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兔 子 可 溶 性 血 管 细 胞 粘 附 分 子 1(sVCAM-1) 酶 联 免 疫 分 析 试 剂 盒 使 用 说 明 书
本 试 剂 盒 仅 供 体 外 研 究 使 用
预 期 应 用
ELISA 法 定 量 测 定 兔 子 血 清 、 血 浆 、 细 胞 培 养 上 清 或 其 它 相 关 生 物 液 体 中 可 溶 性 血 管 细 胞
粘 附 分 子 1(sVCAM-1) 含 量 。
实 验 原 理
用 纯 化 的 抗 体 包 被 微 孔 板 , 制 成 固 相 载 体 , 往 包 被 抗 sVCAM-1 抗 体 的 微 孔 中 依 次 加 入 标 本
或 标 准 品 、 生 物 素 化 的 抗 sVCAM-1 抗 体 、HRP 标 记 的 亲 和 素 , 经 过 彻 底 洗 涤 后 用 底 物 TMB
显 色 。TMB 在 过 氧 化 物 酶 的 催 化 下 转 化 成 蓝 色 , 并 在 酸 的 作 用 下 转 化 成 最 终 的 黄 色 。 颜 色
的 深 浅 和 样 品 中 的 sVCAM-1 呈 正 相 关 。 用 酶 标 仪 在 450nm 波 长 下 测 定 吸 光 度 (OD 值 ) ,
计 算 样 品 浓 度 。
试 剂 盒 组 成 及 试 剂 配 制
1. 酶 联 板 : 一 块 (96 孔 )
2. 标 准 品 ( 冻 干 品 ):2 瓶 , 每 瓶 临 用 前 以 样 品 稀 释 液 稀 释 至 1ml, 盖 好 后 静 置 10 分 钟 以
上 , 然 后 反 复 颠 倒 / 搓 动 以 助 溶 解 , 其 浓 度 为 400 ng/ml, 做 系 列 倍 比 稀 释 后 , 分 别 稀 释
400 ng/ml,200 ng/ml,100 ng/ml,50 ng/ml,25 ng/ml,12.5 ng/ml,6.25 ng/ml, 样 品 稀 释
液 直 接 作 为 标 准 浓 度 0 ng/ml, 临 用 前 15 分 钟 内 配 制 。
如 配 制 200 ng/ml 标 准 品 : 取 0.5ml( 不 要 少 于 0.5ml)400 ng/ml 的 上 述 标 准 品 加 入 含 有 0.5ml
样 品 稀 释 液 的 Eppendorf 管 中 , 混 匀 即 可 , 其 余 浓 度 以 此 类 推 。
3. 样 品 稀 释 液 :1×20ml/ 瓶 。
4. 检 测 稀 释 液 A:1×10ml/ 瓶 。
5. 检 测 稀 释 液 B:1×10ml/ 瓶 。
6. 检 测 溶 液 A:1×120ul/ 瓶 (1:100) 临 用 前 以 检 测 稀 释 液 A 1:100 稀 释 , 稀 释 前 根 据 预 先 计

算 好 的 每 次 实 验 所 需 的 总 量 配 制 ( 每 孔 100ul), 实 际 配 制 时 应 多 配 制 0.1-0.2ml。 如 10ul
检 测 溶 液 A 加 990ul 检 测 稀 释 液 A 的 比 例 配 制 , 轻 轻 混 匀 , 在 使 用 前 一 小 时 内 配 制 。
7. 检 测 溶 液 B:1×120ul/ 瓶 (1:100) 临 用 前 以 检 测 稀 释 液 B 1:100 稀 释 。 稀 释 方 法 同 检 测 溶
液 A。
8. 底 物 溶 液 :1×10ml/ 瓶 。
9. 浓 洗 涤 液 :1×30ml/ 瓶 , 使 用 时 每 瓶 用 蒸 馏 水 稀 释 25 倍 。
10. 终 止 液 :1×10ml/ 瓶 (2N H2SO4)。
