Optické mikroskopy

ozdělení původně polarizovaného světla hranolem vzniknou dva identické obrazy předmětu,
které jsou vůči sobě laterálně posunuty, vznikne zvětšený rozdvojený obraz. Wollastonovy
hranoly pro DIC se vyznačují tím, že úhlový rozdíl vystupujících paprsků je velmi malý (asi
10 -4 radiánu), laterální posun dvou obrazů je za těchto podmínek pod hranicí rozlišovací
schopnosti mikroskopu. V předmětové rovině je ekvivalentem tohoto posunu vzdálenost
odpovídající 0.1 mm. Analyzátor P2 orientovaný pod úhlem 45o vůči vzájemně kolmým
polarizacím dvou laterálně posunutých obrazů, vytváří podmínky pro jejich interferenci.
Prvním (objektivovým) hranolem způsobené fázové rozdíly však nejsou stejné pro světlo
pocházející z různých míst plošného světelného zdroje. Úkolem druhého hranolu
(kompenzačního) je proto učinit fázový rozdíl konstantní v celé ploše objektivového hranolu.
Hodnotu konstantního fázového rozdílu lze plynule měnit laterálním posouváním obou
Wollastonových hranolů vůči sobě, čímž se výrazně ovlivňuje vzhled obrazu. Platí, že pokud
určitý gradient optické dráhy vede ke zvýšení jasu obrazu, pak opačný gradient se projeví
snížením jasu. Zvětšený obraz vzorku se proto jeví jako šikmo osvětlený trojrozměrný objekt.
Nevýhody: Je známo, že některé výrazně odlišné prostorové reliéfy objektů se mohou
projevit prakticky shodnými reliéfy. U biologických preparátů se však optický reliéf zpravidla
dostatečně shoduje s reálným prostorovým reliéfem. Pro DIC je typická velmi malá hloubka
ostrosti (0.25 mm), což se přičítá efektu interference, pro níž se podmínky prudce mění při
přeostření o zlomky vlnové délky.
Výhody: Velkou předností DIC je, že obrazy zkoumaných objektů jsou bez rušivého halo,
DIC umožňuje lepší kontrast zobrazení jemných fázových struktur objektu než fázový či
Hoffmanův kontrast. Nomarskeho metodu lze také realizovat při horním osvětlení či při
měření fluorescenčních. V kombinaci s infračerveným osvětlením ji lze použít pro vizualizaci
těl i výběžků neuronů v živých mozkových řezech.
1.10. Hoffmanův modulační kontrast (HMC)
Vznik tohoto modulační kontrastu se datuje do r. 1975. Jde v podstatě pouze o velmi
dokonalou verzí šikmého osvětlení, které se používá ke zvýraznění kontrastu neabsorbujících
předmětů. Vznik kontrastu při HMC je důsledek asymetrické filtrace Fourierova obrazu, což
je typické pro všechny metody využívající mimoosové (anaxiální) osvětlení. Virtuálním
zdrojem světla zajišťujícím šikmé osvětlení je obdélníková štěrbina nacházející se v přední
ohniskové rovině kondenzoru. V místě jejího obrazu v zadní ohniskové rovině objektivu je
umístěn modulátor. Modulátorem je maska, jejíž tvar se kryje s obrazem štěrbiny kondenzoru.
Štěrbina modulárotu z jedné strany sousedí s absorbující plochou (nepropustná zona, zabírá
méně než 10% apertury objektivu), z druhé strany je neabsorbující plocha (propustná zona)..
Záření zdroje se po průchodu vzorkem s gradientem optické tloušťky odchýlí od původního
směru šíření, jednotlivé příspěvky k odchýlenému záření vytvoří v zadní ohniskové rovině
objektivu dílčí obrazy kondenzorové clony, které jsou však posunuty vůči štěrbině
modulátoru. Je=li gradient kolmý na osu štěrbiny, posune se její tvar v závislosti na znaménku
tohoto gradientu buď do nepropustné nebo do čiré zony modulátoru. Takové posunutí je
provázeno ztemněním, při opačném gradientu zjasněním, příslušného místa v
mikroskopickém obrazu.
Výhody: Výsledný obraz budí dojem šikmo osvětleného reliéfu a je velmi podobný zobrazení
pomocí Nomarského DIC, cena potřebných doplňkových komponent mikroskopu je však při
HMC podstatně nižší než při DIC. Hlavní předností HMC oproti DIC, kromě ceny, je
možnost pozorovat objekty i na dvojlomných podložkách (např. buněčné kultury v
33