.19 multikanálová Eppendorf pipeta (5 a 2,5 ml špièky) 

4.2.20 mikroplatòový reader (450 nm) 

4.3 Chemikálie a kultivaèné médiá 

4.3.1 destilovaná voda 

4.3.2 extrakèný pufer Na 2 

HPO 4 

x 2H 2 

O 35,6 g 

KH 2 

PO 4 

6,8 g 

H 2 

O 

1000 ml 

4.3.3 reagencie na úpravu pH: NaOH (6N), HCl (6N) 

4.3.4 extrakèný kit na extrakciu zo surového mäsa, bravèového mäsa, morských produktov (kat. 

è. AK 0220) 

4.3.5 PEG (polyetylén glykol) MW > 17000 

4.3.6 Brain Heart Infusion broth 

4.3.7 dekomplementované králièie sérum (kat. è. AK 0224) 

47

4.3.8 premývací pufer 

Ak je objem premývacieho pufru na premývanie nedostatoèný, môžete si ho pripravi zmiešaním 

PBS a Tween-u 

PBS: 

NaCl 

0,7650 g 

Na 2 

HPO 4 

x 2H 2 

O 

0,0724 g 

KH 2 

PO 4 

0,0210 g 

H 2 

O 

1000 ml 

Tween 20 (SIGMA ref P1379)0,5 ml 

5. Príprava reagencií a extrakèného pufru 

Reagencie sa musia vytemperova na izbovú teplotu (18 – 25 0 C). Je nutné ich da temperova najneskôr 

jednu hodinu pred zamýš¾aným použitím. 

Všetky reagencie sa musia pred použitím premieša buï manuálne alebo Vortexom. 

5.1 Príprava extrakèného pufru 

Rozpustí sa 35,6 g Na 2 

HPO 4 

x 2H 2 

O a 6,8 g KH 2 

PO 4 

v 1000 ml destilovanej vody. Na každú 

vzorku je potrebné 20 – 40 ml pufru. 

5.2 Príprava reagencií na úpravu pH 

NaOH (6N): Rozpustí sa 240 g NaOH v 800 ml l destilovanej vody. Potom sa upraví objem na 

1000 ml pomocou destilovanej vody. 

HCl (6N): Zmieša sa 500 ml HCl (37 %) (12 N) s 500 ml destilovanej vody. 

Alternatíva – upravenie pH je možné urobi pomocou HCl (1N) a NaOH (1N) 

5.3 Príprava reagencií na extrakciu zo surového mäsa (kat.è. AK0220) 

Každá substancia v skúmavkách z extrakèného kitu (kat è. AK 0220) na extrakciu zo surového 

mäsa sa rozpustí v 400 ml destilovanej vody. Zhomogenizuje sa a rozdelí do alikvótov po 20 ml. 

Uskladòuje sa pri teplote od – 15 do – 30 o C. 

5.4 Príprava dekomplementovaného králièieho séra (kat. è. AK 0224) 

Výrobca poskytuje reagencie osobitne (AK0224). Sérum sa rozdelí do alikvótov po 100 ml a 

uskladòuje sa pri teplote od – 15 °C do – 30 o C. 

5.5 Príprava materiálov a reagencií na koncentráciu vzoriek 

Obsah dialyzaèných skúmaviek sa rozpustí pod¾a návodu výrobcu. 

30 g polyetylén glykolu (PEG) sa rozpustí v 100 ml destilovanej vody za jemného zohrievania. 

5.6 Riedenie premývacieho pufru 

Koncentrovaný premývací pufer (ampulka 3) sa zriedi s destilovanou vodou v pomere 1:30, premieša 

sa a vyleje do premývacej f¾ašky. 

48

Tento krok je možné urobi v predstihu alebo poèas prvého inkubaèného kroku. 

Premývací pufer sa uskladòuje pri teplote +2 až +8 o C maximálne po dobu 1 mesiaca. 

Alebo: 

Jednotlivé komponenty potrebné pre prípravu PBS uvedené v bode 4.3.8 sa rozpustia v 1000 ml 

odmernej banke asi v 800 ml destilovanej vody a premiešajú sa. 

Skontroluje sa pH (7,2 ± 0,1) a doplní objem na 1000 ml destilovanou vodou. 

Preleje sa do f¾aše a oznaèí. Skladuje sa pri teplote +2 až +8 o C maximálne po dobu 1 mesiaca. 

5.7 Riedenie pozitívnej kontroly 

Aby sa predišlo omylom spôsobeným pipetovaním nedostatoèného množstva pozitívnej kontroly, je 

nutné si pripravi väèší objem ako je potrebný na testovanie. 

Na každé testovanie sa musí pripravi nová pozitívna kontrola. 

Zriedi sa koncentrát pozitívnej kontroly (ampulka 2) v premývacom pufri 1 : 50 (40 ml koncentrátu v 

2 ml premývacieho pufru). 

5.8 Rozmiešanie chromogénu a substrátu 

Zmes chromogénu a substrátu nie je stabilná a nemôže by pripravená v predstihu. Èas prípravy 

zmesi je uvedený v bode 7.6 (kapitola 7 Postup skúšania). 

Príprava: Zmieša sa 60 ml substrátu (ampulka 5) a 60 ml chromogénu (ampulka 6) na každú použitú 

jamku. 

6 Príprava vzoriek 

Aby sa zabezpeèil optimálny extrakèný vý ažok, boli vyvinuté špeciálne postupy pre dané potravinové 

matrice - postup pre mliekarenské a èokoládové produkty, surové mäso, surové a varené bravèové 

mäso, morské živoèíchy, konzervované huby v náleve a produkty s vysokým obsahom soli alebo cukru. 

Ak je potrebné, je možné extrakt zakoncentrova dialýzou, vymrazením alebo Speed Vacom pri teplote 

44 o C. 

Extrakty je možné skladova pri teplote – 15°C až – 20 o C ale maximálne 1 mesiac pred testovaním, 

pre mliekarenské produkty maximálne 1 týždeò. 

6.1 Všeobecný postup 

6.1.1 Zhomogenizuje sa 20 g príslušnej vzorky s 20 ml extrakèného pufru alebo destilovanej vody použitím 

mixéra alebo stomachera. Ak je suspenzia príliš viskózna, pridá sa extrakèný pufer alebo destilovaná 

voda. 

6.1.2 Toxíny sa musia necha difundova zo sedimentu poèas 20 minút. 

6.1.3 Suspenzia sa scentrifugujte (15 min, 3000 g minimum) alebo prefiltrujte, aby sa eliminovali èastice 

vyšetrovanej vzorky. 

6.1.4 Supernatant sa stiahne a použije pre ïalšie testovanie. 

6.1.5 Skontroluje sa pH a nastaví na hodnotu 7,0 - 7,5. 

6.1.6 Pokia¾ by prišlo k precipitácii, zopakuje sa centrifugácia (bod 6.1.3 a 6.1.4). 

Pre vykonanie testu je potrebných 100 ml extraktu. 

49

6.2 Sušené vzorky 

Rozpustí sa 20 g sušenej vzorky v destilovanej vode a urobí sa extrakcia pod¾a bodu 6.1. 

6.3 Surové mäso, surové a varené bravèové mäso a morské produkty 

Urobí sa extrakcia pod¾a všeobecného postupu pod¾a bodov 6.1.1až 6.1.6. Na homogenizáciu 

vzorky sa použije destilovaná voda . Pokia¾ by sa použil extrakèný pufer, mohlo by dôjs k tvorbe 

gélu. 

Aby sa predošlo k možným falošným pozitívam, je výhodnejšie použi Extrakèný kit pre surové 

mäso (AK0220) 

6.3.1 Extrakt z bodu 6.1.6 vo všeobecnom postupe sa nechá vytemperova na izbovú teplotu. 

6.3.2 Skontroluje sa pH a nastaví na hodnotu 7,0 – 7,5. 

6.3.3 Pridá sa 1 ml extraktu ku 20 ml extrakèného èinidla pre surové mäso è.1 

6.3.4 Zhomogenizuje sa. 

6.3.5 Inkubuje sa 10 min pri izbovej teplote (18 – 25 o C). 

6.3.6 Pridá sa 20 m1 extrakèného èinidla pre surové mäso è.2. 


6.3.8 Inkubuje sa 10 minút pri izbovej teplote (18 – 25 o C). 

6.3.9 Skontroluje sa pH a nastaví sa na hodnotu 7,0 – 7,5. 


6.4 Produkty s vysokým obsahom cukru (lekvár, džem, produkty na báze džemov) alebo s vysokým 

obsahom soli (>5 %) 

Vyberie sa extrakèný postup pod¾a typu produktu a zdialyzujte extrakt cez noc proti destilovanej 

vode použitím dializaèných túb s MWCO s prahovou hodnotou 6 – 8000 da. 

6.5 Mliekarenské a èokoládové produkty a údené hydinové mäso 

Precipitácia kyselinou zlepšuje extrakèné vý ažky. 

6.5.1 Rozmelie sa 20 g vzorky so 40 ml destilovanej vody alebo pufru na homogénnu suzpenziu. 

6.5.2 Toxíny sa musia necha difundova zo sedimentu poèas 30 minút. 

6.5.3 Upraví sa pH suzpenzie na hodnotu 4,0 – 4,5. 

6.5.4 Suzpenzia sa centrifuguje (15 min., 3000 g minimum), alebo prefiltruje. 

6.5.5 Supernatant sa odsaje a ïalej sa upravuje. 


6.5.7 Scentrifuguje (15 min, 3000 g minimum) alebo prefiltrujte. 

6.5.8 Supernatant sa odsaje a použije pre dalšie testovanie. 



6.6 Konzervované hríby v tekutom náleve 

Detekcia enterotoxínov v konzervovaných hubách sa robí v náleve a v hríboch .Detekcia enterotoxínov 

v tekutom náleve sa môže robi priamo bez extrakcie. Skontroluje sa pH a nastaví na hodnotu 

pH 7,0 – 7,5 pred testom. 

50

6.7 Supernatant Staphylococcus aureus 

Interferenciu spôsobenú prítomnos ou proteínu A je možné ¾ahko odstráni pridaním dekomplementovaného 

normálneho králièieho séra (kat.è. AK0224) 

6.7.1 Jedna kolónia S. aureus sa kultivuje v 10 ml brain heart broth 24 hod pri 37 o C. 

6.7.2 Získaná kultúru sa centrifugujte 10 minút pri 3000 g. 

6.7.3 Supernatant sa odoberie a sterilizuje filtráciou (ve¾kos pórov 0,2 mm ). 

6.7.4 Supernatant sa zriedi v pomere 1/ 10 v brain heart broth (100 ml supernatantu kultúry + 900 ml 

brain heart broth). 

6.7.5 Do skúmavky sa napipetuje 900 ml rozriedeného roztoku a pridá sa 100 ml dekomplementovaného 

králièieho séra. 

6.7.5 Pripraví sa negatívna kontrola zmiešaním 900 ml sterilného brain heart broth a 100 ml dekomplementovaného 

normálneho králièieho séra. Táto negatívna kontrola, NC (kultúra) sa použije 

na kalkuláciu prahovej hodnoty pozitívnej vzorky. 


