Oznaczanie masy czÄ steczkowej białek metodÄ filtracji żelowej

POLITECHNIKA ŚLĄSKA
WYDZIAŁ CHEMICZNY
KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ
I BIOTECHNOLOGII
ĆWICZENIE 4
Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą
filtracji żelowej
Laboratorium z Chemii Związków
Naturalnych
Miejsce ćwiczenia: sala 102
Prowadzący: dr inż. Ilona WANDZIK
Opracowanie: dr inż. Ilona WANDZIK

Ćwiczenie 4. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą filtracji żelowej 2/11
1. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest oznaczenie masy cząsteczkowej α-amylazy metodą filtracji żelowej.
Ćwiczenie składa się z dwóch zasadniczych części:
• wykalibrowania kolumny Sephadex G-75 za pomocą makrocząsteczek o znanej masie
cząsteczkowej (błękit dekstranowy, hemoglobina, witamina B-12, cytochrom C).
• użycie wykalibrowanej kolumny do oznaczenia masy cząsteczkowej wybranego białka.
2. Wstęp teoretyczny
Polipeptydy i białka
Polipeptydy i białka są polimerami wielkocząsteczkowymi złożonymi z α-aminokwasów.
Pojedyncze cząsteczki α-aminokwasów połączone są ze sobą wiązaniami amidowymi
(peptydowymi). Wiązanie peptydowe powstaje w ten sposób, że grupa aminowa jednego
aminokwasu łączy się z grupą karboksylową drugiego z wydzieleniem cząsteczki wody.
H
O
H
O
H
O
H
O
N
CH
C N CH C
N
CH
C
N
CH
C
R
R'
Liczbę powiązanych aminokwasów (długość łańcucha) można z pewnym przybliżeniem
określić przez oznaczenie masy cząsteczkowej białka. Przyjmuje się, że średnia masa
cząsteczkowa aminokwasu wynosi 115 Da. Polimery aminokwasów o masie cząsteczkowej
do 10 000 są zaliczane do polipeptydów, natomiast polimery o masie cząsteczkowej
przekraczającej tą wartość zalicza się do białek. Masę cząsteczkową białek i innych
makrocząsteczek poza metodą spektrometrii masowej można oznaczyć m. in.: metodą
sedymentacji w ultrawirowaniu, metodą elektroforezy lub filtracji żelowej. Masy
cząsteczkowe białek wahają się w granicach od ok. 11,5 kDa do wielu milionów Daltonów.
Przykładowe masy cząsteczkowe białek najczęściej stosowanych jako markery masy
cząsteczkowej przedstawia Tabela 1.
R"
R
Tabela 1. Masy cząsteczkowe białek – markerów.
Białko
Masa cząsteczkowa (Da)
α-lactalbumin z mleka krowiego 14 200
Lizozym z jaja kurzego 14 300
Mioglobina 15 000
Inhibitor trypsyny z soi 20 100
Anhydraza węglanowa 29 000
Albumina jaja kurzego 45 000
α-amylaza z Bacillus species 53 000
Hemoglobina 68 000
Albumina surowicy wołowej 67 000
Fosforylaza B z mięśni królika 94 000
β-galaktozydaza z Escherichia coli 116 000
Miozyna z mięśni królika 205 000
Blue Dextran 2 000 000
Cytochrom C
Witamina B-12
Błękit tymolowy
12 400
1 355
483

