Optické mikroskopy

Kromě těchto filtrů se používají také filtry, absorbující tepelné záření.
Pozorování v tmavém poli (v zástinu): Při pozorování v tmavém poli je z obrazu vyloučeno světlo,
které by dopadalo přímo do objektivu. Prázdné zorné pole je při tomto postupu tmavé. Teprve to
světlo, které se rozptýlí při dopadu na preparát, prochází částečně objektivem
a vytváří obraz objektu,
složený ze zářících bodů. Pro suché objektivy s numerickou aperturou do 0,65 není třeba zvláštních
kondenzorů pro tmavé pole, stačí zastínit výstupní čočku kondenzoru clonou pro tmavé pole, která
je ve volitelné výbavě mikroskopu. Protože se při tomto pozorování využívá jen zlomku světlené
intenzity zdroje, má mít tento zdroj dostatečný výkon. Z hlediska světelné optiky je důležité, že při
pozorování v tmavém poli září na tmavém podkladě ty části objektu, na kterých dochází ve
vlastnostech světla k dostatečnému rozdílu při průchodu pozorovaným objektem, jako např. na
hranách. Při tvorbě obrazu v tmavém poli nemají význam rozdíly v indexu lomu, které jsou podstatné
při pozorování ve fázovém kontrastu.
Pozorování ve fázovém kontrastu: Fyzikální principy fázového kontrastu nejsou snadno přístupné.
Naopak praktické používání fázového kontrastu ve světlené mikroskopii nečiní většinou žádné potíže.
Stručně můžeme říci, že po průchodu preparátem se světlo mění dvěma způsoby: změna amplitudy
procházejícího světla nám zprostředkuje vnímání detailů kontrastů jak intenzity, tak i barev. Výsledný
vjem je běžný kontrastní barevný obraz. Změna fáze světla, která nastává při průchodu objektem, není
zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily, lišící se kontrastem, je pro lidský zrak průhledný,
čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti převažují a proto je zrakem obtížně identifikujeme.
Mikroskop, vybavený pro pozorování ve fázovém kontrastu, nám umožňuje pozorovat i takové objekty,
které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší poznatky o tomto principu jsou součástí fyzikální
optiky.
Mikroskop pro pozorování ve fázovém kontrastu musí být pro tuto metodu vybaven. Potřebujeme
objektivy pro fázový kontrast a kondenzor pro fázový kontrast. Oba tyto optické díly jsou opatřeny tak
zvanými
fázovými prstenci. U objektivů jsou jejich trvalou částí, u kondenzoru jsou používány podle
potřeby. Objektivy pro fázový kontrast mají na jedné ze svých čoček nanesený neprůhledný "fázový"
prstenec, na kterém nastává posun fáze světelné vlny. Objektivy pro fázový kontrast mohou sloužit
též pro pozorování bez fázového kontrastu, avšak prstenec v objektivu způsobuje v tomto případě
mírné snížení jakosti obrazu - udává se přibližně 10 %. U objektivu s malým zvětšením se toto
zhoršení prakticky neprojevuje.
Fázový kontrast je značně závislý na seřízení mikroskopu. K tomu se dodává účelná pomůcka, tzv.
středící (centrovací) dalekohled. Ten se nasadí místo jednoho okuláru a pak pozorujeme polohu
fázových prstenců, které můžeme
vystředit pomocí nastavovacích prvků. Přesný postup je v návodu
ke každému mikroskopu, nicméně vyžaduje trochu zkušeností. Je běžné používat pro světlé pole a
fázový kontrast společné objektivy až do zvětšení 40x, pro vyšší zvětšení je téměř nutné používat pro
každou metodu jednoúčelový objektiv.
Kondenzor pro fázový kontrast bývá u jednoduchých mikroskopů vybaven tzv. šoupátkem,
nesoucím 1 nebo 2 fázové prstence. Tyto fázové prstence jsou svým tvarem přizpůsobeny vždy
objektivu s určitým zvětšením. Dokonalejší
mikroskopy jsou vybaveny univerzálním otočným
kondenzorem, vybaveným třemi fázovými prstenci, prstencem pro pozorování v tmavém poli a
otvorem pro pozorování ve světlém poli. Volba se provádí otáčením karuselu, nesoucím jednotlivé
prstence. Pozorování při fázovém kontrastu se podstatně zlepší, použijeme-li zelený interferenční
filtr. Tento filtr propouští zelené světlo vlnové délky kolem 540nm, které zvyšuje vjem kontrastů.
Oko
je na tuto vlnovou délku světla maximálně citlivé.
Fluorescenční mikroskopie
Fluorescenční mikroskopie se dělí na dvě metody: pozorování v odraženém světle (epifluorescence)
a pozorování v procházejícím světle (diafluorescence). Fluorescenční pozorování v procházejícím
světle se v současné době téměř
nepoužívá, pod pojmem fluorescence budeme rozumět výhradně
pozorování odraženého fluorescenčního světla, tj. epifluorescenci.
Podstatou fluorescence je buzení viditelného záření v objektech, které obsahují chemické sloučeniny
(fluorochromy), schopné specificky měnit dopadající ultrafialové záření na “odražené” barevné
viditelné záření. Některé biologické objekty již takové sloučeniny samy obsahují (např. chlorofyl), jiným
25