标 本 的 采 集 及 保 存
1. 血 清 : 全 血 标 本 请 于 室 温 放 置 2 小 时 或 4℃ 过 夜 后 于 1000 x g 离 心 20 分 钟 , 取 上 清 即 可
检 测 , 或 将 标 本 放 于 -20℃ 或 -80℃ 保 存 , 但 应 避 免 反 复 冻 融 。
2. 血 浆 : 可 用 EDTA 或 肝 素 作 为 抗 凝 剂 , 标 本 采 集 后 30 分 钟 内 于 2 - 8° C 1000 x g 离 心 15
分 钟 , 或 将 标 本 放 于 -20℃ 或 -80℃ 保 存 , 但 应 避 免 反 复 冻 融 。
3. 细 胞 培 养 物 上 清 或 其 它 生 物 标 本 : 请 1000 x g 离 心 20 分 钟 , 取 上 清 即 可 检 测 , 或 将 标 本
放 于 -20℃ 或 -80℃ 保 存 , 但 应 避 免 反 复 冻 融 。
注 : 以 上 标 本 置 4℃ 保 存 应 小 于 1 周 ,-20℃ 或 -80℃ 均 应 密 封 保 存 ,-20℃ 不 应 超 过 3 个 月 ,-80
℃ 不 应 超 过 6 个 月 ; 标 本 溶 血 会 影 响 最 后 检 测 结 果 , 因 此 溶 血 标 本 不 宜 进 行 此 项 检 测 ; 高 血
脂 的 标 本 不 需 进 行 特 殊 处 理 , 可 直 接 检 测 。
操 作 步 骤
实 验 开 始 前 , 请 提 前 配 制 好 所 有 试 剂 ; 试 剂 或 样 品 稀 释 时 , 均 需 混 匀 , 混 匀 时 尽 量 避 免 起 泡 。
每 次 检 测 都 应 该 做 标 准 曲 线 。 如 样 品 浓 度 过 高 时 , 均 应 用 样 品 稀 释 液 进 行 稀 释 , 以 使 样 品 符
合 试 剂 盒 的 检 测 范 围 。 建 议 各 实 验 室 在 操 作 前 先 进 行 预 实 验 以 建 立 最 佳 稀 释 倍 数 。
1. 加 样 : 分 别 设 空 白 孔 、 标 准 孔 、 待 测 样 品 孔 。 空 白 孔 加 样 品 稀 释 液 100ul, 余 孔 分 别 加 标
准 品 或 待 测 样 品 100ul, 注 意 不 要 有 气 泡 , 加 样 将 样 品 加 于 酶 标 板 孔 底 部 , 尽 量 不 触 及 孔 壁 ,
轻 轻 晃 动 混 匀 , 酶 标 板 加 上 盖 或 覆 膜 ,37℃ 反 应 120 分 钟 。

为 保 证 实 验 结 果 有 效 性 , 每 次 实 验 请 使 用 新 的 标 准 品 溶 液 。
2. 弃 去 液 体 , 甩 干 , 不 用 洗 涤 。 每 孔 加 检 测 溶 液 A 工 作 液 100ul( 在 使 用 前 一 小 时 内 配 制 ),
37℃,60 分 钟 。
3. 温 育 60 分 钟 后 , 弃 去 孔 内 液 体 , 甩 干 , 洗 板 3 次 , 每 次 浸 泡 1-2 分 钟 ,350ul/ 每 孔 , 甩 干
( 也 可 轻 拍 将 孔 内 液 体 拍 干 )。
4. 每 孔 加 检 测 溶 液 B 工 作 液 ( 同 检 测 A 工 作 液 ) 100ul,37℃,60 分 钟 。
5. 温 育 60 分 钟 后 , 弃 去 孔 内 液 体 , 甩 干 , 洗 板 5 次 , 每 次 浸 泡 1-2 分 钟 ,350ul/ 每 孔 , 甩 干
( 也 可 轻 拍 将 孔 内 液 体 拍 干 )。
6. 依 序 每 孔 加 底 物 溶 液 90ul,37℃ 避 光 显 色 (30 分 钟 内 , 此 时 肉 眼 可 见 标 准 品 的 前 3-4 孔