Ćwiczenie 4. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą filtracji żelowej 3/11
Istnieje kilka sposobów klasyfikacji białek, z których najbardziej rozpowszechniony dzieli
białka ze względu na budowę na białka proste i złożone. Białka proste zbudowane są z
łańcuchów polipeptydowych, które po hydrolizie dają wyłącznie aminokwasy lub ich
pochodne. Białka złożone składają się z cząsteczki białka prostego połączonego z inną,
niebiałkową cząsteczką, zwykle organiczną (tzw. grupą prostetyczną) z udziałem wiązań
kowalencyjnych, jonowych i koordynacyjnych.
Ze względu na kształt cząsteczki, wyróżnia się białka włókniste (fibrylarne) i kłębuszkowe
(globularne). Białka fibrylarne są podstawowymi elementami budowy tkanek zwierzęcych,
charakteryzują się znaczną asymetrią cząsteczek, tj. dużym stosunkiem długości osi długiej
do krótkiej. Białkami globularnymi są enzymy, przeciwciała i niektóre hormony. Białka
globularne mają kształt eliptyczny i zazwyczaj dobrze rozpuszczają się w wodzie.
Białka można oczyszczać w formie aktywnej wykorzystując ich właściwości
fizykochemiczne, takie jak:
• wielkość,
• ładunek,
• rozpuszczalność,
• specyficzne powinowactwo wiązania do innych cząsteczek.
Techniką wykorzystywaną do rozdziału makrocząsteczek jest chromatografia. Głównie
stosowane typy chromatografii to:
• filtracja żelowa; rozdział następuje z uwagi na rozmiar cząsteczek,
• chromatografia jonowymienna; wykorzystuje się różnice w ładunku wypadkowym
odmiennych cząsteczek białkowych
• chromatografia powinowactwa; wykorzystuje się powinowactwo białek do
specyficznych grup chemicznych,
• wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa; usprawnia wcześniej wymienione
metody chromatograficzne.
Przedmiotem ćwiczenia jest oznaczanie masy cząsteczkowej M CZ białek metodą filtracji
żelowej, dlatego tylko ta technika zostanie omówiona w instrukcji.
Chromatografia metodą filtracji żelowej.
Filtracja żelowa, inaczej chromatografia rozmiarów wykluczających jest techniką mającą
zastosowanie preparatywne do oczyszczania białek lub innych makrocząsteczek. Ponadto za
pomocą filtracji żelowej można oznaczać masę cząsteczkową białek i innych biopolimerów.
W filtracji żelowej:
• Kryterium rozdziału makrocząsteczek jest ich wielkość.
• Większe cząsteczki wymywane są z kolumny jako pierwsze.
• Mniejsze cząsteczki wymywane są z kolumny jako ostatnie.
Dlaczego makrocząsteczki o różnych M CZ wymywane są z różną szybkością?
Zasada separacji przedstawiona na Rysunku 1 oparta jest na wykorzystaniu porowatości
wypełnienia kolumny. Wypełnienie takie zawiera liczne mikroskopijne kanaliki lub pory o
powtarzalnej wielkości. Po naniesieniu na kolumnę rozdzielanych substancji, następuje
wymywanie poszczególnych składników mieszaniny za pomocą buforu wymywającego.
Względnie małe cząsteczki mogą przemieszczać się pomiędzy ziarnami złoża lub wnikać do

Ćwiczenie 4. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą filtracji żelowej 4/11
wewnątrz porów. Z kolei większe cząsteczki mogą tylko przemieszczać się pomiędzy
ziarnami złoża. Jeśli jakaś cząsteczka wniknie w głąb pora jej przemieszczanie w dół
kolumny zostaje spowolnione, gdyż przepływ buforu wymywającego wewnątrz ziaren jest
dużo wolniejszy niż na zewnątrz. A zatem cząsteczki znajdujące się w mieszaninie ulegają
podziałowi pomiędzy fazy V O (poza ziarnami złoża) i V I (wewnątrz ziaren złoża, w porach
żelu).
Próbka białka
Ziarno złoża
Małe cząsteczki zatrzymywane
są w porach ziaren
Małe cząsteczki wymywane
jako ostatnie
Duże cząsteczki wymywane
jako pierwsze
Rysunek 1. Chromatografia na drodze filtracji żelowej
Podstawowe oznaczenia:
V E Objętość elucji
V O Objętość swobodna (martwa), czyli objętość cieczy zalegającej między ziarenkami żelu
V T Objętość całkowita
V M Objętość samego żelu
Objętość wewnętrzna, objętość cieczy zawartej w porach żelu
V I
Eluent – rozpuszczalnik stosowany do wymywania (elucji) składników mieszaniny z
kolumny chromatograficznej
Eluat - roztwór wypływający z kolumny chromatograficznej, eluent wraz z rozpuszczonymi
w nim składnikami rozdzielanej chromatograficznie mieszaniny.
Objętość cieczy poza złożem nazywana jest objętością swobodną i oznaczana V O. Objętość
swobodną V O można wyznaczyć przepuszczając przez kolumnę substancję barwną o bardzo
dużej masie cząsteczkowej, która w ogóle nie wniknie do porów. Najczęściej stosuje się
błękit dekstranowy, polisacharyd o masie cząsteczkowej rzędu 2*10 6 Da. Mierzy się ilość
wycieku od chwili naniesienia próbki do momentu jej wyjścia z kolumny. Z kolei V I można
wyznaczyć, przepuszczając przez kolumnę substancję barwną o bardzo małej masie
cząsteczkowej. Całkowitą objętość utworzonego wypełnienia można określić wzorem:
V T = V O + V I + V M
gdzie V M oznacza objętość samego żelu, którą jako znacznie mniejszą od pozostałych pomija
się.

