Fluorescencija - TehniÄki fakultet u Rijeci

Medicinska dijagnostika I 

Željko Jeričević, dr. sc. 

Zavod za računarstvo, Tehnički fakultet & 

Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultet 

51000 Rijeka, Croatia 

Phone: (+385) 51-651 594 

E-mail: zeljko.jericevic@riteh.hr 

http://www.riteh.uniri.hr/~zeljkoj/Zeljko_Jericevic.html 

Fluorescencija 

2009.05.28 Zeljko Jericevic, Ph.D. 2 

1


1. Udžbenici 

2. Povijest fluorescencije 

3. Fizikalni i kemijski procesi u fluorescenciji 

4. Fluorescentni spektrometar 


1. Udžbenici 


2

Ukratko 

1. Udžbenici 





Povijest 

metode: 

William 

Herschel 

On a case of superficial colour presented by a 

homogeneous liquid internally colourless. By Sir 

John 

Frederick William Herschel, Philosophical Translation 

of the Royal Society of London (1845) 135:143–145. 

Received January 28, 1845 — Read February 13, 1845 

“Though perfectly transparent and colorless when held between 

the eye and the light, or a white object, it yet exhibits in certain 

aspects, and under certain incidences of the light, an extremely 

vivid and beautiful celestial blue color, which, from the 

circumstances of its occurrence, would seem to originate in 

those strata which the light first penetrates in entering the 

liquid, and which, if not strictly superficial, at least exert their 

peculiar power of analyzing the incident rays and dispersing 

those which compose the tint in question, only through a very 

small depth within the medium.” 


3

Povijest 

metode: 

George 

Stokes 

On the Change of Refrangibility of Light. By G. G. 

Stokes, M.A., F.R.S., Fellow of Pembroke College, 

and Lucasian Professor of Mathematics in the 

University of Cambridge. Phil. Trans. Royal 

Society of London (1852) pp. 463-562. 

Received May 11, — Read May 27, 1852. 

“It appears from the experiments of Sir John Herschel that 

the blue color comes only from a stratum of fluid of small 

but finite thickness adjacent to the surface by which the 

light enters. After passing through this stratum, the 

incident light, though not sensibly enfeebled nor coloured, 

has lost the power of producing the same effect, and 

therefore may be considered as in some way or other 

qualitatively different from the original light." 




4

Povijest metode: 

Aleksandar Jablonski 

Professor Alexander Jablonski, who is regarded 

as the father of fluorescence spectroscopy 

because of his many accomplishments, including 

descriptions of concentration depolarization and 

defining the term "anisotropy" to describe the 

polarized emission from solutions 

2010.05.26 9 

Povijest metode: 

Aleksandar Jablonski 

His work continued beyond his retirement in 

1968. Professor Jablonski created a 

spectroscopic school of thought that persists 

today through his numerous students, who 

now occupy positions at universities in Poland 

and elsewhere. Professor Jablonski died on 

September 9, 1980. 


5

Pitanja 

1. Ko je prvi opisao fenomen fluorescencije? 

2. Što je Stokesov efekt? 

3. Što je Jablonski dijagram? 

Ponovite prethodni materijal ako ne možete 

odgovoriti na pitanja 


Ukratko 

1. Udžbenici 





6



Elektronski prelazi 

Frack-Condonov dijagram: 

Slika prikazuje apsorpciju 

zračenja iz osnovnog 

elektronskog stanja (E 0 ) u 

drugo vibracijsko stanje 

(v'=2) pobuñenog 

elektronskog stanja (E 1 ). 

Emisija fotona je iz (v'=0) u 

drugo vibracijsko stanje 

osnovnog elektronskog 

stanja (v”=2). 


(from Wikipedia) 

7




Singlet state: All electrons in the molecule are spin-paired 

Triplet state: One set of electron spins is unpaired 


8



Beer-Lambertov zakon 

l 


9


dI 

dz 

= − Iσ 

N 

Promjena intenziteta svijetla po dubini dI/dz 

proporcionalna je intenzitetu upadnog svijetla I, 

udarnom presjeku σ i broju molekula N po cm 3 



dI 

I 

I 

I0 0 

I 

log 

ln = − σ Nl 

log 

b 

x = 

I 

log 

0 

I 

log x 

( − log e)ln = σ Nl log e ln x = 

I 

log e 

I 

log 

I 

= −σ 

N dz 

0 

l 

dI 

du 

= − σ N dz = ln u + C 

I 

u 

∫ ∫ ∫ 

= εlc 

= A 

2009.05.28 0 

Zeljko Jericevic, Ph.D. 20 

k 

k 

x 

b 

10

A 

T 


0 

= log = ε 

= 

I 

I 

0 

I 

I 

=10 

-A 

lc 

A je apsorbancija 

(ekstinkcija | optička 

gustoća) 

ε je molarni koeficijent 

apsorbancije 

c je koncentracija 

T je transmitacija 


Ograničenja za Beer-Lambertov 

zakon 

Beer-Lambertov zakon vrijedi za 

koncentracije kod kojih je meñusobna 

interakcija molekula zanemariva 

(c < 0.01 mol/l) 

Raspršenje svijetla smatra se zanemarivim 


11

Pitanja 

1. Objasni razliku izmedu tripleta i singleta 

2. Što je Franck-Condonov princip? 

3. Izvedi Beer-Lambertov zakon 

4. Što je apsorbancija a što transmitacija? 