有 明 显 的 梯 度 兰 色 , 后 3-4 孔 梯 度 不 明 显 , 即 可 终 止 )。
7. 依 序 每 孔 加 终 止 溶 液 50ul, 终 止 反 应 , 此 时 蓝 色 立 转 黄 色 。 终 止 液 的 加 入 顺 序 应 尽 量 与 底
物 液 的 加 入 顺 序 相 同 。 为 了 保 证 实 验 结 果 的 准 确 性 , 底 物 反 应 时 间 到 后 应 尽 快 加 入 终 止 液 。
8. 用 酶 联 仪 在 450nm 波 长 依 序 测 量 各 孔 的 光 密 度 (OD 值 )。 在 加 终 止 液 后 立 即 进 行 检 测 。
注 :
1. 每 次 实 验 留 一 孔 作 为 空 白 调 零 孔 ( 不 同 于 空 白 孔 ), 该 孔 不 加 任 何 试 剂 , 只 是 最 后 加 底 物
溶 液 及 2N H2SO4。 测 量 时 先 用 此 孔 调 OD 值 至 零 。
2. 严 格 按 照 规 定 的 时 间 和 温 度 进 行 温 育 以 保 证 准 确 结 果 。 所 有 试 剂 都 必 须 在 使 用 前 达 到 室
温 。 使 用 后 立 即 冷 藏 保 存 试 剂 。
3. 洗 板 不 正 确 可 以 导 致 不 准 确 的 结 果 。 在 加 入 检 测 溶 液 B 或 底 物 前 确 保 尽 量 吸 干 孔 内 液 体 。
为 防 止 样 品 蒸 发 , 试 验 时 将 反 应 板 放 于 铺 有 湿 布 的 密 闭 盒 内 , 酶 标 板 加 上 盖 或 覆 膜 , 以 避 免
液 体 蒸 发 ; 洗 板 后 应 尽 快 进 行 下 步 操 作 , 避 免 酶 标 板 长 时 间 处 于 干 燥 状 态 。
4. 消 除 板 底 残 留 的 液 体 和 手 指 印 , 否 则 影 响 OD 值 。
5. 在 储 存 和 温 育 时 避 免 强 光 直 接 照 射 。
6. 未 使 用 完 的 酶 标 板 或 者 试 剂 , 请 于 2-8℃ 保 存 。 标 准 品 、 检 测 溶 液 A 工 作 液 、 检 测 溶 液 B

工 作 液 请 依 据 所 需 的 量 配 置 使 用 , 请 精 确 配 置 标 准 品 及 工 作 液 , 尽 量 不 要 微 量 配 置 ( 如 吸 取
检 测 溶 液 A 时 , 一 次 不 要 小 于 10ul), 以 避 免 由 于 不 准 确 稀 释 而 造 成 的 浓 度 误 差 ; 检 测 液
A、B, 以 及 底 物 溶 液 在 使 用 前 , 应 置 于 37℃ 温 育 30 分 钟 ; 请 勿 重 复 使 用 已 稀 释 过 的 标 准
品 、 检 测 溶 液 A 工 作 液 或 检 测 溶 液 B 工 作 液 。
7. 建 议 检 测 样 品 时 均 设 双 孔 测 定 , 以 保 证 检 测 结 果 的 准 确 性 。
洗 板 方 法
手 工 洗 板 方 法 : 吸 去 ( 不 可 触 及 板 壁 ) 或 甩 掉 酶 标 板 内 的 液 体 ; 在 实 验 台 上 铺 垫 几 层 吸 水
纸 , 酶 标 板 朝 下 用 力 拍 几 次 ; 将 推 荐 的 洗 涤 缓 冲 液 至 少 0.3ml 注 入 孔 内 , 浸 泡 1-2 分 钟 , 根
据 需
要 , 重 复 此 过 程 数 次 。
自 动 洗 板 : 如 果 有 自 动 洗 板 机 , 应 在 熟 练 使 用 后 再 用 到 正 式 实 验 过 程 中 。
特 异 性
