Optické mikroskopy
Optické mikroskopy
Optické mikroskopy
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
<strong>Optické</strong> <strong>mikroskopy</strong><br />
Osnova :<br />
1) Úvod<br />
2) Použití<br />
3) Historie<br />
4) Princip zobrazení<br />
5) Složení optického mikroskopu<br />
6) Základní používané pojmy<br />
7) Vady čoček + typy objektivů<br />
8) Seznam firem na trhu<br />
1) Úvod + 2) použití<br />
Z knížky<br />
Mikroskop - přístroj určený k pozorování drobných předmětů n. k rozlišení podrobností na<br />
pozorovaném předmětu<br />
Druhy mikroskopů podle způsobu zobrazení předmětu<br />
• elektronové (proud elektronů)<br />
• tunelovací (kontakt jednoatomového hrotu s atomy povrchu vzorku → rozdíl<br />
potenciálů → vznik proudu)<br />
• světelné (světelný paprsek)<br />
podle osvětlení objektu ….. v procházejícím světle ( světlo prochází pozorovaným<br />
objektem)<br />
….. v dopadajícím světle ( světlo dopadá na povrch objektu)<br />
podle osvětlení okolí objektu ….. ve světlém poli (objekt má tmavý obrys a nalézá se ve<br />
světlém poli)<br />
….. v temném poli (světlý objekt v temném poli, méně se<br />
Adresa: ceg@fsv.cvut.cz<br />
Mikroskopické metody<br />
používá)<br />
Optická mikroskopie<br />
Optická mikroskopie umožňuje pozorovat mikroskopické objekty a struktury do 1000násobného<br />
zvětšení bez speciálních úprav mikroskopu a při běžné přípravě vzorků broušením<br />
a leštěním nebo rozložených na skleněné podložce. Pozorování neleštěných povrchů v<br />
odraženém světle je u běžných mikroskopů možné jen u malých zvětšení pokud je nerovnost<br />
povrchu menší než hloubka ostrosti použitého objektivu. Pozorování neleštěných povrchů při<br />
větším zvětšení umožňuje konfokální mikroskop, dosahující zvýšenou hloubku ostrosti<br />
speciální konstrukcí optické soustavy nebo speciální software SIS Extended Focal Imaging,<br />
který dosahuje zaostření snímku objektu digitální rekonstrukcí série snímků pořízených při<br />
rozdílném zaostření. Optická mikroskopie umožňuje pozorovat vzorky v přirozeném stavu<br />
včetně vlhkosti a s malými úpravami též při nižších nebo vyšších teplotách.<br />
1
Mikroskopická laboratoř FSv ČVUT je vybavena optickými <strong>mikroskopy</strong> ZEISS Neophot 21,<br />
Metaval, Amplival s mikrotvrdoměrem PAAR a videomikroskopem OLYMPUS OVM<br />
1000NM, majícím objektivy se zvýšenou hloubkou ostrosti.<br />
Optická mikroskopie a obrazová analýza<br />
Systém obrazové analýzy byl v laboratoři uveden do provozu na počátku roku 1997. Skládá se<br />
ze tří částí: z optického mikroskopu, makro soustavy a PC s obrazovou analýzou. Optický<br />
mikroskop s mikrofotografickým zařízením umožňuje pozorování mikroskopických preparátů<br />
v procházejícím i v odraženém světle při zvětšení 1000x a při použití zoomu pak ještě větším.<br />
K dalšímu příslušenství patří vybavení pro epifluorescenci, dále pro temné pole, polarizované<br />
světlo a Nomarského DIC v odraženém i procházejícím světle. Makro soustava je tvořena<br />
repro stativem s osvětlovací soustavou. Na stativ je možno připevnit barevnou CCD video<br />
kameru s makro video zoom objektivy, které umožňují vytváření dokumentačních snímků<br />
nebo obrazů s různým zvětšením a nahrazují tak částečně stereomikroskop. Obrazy z<br />
mikroskopu nebo z makrooptiky snímané barevnou TV 3 CCD kamerou nebo černobílou<br />
CCD kamerou mohou být archivovány, softwarově upravovány, proměřovány a dále<br />
matematicky zpracovávány.<br />
Využití v celních laboratořích<br />
Optický mikroskop ve spojení s obrazovou analýzou je využíván např. v analýze papíru pro<br />
zjištění přítomnosti anorganického nátěru a stanovení vlákninového složení. U keramických<br />
dlaždic se posuzuje glazování. U dřevin se podle buněčné stavby rozlišují jejich druhy. Dále<br />
tato technika nachází uplatnění při rozlišování druhů vláken, škrobů, měří se tloušťka tenkých<br />
vrstev apod. Makro soustava se používá k dokumentaci vzorků, při posuzování heterogenních<br />
směsí, měření velikosti částic u sypkých materiálů, při rozlišení dřevovláknitých desek apod.<br />
Rozsah aplikací celého systému je velký a dále se rozšiřuje podle problémů, které vyvstávají u<br />
nově analyzovaných vzorků.<br />
glazovaná dlaždice, polarizované odražené světlo,<br />
zvětšení 200x<br />
příčný řez tropickou dřevinou Seraya, procházející<br />
světlo, zvětšení 200x<br />
2
Z knížky<br />
Na principu mikroskopu jsou založeny<br />
Stereomikroskopie (prostorové zobrazování objektu, přístroj - stereomikroskop)<br />
Mikrofotografie (znázornění objektu pomocí fotografie,přístroje - fotokamera, zaostřovací<br />
zařízení, expoziční automat…)<br />
Mikrokinematografie (filmování pohyblivých obrázků)<br />
Mikrofotometrie (měření světelných intenzit, fotometr spojený s mikroskopem,<br />
fotonásobič,…)<br />
Inverzní m. (pozorování objektů zespodu, přístroj – inverzní mikroskop, objektiv má pod<br />
stolkem, kondensor nad ním )<br />
Mikromanipulace, mikrokultivace, m. za speciálních podmínek<br />
řada dalších………..<br />
Adresa – <strong>mikroskopy</strong>.cz<br />
Optická mikroskopie je základem mikrostrukturální analýzy už přes 100 let. Tvar a technika<br />
mikroskopu se během posledních 40 let změnily jen málo, přičemž k největšímu pokroku<br />
došlo v oblasti vícenásobných optických vrstev (multilayer coating) sloužících k redukci<br />
nežádoucích odrazů světla na povrchu skel. Co se ale opravdu změnilo, je přístup k přípravě<br />
povrchu pro mikrostrukturální analýzu. Ta dnes dosahuje celistvosti vzorku a povrchové<br />
planarity na úrovni, která dříve byla nedosažitelná. Pokud se povrchová planarita mezi fázemi<br />