5. Koje su limitacije Beer-Lambertova zakona? 




Instrumentacija za fluorescenciju 


12





13

Tipični fluorofori 


Apsorpcija i emisija 

(zrcalna simetrija A&E) 


14


(izuzeci zrcalne simetrije) 

HPTS 

1-hydroxypyrene-3,6,8-trisulfonate) 

U pobuñenom stanju 

ionizacija OH grupe je 

favorizirana 




Stvaranje “charge transfer 

complex” izmeñu antracena i 

anilina dovodi do promjene 

emisionog spektra 


15



Stvaranje “charge 

transfer complex” 

izmedu molekula pirena 

dovodi do promjene 

emisionog spektra 

(6x10 -3 do 9x10 -5 M) 


Kvantno iskorištenje 


16

Kvantno iskorištenje 

Γ 

Q = Γ + k 

Q 

Γ 

k 

nt 

nt 

je kvantno iskoristenje 

je konstanta brzine depopulacije pobudenog stanja emisijom fotona 

je konstanta brzine depopulacije pobudenog stanja nefotonskim procesima 


Kvantno iskorištenje i vrijeme 

života 

Teški atomi 

poput I tipično 

rezultiraju u 

kraćem 

vremenu života 

i nižem 

kvantnom 

iskorištenju 


17

Kvantno iskorištenje i vrijeme 

života 

1 

τ = Γ + k 

τ 

nt 

je vrijeme zivota pobudenog stanja 

1 

= 

Γ 

za k = 0 

τ 

τ 

n 

= 

Q 

τ τ postaje prirodno vrijeme zivota τ 

n nt n 




18

Fluorofori, kvantno 

iskorištenje 

• Compound Solvent Exc Em QYield 

• Acridine_Orange Ethanol 493 535 0.46 

• Benzene Ethanol 248 300-350 0.04 

• Chlorophyll-A Ethanol 440 685 0.23 

• Eosin Water 521 544 0.16 

• Fluorescein Water 437 515 0.92 

• Rhodamine-B Ethanol 555 627 0.97 


Gašenje fluorescencije 


19

Osjetljivost fluorofora na okoliš 

Tyr (slobodni) 

_______ 

Tyr u kalmodulinu & Ca ----------- 

Tyr u kalmodulinu, no Ca ………... 


Osjetljivost fluorofora na okoliš 

Apomioglobin (ima 

hidrofobni džep za hem) 

Model membrane DMPC 

dimyristoyl-l-α-phosphatidylcholine 

Voda 


20

Osjetljivost 

fluorofora na okoliš 

Dostupnost florofora 

molekulama koje gase 

fluorescenciju. Q je ion I - 


Pitanja 

1. Što su florofori? 

2. Što je kvantno iskoristenje? 

3. Što je vrijeme života florofora? 

4. Što je spektralno prekrivanje? 




21

Fluorescentna anizotropija 


Fluorescentna anizotropija 

Efekt asocijacije 

proteinskih molekula i 

mikroviskoziteta 

membrane na 

anizotropiju 

fluorescencije 


22

Fluorescentna anizotropija i 

polarizacija 

r 

= 

I 

|| ⊥ 

I|| 

+ 2I⊥ 

I|| 

− I⊥ 

P I I 

= 

|| 

− I 

+ 

⊥ 

anizotropija 

polarizacija 


RET 


23

RET 

1 

Efikasnost = 

⎛ r ⎞ 

1+ ⎜ ⎟ 

⎝ R0 

⎠ 

Tyr-heme 2.5 

Trp-heme 2.8 

Tyr-DNS 

2.0 

Trp-DNS 2.0 

Trp-ANS 2.2 

DNS-DNS 0.9 

DNS-heme 6.0 

Tyr-NADH 2.5 

2009.05.28 Zeljko Jericevic, Ph.D. Trp-NADH 2.5 47 

Flu-Rho 

4.5 

6 

Donor-Acceptor R 0 nm 

Phe-Phe 

0.6 

Phe-Tyr 

1.4 

Tyr-Tyr 

0.8 

Tyr-Trp 

1.5 

Trp-Trp 

0.6 

RET 


24

RET 


RET 


25

Stacionarna fluorescencija i 

fluorescencija u vremenu 


Fluorescencija u vremenu (kinetika 1 reda) 

dF( t) 

− = F( t) 

k 

dt 

F 

dF( t) 

F( t) 

F (0) 0 

du 

= − k dt = ln u + C 

u 

F( t) 

ln F( t) − ln F(0) = ln = −kt 

F(0) 

F( t) = F(0) 

e − 

t 

∫ ∫ ∫ 

kt 


26

Fluorescencija u vremenu (kinetika 1 

reda) 

Vrijeme života τ=1/k 

Svojstveno vrijeme života τ 0 =1/k (pretpostavlja Q=1) 

F 

( τ ) = 

F 

(0) 

e 


Biokemijski flurofori 


27

Kovalentno vezani 

flurofori 


Flurescentni indikatori 


28

Asocijacija 


Multifotonska pobuda 


29

Ukratko 

1. Udžbenici 





Zadatak: 

Povući i pročitati poglavlje 2 iz: 

Joseph R. Lakowicz 

“Principles of Fluorescence Spectroscopy” 

3rd ed., 2006, XXVI, 954 p. 1255 illus., 1210 in 

color., ISBN: 978-0-387-31278-1 

http://www.springer.com/chemistry/analytical/book 

/978-0-387-31278-1 


30

Shema fluorescentnog spektroskopa 


Instrumenti za tehnike visoke 

učintkovitosti 


31

Idealni spektrometar 


Izvori pobude 


32

Izvori pobude 


Izvori pobude 


33

Optički filteri 


Fotomultiplikator kao detektor 


34

Materijali za 

fotomultiplikator 


Fotomultiplikator 


35

Fotomultiplikat 

or 


Polarizacija 

svjetla 


36

Greške kod 

mjerenja 


37

Fluorescencija - TehniÄki fakultet u Rijeci

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?

Fluorescencija - TehniÄki fakultet u Rijeci