本 试 剂 盒 可 同 时 检 测 重 组 或 天 然 的 兔 子 可 溶 性 血 管 细 胞 粘 附 分 子 1(sVCAM-1), 且 与
其 它 相 关 蛋 白 无 交 叉 反 应 。
计 算
以 标 准 物 的 浓 度 为 横 坐 标 ( 对 数 坐 标 ),OD 值 为 纵 坐 标 ( 普 通 坐 标 ), 在 半 对 数 坐 标 纸
上 绘 出 标 准 曲 线 ( 推 荐 使 用 专 业 制 作 曲 线 软 件 进 行 分 析 , 如 curve expert 1.3), 根 据 样 品 的
OD 值 由 标 准 曲 线 查 出 相 应 的 浓 度 , 再 乘 以 稀 释 倍 数 ; 或 用 标 准 物 的 浓 度 与 OD 值 计 算 出 标
准 曲 线 的 回 归 方 程 式 , 将 样 品 的 OD 值 代 入 方 程 式 , 计 算 出 样 品 浓 度 , 再 乘 以 稀 释 倍 数 , 即
为 样 品 的 实 际 浓 度 。
注 意 事 项
1. 洗 涤 过 程 非 常 重 要 , 不 充 分 的 洗 涤 易 造 成 假 阳 性 。
2. 一 次 加 样 时 间 最 好 控 制 在 5 分 钟 内 , 如 标 本 数 量 多 , 推 荐 使 用 多 道 移 液 器 加 样 。

3. 请 每 次 测 定 的 同 时 做 标 准 曲 线 , 最 好 做 复 孔 。
4. 如 标 本 中 待 测 物 质 含 量 过 高 , 请 先 稀 释 后 再 测 定 , 计 算 时 请 最 后 乘 以 稀 释 倍 数 。
5. 在 配 制 标 准 品 、 检 测 溶 液 工 作 液 时 , 请 以 相 应 的 稀 释 液 配 制 , 不 能 混 淆 。
6. 底 物 请 避 光 保 存 。
检 测 范 围 :6.25 ng/ml - 400 ng/ml
最 低 检 测 限 :1.56 ng/ml
说 明
1. 在 储 存 及 孵 育 过 程 中 避 免 将 试 剂 暴 露 在 强 光 中 。 所 有 试 剂 瓶 盖 须 盖 紧 以 防 止 蒸 发 和 污 染 ,
试 剂 避 免 受 到 微 生 物 的 污 染 , 因 为 蛋 白 水 解 酶 的 干 扰 将 导 致 出 现 错 误 的 结 果 。
2. 小 心 吸 取 试 剂 并 严 格 遵 守 给 定 的 孵 育 时 间 和 温 度 。 请 注 意 在 吸 取 标 本 / 标 准 品 , 酶 结 合
物 或 底 物 时 , 第 一 个 孔 与 最 后 一 个 孔 加 样 之 间 的 时 间 间 隔 如 果 太 大 , 将 会 导 致 不 同 的 “ 预 孵
育 ” 时 间 , 从 而 明 显 地 影 响 到 测 量 值 的 准 确 性 及 重 复 性 。 而 且 , 洗 涤 不 充 分 将 影 响 试 验 结 果 。
3. 试 剂 盒 保 存 : 部 分 试 剂 保 存 于 -20℃, 部 分 试 剂 保 存 于 2-8℃, 具 体 以 标 签 上 的 标 示 为 准 。
4. 浓 洗 涤 液 会 有 盐 析 出 , 稀 释 时 可 在 水 浴 中 加 温 助 溶 。
5. 刚 开 启 的 酶 联 板 孔 中 可 能 会 含 有 少 许 水 样 物 质 , 此 为 正 常 现 象 , 不 会 对 实 验 结 果 造 成 任
何 影 响 。
6. 中 、 英 文 说 明 书 可 能 会 有 不 一 致 之 处 , 请 以 英 文 说 明 书 为 准 。
7. 所 有 的 样 品 都 应 管 理 好 , 按 照 规 定 的 程 序 处 理 样 品 和 检 测 装 置 。
8. 有 效 期 :6 个 月