složky pohybuje v rozsahu jednoho mikrometru (1µm), je možné plně využít interferenčních<br />
technik. Další dimenzi získává analýza vzorku v případě průsvitných materiálů připravených<br />
celistvě a zkoumaných na tmavém poli. Při přípravě drolivých materiálů pomocí drcení, které<br />
zamezuje obrušování povrchu, je možné optickou aktivitu zesílit pomocí polarizačních<br />
technik. Při pozorování přesného obrazu uhlíkových vláken můžeme pomocí potlačení barev<br />
určit jejich směrovou orientaci. Lze doložit, jak použití nesprávné techniky může vést k<br />
chybné analýze, a také že pro získání komplexního pohledu je důležité použít kombinované<br />
optické techniky. Tato přednáška se proto zaměřuje na vizuální stránku, přičemž používá řadu<br />
mikrofotografií, které dokumentují autorovy rozsáhlé zkušenosti jak v přípravě povrchů, tak v<br />
používání technik optické mikroskopie.<br />
Adresa - httpstaffold.vscht.czktkwwwrootstaffkratkaBrno%202001.htm<br />
Praktické využití mikroskopie v potravinářství<br />
J. Krátká, M. Maryška * , M. Voldřich, F. Kvasnička, R. Ševčík, P. Skálová,<br />
M. Dušek<br />
Ústav konzervace potravin a technologie masa<br />
* Ústav skla a keramiky<br />
Abstract:<br />
3
Food processing is accompanied by various technological defects and faults, some of them are<br />
important for the quality of product or can influence its safety. The mentioned faults or<br />
technological defects can result from the technology or from external factors (work power,<br />
equipment, premises, hygiene, etc.). The faults and defect are prevented by the quality<br />
assurance systems, the food safety defect by HACCP. These systems need suitable monitoring<br />
, the optical macro and microscopy combined with computer image analysis could be a useful<br />
tool for this purpose (detection of clouds and sediments in drinks, identification of foreign<br />
bodies in food, etc.).<br />
Detection of authenticity of food products seems to be another perspective field of the use of<br />
the mentioned methods, especially evaluation of powdered products (spices, tea, coffee,<br />
addition of non permitted or undeclared additives into the powder products, etc.), detection of<br />
pulp particles in fruit juices, identification of botanical origin, etc.<br />
The presentation includes the examples of the use of these procedures for identification of<br />
clouds and sediments in spirits, detection of falsification of milled pepper, identification of<br />
foreign bodies in vine and others.<br />
Mikroskopie jako taková, je rychlá a jednoduchá metoda, pro kterou zpravidla není třeba<br />
složitě připravovat vzorky. Zároveň umožňuje ve spojení s digitálním fotoaparátem či<br />
digitální kamerou pořízení a uchování velkého množství dat. Tak je možné vytvořit<br />
širokou databázi zjištěných závad potravinářských komodit, doplněnou o souhrnné informace<br />
použitých metod izolace vzorků a jejich přípravy. Takto vytvořenou základní databázi je<br />
možné průběžně doplňovat výsledky příslušné chemické analýzy upřesňující vlastní<br />
mikroskopické stanovení. Kompletní a průběžně aktualizovanou informační databázi lze<br />
použít jak k rychlému určení problému a rozhodnutí o dalším postupu při rozboru vzorku, tak<br />
i k vyhledávání zpětných informací o již provedených nálezech. Při využití moderní techniky<br />
je archivace získaných dat nenáročná, levná a téměř bez nároků na skladovací prostor a<br />
údržbu dat. V současnosti tak lze uchovávat na poměrně malém disku nejen textové a datové<br />
soubory v podobě snímků, ale i ve formátu celých video sekvencí.<br />
V naší práci bylo používáno světelného mikroskopu s možností polarizace světla, digitálního<br />
fotoaparátu, kamery a softwaru Lucia , umožňujícího zpracování digitálních snímků.<br />
Při detekci různých složek zkoumaných vzorků potravinářských výrobků je někdy nezbytné<br />
použít metody mikroskopie v polarizovaném světle. Z izotropních a anizotropních vlastností<br />
látek lze potom odhadnout jejich iontovou a molekulární strukturu.<br />
Mezi anizotropní látky řadíme takové, které propouštějí polarizované světlo do určité roviny<br />
rychleji než světlo kmitající kolmo na tuto rovinu. Tato vlastnost se projevuje např. u škrobu,<br />
buněčných stěn, fibril, jaderné membrány, krystaly atd. Jsou to látky s pravidelnou orientací<br />
základních stavebních složek.<br />
Hlavním předmětem této práce je za prvé detekce příčin zákalů ve výrobě různých typů<br />
alkoholických a nealkoholických nápojů, za druhé pak detekce falšování potravin přidáváním<br />
levnějších a lehce dostupných příměsí.<br />
Detekci příčin zákalů v tekutých výrobcích lze rozdělit na dva směry.<br />
4
• Makroskopické zkoumání výrobků zahrnuje především určení mikrobiologické příčiny<br />
zákalu. Přitom sledujeme změnu barvy výrobku, vývoj plynů, vznik přípachů a pachuti,<br />
změnu konzistence a všeobecně změnu senzorických vlastností daného výrobku;<br />
• Mikroskopické zkoumání navazuje na makroskopické a jeho cílem je dále prohloubit<br />
znalosti o původu zákalu. Sledujeme obsah nežádoucí mikrobiální kontaminace (obsah<br />
kvasinek, plísní a bakterií), popřípadě detekujeme obsah částic rostlinných pletiv,<br />
organických nebo anorganických přimísenin či sloučenin, vzniklých z přidaných činidel.<br />
V zásadě je možné rozdělit příčiny vzniku zákalů do několika skupin:<br />
1. zákaly anorganického původu: Fe, Cu, Sn, Al, azbestová a celulózová vlákna<br />
2. zákaly organického původu : vinný kámen, vápenaté soli kyseliny vinné, slizové<br />
a šťavelové, bílkoviny a jejich komplexy s polyfenoly a<br />
ionty kovů, třísloviny a jejich komplexy s pektiny,<br />
škrob<br />
