Optické mikroskopy

Při rastrování je signál z fotonásobiče registrován počítačem spolu s informací o souřadnicích
analyzovaných bodů. Celý soubor těchto dat je pak převeden na obraz pozorovaného vzorku.
Tento obraz již díky prostorové filtraci záření dopadajícího na detektor neobsahuje neostré
pozadí mimofokálních oblastí vzorky. Konfokální obrazy jsou proto vždy zaostřené a
představují optické řezy vzorkem. S imerzním objektivem o numerické apertuře NA=1.3 a při
použití modrozelené čáry argonového laseru (488nm) činí jejich tloušťka asi 0.4 µ m
4. Pojmy
Abbeho teorie mikroskopu.
Ernas Abbe (1873) vysvětlil a experimentálně doložil fyzikální podstatu vzniku obrazu v
optickém mikroskopu. Základní myšlenka jeho teorie spočívá v představěm že každý bod
osvětleného objektu se stává zdrojem sekundárních sférických vln (Huygensův princip).
Záření prošlé vorkem vstupuje v podobě sekundárních vln do objektivu a dostává se do zadní
ohniskové roviny objektivu. Změny amplitudy a fáze světelných vln procházejících vzorkem
Abbe popsal transmisní funkcí F (x,y), jejíž proměnné x a y značí souřadnice v předmětové
rovině, která je kolmá na optickou osu mikroskopu.
Zadní ohnisková rovina objektivu
F = nejkritičtější místo mikroskopu, v této rovině se setkávají paprsky, které opouštějí
předmětovou rovinu šíříce se stejným směrem a vstoupily do objektivu.
Airyho kroužky
Žádný objektiv nezobrazí bod opět jako bod , ale obrazem bodu jsou difrakční obrazce
vznikající ohybem světla na výstupní pupile objektivu (Airyho kroužky). Při zobrazení dvou
blízkých bodů se mohou příslušné difrakční kroužky překrývat, až se při jisté minimální
vzdálenosti stanou nerozlišitelnými.
Kontrast
Kontrast (K) je definován pomocí rozdílu mezi jasem pozadí (Ip) a jasem pozorovaného
objektu (I) jako poměr: K= (I-Ip)/Ip
Wollastonův hranol
Wollastonův hranolu rozdělí původně lineárně polarizované zobrazující světlo na dvě
vzájemné kolmo polarizované složky (odpovídající řádnému a mimořádnému paprsku), které
z děliče vystupují různým směrem.
Fluorescence
Fyzikální proces při němž dochází k přeměně vlnové délky budícího záření na vlnovou délku
luminiscenčního emisního záření, které doznívá delší dobu. Absorpce fotonů molekulami má
za následek přechod elektronů do vyšších energetických hladin a při zpětném návratu
elektronů dochází k emisi světla. Emisi lze charakterizovat fluorescenčním excitačním
spektrem t.j.závislostí intenzity emise na vlnové délce excitačního světla. Když je vzorek
ozářen světlem s určitou excitační vlnovou délkou, emituje světlo o viditelně delší vlnové
délce (Stokesovo pravidlo)
Dichronické zrcadlo
36