Optické mikroskopy

plastikových miskách), které se pro DIC, kde je podstatná polarizace zobrazujícího světla,
mohou stát zdrojem rušivých efektů.
Nevýhody: Výrazně závisí na orientaci zobrazovaného objektu vůči štěrbině, neboť optické
gradienty rovnoběžné se štěrbinou se v obrazu objektu neobjeví. Mezi biology je DIC zatím
více oblíben než Hoffman, částečně proto, že je metodou s delší tradicí, zejména však kvůli
tomu, že DIC často umožňuje lepší kontrast zobrazení jemných fázových struktur
1.11. Dodtův infračervený gradientový kontrast (Dodt gradient contrast
DGC).
Tento kontrast byl vyvinut teprve nedávno pro vizualizaci buněk ve tkáňových řezech v
minulých deseti letech, jeho princip dosud nebyl zveřejněn.. Tubus je namontován mezi zdroj
světla a mikroskop, kontrast je vhodný pro všechny typy objektivů, neinterferuje s
fluorescenčním snímáním.
2. Fluorescenční mikroskop
V r. 1910 pozoroval Kohler při mikroskopování s ultrafialovým světlem fluorescenci mnoha
preparátů. První fluorescenční mikroskop s UV excitací vznikl r.1913. Jako zdrojů světla se
používá převážně vysokotlakých výbojek plněných rtutí nebo xenonem. Tyto výbojky
vydávají velké množství energie svého záření v ultrafialové oblasti. Jejich světlo je poměrně
stabilní, výbojky vydrží zářit asi 500 pracovních hodin. Zažehávají se však
vysokonapěťovými pulsy, je proto potřeba zapínat je dříve než ostatní elektronické přístroje v
aparatuře. Fluorescenční mikroskop je používán k vizualizaci označených buněk, buněčných
struktur či molekul a k měření koncentrací iontů uvnitř buněk. Typicky se měří změny
koncentrace vápníku v cytoplazmě, které jsou v klidovém stavu udržovány v rozmezí 50 až
200 nM a po stimulaci vstupu vápníku do buňky nebo po jeho uvolnění z intracelulárních
zásob stoupají až destinásobně. Změny ve fluorescenčních vlastnostech sond po navázání
iontu jsou registrovány a po porovnání s kalibrační křivkou přepočteny na komncentraci.
pomocí mikrofluorescenčního měřícího systému MetaFluor od firmy Visitron.
Fluorescenční mikroskopie používá většinou zesilovačů obrazu nebo chlazených CCD kamer
(tzv. zesílená fluorescenční mikroskopie, IFM - Intenzified Fluorescence Microscopy)..
Použití takových detektorů je nezbytné ve většině biologických vzorků, neboť intenzita jejich
fluorescence nebývá postačující pro obyčejné videokamery. Musí se proto kombinovat s
počítačovým zpracováním obrazu (videomikroskopie). Při IFM lze snižovat intenzitu buzení
oproti intenzitě potřebné pro obyčejné vizuální pozorování, čímž lze úspěšně potlačit
nežádoucí vybělování fluorescence.
2.1. Epifluorescence
Epifluorescence spočívá ve vertikálním fluorescenčním osvětlení excitačním světlem o
požadované vlnové délce. Objekt je pozorován přes objektiv, světlo dopadá zhora přes
excitační filtr a dichronické zrcadlo, obraz předmětu je pozorován přes emisní filtr.
Dichronické zrcadlo odráží excitační světlo o určité vlnové délce směrem do vzorku a
propouští ostatní vlnové délky. Bariérový filtr umístěný mezi objektiv a okulár blokuje
nechtěné vlnové délky, čímž poskytuje černé pozadí k fluorescenčnímu obrazu. Spektrální
charakteristiky vlnové délky transmitance a reflektance dichronického zrcadla se kříží, takže
je zapotřebí použít vhodnou kombinaci excitačních a barierových filtrů v kombinaci s
dichronickým zrcadlem, aby bylo dosaženo dobrého kontrastního obrazu. K fluorescenčním
34