6.7.8 Negatívna kontrola a vzorky sa inkubujú 30 minút pri izbovej teplote (18- 25 o C). 

6.7.9 Skontroluje sa pH a nastaví na hodnotu pH 7,0 – 7,5. 

Pre vykonanie testu je potrebných 100 ml vzorky. 

6.8 Koncentrácia vzorky 

Upozornenie: so skúmavkami sa narába v rukaviciach. 

6.8.1 Vzorky, ktoré chceme koncentrova sa uzatvoria v dialyzaèných skúmavkách na oboch koncoch 

vrchnáèikmi. 

6.8.2 Skúmavky sa vložia do 30 % PEG roztoku a dajú sa dialyzova tak aby sa dosiahla 10 – násobná 

koncentrácia (napr. zaèína sa s 30 ml extraktu, a má sa skonèi pri 3 ml). 

6.8.3 Dialyzaèné skúmavky sa vyberú z PEG roztoku a opatrne sa prepláchnu okraje s destilovanou 

vodou tak, aby sa odstránili zvyšky PEG. 

6.8.4 Dialyzaèná skúmavka sa otvorí a vzorka sa odoberie pipetou. Dialyzaèná skúmavka sa premyje 

malým množstvom extrakèného pufru tak aby sa odstránil všetok zvyškový extrakt. 

Skontroluje sa pH a nastaví na hodnotu 7,0 – 7,5. 

Pre vykonanie testu je potrebných 100 ml vzorky. 

7. Postup práce 

7.1 Zoberte požadované množstvo stripov + dve jamky pre negatívnu a jednu jamku pre pozitívnu 

kontrolu (jedna negatívna kontrola pre supernatant kultúry). Nepoužité stripy sa vrátia do 

vrecúška s dehydrataèným èinidlom a tesne uzatvoria. 

7.2 Rozplní sa po 100 ml kontroly (ampulka 1 a 2) a vzorky do urèených jamiek. Druhá negatívna 

Kontrola - supernatant kultúry sa použije negatívna kontrola pripravená pod¾a kapitoly 6 bodu 6.7.6. 

Platnièka sa zakryje vieèkom. 

7.3 Inkubuje sa pri izbovej teplote poèas 30 min za jemného pretrepávania. 

Pripraví sa premývací pufer. 

51

7.4 Platnièka sa pevne uchopí do ruky a švihom zápästia sa vytrepe obsah jamiek nad kontajnerom. 

Každá jamka sa premyje a premývací pufer sa nechá v jamke max 5 až 10 sekúnd. Platnièka sa 

vyprázdni nad kontajnerom a zbývajúca kvapalina sa odstáni obrátením platnièky na podložku z 

bunièitej vaty a jemným pobúchaním nieko¾kokrát po platnièke. Premývanie sa zopakuje najmenej 

5 krát. 

7.5 Pridá sa 100 ml konjugátu (ampulka 4) do každej jamky. Je nutné pracova opatrne tak, aby sa 

predišlo k dotknutiu špièky okrajov a dna jamiek. Obsah jamiek sa premieša krúživým jemným pohybom 

na laboratórnom stole. Platnièka sa zakryje vieèkom. 

7.6 Inkubuje sa 30 minút pri izbovej teplote a jemne pretrepáva. Tesne pred koncom tohto kroku sa 

pripraví požadovaný objem substrát / chromogénovej zmesi, pod¾a bodu 5.7. 

7.7 Platnièka sa pevne uchopí do ruky a švihom zápästia sa vytrepe obsah jamiek nad kontajnerom. 

Každá jamka sa premyje a premývací pufer sa nechá v jamkách max. 5 až 10 sek. Platnièka sa 

vyprázdni nad kontajnerom a zbývajúca kvapalina sa odstráni obrátením platnièky na podložku z 

bunièitej vaty a jemným pobúchaním nieko¾kokrát po platnièke. Premývanie sa zopakuje najmenej 

5 krát. 

7.8 Pridá sa 100 ml substrát / chromogénovej zmesi do každej jamky pomocou multikanálovej pipety 

a platnièka sa zakryje. Nepoužitá zmes sa znehodnotí. Chromogén a substrát sa môžu pridáva aj 

bez toho, aby boli predtým spolu zmiešané, to znamená že sa pridá pridá 50 ml substrátu (ampulka 

5) a 50 ml chromogénu (ampulka 6) do jamiek. 

7.9 Inkubuje sa pri izbovej teplote (18 – 25 o C) 30 minút za jemného pretrepávania. 

7.10 Pridá sa 50 ml zastavovacieho roztoku (ampula 7) do každej jamky multikanálovou pipetou rovnako 

ako keï sa pridával substrát. Zmieša sa obsah jamiek spolu tak aby sa dosiahla plná farebná 

konverzia. Modrá farba sa zmení na žltú. 

7.11 Zmerá sa optická hustota pri 450 nm spektrofotometrom (blank je èistý vzduch) 


8.1 Validácia testu 

8.1.1 Optická hustota pozitívnej kontroly (PC) musí by vyššia alebo rovná 0,50. 

8.1.2 Optická hustota negatívnej kontroly (NC) musí by nižšia alebo rovná 0,30. 

8.1.3 Ak kontroly nespåòajú tieto predpoklady, výsledky sú nesprávne. 

8.2 Hranièný limit (extrakt z potraviny) 

Hranièný limit sa vypoèíta ako priemer z negatívnych kontrol plus 0,20:T = (NC1 + NC2)/2 + 0,20 

8.3 Hranièný limit (supernatant kultúry) 

Hranièný limit sa vypoèíta ako optická hustota sterilného kultivaèného média (negatívna kontrola) 

plus 0,10:T (kultúra) = NC (kultúra) + 0,1 

52

8.4 Pozitívne vzorky 

Vzorka sa považuje za pozitívnu na stafylokokové enterotoxíny, ak je hodnota optickej hustoty väèšia 

alebo rovná detekènému limitu. 

8.5 Negatívne vzorky 

Vzorka sa považuje za negatívnu na stafylokokové enterotoxíny, ak je hodnota optickej hustoty 

nižšia ako T – 0,05. 

8.6 Dubiózne vzorky 

Vzorka sa považuje za dubióznu, ak je optická hustota medzi T-0,05 a T. Výsledky sa môžu overi 

koncentráciou extraktu dialýzou. 

8.7 Potvrdenie pozitívnych výsledkov 

Pozitívna vzorka môže by potvrdená detekciou enterotoxigénnych vlastností kmeòa Staphylococcus 

aureus, izolovaného zo vzorky (kapitola 6 bod 6.7 ). 

9. Charakteristika úèinnosti 

9.1 Detekèný limit 

Pre umelo kontaminované vzorky (mliekarenské produkty a surové mäso) je test schopný dokáza 

prítomnos 0,25 – 1 ng enterotoxínov na 1 g vzorky. 

Extrakèný zisk varíruje od zloženia vzorky, a preto nie je možné kvantitatívne odhadnú množstvo 

enterotoxínov. 

Koncentrácia vzorky (dialýzou) umožní detekova aj nižšie koncentrácie enterotoxínov. 

9.2 Špecificita testu 

Test je špecifický pre stafylokokové enterotoxíny A, B, C, D a E. 

Proteín A produkovaný S. aureus, endogénna peroxidáza alebo endogénne substancie s podobným 

efektom, ktoré sú prítomné vo vzorkách môžu v niektorých prípadoch dáva skrížené reakcie. 


V protokole o skúške sa musí uvies použitá metóda skúšania / testaèný kmeò, doba inkubácie a získané 

výsledky a jednoznaène uvedený použitý spôsob ich vyjadrenia. 

Protokol musí obsahova aj všetky detaily pracovného postupu, ktoré nie sú uvedené v metóde, aj 

všetky podrobnosti o okolnostiach, ktoré môžu ma vplyv na výsledky. 

Protokol musí obsahova aj všetky informácie nevyhnutné na úplnú identifikáciu vzorky. 


ELISA kit – návod výrobcu 

53




M – 50 

Dôkaz stafylokokových enterotoxínov pomocou TECRA modulov 


Táto metodika urèuje postup pre dôkaz stafylokokových enterotoxínov A, B, C 1 

, C 2 

, C 3 

, D a E v 

potravinách a vo filtrátoch kultúr. 

2. Definícia 

Stafylokokové enterotoxíny sú termostabilné proteíny (molekulárna hmotnos 26 000 – 35 000 daltonov), 

ktoré sa zis ujú sa predovšetkým u kmeòov izolovaných z èloveka, oviec a menej z dobytka a kôz. 

Prítomnos stafylokokového enterotoxínu v potravinách je jednou z celosvetovo najèastejšie sa 

objavujúcich príèin otravy jedlom (stafylokoková enterotoxikóza). Pod¾a produkcie protilátok sú 

najrozšírenejšie enterotoxíny oznaèené písmenami A, B, C, D a E, prièom k najèastejšie tvoreným 

enterotoxínom patria enterotoxíny typu A a D. Pasterizaèné teploty neovplyvòujú ich aktivitu. Znášajú 

teplotu 100 °C 15 – 20 minút. Optimálna teplota pre produkciu enterotoxínu je 37 °C – 40 o C. Optimálne 

pH pre produkciu enterotoxínu je 6,5 – 7,3. Produkcia sa znižuje pri poklese pH. Niektoré 

kmene produkujú viac ako jeden typ enterotoxínu. Nedávne analýzy genómu Staphylococcus aureus 

dokázali prítomnos poèetných homológov enterotoxínov, ktoré boli oznaèené ako stafylokokovým 

enterotoxínom podobné superantigény. 


Princípom skúšky je reakcia antigén – protilátka. Reakcia prebieha v pripravených moduloch, do ktorých 

sa nanáša skúšaná vzorka a vkladajú sa štítky potiahnuté protilátkou proti stafylokokovým enterotoxínom. 

4. Prístroje, pomôcky a kultivaèné médiá 

4.1 Súprava TECRA UNIQUE SET 

4.1.1 20 UNIQUE modulov 

4.1.2 20 protilátkou potiahnutých štítkov v uzatvárate¾nom vrecku 

4.1.3 Farebná karta pre vyhodnotenie skúšky 

Skladovanie a manipulácia so zložkami súpravy sa vykonáva pod¾a návodu výrobcu. 

54

4.2 Prístroje a pomôcky 

4.2.1 Váhy a nádobky na váženie 

4.2.2 Miešaè (vortex) alebo homogenizátor 

4.2.3 Chladnièka (teplotný rozsah + 2 °C až + 8 °C) 

4.2.4 pH meter (škála 0 – 14) 

4.2.5 Termostat (inkubátor) s teplotou 37 °C (teplotný rozsah + 36 °C až + 38 °C) 

4.2.6 Laboratórna centrifúga (minimálne 1000 – 3000 g) 

4.2.7 Latexové rukavice 

4.2.8 Jednorazové striekaèkové filtre s poréznos ou 0,2 – 0,45 mm 

4.2.9 Absorpèná bavlna 

4.2.10 Jednorazové polypropylénové striekaèky s objemom 10 ml, 25 ml 

4.2.11 Pipeta s objemom 1 ml 

4.2.12 Sterilné skúmavky 

4.2.13 Uzatváracia páska (lepiaca) 

4.3 Chemikálie a kultivaèné médiá 

4.3.1 Tekuté stafylokokové rastové médium (napr. tryptónovo – sójový bujón, bujón s mozgovo – 

srdcovou infúziou alebo TECRA stafylokokové rastové médium) 

4.3.2 Tuhé agarové živné pôdy na kultiváciu stafylokokov (napr. Baird – Parker agar) 

4.3.3 Tris [Tris (hydroxymetyl) aminometán] 

4.3.4 Hydroxid sodný (NaOH) 

4.3.5 Kyselina chlórovodíková (HCl) 

4.3.6 Destilovaná alebo deionizovaná voda 

4.3.7 Roztok hypochloritu sodného (2 %) 

5. Príprava èinidiel a roztokov 

Je potrebné zabezpeèi , aby všetky èinidlá boli pred použitím vytemperované na laboratórnu teplotu. 