Ćwiczenie 4. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą filtracji żelowej 5/11
Wyznaczanie objętości elucji V E składników mieszaniny
Zazwyczaj wyciek z kolumny zbierany jest w postaci frakcji o określonej objętości. W
większości przypadków wymywane makrocząsteczki nie są barwne, a zatem zachodzi
konieczność oznaczenia, które frakcje zawierają białko i w jakiej ilości. Oznaczenia takiego
należy dokonać za pomocą innych technik, jak np. analiza spektrofotometryczna frakcji,
elektroforeza w warunkach denaturujących lub pomiar aktywności enzymatycznej
poszczególnych frakcji (gdy oznaczane białko jest enzymem i znany jest jego substrat). W
przypadku substancji barwnych jako V E można przyjąć środkową wartość objętości pomiędzy
pierwszą i ostatnią zebraną kroplą barwnego wycieku z kolumny. Oznaczone stężenia
makrocząsteczek przedstawia się w funkcji objętości elucji (Rysunek 2)
Stężenie
Rysunek 2. Stężenie poszczególnych składników w funkcji objętości elucji
Podczas filtracji próbki złożonej z kilku składników o zróżnicowanych wielkościach, duże
cząsteczki będą sporadycznie wnikały do porów, ale zostaną wymyte z kolumny później w
stosunku do błękitu dekstranowego. Z kolei małe cząsteczki, które będą regularnie wnikały do
porów żelu opuszczą kolumnę jako ostatnie. Im mniejsza cząsteczka tym łatwiej będzie
zatrzymywana na żelu. A zatem rozmiar cząsteczek decyduje o objętości elucji danej
substancji V E . Rozmiar geometryczny cząsteczki skorelowany jest z masą cząsteczkową.
Doświadczalnie wyznaczono zależność masy cząsteczkowej w funkcji objętości elucji V E . W
pewnym zakresie mas cząsteczkowych otrzymuje się wykres liniowy:
logM CZ = a + b*V E /V O
V E
log Mcz
7
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30
względna objętość elucji Ve/Vo
Rysunek 3. Zależność masy cząsteczkowej od objętości elucji