3. zákaly biologického původu: kvasinky, plísně a bakterie<br />
K potvrzení mikroskopického nálezu lze použít na příklad barevných reakcí zákalů s<br />
reagenčním činidlem. K dalším kvantitativním a kvalitativním stanovením lze pak využít<br />
některých instrumentálních metod. V našem případě bylo zpravidla používáno<br />
isotachoforetické stanovení kationtů.<br />
Druhým, neméně podstatným směrem našeho výzkumu, je využití mikroskopie k detekci<br />
falšování potravinářských výrobků.<br />
Zkoumaný vzorek lze opět prověřovat jak makroskopicky tak mikroskopicky. Lze tak ověřit<br />
botanické znaky specifické pro daný druh a prokázat identitu prověřovaného zboží. Zároveň<br />
lze mikroskopii použít pro sledování některých úseků technologických operací. Lze tak např.<br />
kontrolovat mletí kakaové hmoty či funkci emulgátorů a homogenizátorů.<br />
Mikroskopický rozbor vybraných komodit:<br />
1. Med:<br />
Mikroskopickým zkoumáním jeho sedimentu lze určit podle druhu (velikosti, tvaru a<br />
specifických znaků) pylových zrn druh medu. Lze tedy bezpečně určit jeho botanický původ<br />
(akátový, lipový, luční, lesní). Zároveň lze, v návaznosti na předchozí stanovení, určit dobu<br />
květu a tak stanovit zda se jedná o med jarní, letní nebo podzimní. Stejně tak lze stanovit i<br />
geografický původ medu. Tento fakt je důležitý zejména při dokazování úmyslné deklarace<br />
medu jiného původu (např. pravého anglického medu s nálezem pylových zrn typické<br />
australské flóry). U zkaženého medu lze pak vždy detekovat zvýšený výskyt kvasinek, plísní<br />
nebo bakterií.<br />
2. Výrobky z ovoce a zeleniny:<br />
Jedná se především o různé druhy marmelád a džemů. Jejich mikroskopickým rozborem a<br />
určením charakteristických biologických znaků jednotlivých druhů lze potvrdit nebo vyvrátit<br />
5
pravost a množství deklarovaného ovocného základu. U sušených výrobků lze<br />
mikrobiologickou detekci využít k identifikaci povrchových roztočů a nedoporučit nebo<br />
vyloučit takový výrobek z distribuční sítě.<br />
3. Koření:<br />
Při mikroskopickém rozboru koření lze zkoumat řadu parametrů typických pro daný<br />
botanický druh. Lze tak od sebe rozlišit kvalitní a nekvalitní zboží, co se týče kvality<br />
jednotlivých rostlinných druhů. Zároveň lze potvrdit či vyvrátit podezření z nastavení<br />
výrobku některou z dostupnějších a levnějších komodit ( nastavení pepře škrobem). Při<br />
rozboru koření se tak sledují především tvary a velikost buněk, trichomů, sekrečních kanálků,<br />
zásobních buněk a škrobových zrn. Dále se sleduje struktura povrchu listů a průduchů po<br />
obou jejich stranách, tvar a velikost pylových zrn, sklerenchymatických buněk.<br />
Mikroskopicky lze rovněž detekovat pro daný druh charakteristické sloučeniny (např. šťovan<br />
vápenatý ve vanilce, oxalát vápenatý v česneku).<br />
4. Káva:<br />
Mikroskopickým rozborem kávy lze určit její pravost, tzn. botanický druh deklarovaného<br />
zboží. Dále lze ve výrobku detekovat možný obsah kávovinových náhražek, jako jsou fíky,<br />
čekanka, řepa, pampeliška, žito nebo ječmen.<br />
5. Mlýnské výrobky:<br />
U mlýnských výrobků se mikroskopicky detekují především různé typy jednoduchých a<br />
složených škrobových zrn, aleuronových buněk a různě veliké úlomky oplodí a osemení. Lze<br />
tak u nich určit druh použitého základu a u směsí i přibližný poměr jednotlivých mouk.<br />
Cílem přednášky nebylo přinést vyčerpávající přehled možností, ale informovat o stavu<br />
projektu, na jehož řešení se v rámci postgraduálního studia podílím. Do budoucna<br />
předpokládám, že budeme rozvíjet především postupy identifikace technologických vad u<br />
potravin z ovoce, zeleniny, koření a dalších příbuzných produktů, rádi bychom pokračovali<br />
v přípravě databáze pro identifikaci fyzikálních nebezpečí ve vztahu k HACCP. Vzhledem<br />
k falšování potravin bude postup zřejmě doplňkem k analýzám autenticity prováděných na<br />
základě analýzy chemických markerů.<br />
3) Historie<br />
Již od pradávna toužil člověk vidět věci menší než ty, které mohl vidět pouhým okem. Prvním<br />
krokem k tomu bylo zvládnutí techniky broušení čoček do brýlí italskými mnichy ve 14.<br />
století. Tato technika se rychle rozšířila po Evropě. Někteří optici začali upozorňovat, že<br />
pomocí dvou čoček lze vidět věci zvětšené.<br />
6
Patrně jako prvý sestrojil použitelný mikroskop holandský brusič čoček a výrobce brýlí<br />
Zacharias Jansen někdy kolem roku 1590. Při jeho konstrukci použil jak konkávní (vyduté),<br />
tak konvexní (vypouklé) čočky.<br />
Italský astronom a matematik Galileo Galilei vylepšil Jansenův vynález a použil jej k<br />
vědeckým účelům, např. aby prozkoumal mravenčí oko.<br />
Ale teprve Anthony van Leeuwenhoek, holandský obchodník s látkami z Delftu, přispěl<br />
významnou měrou ke zdokonalení dosud primitivního přístroje Jeho koníčkem bylo foukání<br />
skla a jemná práce s kovem. Vymyslel, jak přesně vybrousit čočky a jak je sestavit a upevnit,<br />
aby vytvořily silný zvětšovací efekt. Díky svému mikroskopu mohl zkoumat strukturu vláken<br />
látek které prodával. Později začal také zkoumat listy, květiny a drobné organizmy, např.<br />
včely nebo vši. Studoval rovněž lidskou krev, kůži a vlasy. Jako první na světě viděl a popsal<br />
krevní buňky.<br />
Van Leeuwenhoek (1632-1723)<br />
(převzato z http://neon.chemistry.ox.ac.uk/icl/heyes/structure_of_solids/Lecture1/leeuwenhoek.jpg)<br />
Van Leeuwenhoek sice dokázal nedocenitelný přínos mikroskopu v mnoha oblastech vědy,<br />
jeho přístroj však byl jednočočkový. Tím byly možnosti mikroskopu značně omezeny<br />
(přestože jeho čočky zvětšovaly až 270x). V roce 1665 vynalezl anglický fyzik a chemik<br />