5.1 Príprava Tris pufra (0,25 M; pH 8,0) 

Pridá sa 30,3 g Tris do 800 ml destilovanej alebo deionizovanej vody a mieša sa do rozpustenia. 

Upraví sa pH pufru na 8,0 a doplní destilovanou vodou do 1000 ml. 

5.2 Príprava tekutého stafylokokového rastového média 

Médium pripravte pod¾a pokynov výrobcu. 

5.3 Príprava striekaèiek pre filtráciu vzorky 

V prípade, ak sa na filtráciu vzorky nepoužijú jednorázové striekaèkové filtre (poréznos 0,2 

– 0,45 mm), môže sa alternatívne použi aj tento postup: Do jednorazovej plastovej striekaèky sa 

vloží 0,5 – 1,0 cm hrubý chumáè absorpènej vaty. Naleje sa do striekaèky 5 ml destilovanej vody 

a pretlaèí sa pomocou piestu tak, aby bol chumáè vaty tesný a pevný. Piest sa odstráni, do striekaèky 

sa vleje vzorka, potom sa piest vráti spä a prefiltruje sa vzorka cez striekaèku. Eluát sa zachytí do 

vhodnej nádoby. Pre každú vzorku sa použije nová striekaèka. 

55

6. Príprava vzoriek 

Pre zabezpeèenie optimálneho extrakèného vý ažku boli vypracované špeciálne postupy pre dané 

potravinové matrice. Pre analýzu a konfirmáciu je nutné ma minimálne 3 ml extraktu vzorky. Extrakt 

vzorky môže by uskladnený cez noc pri teplote 4 °C, avšak je výhodnejšie, ak sa vzorka pripraví 

v deò, kedy sa bude testova . Ak sa upravuje pH, pre všetky skupiny vzoriek nesmie klesnú pod 

hodnotu 3,0 – môže dôjs k denaturácii toxínu. 

6.1 Potraviny tekutého charakteru 

Upraví sa pH vzorky na 7,0 – 8,0. Vzorka sa neriedi, testuje sa neriedená tekutina. 

6.2 Dehydrované potraviny s nízkym obsahom vlhkosti 

10 g vzorky sa pridá do 50 ml Tris pufru. Nechá sa odstá 30 minút, dôkladne sa premieša a 

centrifuguje 10 minút pri 1000 – 3000 g (gal). Vzorka sa prefiltruje cez pripravenú striekaèku, upraví 

sa pH na 7,0 – 8,0 a testuje sa UNIQUE testom. 

6.3 Ryby a rybie produkty 

10 g vzorky sa pridá do 20 ml vody a dôkladne sa 3 minúty mieša. Upraví sa pH na 4,0 a centrifuguje 

10 minút pri 1000 – 3000 g (gal). Vzorka sa prefiltruje cez pripravenú striekaèku, upraví sa pH na 

7,0 – 8,0 a testuje sa UNIQUE testom 

6.4 Potraviny s vysokým obsahom vlhkosti 

10 g vzorky sa pridá do 20 ml Tris pufru, dôkladne sa premieša a centrifuguje 10 minút pri 1000 – 

3000 g (gal). Vzorka sa prefiltruje cez pripravenú striekaèku, upraví sa pH na 7,0 – 8,0 a testuje sa 

UNIQUE testom. 

6.5 Testovanie kmeòov Staphylococcus spp. 

6.5.1 Izolácia Staphylococcus spp. z potravín 

Pridá sa 10 g vzorky do 90 ml tekutého stafylokokového média na pomnoženie, dôkladne sa 

premieša. Inkubuje sa cez noc pri teplote 37 °C. Vzorka sa centrifuguje 10 minút pri 1000 – 3000 g 

(gal), supernatant sa zleje a upraví sa pH na 7,0 – 8,0 a testuje sa UNIQUE testom. 

6.5.2 Testovanie stafylokokových kultúr 

Kultúra sa inokuluje do 10 ml tekutého stafylokokového média na pomnoženie, inkubuje cez noc 

pri teplote 37 °C. Centrifuguje sa 10 minút pri 1000 – 3000 g, supernatant sa zleje a upraví sa pH 

na 7,0 – 8,0 a testuje sa UNIQUE testom. 

56


7.1 Je potrebné zabezpeèi , aby moduly aj štítky boli vytemperované na teplotu laboratória (20 – 25 °C). 

7.2 Oznaèenie modulu a premiešanie vzorky. 

7.3 Odstránenie fólie zo skúmaviek 1 až 3. 

7.4 Do skúmavky 1 sa pridá 1,0 ml vzorky. 

7.5 Otvorí sa fóliové vrecko a vyberú sa štítky. Nesmie sa dotýka plôch potiahnutej protilátkou. Fóliové 

vrecko sa uzavrie. 

7.6 Štítok sa vloží do skúmavky 1 tak, aby jeho oèíslovaná strana bola otoèená smerom k skúmavke 2. 

7.7 Dvakrát sa premieša pohybom štítka HORE a DOLE. Štítok sa vyberie úplne celý z tekutiny, ale nie 

zo skúmavky. Potom sa vráti spä do skúmavky. 

7.8 Modul sa vloží do inkubátora. Inkubuje sa 2,5 hodiny pri 37 °C. 

7.9 Štítok prenesie do skúmavky 2. Premieša sa 5x, nechá sa pôsobi 2 minúty. 

7.10 Odstráni sa fólia zo skúmaviek 4 až 6. 

7.11 Preneste štítok do skúmavky 4. Skúmavky 1 až 3 uzavrite s uzatváracou páskou (skúmavka 3 sa 

v teste nepoužíva). 

7.12 Modul sa vloží do inkubátora, inkubuje sa 60 – 75 minút pri teplote 37 °C. 

7.13 Štítok sa prenesie do skúmavky 5. Premieša sa 10x, nechá sa máèa 5 minút. 

7.14 Prenesie sa do skúmavky 6. 

7.15 Modul sa nechá stá pri laboratórnej teplote po dobu 10 minút. 

7.16 Po odèítaní výsledkov sa ponoria moduly do nádoby s 2 % hypochloridom sodným. Potom sa 

obsah modulov vyprázdni a zlikviduje sa v súlade s miestnymi nariadeniami a predpismi. 


Štítok sa umiestni do takej pozície, aby boli vidite¾né farebné zmeny. Pomocou priloženej farebnej 

karty sa odèítajú výsledky do 1 hodiny. 

Test obsahuje pozitívnu kontrolu, negatívnu kontrolu a výsledok skúšky. 

57

Pozitívna kontrola je umiestnená na štítku medzi pozíciami 1 a 2. Platný test bude zafarbený v tejto 

oblasti. Akýko¾vek odtieò alebo farba v tejto oblasti indikuje, že pozitívna kontrola je prítomná a test 

bol prevedený správne. Ak sa táto plocha nezafarbí, znamená to, že niektorý z krokov nebol urobený 

správne, alebo bol vynechaný a výsledky sa nedajú použi . 

Negatívna kontrola je na štítku umiestnená medzi pozíciami 2 a 3. Platný test nemá žiadne zafarbenie na 

tomto mieste (štítok ostáva biely). 

Výsledok testu je lokalizovaný medzi pozíciami 3 a 4. Akéko¾vek zafarbenie (sivé až purpurové) 

v tejto oblasti indikuje prítomnos enterotoxínov, vzorka je pozitívna. Ak v tejto oblasti nenastala žiadna 

farebná zmena a štítok ostal biely, vzorka je negatívna. 

Vzorky považované za pozitívne testovaním TECRA UNIQUE SET by mali by konfirmované jednou 

zo štandardných metód. 

9. Charakteristika úèinnosti 

9.1 Detekèný limit 

Limit citlivosti je definovaný ako najnižší koncentraèný bod, pri ktorom sa ešte dajú získa spo¾ahlivé 

analytické výsledky. Tieto sa menia v závislosti od typu toxínu. Pri UNIQUE teste bola táto koncentrácia 

stanovená a preukázaná pri 0,25 ng/ml vzorky. 

9.2 Špecificita testu 

Test je špecifický pre stafylokokové entrotoxíny A, B, C 1 

, C 2 

, C 3 

, D a E. 


V protokole o skúške sa musí uvies použitá metóda skúšania/testaèný kmeò, doba inkubácie a získané 

výsledky a musí by jednoznaène uvedený použitý spôsob ich vyjadrenia. Protokol musí obsahova 

aj všetky detaily pracovného postupu, ktoré nie sú uvedené v metóde, aj všetky podrobnosti o okolnostiach, 

ktoré môžu ma vplyv na výsledky. Protokol musí obsahova aj všetky informácie nevyhnutné 

na úplnú identifikáciu vzorky. 


TECRA UNIQUE Staphylococcal enterotoxins (SET) test. Návod výrobcu. 

58

44 

Z O Z N A M 



èas CHÉMIA 

Doplnok è. 1/2006 





úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín 

a krmív – èas Chémia (ïalej len „zoznam“) 

ako doplnok è. 1/2006 k zoznamu zverejnenému 

v èiastke è. 1 Vestníka Ministerstva pôdohospodárstva 

Slovenskej republiky z 9. januára 2004, 

ktorý pod¾a § 14 ods. 3 zákona vydáva hlavný 

veterinárny lekár: 

CH Stanovenie rezíduí inhibièných látok v mlieku úradné metódy 

12.17. a v mlieènych výrobkoch metódou DELVOTEST ® SP - NT laboratórnej diagnostiky 


príloha è. 70 - zmena 1 

CH Stanovenie rezíduí inhibièných látok v mäse metódou úradné metódy 

12.18 PREMI test laboratórnej diagnostiky 


príloha è. 71 – zmena 1 

CH Screeningový test na stanovenie rezíduí antibiotík úradné metódy 

12.19 s použitím bakteriálnych kmeòov laboratórnej diagnostiky 

(STAR) 


príloha è. 72- zmena 1 



59



laboratórnej diagnostiky potravín a krmív – èas Chémia 

CH – 12.17 

Stanovenie rezíduí inhibièných látok v mlieku a mlieènych výrobkoch metódou 

DELVOTEST ® SP - NT 

Zmena 1/2006 

1. Oblas použitia 

Táto metóda popisuje stanovenie rezíduí a látok inhibujúcich rast kultúr v mlieku a mlieènych výrobkoch 

metódou DELVOTEST ® SP – NT. Metóda je vhodná pre surové a pasterizované mlieko a sušené 

mlieko po obnovení. Štandardný difúzny test DELVOTEST ® SP - NT je zvláš citlivý na penicilíny 

a sulfónamidy. Jeho citlivos zodpovedá rozsahu koncentrácie penicilínu 2-3 ng/ml a sulfadiazínu 

100-150 ng/ml. 

