Optické mikroskopy

1.7. Koehlerovo osvětlen
Koehlerovo osvětlení nastavujeme pohybem kondenzoru nahoru a dolu, a pomocí clonek
kondenzoru, kterými je přiváděno světlo z osvětlovacího zdroje.
Jak nastavíme optimální osvětlení preparátu v přímém mikroskopu ?
Ve snížené poloze kondenzoru naplno otevřeme otvor clonky kondenzoru a clonu vymezující
vstup paprsků světla do objektivu. Pak zúžíme otvor clony vymezující vstup světelných
paprsků a nastavíme pomocnými šrouby jeho střed doprostřed zorného pole. Zdviháme
kondenzor a rozšiřujeme světelné pole, až jeho obraz plně a právě zaplní.zorné pole. Tím
vymezíme vstup světla ze zdroje a zamezíme vstupu světla pocházejícího z okolí. Dále
nastavíme clonku kondenzoru, která určuje numerickou aperturu osvětlovacího systému.
Doporučuje se nastavit hodnotu NA kondenzoru na 70 - 80 % NA objektivu. Tímto
nastavením omezíme rozptyl světla a dosáhneme lepšího rozlišení, kontrastu i hloubky
ostrosti.
1.8. Fázový kontrast
R. 1932 holandský fyzik Frederik Zernike uveřejnil princip fázového kontrastu v mikroskopu.
Při fázovém kontrastu je do přední ohniskové roviny kondenzoru vložena kondenzorová
maska (apertura ve tvaru úzkého mezikruží), která je kondenzorem a za ním následujícím
objektivem zobrazena do zadní ohniskové roviny objektivu.
Zde se nachází skleněná podložka s nanesenou fázovou maskou (tenká transparentní vrstva o
vhodném indexu lomu) ve tvaru mezikruží, které se překrývá s obrazem kondenzorové
apertury. Fázová maska mění fázi procházejícího záření o úhel α, případně může procházející
záření také částečně absorbovat. Kontrast obrazu fázového objektu vůči pozadí roste s
klesající propustností fázové masky. Fázová destička bývá zhotovena tak, že mění fázi buď o
úhel π /2 nebo -π /2. Při fázovém kontrastu se intenzita světla v obrazu objektu mění lineárně
se změnou fáze světla procházejícího objektem. S fázovou maskou měnící fázi o -π /2 se
silnější části objektu jeví tmavší, tzv. pozitivní fázový kontrast. Při změně fáze o π /2 je
tomu naopak, tzv. negativní fázový kontrast. Při fázovém kontrastu se často používá
kvazimonochromatického osvětlení (žlutozelené světlo), při použití bílého světla bude obraz
vzorku zbarvený, neboť úhel a o který fázová maska mění fázi procházejícího světla, závisí na
vlnové délce. Nejmenší rozdíly v tloušťce různých buněčných struktur, které můžeme pomocí
fázového kontrastu zaznamenat se tedy blíží k hodnotě 0.1 µm.
Nevýhody: Při pozorování silně lomivých objektů (např kvasinek) vzniká tzv halo, což je
jasně zářící rozhraní mezi objektem a okolním prostředím, v němž se ztrácejí skutečné hranice
objektů. Druhým nedostatkem fázového kontrastu je to, že silně absorbující zbarvené objekty
nemusí být ve fázovém kontrastu vůbec viditelné.
1.9. Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)
Německá firma Carl Zeiss vyvinula r.1959 interferenční mikroskop, který umožnil vytváření a
vyhodnocování optických interferencí ve zvětšeném biologickém preparátu. Umožnil tak
zvláště povrchovou topologii preparátu.
Od běžného mikroskopu se liší vloženým párem Wollastonových dvojlomných hranolů a
párem zkřížených polarizátorů světla. Světlo vstupující do kondenzoru je nejprve lineárně
polarizováno polarizátorem P1. Pak prochází prvním hranolovým děličem, přičemž směr jeho
polarizace svírá s optickými osami hranolového děliče úhel 45°. Druhý hranol shodně
orientovaný s hranolem prvním, se nachází těsně za zadní ohniskovou rovinou objektivu.
Následuje polarizátor P2, který je kvůli lepšímu kontrastu zobrazení zkřížen s P1. V důsledku
32