Robert Hooke tzv. složený mikroskop s více čočkami. Zkoumal jím slabé plátky korku, který<br />
byl vyhledávaným materiálem loďařského průmyslu. přitom zjistil, že živé látky jsou tvořeny<br />
buňkami.<br />
7
Van Leeuwenhoekeův mikroskop<br />
(převzato z http://www.ucmp.berkeley.edu/history/leeuwenhoek.html)<br />
V lékařském světě použil mikroskop např. Francouz Luis Pasteur při objevu kvasinek nebo<br />
Robert Koch při objevu bacilů tuberkulozy a cholery.<br />
8
Němec Carl Zeiss vyrobil první mikroskop ("Stand 1") v r. 1857<br />
(převzato z http://micro.magnet.fsu.edu/optics/timeline/people/zeiss.html)<br />
V 19. století prožívá mikroskop dramatický vývoj. Přispěli k tomu především Carl Zeiss,<br />
který věnoval významné úsilí výrobě mikroskopů, Ernst Abbe, jehož jména je spojováno<br />
s teoretickou studií optických principů a Otto Schott, který vedl výzkum optického skla.<br />
Zeissův mikroskop z roku 1934<br />
(převzato z http://www.neurosurgery.org/cybermuseum/artgallery/collect/room1.html#zeiss)<br />
9
Optický (paprskový) mikroskop dosáhl ve 30. letech své teoretické hranice. Ta je limitována<br />
500násobným nebo 1000násobným (2000násobným) zvětšením a rozlišením 0,2 mikrometru.<br />
Vědci však chtěli vidět detaily buněk. To vyžadovalo zvětšení řádově 10 000násobné.<br />
Ernst Ruska<br />
(převzato z http://neon.chemistry.ox.ac.uk/icl/heyes/structure_of_solids/Lecture1/ruska.jpg)<br />
Bylo tedy nutno zkonstruovat mikroskop na jiném principu. Místo světelného paprsku se zde<br />
využívá elektronový paprsek (tok rychlých elektronů), místo skleněné čočky čočka<br />
magnetická. První mikroskop na tomto principu byl vyvinut v Německu v roce 1931 a<br />
zasloužili se o to především Max Knoll a Ernst Ruska. Byl to tzv. prozařovací elektronový<br />
mikroskop (TEM – Transmission Electron Microscope), kdy elektronové paprsky procházely<br />
zkoumaným předmětem (urychlovací napětí až 20 kV) a vytvořily stínový obraz (jako např.<br />
při promítání diapozitivu). Druhý typ elektronového mikroskopu, tzv. skenovací (SEM –<br />
Scanning Electron Microscope), se objevil v roce 1942, komerčně však byl požíván až kolem<br />
roku 1965, kdy se podařilo zvládnout skenování (postupné bombardování elektrony) vzorku<br />
(podobně jako např. při skenování fotografií). U tohoto typu mikroskopu je nutné urychlovací<br />
napětí pro elektrony 60 až 80 kV a jejich zvětšení je 30 000násobné a s kombinací<br />
s mikroskopem optickým až 100 000násobné.<br />
10
Elektronový mikroskop z roku 1938<br />
(převzato z http://helios.physics.utoronto.ca/%7Einteract/microsco/microscopy.htm)<br />
Adresa – zeiss.cz<br />
Robert Koch, Nobelpreis für Medizin 1905.<br />
Koch gilt als Begründer der modernen Bakteriologie. Der Landarzt entdeckte in den 80er Jahren des vorigen<br />
Jahrhunderts die Tuberkelbazillen und Choleraerreger. "Verdanke ich doch einen großen Teil meiner Erfolge<br />
Ihren ausgezeichneten Mikroskopen", schrieb Koch an Zeiss; 1904 erhielt er das 10.000ste Objektiv homogener<br />
Immersion zum Geschenk.<br />
11
Richard Zsigmondy, Nobelpreis für Chemie 1925.<br />
Der Göttinger Professor führte bahnbrechende Arbeiten auf dem Gebiet der Kolloidchemie aus. Er erfand 1903<br />
das Ultramikroskop, 1918 den Membranfilter und 1922 den Ultrafeinfilter. Die Spaltultramikroskopie<br />
(nach Siedentopf/Zsigmondy) läßt winzig kleine Teilchen sichtbar werden, deren Linearausdehnung unter der<br />
Auflösungsgrenze liegt.<br />
Frits Zernike, Nobelpreis für Physik 1953.<br />
Der niederländische Physiker entdeckte 1930 beim Experimentieren mit Reflektionsgittern, daß er die Phasenlage<br />
der einzelnen Lichtstrahlen beobachten konnte, und wollte diese Erkenntnis auf das Mikroskop übertragen.<br />
Zusammen mit Zeiss entwickelte er das erste Phasenkontrastmikroskop, 1936 als Prototyp hergestellt. Es<br />
ermöglichte ein Studium lebender Zellen, ohne sie durch chemische Färbung zu schädigen<br />
Manfred Eigen, Nobelpreis für Chemie 1967.<br />
Der Biophysiker und Gründer des Max-Planck-Instituts für Biophysikalische Chemie in Göttingen entwickelte ein<br />
Verfahren zum Einzelmolekül-Nachweis. Im Zusammenwirken mit seinem schwedischen Kollegen Rudolf Riegler<br />
sowie den Firmen EVOTEC und Carl Zeiss gelang 1995 die Herstellung des ersten kommerziell verfügbaren<br />
Fluoreszenz-Korrelations-Spektrometers ConfoCor.<br />
Erwin Neher, Nobelpreis für Medizin 1991.<br />
Zusammen mit Professor Sakmann entdeckte er am Max-Planck-Institut in Göttingen die grundlegenden<br />
Mechanismen der Kommunikation zwischen Zellen. Dabei wurden elektrophysiologische Untersuchungen an<br />
Ionenkanälen mit der Patch-Clamp Technik durchgeführt.<br />
12
Bert Sakmann, Nobelpreis für Medizin 1991.<br />
Für die visuelle Kontrolle bei diesen versuchen benötigten die beiden Wissenschaftler Bilder mit<br />
ausgezeichnetem Kontrast und hoher optischer Auflösung. Es wurden speziell für diese Anwendungen<br />
konstruierte aufrechte Mikroskope eingesetzt - ausschließlich von Carl Zeiss.<br />
Die Grenzen brechen auf, die Grenzen verschwinden. Neue Dimensionen eröffnen sich, die noch vor<br />
Jahren als Science-fiction gegolten hätten. Und die technologischen Möglichkeiten ultramoderner<br />
Mikroskopie sind noch längst nicht ausgeschöpft.<br />
Telemikroskopie rund um den Erdball. Lichtschnelle digitale Kommunikation. Räumliche Bildserien,<br />
hochaufgelöst, kontrastreich, zeitecht...<br />
Screening-Technologie von Carl Zeiss ausgezeichnet<br />
Jena, 06.12.2002. Für seine herausragenden Leistungen bei der Entwicklung eines Systems zur<br />
automatisierten Wirkstoffsuche in der Pharmaforschung hat Dr. Klaus Mlejnek, Leiter des<br />