DELVOTEST ® SP - NT nie je vhodný k skúšaniu kyslého mlieka alebo mlieka inak kontaminovaného. 

2. Definícia 

Mlieko obsahuje inhibièné látky, ak má vzorka pri tomto postupe v celom objeme pevného živného 

média modrofialové zafarbenie. 


DELVOTEST ® SP- NT kombinuje princíp agarových difúznych testov so zmenou farby indikátora 

v dôsledku aktívneho metabolizmu testovacieho mikroorganizmu v neprítomnosti inhibítora. Skúšaná 

vzorka sa dávkuje do liekoviek vyplnených pevným živným médiom obsahujúcim Bacillus stearothermophilus 

var. calidolactis. Inkubácia pri ktorom dochádza k normálnemu rastu testovacieho kmeòa, 

spôsobuje, že farba pH indikátora sa mení z modrofialovej na žltú. Ak sú v skúmanej vzorke látky inhibujúce 

rast testovacieho kmeòa, farba indikátora zostáva modrofialová. 

4. Chemikálie a èinidlá 

Použité chemikálie musia ma kvalitu vhodnú na mikrobiologické úèely. Voda na prípravu roztokov 

a riedenie vzorky má by destilovaná v skle alebo demineralizovaná, alebo rovnakej èistoty a sterilná. 

Voda nesmie obsahova inhibièné látky. 

60

4.1 Štandardný difúzny DELVOTEST® SP - NT na stanovenie rezíduí antibiotík a sulfónamidov 

v mlieku 

4.2 Èinidlá 

4.2.1 Kontrolné roztoky penicilínu (PNC) 

Pracovný roztok PNC a kontrolné roztoky PNC sa pripravujú tesne pred použitím. Všetky roztoky 

sa pripravujú do sterilných fliaš. 

4.2.1.1 Základný roztok PNC s koncentráciou 100 IU/ml (60 µg/ml, 

1 IU= 0,6 µg) 

Tento roztok sa pripraví rozpustení sodnej alebo draselnej soli benzylpenicilínu v sterilnej vode 

tak, aby výsledná koncentrácia bola 100 IU/ml (60 µg/ml). 

Roztok sa pripravuje denne èerstvý a musí sa uchováva v chladnièke do 5 o C. 

4.2.1.2 Kontrolný roztok PNC s koncentráciou 0,005 IU/ml (0,003 µg/ml). 

Tento kontrolný roztok sa pripraví zriedením základného roztoku PNC (4.2.1.1) s destilovanou 

vodou na výslednú koncentrácie PNC 0,005 IU/ml. 

4.2.2 Kontrolná vzorka mlieka negatívna 

Na prípravu negatívnej kontrolnej vzorky mlieka sa použije surové mlieko, ktoré je najviac 12 hodín 

uchovávané pri 5 o C s negatívnym výsledkom skúšky na obsah inhibièných látok. Toto mlieko 

sa ošetrí vo vodnom kúpeli pri teplote 100 o C po dobu 60 minút. Takto ošetrené mlieko sa uchováva 

pri teplote 0 o C do 6 o C najviac 7 dní. 

Mlieko bez obsahu inhibièných látok sa môže pripravi aj z 10g sušeného odtuèneného mlieka a 90 ml 

sterilnej destilovanej vody. Sušené odtuènené mlieko musí najprv prejs skúškou zis ujúcou 

prítomnos inhibièných látok. Výsledok tejto skúšky musí by negatívny. Takto skontrolované mlieko 

sa môže skladova 6 mesiacov. 


5.1 Delvotest ® SP - NT 

5.2 Sterilné f¾aše, vzorkovnice s vhodnými zátkami (niektoré gumové zátky môžu vnies inhibièné látky 

do f¾aše). 

5.3 Vyhrievací blok s termostatom 

5.4 Stopky 

5.5 Dávkovacie pipety 

5.6 Pinzety 

5.7 Nožnièky 

5.8 Stojan na skúmavky 

61



a uskladnenia poškodená alebo zamenená. Vzorky sa odoberajú v súlade s príslušnou vhodnou normou 

pre skúšaný výrobok. Ak táto norma neexistuje, odporúèa sa, aby sa na tomto postupe zúèastnené 

strany dohodli. Vzorky sa skúšajú najneskôr do 24 hodín po odbere, prièom sa skladujú pri teplote od 

0 o C do 5 o C. Ak to nie je možné, vzorka sa musia zmrazi na teplotu od – 30 o C do –15 o C, aby sa 

predišlo inaktivácii penicilínu. 

7. Príprava analytických vzoriek 

Tekuté alebo zmrazené vzorky mlieka sa ponoria do vodného kúpe¾a s teplotou 45 o C a po vytemperovaní 

sa dôkladne premiešajú. 

Zo vzorky sušeného mlieka sa pred testovaním pripraví roztok s obsahom 10 hmotnostných percent 

sušeného mlieka v sterilnej destilovanej vode. 


Pri pracovnom postupe sa dodržiavajú pokyny výrobcu: 

POZNÁMKA: Test je ve¾mi citlivý na antibiotiká, sulfonamidy a iné inhibièné látky. Preto sa musí 

predchádza akejko¾vek kontaminácii. Pred použitím testu sa doporuèuje dôkladne umy ruky. 

S ampulami manipulova opatrne (nemôžu sa trepa ), aby nedošlo k uvo¾neniu agarového média a tým 

aj ovplyvneniu výsledku. 

8.1 Pomocou nožnièiek sa opatrne odstrihne potrebné množstvo ampuliek (aby sa nepoškodila hliníková 

fólia ostatných ampuliek) a oznaèí sa nezmývate¾nou fixou. 

8.2 Dolným koncom striekaèky(bez špièky) sa prepichne hliníková folia ampulky a uloží sa do jedného 

otvoru v boxe DELVOTESTU ®SP-NT. Pri dávkovaní sa používa striekaèka, ktorá je súèas ou 

testu. 

8.3 Na striekaèku sa nasadí špièka tak, aby predok špièky, ktorý bude ponorený, zostal nedotknutý.Úplným 

stlaèením striekaèky sa nasaje vzorka mlieka = 0,1ml mlieka. 

8.4 Obsah striekaèky sa pomaly vstrekne do ampule.Pre každú vzorku mlieka sa použije nová špièka, 

ktorá sa prepláchne skúšanou vzorkou. Pri pipetovaní vzoriek je potrebné dodržiava tieto zásady: 

- špièka nesmie by upchatá tukom zo vzorky a objem vzorky musí by správne nasatý 

- pri dávkovaní sa špièka nesmie dotknú vrstvy agaru, aby pipetovaná vzorka neprenikla do spodnej 

èasti jamky 

- pri dávkovaní vzorky nesmie dôjs k rozstreku vzorky mimo ampulky. 

8.5 Na kontrolu testu sa pipetuje do ampuliek okrem testovaných vzoriek aj 0,1ml negatívnej kontrolnej 

vzorky (4.2.2) a 0,1ml pozitívnej kontrolnej vzorky (4.2.1). 

62

8.6 Skontroluje sa teplota vyhrievacieho bloku, ktorá musí by 64±0,5°C, vložia sa do neho ampule na 

kultiváciu a zapnú sa stopky. 

8.7 Po troch hodinách kultivácie sa ampule vyberú z vyhrievacieho bloku a hodnotia sa . 

8.8 Pri posudzovaní sa hodnotí farba dolných dvoch tretín agaru ( farba hornej èasti môže zosta z rôznych 

dôvodov dlhšie fialová). 


9.1 Žlté sfarbenie pevného média udáva, že nie sú prítomné antibiotiká nad detekèný limit (pre penicilín 

0,002 – 0,003 µg/ml, pre sulfonamidy 0,1 – 0,15 µg/ml) a mlieko je vhodné pre ïalšie spracovanie. 

9.2 Fialové sfarbenie pevného média ukazuje prítomnos antibiotík, ktorých koncentrácia prekraèuje 

detekèný limit (pre penicilín 0,002 – 0,003 µg/ml, pre sulfonamidy 0,1 – 0,15 µg/ml). Toto mlieko by 

nemalo by ïalej použité. 

9.3 Žlté/Fialové sfarbenie pevného média ukazuje prítomnos antibiotík ležiacich blízko detekèného 

limitu s (pre penicilín 0,002 – 0,003 µg/ml, pre sulfonamidy 0,1 – 0,15 µg/ml). 


V protokole o skúške sa musí uvies použitá metóda skúšania / testaèný kmeò, doba inkubácie 

a získané výsledky a jednoznaène uvedený použitý spôsob ich vyjadrenia. 

Protokol musí obsahova aj všetky detaily pracovného postupu, ktoré nie sú uvedené v metóde, aj 

všetky podrobnosti o okolnostiach, ktoré môžu ma vplyv na výsledky. 


11. Zabezpeèenie kvality postupu prevedenia skúšky a overenia metódy merania 

Pre správnos vyšetrovacieho postupu a presnos výsledku sa stanovenie RIL DELVOTESTOM ® 

SP - NT vykonáva u každej vzorky porovnávaním vyšerovanej vzoky s kontrolným pozitívnym a negatívnym 

štandardom. 


DELVOTEST ® SP- NT DELVOTEST ®SP-NT – Štandardný difúzny test na detekciu 

antibakteriálnych látok v mlieku - návod výrobcu 

STN 570531 Dôkaz a stanovenie antibiotík a sulfonamidov v surovom mlieku a tepelne ošetrenom 

mlieku 

63




CH – 12.18 

Stanovenie rezíduí inhibièných látok v mäse metódou 

PREMI ® TEST 

Zmena 1 

1. Úvod 

Táto metóda urèuje všeobecné pokyny na stanovenie rezíduí inhibièných látok v potravinách a surovinách 

živoèíšneho pôvodu: mäso, orgány (oblièky, peèeò), vajcia (okrem potravín technologicky opracovaných 

s použitím prídavných a technologických pomocných látok) metódu PREMI ® test. 


PREMI ® test je je širokospektrálny mikrobiologický screeningový test urèený na sledovanie antibiotík 

vyskytujúcich sa v mäsovej š ave svalu, oblièky a peèene, rybách, vajciach a v moèi prasiat lieèených 

antibiotikami. Použitím PREMI testu je možné urèi prítomnos najdôležitejších antibiotík b - laktámy, 

cefalosporíny, makrolidy, tetracyklíny, sulfonamidy a aminoglykozidy na alebo pod ich MRL (maximálna 

hladina rezíduí). 

3. Definícia 

Vzorka obsahuje inhibièné látky, ak má vzorka pri tomto postupe v celom objeme tuhého živného 

média modrofialové zafarbenie. 


PREMI ® test kombinuje princíp agarových difúznych testov so zmenou farby indikátora v dôsledku 

aktívneho metabolizmu testovacieho mikroorganizmu v neprítomnosti inhibítora. Skúšaná vzorka sa 

dávkuje do liekoviek vyplnených agarovým živným médiom obsahujúcim Bacillus stearothermophillus 

var. calidolaktis. Inkubácia pri ktorom dochádza k normálnemu rastu testovacieho kmeòa, spôsobuje, 

že farba pH indikátora sa mení z modrofialovej na žltú. Ak sú v skúmanej vzorke látky inhibujúce rast 

testovacieho kmeòa, farba indikátora zostáva modrofialová. 

