dim. – skr. z l. dimidius polovica. Dimastigamoeba ... - datasolution.sk

s nimi. Na rozrušenie väzby NK s bielkovinami sa pouţívajú org. Rozpúšťadlá (fenol, chloroform,
močovina ap.). na potlačenie aktivity nukleáz (enzýmov štiepiacich DNA) slúţia inhibítory –
polyamíny (spermidín, putrescín). Pri izolácii DNA z krvi sa pouţívajú aj antikoagulanty (EDTA).
DNA moţno získať z periférnej krvi, choriových klkov, vlasových korienkov, bukálnej sliznice
získaných výplachom úst, rôznych tkanív, ako aj baktérií. Vzorky periférnej krvi odobraté do
skúmaviek s EDTA sa majú zmraziť najneskôr do 3 h a skladovať pri teplote – 20 °C, príp. sa
získava vzorka z tkaniva fixovaného vo formalíne al. histol. parafínových bločkov.
Najčastejšie pouţívanou metódou izolácie DNA je fenol-chloroformová extrakcia z bunkového
lyzátu (sodium dodecylsulfát/proteínkináza K) a vysoľovacia metóda. Postup izolácie DNA
poyostáva z týchto krokov: 1. lýza buniek; 2. inhibícia nukleáz; 3. rozklad nukleoproteínového
komplexu; 4. odstránenie proteínov a vyzráţenie DNA. Pri izolácii RNA sa po deštrukcii bunkových
membrán pouţíva ultracentrifugácia v gradiente s CsCl. RNA utvorí pelet, DNA a proteíny zostanú
nad vrstvou CsCl. Etanolový precipitát sa uchováva pri teplote – 20 °C, vodný roztok pri – 70 °C.
Koncentrácia a čistota získanej DNA a RNA sa určuje spektrofotometricky al. elektroforeticky. NK
majú maximum absorpcie pUV svetla pri 260 nm, jednovláknová DNA dáva o 20 – 30 % väčšiu
absorbanciu ako dvojvláknová.
Zákl. metóda, kt. umoţňuje identifikáciu a triedenie úsekov DNA je gélová elektroforéza. Vzorky
DNA získané z buniek sa na štiepia („strihajú“) na fragmenty reštrikčnými enzýmami
(endonukleázami). Je známe veľké mnoţstvo baktériových endonukleáz (asi 2500). Prirodzenou
funkciou reštrikčných enzýmov je ochrana baktérií pred cudzou (napr. bakteriofágovou) DNA, kt.
vnikla do ich buniek. Reštrkičný enzým štiepi DNA na rôzne dlhé fragmenty, pretoţe rozštiepi DNA
vţdy, keď nájde svoj palindróm.
Pri elektroforéze postúpi fragment DNA v géli od štartu tým ďalej, čím je kratší. Poloha fragmentu
sa zviditeľňuje farbením (v agarózovom géli napr. fluorescenčným farbivom etídiumbromidom. Na
transluminátore sa potom porovnáva dĺţka fragmentu v UV svetle s markerom a odfotografuje
(skupin jednotlivých fragmentov sú viditeľné ako jasnooranţové pásiky).
Rozdelené fragmenty sa denaturujú a pomocou vzlínania kvapaliny prepijakújú (blottujú) na
membránu (nitrocelulóza al. nylón), ktorá prepustí tekutinu, ale fragmenty DNA sa v nej zachytia.
Kvantitatívna analýza fragmentov sa uskutočňuje autorádiograficky pomocou nadviazania
(hybridizácie) rádioaktívne značenej sondy.
Analýza DNA umoţňuje dg. porúch genetického kódu a prítomnosť určitých úsekov (sekvencie)
v DNA. K najdôleţitejším metodam analýzy DNA patria: 1. hybridizácia so značenou sondou (sonda
je úsek dvojvláknovej DNA al. RNA, ktorého sekvenciu dusíkových báz poznmáme a je označená
napr. rádioaktívnym izotopom, aby sme mohli dokázať jej nadviazanie na príslušný komplementárny
úsek DNA); 2. polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov (restriction fragment length
polymorphism, RFLP) a variabilný počet za sebou idúcich opakovaní (variable number of transition
repetition), pri kt. sa pouţívajú reštrikčné enzýmy alebo polymerázozu reťazová reakcia (polymerase
chain reaction, PCR); 3. sekvenovanie DNA – určenie poradia nukleotidov (dusíkových báz) vo
vybranom úseku DNA (fragmente).
Príkladom vyuţitia hybridizácie so sondou je dg. kosáčikovej anémie, pri kt. je zmenená jediná zo
146 aminokyselín v -globínovom reťazci hemoglobínu (v pozícii 6 je kys. glutámová nahradená
valínom).
Metóda RFLP má význam pri odhaľovaní nositeľov recesívnych mutácií (alel).
Určenie prítomnosti a počtu istého typu opakovaných sekvencií sa pouţíva pri identifikácii jedinca
v súdnom lekárstve (tzv. fingerprint), pri paternitných sporoch a na dg. niekt. chorôb.
139