Geschäftsbereiches Molekulare Medizin bei Carl Zeiss Jena, den 2002 SBS Accomplishment Award<br />
erhalten. Mit diesem Preis zeichnet die Gesellschaft für Biomolecular Screening (SBS) in jedem Jahr<br />
Mitglieder aus, die sich um die Förderung der Wirkstoffsuche verdient gemacht haben. Nach den<br />
Worten des Präsidenten der SBS, Dr. Thomas D.Y. Chung, wird die Beteiligung Dr. Mlejneks "an der<br />
Entwicklung des innovativen modularen Zeiss Systems zum Proben-Screening als ein bedeutender<br />
Beitrag auf dem Gebiet der Medikamentenentwicklung anerkannt".<br />
Das Screening großer pharmazeutischer Substanzbibliotheken hat zum Ziel, schnell geeignete<br />
Wirkstoffe für die Medikamentenentwicklung zu finden. Mit dem UHTS-System plate::explorer® von<br />
Carl Zeiss können mehrere 100.000 Proben am Tag auf ihre Eignung als potenzielle Wirkstoffe<br />
untersucht werden. Herzstück des Systems ist der plate::vision® Multimode Reader, der die<br />
vollautomatische Messung von Mikrotiterplatten mit höchster Datenqualität in extrem kurzer Zeit<br />
ermöglicht. Das System ist weltweit in der Pharmaindus-trie im Einsatz, so an allen<br />
Forschungsstandorten von F. Hoffmann-La Roche.<br />
Der mit 1000 US $ dotierte SBS Award wurde auf der 8. Jahrestagung der Gesellschaft für<br />
Biomolecular Screening in Den Haag, NL an Dr. Mlejnek übergeben. Die Gesellschaft ist 1994 als<br />
Forum des Wissens- und Informationsaustausches zwischen Spezialisten der Pharmaforschung und<br />
damit verbundener Disziplinen gegründet worden. Sie bietet ihren mehr als 2000 Mitgliedern<br />
verschiedene Publikationen, Veranstaltungen und Bildungsprogramme.<br />
13
Z knížky<br />
Současnost<br />
Optický (paprskový) mikroskop dosáhl ve 30. letech své teoretické hranice. Ta je limitována<br />
500násobným až 1000násobným zvětšením a rozlišením 0,2 mikrometru.<br />
Rozdělení<br />
Podle počtu okulárů:<br />
1) Monokulární<br />
2) Binokulární<br />
3) Trinokulární<br />
14
Podle výsledného obrazu:<br />
1) Fluorescenční<br />
2) Polarizační<br />
3) Interferenční<br />
4) Fázově kontrastní<br />
5) + řada dalších (UV, Rtg, IČ)<br />
4) Princip zobrazení<br />
Z knížky<br />
Pozorovaný předmět je postaven mezi jednoduchou a dvojitou ohniskovou vzdálenost<br />
objektivu tak, aby se zobrazil jako skutečný zvětšený a převrácený obraz – obr.1. Obraz<br />
předmětu vzniká v přiměřené vzdálenosti za dvojitou ohniskovou vzdáleností zvanou optický<br />
interval (délka optického tubusu). Je určena mechanickou délkou tubusu, která se měří od<br />
dosedací plochy objektivu k dosedací ploše okuláru. Není pro všechny objektivy stejná a<br />
obvykle se pohybuje okolo 170 mm.<br />
Tento obraz pak pozorujeme okulárem jako lupou a získáme neskutečný a zvětšený obraz –<br />
obr.2.<br />
Adresa – <strong>mikroskopy</strong>.cz<br />
Diagram optické dráhy<br />
Na následujícím obrázku je znázorněn diagram optické dráhy s mikrofotografickým zařízením.<br />
2. Princip zvětšení<br />
Činnost mikroskopu je založena na vhodném uspořádání dvou systémů s konvexními<br />
čočkami. Při tomto uspořádání dochází ke zvětšení vzorku.<br />
V blízkosti vzorku je systém konvexních čoček Lo, který se nazývá objektiv. Tento objektiv<br />
vytváří skutečný obraz A' B' se zvětšením 1 až 100. V blízkosti oka je systém čoček Le, který<br />
se nazývá okulár, má zvětšení 20 až 50 a vytváří neskutečný obraz A"B". Obrazový prostor je<br />
ve vzdálenosti asi 250 mm od oka.<br />
Člověk tedy pozoruje zvětšení odpovídající obrazu A"B".<br />
15
Pozorovaný předmět je postaven mezi jednoduchou a dvojitou ohniskovou vzdálenost<br />
objektivu tak, aby se zobrazil jako skutečný zvětšený a převrácený obraz – obr.1. Obraz<br />
předmětu vzniká v přiměřené vzdálenosti za dvojitou ohniskovou vzdáleností zvanou optický<br />
interval (délka optického tubusu). Je určena mechanickou délkou tubusu, která se měří od<br />
dosedací plochy objektivu k dosedací ploše okuláru. Není pro všechny objektivy stejná a<br />
obvykle se pohybuje okolo 170 mm.<br />
Tento obraz pak pozorujeme okulárem jako lupou a získáme neskutečný a zvětšený obraz –<br />
obr.2.<br />
2. Aperturní clona kondenzoru<br />
Tato clona je připevněna k čočce kondenzoru a používá se k řízení rozlišení, kontrastu a hloubky ostrosti. Tyto<br />
parametry však nelze nastavit nezávisle.<br />
Rozlišení Kontrast Hloubka ostrosti Jas<br />
Aperturní clona kondenzoru zcela otevřená Velké Malý Malá Velký<br />
Aperturní clona kondenzoru zcela zacloněná Malé Velký Velká Malý<br />
Obecně lze říci, že optimální nastavení aperturní clony kondenzoru je 70-80% numerické<br />
16
apertury objektivu. Pokud je tato clona zacloněná více než na 70%, pak dochází ke snížení<br />
jasu. Současně se však zvětšuje kontrast a hloubka ostrosti se zvětší dvakrát.<br />
Adresa - httpwww.physics.muni.cz~kubenaoptika1sld001.htm<br />
httpwww.physics.muni.cz~kubenaModerni%20metody31_souboryframe.htm<br />
a mnoho dalších.....<br />
17
Z knížky<br />
Pro přesměrování<br />
světla do fotografického přístroje nebo televizní kamery jsou určeny<br />
trinokulární tubusy. Mikroskop však může mít pro fotografický přístroj nebo televizní kameru<br />
jeden i více samostatných výstupů. Jednoduché trinokuláry dělí světelné paprsky zrcadly,<br />
lepší jsou vybavené hranoly.<br />
5)<br />
Složení optického mikroskopu + 6) Základní používané pojmy<br />
Adresa - httpwww.arid.cznikcovite.htm<br />
Víte všechno o světelných mikroskopech ?<br />
Rádi bychom Vám pomohli osvěžit a rozšířit si znalosti o mikroskopech. Nabízíme Vám krátký souhrn<br />
poznámek o světelných mikroskopech, používaných převážně v biologii a medicíně. Přivítáme Vaše<br />