5. Chemikálie a èinidlá 

Použité chemikálie musia ma kvalitu vhodnú na mikrobiologické úèely. Voda na prípravu roztokov 

a riedenie vzorky má by destilovaná v skle alebo demiralizovaná, alebo rovnakej èistoty a sterilná. 

Voda nesmie obsahova inhibièné látky. 

64

5.1. Štandardný difúzny PREMI®Test na stanovenie rezíduí antibiotík 

5.2. Èinidlá 

5.2.1.Kontrolné roztoky penicilínu (PNC) 

Pracovný roztok PNC a kontrolné roztoky PNC sa pripravujú tesne pred použitím. Všetky roztoky 

sa pripravujú do sterilných fliaš. 

5.2.1.1. Základný roztok PNC s koncentráciou 100 IU/ml (60 µg/ml,1 IU= 0,6 µg) 

Tento roztok sa pripraví rozpustení sodnej alebo draselnej soli benzylpenicilínu v sterilnej vode 

tak, aby výsledná koncentrácia bola 100 IU/ml (60 µg/ml). 

Roztok sa pripravuje denne èerstvý a musí sa uchováva v chladnièke do 5 o C. 

5.2.1.2.Kontrolný roztok PNC s koncentáciou 0,005 IU/ml (0,003 µg/ml). 

Tento kontrolný roztok sa pripraví zriedením základného roztoku PNC (5.2.1.1.) s destilovanou 

vodou na výslednú koncentrácie PNC 0,005 IU/ml. 

5.2.2.Negatívne kontrolné vzorky mäsa, orgánov (peèeò, oblièka), vajec, rýb 

Na prípravu negatívnej kontrolnej vzorky sa použije vzorka, ktorá bola po predchádzajúcom vyšetrení 

s negatívnym výsledkom skúšky na obsah inhibièných látok.Takto overené vzorky s negatívnym 

výsledkom skúšky na obsah inhibièných látok sa chovávajú(mäso,orgány, ryby) pri –18°C najviac 

30 dní. 

Pri extrakènej metóde sa postupuje ako pri príprave vzoriek zo vzoriek s negatívnym výsledkom 

skúšky na prítomnos inhibièných látok. 

5.3. Extrakèný roztok 

množstvo extrakèného roztoku sa pripraví pod¾a potreby a to v pomere acetonitril/acetón (70:30, 

v/v) (t.j.70 dielov acetonitril, 30 dielov acetón) a dôkladne sa premieša. 

5.4. Mäsový bujón-Živný bujón è.1 fa.IMUNA 

Zloženie 

mäsový extrakt 

peptón pre bakteriológiu 

destilovaná voda 

3,0 g 

8,0 g 

1000 ml 

Príprava: Zložky média sa rozpustia vo vode a sterilizujú v autokláve pri teplote 120 °C 20 minút 

a pod¾a potreby sa upraví pH na 6,8. 


6.1. Sterilné f¾aše, vzorkovnice s vhodnými zátkami, niektoré gumové zátky môžu vnies inhibièné látky 

do f¾aše 

6.2. Vyhrievací blok s termostatom 

6.3. Stopky 

65

6.4. Nožnièky 

6.5. Mikropipety 50 µl,100 µl,1000 µl 

6.6. Dávkovacia pipeta 

6.7. Stojan na skúmavky 

6.8. Mikroténové sáèky 

6.9. Mixér 

6.10. Laboratórne sklo 

6.11. Centrifuga 

6.12. Termovap 


Je dôležité, aby laboratótium dostalo vzorku, ktorá je skutoène reprezentatívna a nebola poèas prepravy 


pre skúšaný výrobok. Ak táto norma neexistuje, odporúèa sa aby sa na tomto postupe zúèastnené 

strany dohodli. 

8. Príprava analytických vzoriek 

8.1. Vzorky mäsa a rýb - získanie svalovej tekutiny 

8.1.1. Vzorka mäsa, rybacej svaloviny sa zmrazí a opätovne rozmrazí. 

8.1.2. Surové mäso sa zahreje v mikroténovom sáèku na teplotu cca 60 °C vo vodnej lázni 2-3 minúty. 

8.1.3. Odrezok mäsa (svalovina cca 2 cm 3 ) sa vylisuje cesnakovým lisom, takto sa získa tekutina, ktorej 

100 µl sa použije na analýzu. 

8.2. Vzorky oblièiek a peèene 

8.2.1. Oblièka, peèeò sa horizontálne rozreže 

8.2.2. Vyreže sa èas oblièkového tkaniva / peèene (cca 1-2 cm 3 ) 

8.2.3. Tekutina zo vzorky sa získa postupom 8.1.1,8.1.2. 

8.2.4. 100 µl tekutiny získanej z oblièiek / peèene sa aplikuje do ampulky PREMI®testu, vykoná sa 

inaktivácia po dobu 10 minút pri teplote 80 °C (eliminácia prirodzených inhibítorov). 

8.3. Vzorky vajec 

8.3.1. Vajeèná tekutina 

Obsah vajca (žåtok, bielok) sa dá do èistej vzorkovnice a dôkladne zhomogenizuje(mixérom). 

8.3.2. Extrakèný roztok 

Odváži sa 2 g zhomogenizovanej vzorky (8.3.1) do skúmavky na odstreïovanie, pridá sa 5 ml 

extrakèného roztoku acetonitril/acetón (5.3) a homogenizuje 45 s (vznikne zrazenina). 

Vzorka v centrifugaènej skúmavke sa odstredí v centrifuge 10 min/4500g/4 °C (a keï nie je supernatant 

èíry, na stenách skúmavky môžu osta èiastoèky zrazeniny, ešte raz premiešame obsah 

v skúmavke a odstredenie opakujeme). 

Odoberie sa supernatant (na spodu usadenina, berie sa vrchná tekutina) a dá sa vysuši do sucha 

pod prúdom dusíka a teplote – 45 °C.Do vysušeného zvyšku rezíduí sa pridá 250 µl mäsového 

bujónu (5.4). 

Na analýzu sa použije 100 µl pripraveného analytu. 

66

Poznámka: Tento postup na prípravu extrakèného roztoku môžeme použi aj pre mäso,orgány 

(peèeò, oblièku) a ryby. Použitím extrakèného postupu sa získavajú nízke detekèné hladiny 

sledovaných rezíduí antibiotík. 


Pri pracovnom postupe sa dodržiavajú pokyny výrobcu: 

9.1. Pomocou nožnièiek sa opatrne odstrihne potrebné množstvo ampuliek (aby sa nepoškodila hliníková 

fólia ostatných ampuliek) a oznaèí sa nezmývate¾nou fixkou. 

9.2. Opatrne sa odstráni hliníková fólia ampulky 

9.3. Do ampulky sa pomaly aplikuje 100 µl vzorky/extraktu (8.1.3, 8.2.4, 8.3.2) a prekryje fóliou 

9.4. Na kontrolu testu sa pipetuje do ampuliek okrem extraktu aj negatívna kontrola a pozitívna kontrola 

9.5. Skontroluje sa teplota vyhrievacieho bloku, ktorá musí by 64±0,5 o C, vložia sa do neho ampule na 

kultiváciu a zapnú sa stopky. 

9.6. Po troch hodinách kultivácie sa ampule vyberú z vyhrievacieho bloku a hodnotia sa (pri extrakènej 

metóde sa doba inkubácie predlžuje na 3 1/2 hod, porovnaním so zmenou farby negatívnej kontrolky). 

9.7. Pri posudzovaní sa hodnotí farba dolných dvoch tretí agaru ( farba hornej èasti môže zosta z rôznych 

dôvodov dlhšie fialová). 


10.1. Žlté sfarbenie pevného média udáva, že nie sú prítomné antibiotiká. 

10.2. Fialové sfarbenie pevného média ukazuje prítomnos antibiotík. 

10.3. Žlté/Fialové sfarbenie pevného média ukazuje prítomnos antibiotík, ktorých množstvo je na úrovni 

detekovate¾nosti tohto testu. 


V protokole o skúške sa musí uvies použitá metóda skúšania , doba inkubácie a získané výsledky 

a jednoznaène uvedený použitý spôsob ich vyjadrenia. 

Protokol musí obsahova aj všetky detaily pracovného postupu, ako aj všetky podrobnosti o okolnostiach, 

ktoré môžu ma vplyv na výsledky. 


12. Použitá lieratúra 

12.1. Food Additives and Contaminants,Vol.21, No 3 (march 2004), pp.216-221: 

Meeting maximum residues limits:an improved screening technigue for the rapid detection of antimicrobial 

residues in animalfood products 

12.2. Improvements to the Screening of Antimicrobial Drug Residues in Food by the use of the 

PREMi®test:DSM Food Specialties, Delft,The Netherlands 

12.3. PREMI ® test-Návod k použitiu 

67




CH – 12.19 

Screeningový test na stanovenie rezíduí antibiotík s použitím piatich 

bakteriálnych kmeòov (metóda STAR) 

Zmena 1 


Táto metóda urèuje všeobecné pokyny na stanovenie rezíduí inhibièných látok v potravinách a surovinách 

živoèíšneho pôvodu (okrem potravín technologicky opracovaných s použitím prídavných a technologických 

pomocných látok) s použitím citlivých bakteriálnych kmeòov. 

2. Definícia 

Potraviny a suroviny obsahujú inhibièné látky, ak sa okolo vzorky pri tomto postupe nachádza èíra 

zóna inhibície, ktorá znamená obmedzenie metabolickej aktivity testovacích kmeòov. 


Princípom metódy je agarový difúzny test, pri ktorom sa používajú na piatich P. miskách s agarovým 

médiom testovacie kmene: 

Testovacie kmene Citlivos na 

agar s pH 7,2 s kmeòom Bacillus subtilis 

agar s pH 8 s kmeòom Kocuria varians 

(ex. Micrococcus luteus) 

agar s pH 6 s kmeòom Bacillus cereus 

agar s pH 8 s kmeòom Escherichia coli 

agar s pH 7,4 s kmeòom Bacillus stearothermophilus 

aminoglykozidové antibiotiká 

makrolidové antibiotiká a beta-laktámové 

antibiotiká 

tetracyklínové antibiotiká 

citlivos na chinolóny 

beta-laktámové antibiotiká a sulfonamidy 

68


Na povrch testovacieho agarového média s testovacími kmeòmi (3.) sa položia pripravené vzorky. 

Inkubácia, pri ktorej dochádza k normálnemu rastu testovacieho kmeòa, spôsobuje zakalenie agarového 

média. Ak sú v skúšanej vzorke prítomné látky inhibujúce rast testovacieho kmeòa, vznikajú okolo 

vzorky èíre zóny. 

Ve¾kos inhibièných zón závisí od koncentrácie a typu antimikrobiálnej látky prítomnej v skúšanej vzorke. 

