Sborník příspěvků z workshopu MICROMYCO 2008 - Ústav půdní ...

Materiál a metodika
Vzorky
Analyzované vzorky pšenice letnej formy ozimnej (Triticum aestivum L.) boli zberané
v roku 2007. Celkovo bolo mykologicky vyšetrených 23 vzoriek, pričom 8 pochádzalo
z konvenčného poľnohospodárstva, 5 z konvenčného poľnohospodárstva bez fungicídnej
ochrany a 10 z ekologického poľnohospodárstva. Vzorky boli dopestované na rôznych
lokalitách západného a stredného Slovenska.
Izolácia
Pri zisťovaní povrchovej mykocenózy celého zrna (oplach) a mykocenózy šrotovaného
zrna bola použitá platňova zrieďovacia metóda. Očkovali sme povrchovo riedeniami 10 -2 až
10 -4 , resp. 10 -1 až 10 -3 v trojnásobnom opakovaní na DRBC (agar s dichlóranom, bengálskou
červeňou a chloramfenikolom) a MEA (agar so sladinovým extraktom) s prídavkom 100 mg
chloramfenikolu. Endogénna mykocenóza bola detegovaná po povrchovej sterilizácii zŕn
NaOCl (0,4 %) metódou priameho ukladania pšeničných zŕn na agarové platne DRBC
a DYSG (agar s dichlóranom, kvasničným extraktom, sacharózou a glycerolom).
Kultivácia pri všetkých troch formách izolácie prebehla pri 25 ± 1 °C, po dobu 5 – 7 dní
v tme.
Identifikácia
Izoláty patriace do podrodu Penicillium boli preočkované na identifikačné médiá - CYA
(Czapkov agar s kvasničným extraktom), MEA, CREA (agar s kreatínom a sacharózou) a
YES (kvasničný extrakt so sacharózou). Izoláty patriace do podrodu Aspergilloides,
Biverticillium a Furcatum boli preočkované na CYA 25 °C, CYA 37 °C, MEA a YES.
Kultivácia prebehla pri 25 ± 1 °C, 5 - 7 dní v tme (SAMSON et al., 2002b).
Na identifikáciu boli použité kľúče: PITT et HOCKING (1997); SAMSON et al. (2002);
SAMSON et FRISVAD (2004).
Stanovenie toxinogenity
Schopnosť vybraných izolátov produkovať citrinín (C), cyklopiazónovú kyselinu (CPA),
grizeofulvín (G), patulín (P), penitrém A (PA) a roquefortín C (RC) bola stanovená
v podmienkach in vitro tenkovrstvovou chromatografiou (TLC). Tri agarové výseky
s plochou približne 5 x 5 mm z CYA (pre intracelulárne mykotoxíny: CPA, PA, RC) alebo
z YES (pre extracelulárne mykotoxíny: C, G, P) boli zmiešané s 500 µl extrakčným činidlom
chlorofom metanol (2 : 1). Toxíny boli extrahované na Vortexe (G-560E, Scientific
Industries, Bohemia) cca 3 min. Na štart chromatografickej platne (Alugram sil G Macherem-
Nagel, Nemecko) boli nanesené extrakty v množstve 30 µl a štandardy skrínovaných
mykotoxínov 10 µl (Sigma, Nemecko). Po vysušení boli mykotoxíny vyvíjané
v chromatografickej sústave TEF (toluén, etylacetát, kyselina mravčia 5 : 4 : 1) a po
opätovnom vysušení detegované na základe fluorescencie a retenčných hodnôt použitých
štandard. Vizualizácia citrinínu (žltozelená škvrna s chvostom) a grizeofulvínu (modrá
škvrna) bola priamo viditeľná pod UV svetlom 365 nm. Pri dennom svetle boli vizualizované
cyklopiazónová kyselina – po nanesení Erlichovho činidla (fialová škvrna s chvostom),
patulín – po nanesení 0,5 % MBTH (3-metyl-2-benzotiazoliónhydrazón hydrochlorid)
v metanole, zahriatí pri 130 °C, 8 min. (žltooranžová škvrna); penitrém A – po nanesení 20 %
14