připomínky a přání k textu, který Vám předkládáme.<br />
Světelný mikroskop<br />
je optická soustava, určená k pozorování drobných - mikroskopických - objektů při velkém zvětšení až<br />
1000x, případně 1500x. Hranice zvětšení ve světelném mikroskopu je dána vlnovými vlastnostmi<br />
světla. Obrazy z mikroskopu pozorujeme zrakem, takže o výsledné kvalitě obrazu rozhoduje nejen<br />
technická dokonalost mikroskopu, ale také psychofyziologická kondice uživatele.<br />
Základní díly mikroskopu:<br />
Stativ<br />
Úplný mikroskop<br />
se skládá z mechanického tělesa, které tvoří stativ se stolkem, tubusem a<br />
osvětlovací soupravou s kondenzorem, a z optických dílů: okulárů a objektivů v otočném revolverovém<br />
nosiči. U běžných mikroskopů nejsou jednotlivé díly pevnou součástí stativu, lze je vyměňovat a<br />
sestavit tak mikroskop různým způsobem podle požadavků metody, kterou chceme použít. Mluvíme<br />
pak o “stavebnicových” mikroskopech. Jednotlivé díly mikroskopů se často nazývají "moduly".<br />
Zaostřování obrazu v mikroskopu se provádí změnou pozorovací vzdálenosti dvojitým souosým<br />
knoflíkem na obou stranách stativu mikroskopu. Vnější - větší - knoflík je pro hrubé nastavení, vnitřní -<br />
menší - knoflík pro jemné zaostřování. Knoflík jemného posunu bývá opatřen stupnicí, nejmenší dílek<br />
odpovídá obvykle posunu o 1µm. Posun může být opatřen nastavitelnou zarážkou, vymezující pohyb<br />
ve směru zmenšování pozorovací vzdálenosti - to ulehčuje návrat do roviny ostrosti při výměně<br />
vzorků. Rovněž je obvyklé, že můžeme nastavit odpor proti pohybu při zaostřování (samostatným<br />
prstencem na společné ose se zaostřovacími knoflíky). Zaostřování se u vzpřímených mikroskopů<br />
děje svislým pohybem stolku, při zaostřování inverzních mikroskopů se může pohybovat revolverový<br />
nosič objektivů - stolek má pak pro uložení preparátu pevnou základní desku, která je součástí stativu<br />
a po ní se pohybuje vodič preparátu.<br />
Stolek mikroskopu slouží pro uložení<br />
pozorovaného vzorku do optické osy mikroskopu. Preparáty<br />
jsou nejčastěji na standardních podložních sklíčkách (76x26x1mm), bývají většinou zakryty krycím<br />
sklíčkem. U krycího sklíčka je nutno dbát na jeho kvalitu, má mít tloušťku přesně 0,17mm, být zcela<br />
čiré a planparalelní. Na tloušťku 0,17mm jsou vesměs korigovány objektivy, není-li tato hodnota<br />
dodržena, může to mít za následek zhoršení obrazu. Některé dražší objektivy jsou vybaveny korekcí<br />
na tloušťku krycího skla. To má význam hlavně u inverzních mikroskopů, kde preparát často<br />
pozorujeme přes Petriho misku nebo dno skleněné kultivační nádoby.<br />
18
Dříve měly jednoduché <strong>mikroskopy</strong> stolky, opatřené dvěma svorkami, které přidržovaly podložní<br />
sklíčko s preparátem - vyhledávání se provádělo ručním posunováním sklíčka po stolku. Moderní<br />
<strong>mikroskopy</strong> mají vodič objektu (vodič preparátu), do kterého se upíná podložní sklíčko (nebo jiný<br />
nosič) s preparátem. Posun se provádí po ploše stolku ve dvou osách dvojitým souosým vrubovaným<br />
knoflíkem, umístěným většinou na pravé straně stolku tak, aby jej bylo možné pohodlně obsluhovat.<br />
Většinou je pohyb možné sledovat na stupnicích s milimetrovým dělením. To usnadňuje vyhledání<br />
místa na preparátu.<br />
Vodiče objektu mikroskopů NIKON Eclipse jsou upraveny k současnému uložení až dvou podložních<br />
sklíček. Povrch stolku je často vystaven působení různých chemikálií, bývá opatřen odolným nátěrem<br />
nebo volitelně keramickou vrstvou. Stolky inverzních mikroskopů jsou upraveny pro uložení velkých<br />
objektů - Petriho misek, Terasakiho komůrek nebo kultivačních lahví. Polarizační <strong>mikroskopy</strong> mají<br />
kruhové otočné stolky, opatřené stupnicí (360°).<br />
Tubus je základním dílem stativu a vsazuje se do něho nástavec pro okuláry, vesměs výměnný a<br />
upravený pro jeden nebo dva okuláry (monokulární<br />
nebo binokulární tubus), případně s dalším<br />
optickým výstupem (trinokulární tubus). Na opačném konci je k tubusu je připevněn otočný<br />
revolverový nosič objektivů, do kterého se závitem upevňují objektivy. Optická a mechanická délka<br />
tubusu patří k základním parametrům mikroskopu.<br />
Osvětlovací souprava se skládá ze síťového transformátoru na 220V/50Hz s regulací výstupního<br />
napětí (6 nebo 12 V=), kterým se napájí halogenová žárovka o výkonu 20 až 100W. Mikroskopy s<br />
vyšším výkonem žárovky mají samostatnou lampovou skříňku, nutnou pro lepší odvádění tepla, která<br />
se ke stativu připevňuje bajonetem. Velké <strong>mikroskopy</strong> mají v samostatné skříňce také napájecí<br />
transformátor. Regulace světelného výkonu žárovky se pak může provádět buď na tomto zdroji, nebo<br />
je přenesena do stativu (volitelné). Vzhledem k tomu, že se jen malá část výkonu žárovky promění ve<br />
světelné záření a zbytek (kolem 90%) v teplo, je nutné dbát na to, aby kolem lampové skříňky mohl<br />
volně proudit vzduch.<br />
Otočný revolverový nosič objektivů může pojmout pět až šest objektivů, které se do něj upevňují<br />
závitem. Revolverový nosič<br />
je připojen ke stativu buď trvale, nebo je výměnný. Výměnný revolver je<br />
výhodný při používání více druhů objektivů, pro metodu DIC je to podmínka (revolverový nosič pro tuto<br />
metodu musí být upraven pro zasunutí hranolů).<br />
Kondenzor. Abychom mohli osvětlení v mikroskopu účelně nastavit, je v dráze paprsků osvětlovací<br />
soustavy kondenzor, který je součástí osvětlovací soustavy mikroskopu. Rozlišovací schopnost<br />
objektivů mikroskopu může být dokonale využita jen tehdy, je-li osvětlení preparátu provedeno pomocí<br />