Tieto zóny sa porovnávajú s ve¾kos ou zón vytvorených kontrolnými roztokmi antibiotík streptomycínu, 

tylozínu, chlortetracyklínu, ciprofloxacínu a sulfamethazínu 

5. Èinidlá, živné médiá a testovacie kmene 

Pokia¾ nie je stanovené inak, používajú sa iba analyticky overené èinidlá, destilovaná voda alebo voda 

porovnate¾nej kvality. Aby sa zlepšila reprodukovate¾nos výsledkov, mali by sa používa dehydrované 

základné komponenty alebo kompletné médiá na prípravu kultivaèných médií a roztokov. Hodnotu pH 

treba stanovi s pH metrom pri izbovej teplote (okolo 20 °C) alebo náhradnou teplotou pre agarové 

médium (asi 45 °C). 

Ak nie je stanovené inak v návode výrobcu, mali by sa roztoky a riedenia nepoužité poèas jedného dòa 

prípravy uskladni v tme pri 4-6 °C najviac 6 mesiacov. Ak sa test nevykonáva v ten istý deò, testované 

vzorky treba uskladni pri –18 °C alebo pri nižšej teplote. 

5.1 Slaný roztok s peptónom 

Zloženie 

Tryptón zahustený kazeínom 

Chlorid sódny 

Destilovaná voda 

1 g 

8.5 g 

1 000 ml 

Príprava 

Ak je to potrebné, pH média sa upraví tak, aby bolo po sterilizácii 7,2 ± 0,1 pri teplote 25 °C. 

Sterilizuje v autokláve 20 minút pri teplote 121 °C. 

5.2 Roztok chloridu sódneho 

Zloženie 



8.5 g 

1 000 ml 

Príprava 

Po rozpustení sa sterilizuje v autokláve 15 minút pri teplote 121°C. 

69

5.3 Tryptón sójový agar(T.S.A) 

Zloženie 

Tryptón (enzymatický kazeínový hydrolyzát) 15, 0 g 

Sójový peptón 

5,0 g 


5,0 g 


1 000 ml 

Príprava 



5.4 Bujón pre zmrazené kmene 

Zloženie 

Mäsový extrakt 

Tryptóza 


5,0 g 

3,0 g 

1 000 ml 

Príprava 

Ak je to potrebné, pH média sa upraví tak, aby bolo po sterilizácii 6,8 ± 0,2 pri teplote 25°C. 


5.5 Finley a Fieldsovo agarové médium 

Zloženie 

Živný agar 

Glukóza 

Síran manganatý (MnSO4.H2O) 


15,0 g 

5,0 g 

0,03 g 

1 000 ml 

Príprava 



5.6 Roztok trimetoprimu 

Použijeme 500 ml odmernú banku. Zriedime 50 mg trimetoprimu (SIGMA reference T 7883 alebo 

ekvivalentné) v 5 ml 5 % kyseliny octovej a doplníme do 500 ml destilovanou vodou. Pred použitím 

tento zásobný roztok zriedime 1/200.Výsledná koncentrácia roztoku trimetoprimu je 0,5 ug/ml. 

70

5.7 Fosfátový tlmivý roztok s pH 6,0 

Zloženie 

Chlorid sódny p.a 

Hydrofosforeènan dvojsodný Na 2 

HPO 4. 

12H 2 

O 

Dihydrofosforeènan sodný NaH 2 

PO 4 

7,650 g 

60,724 g 

0,21 g 

Príprava 

Doplní sa do 1000 ml destilovanou vodou a môže sa uchováva pri teplote +4 °C. 

5.8 Extrakèná zmes 

Množstvo sa pripraví pod¾a potreby a to v pomere acetonitril/ecetón (70:30,v/v)(t.j.70 dielov 

acetonitril, 30 dielov acetón a dôkladne sa premieša). 

5.9 Živný bujón è.1 fa.IMUNA 

Zloženie 

Mäsový extrakt 

peptón pre bakteriológiu 


3,0 g 

8,0 g 

1 000 ml 

Príprava 

Zložky média sa rozpustia vo vode a sterilizujú v autokláve 20 minút pri teplote 120 °C a pod¾a 

potreby sa upraví pH na 6,8. 

5.10 Roztoky antibiotík 

Štandardné roztoky obsahujúce referenèné antibiotiká alebo sulfonamidy sa používajú na overenie 

pracovných podmienok a sú systematicky zoh¾adòované. 

5.10.1 Roztok streptomycínu 

5.10.1.1 Zásobný roztok 

Pou•ijeme 50 ml odmernú banku. Navá•ku 50 mg streptomycínu (SIGMA reference S 6501, 

alebo ekvivalentnej kvality) zriedime do 50 ml destilovanou vodou - koncentrácia 1000mg/l. 

5.10.1.2 Pracovný roztok 

Pred použitím zriedime tento zásobný roztok streptomycínu 1/500, ktorého výsledná koncentrácia 

je 2 mg/l. 

Zásobný roztok môže by uchovávaný pri +4 °C do +6 °C po dobu 2 týždòov. 

5.10.2 Roztok tylozínu 


Pou•ijeme 50 ml odmernú banku. Navá•ku 50 mg tylozínu (SIGMA reference T6134, alebo 

ekvivalentnej kvality) zriedime do 50 ml destilovanou vodou - koncentrácia 1000 mg/l. 

71


Pred použitím zriedime tento zásobný roztok tylozínu 1/1000, ktorého výsledná koncentrácia je 

1 mg/l. 

Zásobný roztok môže by uchovávaný pri +4 °C do +6 °C po dobu 1 mesiac. 

5.10.3 Roztok chlortetracyklínu 


Použijeme 50 ml neprieh¾adnú (tmavú) odmernú banku. Navážku 50 mg chlortetracyklínu (SIGMA 

reference C4881,alebo ekvivalentnej kvality) zriedime do 50 ml destilovanou vodou - koncentrácia 

1000 mg/l. 


Pred použitím zriedime tento zásobný roztok chlortetracyklínu v neprieh¾adnej (tmavej) odmernej 

banke 1/5000, ktorého výsledná koncentrácia je 0,2 mg/l. 

Zásobný roztok chlortetracyklínu musí by vždy pred použitím èerstvo pripravený. 

5.10.4 Roztok ciprofloxacínu 


Použijeme 100 ml neprieh¾adnú (tmavú) odmernú banku. Navážku 10 mg ciprofloxacínu (Bayer, 

alebo ekvivalentnej kvality) zriedime v 1 ml NaOH 0,1N a doplníme do 100 ml destilovanou 

vodou - koncentrácia 100 mg/l. 


Pred použitím zriedime tento zásobný roztok ciprofloxacínu v neprieh¾adnej (tmavej) odmernej 

banke 1/1000, ktorého výsledná koncentrácia je 0,1mg/l. 

Zásobný roztok môže by uchovávaný pri +4 °C do +6 °C po dobu 1 mesiac. 

5.10.5 Roztok sulfamethazínu 


Použijeme 50 ml odmernú banku. Navážku 50 mg sulfamethazínu (SIGMA reference S6256, 

alebo ekvivalentnej kvality) zriedime do 50 ml destilovanou vodou - koncentrácia 1000 mg/l. 


Pred použitím zriedime zásobný roztok tylozínu 1/1000, ktorého výsledná koncentrácia je 1mg/l. 

Zásobný roztok môže by uchovávaný pri +4 °C do +6 °C po dobu 1 týždeò 

5.11 Kontrola citlivosti testovacích agarov 

Každá pripravená šarža všetkých testovacích médií sa sleduje v deò použitia na citlivos diskami 

priemeru 9 mm, na ktoré nanesieme 30 ul pracovného roztoku ATB (5.10). 

Kontrolné disky majú vykazova po inkubácii zónu inhibície (šírka je vzdialenos medzi okrajom 

disku a vonkajším krajom zóny inhibície). 

72

Tabu¾ka: 

Skúšaná Bacillus Micrococcus Bacillus Escherichia Bacillus 

pôda subtilis pH luteus cereus coli stearothermophilus 

7,2 pH 8 pH 6 pH 8 pH 7,4 

Prac.roztok Streptomycín Tylozín Chlortetracyklín Ciprofloxacín Sulfamethazine 

ATB 2mg/l 1mg/l 0,2mg/l 0,1mg/l 1mg/l 

Zóna (mm) 4,5 5,5 6,0 5,5 5 * 

Štandardná 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 

odchýlka (mm) 

5.12 Kultivaèné médiá 

5.12.1. Agarové testovacie médium pH 6 - Bacillus cereus 

Komerène vyrábané fa MERCK reference 10663, alebo ekvivalentné. 

Príprava pod¾a návodu výrobcu. 

5.12.2. Agarové testovacie médium pH 7,2 - Bacillus subtilis 



*èiastoèná inhibièná zóna 

5.12.3 Agarové testovacie médium pH 8 - Kocuria varians ex. Micrococcus luteus, E.coli 



5.12.4 Agarové testovacie médium DST pH 7,4 - Bacillus stearothermophilus 

Komerène vyrábané fa OXOID reference CM261(UNIPATH LTD, Basingstoke, 

Hampshire, ENGLAND), alebo ekvivalentné. 


5.13 Príprava bakteriálnych substancií a P. misiek 

5.13.1 Bacillus subtilis 

Testovaný organizmus: Bacillus subtilis B.G.A., fa MERCK, ampulky obsahujú suspenziu 8.10 6 

do 5.10 7 spór na ml (reference 10649). 

Táto bakteriálna suspenzia je pripravená na použitie po stanovení poètu spór. 

Ak je to potrebné, môže sa pripravi zásobná suspenzia. 

5.13.1.1 Príprava zásobného inokula 

Komerèná suspenzia sa inokuluje na dve T.S.A. platne (5.3) na vyèistenie a izoláciu na konfirmaènú 

identifikáciu. Inkubuje sa pri 30 °C 16-18 hodín. Z nieko¾kých kolónií odobratých z jednej 

73

platne sa inokuluje jedna alebo viac skúmaviek média na zamrazenie (5.4). Inkubuje sa pri 

30 °C 3-6 hod. 

Kultúra sa rozdelí po 0,5 -1 ml do uzatvorených mikroskúmaviek a uskladòuje pri –18 °C po 

dobu dvoch rokov. 

5.13.1.2 Príprava suspenzie spór 

Zo zásobného inokula (5.13.1.1) sa vytvoria 3 po sebe idúce subkultúry na šikmý T.S.A. (5.3.) 

na reaktiváciu kmeòa. Paralelne sa inokuluje v pásoch na dve T.S.A. misky (5.3). Inkubuje sa 

pri 30 °C 16-18-hod. Získa kultúru za menej ako 24 hod vo forme suspenzie s použitím asi 10- 

tich sklenených gulièiek a 2 ml slaného roztoku (5.2). 

Premiestni suspenziu na povrch 200 ml Finley a Fields agarového média (5.5), ktoré bolo 

naliate do Roux f¾ašiek a stuhnuté. Inkubova pri 30 °C najmenej 5 dní sledujúc sporulaèný 

proces pozorovaním vzoriek kultúry pod fázovým kontrastným mikroskopom. Ak je potrebné, 

predåži inkubáciu. Po inkubácii získa spóry so sklenenými gulièkami a 50 ml slaného roztoku 

(5.2.). Túto suspenziu spór centrifugova na 15 min. pri 4,400 g. Odstráni supernatant a resuspendova 

v 50 ml slaného roztoku (5.2). Centrifugova , odstráni supernatant a resuspendova 

v 50 ml slaného roztoku (5.2). Centrifugova a odstráni supernatant. Resuspendova v 30 ml 

slaného roztoku (5.2) a zahria presne 35 min. na 70 °C. Uskladni suspenziu spór pri +4 do 

+6 °C poèas jedného roka. 