Ćwiczenie 4. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą filtracji żelowej 6/11
Objętość elucji jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu z M CZ . Można sporządzić krzywą
wzorcową dla białek o znanej masie cząsteczkowej – markerów, a następnie po wyznaczeniu
współczynników a i b charakterystycznych dla danego wypełnienia wyznaczyć masę
cząsteczkową nieznanego białka (Rysunek 3).
Na rynku istnieje wiele wypełnień kolumnowych do przeprowadzenia filtracji żelowej. Są to
wypełniacze węglowodanowe (dextran, agaroza) lub poliakryloamidowe. Najczęściej
stosowanymi żelami do tej chromatografii są preparaty o nazwach handlowych: Sephadex,
Sepharose i Biogel.
Wybór wypełnienia zależy od wielkości cząsteczek, które będą rozdzielane w procesie
filtracji. Zestawienie kilku przykładowych wypełnień typu dekstranowego i ich
charakterystykę przedstawia Tabela 2. Wypełnienie nanoszone na kolumnę w zawiesinie w
buforze przypomina żel, stąd nazwa filtracja żelowa. Do przygotowania zawiesiny w buforze
nie należy używać mieszadeł magnetycznych, gdyż to może spowodować fragmentację złoża.
Przed nałożeniem żelu na kolumnę należy żel spęcznić (czas pęcznienia 24 h w przypadku
Sephadexu G-75). Po nałożeniu żelu na kolumnę należy sprawdzić upakowanie żelu. Gdy żel
jest prawidłowo ułożony, substancja barwna, na przykład błękit dekstranowy wypływa w
postaci regularnego nie rozmytego pasma. Objętość próbki nanoszonej w przypadku
frakcjonowania powinna wynosić około 2% objętości całkowitej kolumny.
Tabela 2. Charakterystyka wypełnień do filtracji żelowej.
Nazwa
Zakres M CZ (Da)
Przybliżona objętość
utworzonego wypełnienia
(ml/g)
Sephadex G-15

Ćwiczenie 4. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą filtracji żelowej 7/11
Przykładowe pytania kontrolne:
Na czym oparta jest zasada separacji substancji w filtracji żelowej?
Do jakich celów ma zastosowanie filtracja żelowa?
W doświadczeniu przyjęto założenie dotyczące kształtu cząsteczki, jakie?
Objętość elucji wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej substancji będzie się zwiększała czy
zmniejszała?
Gdyby cząsteczki podczas separacji oddziaływały z wypełnieniem to odczytana z wykresu
masa cząsteczkowa będzie zawyżona czy zaniżona?
Niesferyczne, podłużne cząsteczki będą ulegały wymywaniu szybciej czy wolniej od
sferycznych?
Dlaczego objętość elucji przedstawiona jest na wykresie jako wartość względna V E /V O ?
Na czym polega test na obecność α-amylazy?
Opisz budowę białek.

Ćwiczenie 4. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą filtracji żelowej 8/11
3. Wykonanie ćwiczenia
Materiały i sprzęt
Kolumna Sephadex G-75 o wymiarach 1 cm x 30 cm
Statywy na probówki wirówkowe
Statywy na probówki szklane
Probówki wirówkowe pojemności 2 ml
Probówki szklane
Pipeta P1000 (niebieskie końcówki)
Pipeta P200 (żółte końcówki)
Końcówki do pipet
Cylinder miarowy pojemności 50 ml
Łaźnia wodna 45 O C
Spektrofotometr UV
Odczynniki
Bufor fosforanowy pH 6.6
Mieszanina wzorcowa do separacji: 0.6 mg błękitu dekstranowego, 1.0 mg hemoglobiny, 0.15
mg błękitu tymolowego w 0.5 ml buforu fosforanowego
używanego do elucji
Roztwór nieznanej α-amylazy w 0. 5 ml buforu elucyjnego
Test na obecność α-amylazy: 0.2% roztwór skrobii
1 M roztwór HCl
odczynnik Lugola
1. Do dwóch małych statywów przygotuj po 15 ponumerowanych mikroprobówek
wirówkowych o pojemności 2 ml do zbierania wycieku z kolumny (seria czarna lub
czerwona).
2. Otwórz kranik wylotowy z kolumny i usuń bufor fosforanowy do zlewki tak, aby poziom
cieczy znajdował się 0.5 cm powyżej górnej granicy złoża.
3. Nanoszenie próbki. Bardzo delikatnie wprowadź końcówkę pipety automatycznej P1000
(niebieskie końcówki) nieco poniżej poziomu cieczy i zadozuj 0.5 ml mieszaniny
wzorcowej dostarczonej przez prowadzącego.
4. Elucja. Umieść pierwszy odbieralnik u wylotu kolumny, otwórz kranik wylotowy i
zbieraj frakcje o pojemności 2 ml (górna kreska na probówce). Gdy strefa próbki wniknie
całkowicie w złoże dodaj ostrożnie za pomocą pipety dodatkową porcję buforu
fosforanowego pH 6.6. Kolejną porcję dodaj z cylindra (razem około 30 ml buforu).
Uwaga: podczas dolewania buforu i nanoszenia próbki uważaj, aby nie naruszyć
powierzchni żelu. Nigdy nie pozwól, aby poziom cieczy spadł poniżej górnej granicy
złoża.
5. Gdy wszystkie barwne składniki zostaną wymyte z kolumny przemyj kolumnę dodatkową
porcją buforu (5-10 ml). Zakręć kurek wylotowy, gdy poziom cieczy będzie znajdował się
1 cm powyżej górnej granicy złoża.
6. Analiza spektrofotometryczna frakcji.
Zawartość barwnych wycieków przenieś bezpośrednio do kuwety pomiarowej Przed
pomiarem absorbancji do kuwety dodaj dokładnie 1 ml buforu fosforanowego pH 6.6.
Pamiętaj, aby przed każdą serią wyzerować aparat umieszczając w komorze roztwór
odnośnikowy: bufor fosforanowy pH 6.6.
Dokonaj pomiaru absorbancji przy następujących długościach fal:

Ćwiczenie 4. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą filtracji żelowej 9/11
błękit dekstranowy: λ =650 nm (Uwaga: jeśli frakcja błękitu dekstranowego będzie
zawarta w jednym odbieralniku to nie wykonuje się
oznaczenia spektrofotometrycznego).
hemoglobina: λ =462 nm
witamina B-12: λ =380 nm
błękit tymolowy: λ =520 nm
7. Nanoszenie próbki nieznanej α-amylazy. Nanieś 0.5 ml roztworu zawierającego
nieznane białko, dostarczonego przez prowadzącego. Przeprowadź elucję buforem
fosforanowym pH 6.6, zbierając 2 ml frakcje do mikroprobówek wirówkowych. Po
zebraniu frakcji odpowiadającej objętością elucji składnika o najmniejszej masie
cząsteczkowej z poprzedniego doświadczenia zakończ elucję. Wykonaj test na obecność
α-amylazy. Wyznacz objętość elucji odpowiadającą frakcji o maksymalnym stężeniu
białka.
Test na obecność α-amylazy:
Przygotuj w statywie ponumerowane probówki szklane (odpowiednio seria czarna i
czerwona). Numer probówki szklanej odpowiada numerowi frakcji wycieku z kolumny.
Do każdej probówki dodaj 1 ml 0.2% roztworu skrobii oraz 1 ml buforu fosforanowego
pH 6.6. za pomocą pipety P1000 (niebieskie końcówki). Następnie wprowadź 50 µl
każdej frakcji zebranej z kolumny. Do odmierzania 50 µl (0.05 ml) użyj pipety P200
(żółte końcówki). Statyw z probówkami szklanymi umieść w łaźni wodnej o temperaturze
45 O C i termostatuj 5 minut. W zlewce przygotuj 20 ml odczynnika Lugola z 1 M kwasem
solnym (1:1, v:v). Wyjmij statyw z probówkami na bibułę i szybko dodaj do wszystkich
probówek po 1ml zakwaszonego odczynnika Lugola.
Wizualnie oznacz frakcje zawierające α-amylazę. Test pozytywny: odbarwienie
ciemnoniebieskiego roztworu. Test negatywny: ciemnoniebieskie zabarwienie roztworu.
Na spektrofotometrze Cecil dokonaj pomiaru absorbancji przy długości fali λ=610 nm.
Oznaczenie wykonaj tylko dla frakcji zawierających α-amylazę (roztwory o różnym
stopniu odbarwienia roztworu). Zawartość probówek przenieś bezpośrednio do kuwety.
Pamiętaj, aby najpierw wyzerować aparat umieszczając w komorze roztwór
odnośnikowy: bufor fosforanowy pH 6.6.
Uwaga: do płukania cylindrów miarowych, probówek zawsze używaj wody
destylowanej.
8. Po zakończeniu doświadczenia kolumnę przemyj buforem fosforanowym pH 6.6 (użyj
około 25 ml buforu). Wszystkie probówki umyj dokładnie przy użyciu szczoteczek i
przemyj wodą destylowaną. Opis oznaczający numer probówki szklanej zmyj acetonem
(nie usuwaj numerów z mikroprobówek wirówkowych). Roztwory po analizach oraz
wyciek z kolumny wylej do zlewu.
9. Wyniki zanotuj w karcie pracy. Na papierze milimetrowym sporządź wykres absorbancji
każdej analizowanej frakcji w funkcji numeru porządkowego frakcji. Wykres wykonaj dla
trzech cykli jednocześnie. Zaznacz długość fal, przy których dokonywano pomiaru.
Wyznacz maksimum każdego piku i odczytaj odpowiadającą mu objętość elucji
(pamiętaj: każda frakcja zawiera 2 ml).
10. Sporządź wykres logM cz w funkcji V E /V O dla mieszaniny wzorcowej. Odczytaj logM cz dla
nieznanego białka i oblicz jego masę cząsteczkową.
11. Wyznaczenie objętości wypełnienia. Do pustej kolumny o takich samych wymiarach jak
użyta w doświadczeniu wlej ilość wody odpowiadającej poziomowi wypełnienia.
Następnie zmierz objętość wody w cylindrze miarowym.