kondenzoru kuželem paprsků o určité nejmenší apertuře.<br />
Kondenzor je umístěn (u vzpřímených mikroskopů) pod stolkem, nesoucím preparát. Bývá většinou<br />
svisle posuvný v samostatném pomocném stolku, ze kterého jej lze snadno vyjmout. Důležité je, aby<br />
optická osa osvětlovací soustavy procházela středem kondenzoru.<br />
Toho dosáhneme přesným<br />
vystředěním jeho polohy pomocí středících šroubů. Kondenzor je opatřen irisovou clonou, ovládanou<br />
páčkou. V lepším případě se tato páčka pohybuje podél stupnice, udávající numerickou aperturu<br />
kondenzoru. Tuto hodnotu potřebujeme ke správnému nastavení. Numerická apertura kondenzoru<br />
má<br />
být vždy menší, než je apertura objektivu (přibližně 70%). Při nastavování osvětlení (včetně<br />
kondenzoru) postupujeme podle návodu, který navrhl Köhler (tzv. Köhlerovo nastavení - je popsáno<br />
dále).<br />
Základní typy kondenzorů jsou většinou podle svého konstruktéra jsou označeny jako Abbeho<br />
kondenzory, jsou vhodné pro objektivy se zvětšením od 4x až do 100x. Při použití objektivů s malým<br />
zvětšením<br />
mohou nastat potíže, protože se neosvětlí rovnoměrně celé zorné pole. Pro objektivy s<br />
malým zvětšením (2x až 0,5x) jsou k dispozici kondenzory s nízkou numerickou aperturou. Takové<br />
kondenzory se však nehodí pro objektivy s velkým zvětšením.<br />
Velmi kvalitní obraz při použití objektivů s olejovou imerzí zajišťují kondenzory pro olejovou imerzi - na<br />
ně se - podobně jako na preparát - nanese kapka imerzního oleje, takže paprsky procházejí po<br />
výstupu z kondenzoru homogenním prostředím se stejným indexem<br />
lomu.<br />
Zvláštní konstrukcí se vyznačují tzv. univerzální kondenzory. Mají vestavěný karusel, ovládaný<br />
zvenčí, do kterého jsou vloženy volitelné moduly: fázové prstence, prstenec pro tmavé pole, případně<br />
může být tento kondenzor vybaven moduly pro diferenciální interferenční nebo<br />
Hoffmanův kontrast.<br />
Vložené prstence jsou obvykle příslušné k objektivu. Pro fázový kontrast bývají označeny jako Ph1,<br />
19
Ph-2 atd., tyto údaje jsou též na fázových objektivech. Podobné prstence se vkládají do kondenzoru<br />
při použití Hoffmanova kontrastu. Univerzální kondenzor může být upraven pro diferenciální<br />
interferenční kontrast podle Nomarského (DIC). Karusel kondenzoru pro DIC má jinou mechanickou<br />
konstrukci, která umožňuje vkládání hranolů.<br />
Pro pozorování v tmavém poli (v zástinu) musí být kondenzor rovněž vybaven doplňkem (clonou)<br />
pro<br />
tento způsob pozorování.<br />
Inverzní <strong>mikroskopy</strong> mají optickou soustavu "vzhůru nohama", tj. objektivy jsou pod preparátem a<br />
kondenzor s osvětlovací soupravou<br />
nad ním. Zde často záleží na tom, aby mezi výstupní čočkou<br />
kondenzoru a pozorovaným preparátem byl dostatečný prostor pro manipulaci (např. pro<br />
mikromanipulátory). Proto jsou kondenzory a podobně i objektivy u inverzních mikroskopů sestrojeny<br />
tak, aby jak pozorovací vzdálenost, tak i vzdálenost mezi preparátem a kondenzorem byly delší, než<br />
je<br />
běžné. Takové optické prvky bývají označeny LWD (long working distance = dlouhá pracovní<br />
vzdálenost), ELWD (extra long working distance), případně i SLWD (super long working distance =<br />
mimořádně dlouhá pracovní vzdálenost).<br />
Okuláry a tubusy<br />
Obraz v mikroskopu pozorujeme okulárem. Novější <strong>mikroskopy</strong> jsou vybaveny tubusem pro dva<br />
okuláry (binokulární tubus), takže obraz pozorujeme současně oběma očima. Obraz však u běžného<br />
mikroskopu není stereoskopický, protože se díváme přes jeden, oběma okulárům společný objektiv.<br />
Pro malá zvětšení jsou používány stereo<strong>mikroskopy</strong> (preparační lupy), které pozorují obraz<br />
stereoskopicky současně dvěma samostatnými optickými systémy. Tubus se dvěma okuláry se<br />
nazývá binokulární tubus. Pro přesměrování světla do fotografického přístroje nebo televizní kamery<br />
jsou určeny tubusy s dalším výstupem, které se nazývají trinokulární tubusy. Mikroskop však může<br />
mít pro fotografický přístroj nebo televizní kameru jeden i více samostatných výstupů. Jednoduché<br />
trinokuláry dělí světelné paprsky zrcadly, lepší jsou vybavené hranoly. Poměr mezi množstvím světla,<br />
které je vedeno do okuláru a do třetího výstupu může být 100-0% a naopak nebo u lepších trinokulárů<br />
kromě toho ještě 80-20% i jiný.<br />
Okuláry jsou výměnné. Mohou být rozděleny podle optické konstrukce, podle zvětšení a podle<br />
velikosti pozorovaného obrazového<br />
pole (které je kruhové). Kritériem pro jakost okulárů je stupeň<br />
odstranění tzv. zbytkových vad: barevné vady, sklenutí a astigmatismu. Běžné okuláry mají zvětšení<br />
10x, jsou však okuláry se zvětšením 5x, 12,5x , 15 x a jiné.<br />
Průměr zorného pole v okuláru se zmenšuje se stoupajícím zvětšením. Někdy se této veličině říká<br />
"číslo pole" - z anglického "field number" (zkratka "F.N."). Průměr<br />
zorného pole je závislý též na<br />
objektivu. Dobrý mikroskop má pro okuláry 10x průměr zorného pole kolem 20mm, velmi kvalitní<br />
<strong>mikroskopy</strong> mohou mít průměr zorného pole až 25mm. K zobrazení tak velkého zorného pole jsou<br />
nutné tzv. širokoúhlé okuláry (ozn. "UW").<br />
Dobré okuláry mají možnost nastavit dioptrickou korekci pro uživatele, kteří nosí brýle. Zaostření<br />
obrazu pak závisí též na nastavení dioptrických<br />
korekcí v okulárech. Tato okolnost má vliv na správné<br />
zaostření mikrofotografického snímku, nemá-li mikrofotografický přístroj samostatný zaostřovací<br />
okulár.<br />
Měření pomocí mikroskopu<br />