5.13.1.3 Stanovenie poètu spór suspenzie 

Po vhodnom riedení na 10 -10 v slanom roztoku (5.2) inkubova pri 30 °C 24 hod. pred stanovením 

poètu. 

5.13.1.4 Príprava testovaných platní 

Inokulova rozpustené agarové médium (5.12.2) ochladené na 45-55 °C s predriedenou suspenziou 

spór (5.13.1.2) do slaného roztoku s peptónom (5.1), aby sme dosiahli výslednú koncentráciu 

spór 5 x 10 4 /ml. Premiestni 5 ml inokulovaného média do Petriho misiek na vychladený 

horizontálny povrch. 

5.13.2 Kocuria varians ex.Micrococcus luteus 

Testovaný organizmus: Kocuria varians ATCC 9341. Rehydratova zamrznutý vysušený kmeò 

s 2 ml peptón-slaného roztoku (5.2.). 


Použi komerènú suspenziu na inokuláciu prúžkov na dve T.S.A. platne (5.3.) na vyèistenie 

a izoláciu na konfirmáciu. Inkubova pri 37 °C najmenej 24 hod. 

Odobra nieko¾ko kolónií z jednej z platní, inokulova jednu alebo viac skúmaviek pôdy na 

zmrazenie. Inkubova pri 37 °C 3-6 hod.Rozdeli kultúru na èasti 0,5-1 ml do uzatvorených 

mikroskúmaviek a uskladni pri –18 °C na max. 18 mesiacov. 

5.13.2.2 Príprava testovacieho inokula 

Použi zásobné inokulum (5.13.2.1) do troch následných subkultúr do šikmého T.S.A. (5.3) na 

reaktiváciu kmeòa. Paralelne inkubova na T.S.A. platniach na vyèistenie a izoláciu na konfirmaènú 

identifikáciu. Inkubova pri 37 °C najmenej 24 hod. Získa kultúru za menej ako 24 hod. s asi 

10-mi sklenenými gu¾ôèkami a 2 ml slaného roztoku (5.2). Premiestni suspenziu na povrch 200 

74

ml T.S.A (5.3) preliateho do Roux f¾ašiek. Inkubova pri 37 °C najmenej 24 hod. Získa kultúru 

za menej ako 24 hod. s asi 20-mi sklenenými gu¾ôèkami a 10 ml slaného roztoku (5.2). Riedi 

na 50 ml v sterilnej f¾aši. Bakteriálna suspenzia môže by uskladnená pri + 4 až + 6 °C do 

jedného mesiaca. 

5.13.2.3 Stanovenie poètu spór suspenzie 

Po vhodnom riedení na 10 -10 v slanom roztoku (5.2.) inkubova pri 37 °C na 24 hod. pred 

stanovením poètu. 

5.13.2.4 Príprava testovacích P. misiek 


spór (5.13.2.2) do slaného roztoku s peptónom (5.1) aby sme dosiahli výslednú koncentráciu 

spór 5 x 10 4 /ml. Premiestni 5 ml inokulovaného média do P. misiek na vychladený 

horizontálny povrch. 

5.13.3. Bacillus cereus 

Testovaný organizmus: Bacillus cereus ATCC 11788 

Táto bakteriálna suspenzia je pripravená na použitie po stanovení poètu spór. Ak je to potrebné, 

môže by pripravená zásobná suspenzia. 


Použi komerènú suspenziu na inokuláciu prúžkov na dve T.S.A. platne (5.3) na vyèistenie a izoláciu 

na konfirmáciu. Inkubova pri 30 °C na 16-18 hod. Odobra nieko¾ko kolónií z jednej z platní, 

inokulova jednu alebo viac skúmaviek pôdy na zmrazenie (5.4). Inkubova pri 30 °C 3-6 hod. 

Rozdeli kultúru po 0,5-1 ml do uzatvorených mikroskúmaviek a uskladni pri –18°C na max. 2 

roky. 

5.13.3.2 Príprava suspenzie spór 

Zo zásobného inokula (5.13.3.1.) vytvori 3 po sebe idúce subkultúry na šikmý T.S.A. (5.3) na 

reaktiváciu kmeòa. Paralelne inokulova v pásoch dva T.S.A. platne (5.3). Inkubova pri 30 °C 

16-18-hod. Získa kultúru za menej ako 24 hod. vo forme suspenzie s použitím asi 10-tich 

sklenených gulièiek a 2 ml slaného roztoku (5.2). 

Premiestni suspenziu na povrch 200 ml Finley a Fields sporotvorného média (5.5) predtým 

preliateho do Roux f¾ašiek. Inkubova pri 30 °C najmenej 5 dní sledujúc sporulaèný proces 

pozorovaním vzoriek kultúry pod fázovým kontrastným mikroskopom. Ak je to potrebné, predåži 

inkubáciu. Po inkubácii získa spóry so sklenenými gulièkami a 25 ml slaného roztoku (5.2). 

Túto suspenziu spór centrifugova 15 min pri 4,400 g. Odstráni supernatant a resuspendova v 

25 ml slaného roztoku (5.2). Scentrifugova , odstráni supernatant a resuspendova v 25 ml 

slaného roztoku (5.2). Scentrifugova a odstráni supernatant. Resuspendova v 50 ml slaného 

roztoku (5.2.) a umiestni suspenziu spór na 10 min do UV kúpe¾a. 

Uskladni suspenziu spór pri +4 do +6 °C poèas jedného roka. 

5.13.3.3 Stanovenie poètu spór 

Stanovenie poètu každej novej suspenzie spór je potrebné na stanovenie koncentrácie spór. Po 

vhodnom riedení na 10 -10 v slanom roztoku (5.2) inkubova pri 30 °C 24 hod pred stanovením 

poètu. 

75


Inokulova rozpustené agarové médium (5.12.1) ochladené na 45-55°C s predriedenou suspenziou 

spór (5.13.3.2) do slaného roztoku s peptónom (5.1) aby sme dosiahli výslednú koncentráciu 

spór 3 x 10 4 /ml. Premiestni 5 ml inokulovaného média do P. misiek na vychladený horizontálny 

povrch. 

5.13.4 Escherichia coli 

Testovaný organizmus: Escherichia coli ATCC 11303 

Rehydratova zamrznutý vysušený kmeò s 2 ml slaného roztoku s peptónom (5.2). 


Použi komerènú suspenziu na inokuláciu prúžkov na dve T.S.A. platne (5.3) na vyèistenie a izoláciu 

na konfirmáciu. Inkubova pri 37 °C 16-18 hod. Odobra nieko¾ko kolónií z jednej z platní, 

inokulova jednu alebo viac skúmaviek pôdy na zmrazenie (5.4). Inkubova pri 37 °C 3-6 hod. 

Rozdeli kultúru po 0,5-1 ml do uzatvorených mikroskúmaviek a uskladni pri –18 °C na max. 

2 roky. 

5.13.4.2 Príprava zásobných skúmaviek na 1 mesiac 

Použi zásobné inokulum (5.13.4.1) do pásov dvoch T.S.A. skúmaviek (5.3) Inkubova pri 

37 °C 18-24 hod. Z týchto skúmaviek inokulova v pásoch ïalšie dve skúmavky. Inkubova 

pri 37 °C 18-24 hod. Inokulova dostatoèné množstvo skúmaviek na analýzu na jeden mesiac. 

Inkubova pri 37 °C 18 - 24 hod. 

Uskladni skúmavky pri + 4 do + 6 °C do jedného mesiaca. 

5.13.4.3 Príprava testovaného inokula 

Jeden deò pred analýzou vykona subkultúru na šikmom T.S.A. (5.3) zo zásobného inokula 

(6.11.4.2). Inkubova pri 37 °C 18-24 hod. V deò vyšetrenia rozpusti kultúru v slanom roztoku 

s peptónom (5.1). Prispôsobi absorbanciu suspenzie so spektrofotometrom na 620+/- 20 nm, 

ak je potrebné riedi so slaným roztokom s peptónom (5.1) na hodnotu optickej denzity (DO) 

450 +/- 0,005. Táto DO korešponduje asi 10 7 /ml. 


Inokulova rozpustené agarové médium (5.12.3) ochladené na 45-55 °C s 1% (v/v) suspenzie 

(5.13.4.3) aby sme dosiahli výslednú koncentráciu 10 5 /ml. 

Premiestni 5 ml inokulovaného média do P. misiek umiestnených na chladnom horizontálnom 

povrchu. 

5.13.5 Bacillus stearothermophilus 

Testovaný organizmus: Bacillus stearothermophilus ATCC 10149 predávaný firmou MERCK (reference 

1.11499) 

5.13.5.1 Stanovenie poètu spór 

Po vhodnom riedení na 10 -10 v slanom roztoku (5.2) inkubova pri 55 °C 16-18 hod. pred stanovením 

poètu. 

76



spór (5.13.1.2) do slaného roztoku s peptónom (5.1) aby sme dosiahli výslednú 

koncentráciu spór 5 x 10 5 /ml. Prida roztok trimetoprimu (5.10) do agaru na koncentráciu 1% 

(v/v). Premiestni 5 ml inokulovaného média do P. misiek umiestnených na chladnom horizontálnom 

povrchu. 


Základné vybavenie mikrobiologického laboratória a tieto prístroje a pomôcky 

6.1 Termostat s teplotou udržovanou na 35 °C ± 1°C, 37 °C ± 1 °C, 55 °C ± 1 °C, 

6.2 Mraznièka s teplotou udržovanou na -18 °C a nižšie 

6.3 Chladnièka s teplotou udržovanou na + 4 o C do + 6°C 

6.4 Centriguga 

6.5 Vodný kúpe¾ s teplotou udržovanou do 100 °C 

6.6 Mechanické miešadlo (VORTEX alebo ekvivalentné) 

6.7 Váhy s presnos ou váženia 0,1mg 

6.8 pH meter (s presnos ou merania na 0,1 pH jednotky pH) 

6.9 Automatické mikropipety nastavite¾né 10-100 ul 

6.10 Jednorazové špièky pre automatické pipety 

6.11 Delené pipety s objemom 10ml, 5ml s delením po 0,1ml 

6.12 Laboratórne sklo 

6.13 Korkovrták s priemerom 8mm (PROLABO reference 08.146.063, alebo ekvivalentné) 

6.14 Petriho misky (plastové) s priemerom 90 mm 

6.15 Ultralázeò 

6.16 Fázový kontrastný mikroskop 

6.17 Spektrofotometer pri 620nm ± 20 nm 

6.18 Papierové disky ø 9 mm (DURIEUX alebo ekvivalentné) 

6.19 Termovap 




pre skúšaný výrobok. Ak táto norma neexistuje, odporúèa sa na tomto postupe zúèastnené strany 

dohodli. 


8.1. Príprava vzoriek 

8.1.1 Mlieko a mlieène výrobky 

Metóda nie je vhodná pre kyslomlieène výrobky. 