Ćwiczenie 4. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą filtracji żelowej 10/11
12. Wyznaczenie objętości całkowitej V T . Przyjmując za V I objętość elucji składnika
wymywanego jako ostatniego oblicz objętość całkowitą utworzonego wypełnienia V T ze
wzoru:
V T = V O + V I + V M
Uwaga: przyjmij, że objętość samego żelu V M ≈0.25 ml.
Warunki zaliczenia ćwiczenia:
• Pozytywny wynik kartkówki dopuszczającej do wykonania ćwiczenia
• Wykonanie sprawozdania w terminie do dwóch tygodni. Sprawozdanie powinno
zawierać dwa wykresy na papierze milimetrowym: zależność absorbancji w funkcji
numeru porządkowego frakcji oraz krzywą wzorcową (wykres logM CZ w funkcji
V E /V O ). Z krzywej wzorcowej odczytaj masę cząsteczkową nieznanej α-amylazy.
Ponadto należy obliczyć objętość całkowitą wypełnienia. Do sprawozdania należy
dołączyć kartę pracy.
Zalecana literatura:
J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, PWN, Warszawa, 78-82 (2005).
S. Milewski, Biochemia, skrypt Politechniki Gdańskiej, 137-140.
L. Kłyszejko-Stefanowicz Ćwiczenia z biochemii, PWN Warszawa, 137-147; 246-251 (1999).

Ćwiczenie 4. Oznaczanie masy cząsteczkowej białek metodą filtracji żelowej 11/11
Karta pracy
I. Kalibracja kolumny (seria.............................)
Mieszanina do przygotowania krzywej wzorcowej:
Objętość: 0.750 ml
Składnik 1: Błękit dekstranowy: 0.6 mg
Składnik 2: Hemoglobina: 1.0 mg
Składnik 3:........................................................ ..............mg
Osoby wykonujące doświadczenie:
.......................................................
.......................................................
.......................................................
.......................................................
.......................................................
.......................................................
Ilość zebranych frakcji o pojemności 2 ml:.............
Analiza wycieku z kolumny:
Składnik
Frakcja
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
+ / -
1 absorbancja
λ= 650 nm
+ / -
2 absorbancja
λ= 462 nm
+ / -
3 absorbancja
λ= .....nm
Objętość elucji:
V O = V 1 = .........ml
V 2 = .........ml
V 3 = .........ml
II. Oznaczanie masy cząsteczkowej nieznanej α-amylazy
Ilość zebranych frakcji o pojemności 2 ml:.............
Analiza wycieku z kolumny:
Składnik
Frakcja
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
A
+ / -
absorbancja
λ= 610 nm
Objętość elucji nieznanego białka: V A = ...........ml.