77

Tekuté vzorky, ktoré sa netestujú okamžite po ich odobratí, sa uchovávajú pri teplote od + 3 °C do 

+ 15 °C najviac 24 hodín. Ak to nie je možné, vzorky sa musia zmrazi na teplotu –30 °C do –15 °C 

(aby sa minimalizovala inaktivácia inhibièných látok). 

Mlieko sa dôkladne premieša (ak je zmrazené, nechá sa rozmrazi ponorením do vodného kúpe¾a 

s teplotou 45 °C a po vytemperovaní sa dôkladne premieša). 

Vzorky sušeného mlieka sa pred testovaním pripraví roztok s obsahom 10 % hmotn.sušeného mlieka 

v sterilnej destilovanej vode. 

Papierový disk (6.19)sa pomocou èistej, suchej a sterilnej pinzety ponorí do vzorky mlieka. 

Prebytok mlieka sa odstráni priložením disku na vnútornú stenu vzorkovnice, alebo sa odsaje savým 

papierom. 

Disk sa umiestni horizontálne na povrch každého skúšobného média v P. miske (5.13.1.4, 5.13.2.4, 

5.13.3.4, 5.13.4.4, 5.13.5.2) a jemne pritlaèí pomocou pinzety. Postup sa opakuje dvakrát s každou 

vzorkou. 

Týmto spôsobom sa umiestnia na každú P. misku 4 disky zodpovedajúce dvom vzorkám. Disky by 

mali vytvára kruh asi 1 cm od okraja misky. 

8.1.2 Mäso a orgány 

Pri odbere je potrebné zvláš bali mäso a orgány, peèeò a oblièku z jedného zviera a. Ak doprava 

trvá dlhšie ako 6 hodín, je lepšie vzorky prepravova zamrznuté. Silne mikrobiálne kontaminované 

vzorky nie sú vhodné na vyšetrenie. 

Na povrch pripravených testovacích agarov (5.13.1.4, 5.13.2.4, 5.13.3.4, 5.13.4.4, 5.13.5.2) (ak 

sú vzorky zmrazené, nieko¾ko minút pred vyšetrením sa vzorky vyberú a umiestnia na podnos z nehrdzavejúcej 

ocele) sa kladú vzorky mäsa a orgánov, ktoré si pripravíme nasledovným spôsobom: 

z každej vzorky sa odoberie èas vzorky o priemere 8 mm a dåžky 2 cm, táto èas sa rozreže na 

10 èastí po 2 mm. Postup sa opakuje dvakrát s každou vzorkou. 

Takto je možné umiestni na každú P. misku po 4 kúsky zodpovedajúce dvom testovaným vzorkám. 

Vzorky by mali tvori kruh asi 1 cm od kraja misky. 

8.1.3 Vajcia 

Vzorka vajec (žåtok a bielok spolu) sa zhomogenizuje mixérom pri malých otáèkach. 

Odváži sa 2 g zhomogenizovanej vzorky do skúmavky na odstreïovanie, pridá sa 5 ml extrakènej 

zmesi acetonitrilu s acetónom (5.8) a homogenizuje 45 s (vznikne zrazenina). 

Vzorka v centrifugaènej skúmavke sa odstredí v centrifuge 10 min/4500g/4°C (ak nie je supernatant 

èíry, na stenách skúmavky môžu osta èiastoèky zrazeniny, ešte raz sa premieša obsah v skúmavke 

a odstredenie sa opakuje). 

Odoberie sa supernatant (na spodu usadenina, berie sa vrchná tekutina) a dá vysuši do sucha pod 

prúdom dusíka a teplote 45 °C (6.21). Do vysušeného zvyšku rezíduí sa pridá 250 ml živného bujónu 

(5.9). 

Na analýzu sa z pripraveného analytu použije 30 ml na papierový disk s priemerom 9 mm (6.19). 

Poznámka: prípravu extrakèného roztoku-extraktu vykonávame dvojmo, z dôvodu dostatoèného 

množstva analytu. Tento postup na prípravu extrakèného roztoku môžeme použi 

78

aj pre mäso, orgány (peèeò, oblièku), ryby. Použitím extrakèného postupu sa získavajú 

nízke detekèné hladiny sledovaných rezíduí antibiotík. 

Papierové disky (6.19) sa pomocou èistej, suchej a sterilnej pinzety položia na pripravené testovacie 

agary (5.13.1.4, 5.13.2.4, 5.13.3.4, 5.13.4.4, 5.13.5.2).Na disk sa aplikuje 30 ml extraktu. 

Postup sa opakuje dvakrát s každou vzorkou. 

Týmto spôsobom sa umiestnia na každú misku 4 disky zodpovedajúce dvom vzorkám. Disky by 

mali vytvára kruh asi 1 cm od okraja misky. 

8.1.4 Ryby 

Na povrch pripravených testovacích agarov (5.13.1.4, 13.2.4, 5.13.3.4, 5.13.4.4, 5.13.5.2) (ak 

sú vzorky zmrazené, nieko¾ko minút pred vyšetrením sa vzorky vyberú a umiestnia na podnos 

z nehrdzavejúcej ocele) sa kladú vzorky , ktoré si pripravíme nasledovným spôsobom: z každej 

vzorky sa odoberie èas vzorky o priemere 8 mm a dåžky 2 cm, táto èas sa rozreže na 10 èastí po 

2mm. Postup sa opakuje dvakrát s každou vzorkou. Takto je možné umiestni na každú P. misku 

po 4 kúsky zodpovedajúce dvom testovaným vzorkám rýb. Èasti by mali tvori kruh asi 1 cm od 

kraja misky. 

8.2. Negatívna a pozitívna kontrola 

Na každý testovací agar (5.13.1.4, 5.13.2.4, 5.13.3.4, 5.13.4.4, 5.13.5.2) sa umiestni kontrola. 

Negatívna kontrola: 

Mlieko: Pomocou pinzety sa namoèí papierový disk (Ø 9 mm) do mlieka bez antibiotík a prebytok 

sa odstráni absorbèným papierom, alebo o stenu vzorkovnice. Postup sa opakuje dvakrát, dva disky 

sa umiestnia oproti sebe na všetky testovacie agary. 

Extrakèný roztok: Zo vzoriek bez antibiotík sa postupuje ako pri postupe prípravy vzorky vajec 

(prípadne mäsa, orgánov, rýb). Postup sa opakuje dvakrát, dva disky sa umiestnia oproti sebe na 

všetky testovacie agary. 

Mäso, orgány, ryby: Zo vzoriek bez antibiotík postupova ako pri vzorkách mäsa, orgánov 

a rýb.Postup sa opakuje dvakrát,vzorky sa umiestnia oproti sebe na všetky testovacie agary. 

Pozitívna kontrola: 

Bacillus subtilis pri pH 7,2 (Bs 7,2) 

Dva disky filtraèného papiera sa umiestnia na kontrolné P. misky (5.12.1.4). Mikropipetou sa aplikuje 

30 ul štandardného roztoku streptomycínu (5.10.1.2) na každý disk. 

Pripravené misky inkubova pri teplote 30 °C najmenej 18 hod. 

Kocuria varians pri pH 8 (Kv 8) 

Dva disky filtraèného papiera sa umiestnia na kontrolné Petriho misky (5.13.2.4). Mikropipetou sa 

aplikuje 30 ul štandardného roztoku tylozínu (5.10.2.2) na každý disk. 

Pripravené platne inkubova pri teplote 37 °C najmenej 24 hod. 

Bacillus cereus pri pH 6 (Bc 6) 

Dva disky filtraèného papiera sa umiestnia na kontrolné P. misky (5.13.3.4). 

Mikropipetou sa aplikuje 30 ul štandardného roztoku chlortetracyklínu (5.10.3.2) na každý disk. 


79

Escherichia coli pri pH 8 (Ec 8) 


30 ul štandardného roztoku ciprofloxacínu (5.10.4.2) na každý disk. 


Bacillus stearothermophilus pri pH 7,4-DST (Bst) 


30 ul štandardného roztoku sulfamethazínu (5.10.5.2) na každý disk. 

Pripravené platne inkubova pri teplote 55 °C najmenej 12-15 hod. 

9. Výsledky 

Po inkubácii sa zis ujú èíre pravidelné zóny inhibície okolo vzoriek a diskov, ktorých ve¾kos sa meria 

od okraja vzorky alebo disku alebo od okraja zaschnutej tkanivovej tekutiny. 

9.1. Štandardné roztoky 

Pozri 5.11 Kontrola citlivosti testovaných agarov 

9.2. Mlieko, vajcia-extrakèný roztok 

Vzorky sú považované za pozitívne, ak dávajú zónu inhibície vyššiu ako 2 mm u mlieka a vyšiu ako 

1 mm u vajec na najmenej jednej z piatich P.misiek. Dva disky z rovnakej vzorky by mali da rovnaký 

výsledok. 

Ak je výsledok dubiózny, test by sa mal opakova (jeden výsledok negatívny a jeden pozitívny pre 

rovnakú vzorku, kontaminácia...) Ak je druhý výsledok negatívny, dubiózny výsledok má by 

považovaný za negatívny. 

9.3. Mäso, orgány, ryby 

Vzorky sú považované za pozitívne, ak dajú zónu inhibície väèšiu ako 2 mm na miskách Bs 7.2, Kv 

8, Bc 6 a Ec 8 (5.13.1.4, 5.13.2.4, 5.13.3.4, 5.13.4.4) a / alebo zónu inhibície vyššiu ako 4 mm na 

platni Bst (5.13.5.2). Dve èasti vzorky by mali da rovnaký výsledok. 

Test by mal by opakovaný, ak je výsledok dubiózny (jeden výsledok pozitívny a jeden negatívny 

z rovnakej vzorky, kontaminácia...) Ak je druhý výsledok negatívny, dubiózny výsledok by mal by 

považovaný za negatívny. 

9.4. Vzorky mlieka alebo svaloviny, ktoré mali pozitívnu aspoò jednu z piatich agarových platní 

difúzneho testu, sú považované za obsahujúce reziduá antibakteriálnych substancií. 

9.5 Orientácia 

Platòa Bs 7.2 Kv 8 Bc 6 Ec 8 Bst 

Druh Aminoglykozidy Makrolidy Tetracyklíny Chinolóny Sulfonamidy 

a betalaktámy 

a betalaktámy 

80


Protokol musí obsahova všetky informácie nevyhnutné na úplnú identifikáciu vzorky. 

V protokole o skúške sa musí uvies použitá metóda skúšania, doba inkubácie a získané výsledky 

a jednoznaène uvedený použitý spôsob ich vyjadrenia. 

Protokol musí obsahova aj všetky detaily pracovného postupu, ako aj všetky podrobnosti o okolnostiach, 

ktoré môžu ma vplyv na výsledky. 



STAR PROTOKOL SCREENING TEST FOR ANTIBIOTIC RESIDUES Reference:LMV/UCM/ 

PO5/11.AN Version 2, AFSSA-Fougéres 

Food Additives and Contaminants,Vol.21,No 3 (march 2004), pp.216-221: 

Meeting maximum residues limits: an improved screening technigue for the rapid detection of antimicrobial 

residues in animal food products 

81

zoznam ÃºradnÃ½ch metÃ³d laboratÃ³rnej diagnostiky potravÃ­n a krmÃ­v

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?

zoznam ÃºradnÃ½ch metÃ³d laboratÃ³rnej diagnostiky potravÃn a krmÃv