Do okuláru se vkládá destička s pomocnou sítí (např. souřadnicové osy X a Y, čtvercová nebo<br />
kružnicová síť) nebo měřítko (obvykle<br />
1 mm rozdělený na 100 dílků). Rovněž může být v okuláru<br />
fotografická "maska" - rámeček, vymezující obrazové pole snímku. Okulárový mikrometr je<br />
samostatná pomůcka, která se vkládá do tubusu místo okuláru a rovněž slouží k měření délek. Pokud<br />
nám pro srovnání velikostí stačí relativní hodnoty délek, nemusíme mikroskop kalibrovat. Pro<br />
stanovení absolutní velikosti měřených délek potřebujeme ještě objektivové měřítko, kterým pro danou<br />
soustavu objektiv - okulár vypočítáme kalibrační faktor. To je číslo, kterým musíme násobit počet<br />
dílků okulárového měřítka, abychom dostali měřenou úsečku v jednotkách délky (milimetry,<br />
mikrometry atd.).<br />
20
Binokulární tubus má vždy možnost nastavit podle tvaru hlavy uživatele vzdálenost očních pupil. To<br />
je nezbytné, mají-li<br />
se obraz, pozorovaný každým okem zvlášť, spojit do jediného obrazu. Některým<br />
uživatelům to může činit zpočátku potíže.<br />
Do výstupu pro připojení fotografického přístroje se do trinokulárního tubusu vkládá projektiv, který<br />
má mít vlastnosti, zlepšující rovinatost a chromatickou<br />
korekci obrazu. Zvětšení v rovině<br />
fotografického snímku není shodné se zvětšením v okulárech, bývá větší. Tento rozdíl je u použití<br />
televizní kamery pro snímaní obrazu z mikroskopu ještě výraznější a je nutné s ním počítat. Hlavním<br />
důvodem pro tuto neshodu je u televizní kamery jednak to, že její čip je obdélníkový a jeho<br />
úhlopříčka<br />
je kratší, než průměr obrazového pole mikroskopu a pak také to, že se do adaptéru nevkládá projektiv,<br />
jako u fotografického nástavce. Vyrábějí se optické adaptéry, které tuto neshodu odstraňují, avšak<br />
nejsou levné.<br />
Objektivy<br />
Jsou nejvýznamnější částí mikroskopu, která rozhoduje o jeho kvalitě, jsou objektivy. Jejich vlastnosti<br />
prošly dlouhým<br />
vývojem - od jednoduché čočky až k dnešním dokonalým objektivům.<br />
OPTICKÝ SYSTÉM Nikon CFI60 pro <strong>mikroskopy</strong> Nikon ECLIPSE<br />
Na základě dlouholetých zkušeností s objektivy CF provedl Nikon vývoj nových optických systémů,<br />
jehož výsledkem jsou objektivy Nikon CFI60 s vlastnostmi, předstihujícími<br />
podobné objektivy jiných<br />
značek. Tyto objektivy charakterizuje Nikon označením “redefinice nekonečna”. Na trh byly tyto<br />
objektivy zavedeny v r. 1997.<br />
Vývoj základních vlastností objektivů Nikon ukazuje tabulka:<br />
parfokální<br />
vzdálenost<br />
objektivový závit<br />
(průměr)<br />
optická délka<br />
tubusu<br />
do r. 1976 1976 – 1996 od r. 1996<br />
33,6mm 45mm 60mm<br />
20,3mm 20,3mm<br />
25mm<br />
160mm 160mm nekonečná Objektivy Nikon CFI60 mají následující významné vlastnosti:<br />
• zdokonalenou kompenzaci zbytkové barevné vady a zdokonalenou rovinatost obrazu<br />
• prodlouženou pracovní vzdálenost<br />
• vyšší numerickou aperturu<br />
• zvětšení 0,5x u objektivu Nikon CFI Macro Plan UW (pro ECLIPSE E800M a E1000M)<br />
• vysokou propustnost pro uv-záření, významné<br />
při fluorescenčních metodách a při<br />
diferenciálním interferenčním kontrastu (metoda DIC)<br />
• delší paralelní optická dráha paprsků při průchodu tubusem z objektivu do okuláru.<br />
“Nekonečná” délka tubusu je mimo jiné výhodná pro vkládání modulů<br />
(fluorescence, mikrofotografie,<br />
diskusní zařízení, vložky pro zvýšení polohy okulárů atd.) do stativu mikroskopu mezi objektivy<br />
a<br />
okuláry. Při vkládání modulů není u této optiky nutné, aby měly další optiku (pomocné čočky).<br />
Objektivy Nikon CFI60 pro pozorování ve světlém poli jsou dodávány v následujících typech:<br />
typ použitelnost pro<br />
21
UV-záření fluorescenci<br />
CFI Plan<br />
omezeně ano ano<br />
Apochromát<br />
CFI Plan Fluor<br />
ano ano ano<br />
CFI Plan nedoporučené ano<br />
omezeně<br />
Achromát<br />
CFI Achromát<br />
FF<br />
DIC<br />
omezeně ano nedoporučené<br />
Objektivy Nikon CFI jsou vyráběny též pro fázový kontrast (CFI Achromát FF, CFI Plan Achromát, CFI<br />
Plan Fluor a CFI Plan Apochromát) a pro Hoffmanův kontrast (CFI HMC 10x, CFI HMC 20x F a CFI<br />
HMC LWD 40x C).<br />
Optika CFI je doplněna<br />
okuláry se zvětšením 10x - 12,5x a 15x se zorným polem až 25mm a<br />
projekčními okuláry PLI 2x – 2,5x – 4x a 5x.<br />
Vlastnosti objektivů udávají číselné hodnoty pro<br />
zvětšení, numerickou aperturu, parfokální<br />
vzdálenost, pozorovací (pracovní) vzdálenost a průměr vstupní / výstupní pupily. Rovněž stupeň<br />
odstranění zbytkových vad (aberace) je stejně jako u okulárů důležitým kritériem pro jejich jakost.<br />
Numerická apertura (zkratka n.a.) je součin indexu lomu prostředí mezi vstupní čočkou objektivu a<br />
preparátem (krycím sklem) a sinem poloviny otvorového úhlu objektivu. Je měřítkem pro dosažitelnou<br />
rozlišovací schopnost objektivu a tím též pro jeho zvětšení a pro světelný tok, který může objektiv<br />
zachytit. Numerická apertura je vyryta do objímky na každém objektivu dosahuje u objektivů se<br />
zvětšením 100x hodnot až 1,4.<br />
Parfokální vzdálenost je vzdálenost<br />
v milimetrech od závitu objektivu k povrchu preparátu, případně<br />
krycího skla. Má být pro všechny objektivy na jednom mikroskopu stejná, pak odpadá zaostřování při<br />
otáčení revolverovým nosičem. U nových objektivů NIKON CFI60 je tato hodnota 60mm.<br />
Pozorovací (pracovní) vzdálenost se měří od vstupní čočky objektivu k rovině preparátu (krycího<br />
skla), se stoupajícím zvětšením klesá až na zlomky milimetru. Některé objektivy mají pozorovací<br />
vzdálenost prodlouženou, označují se pak LWD nebo ELDW (jak jsme už zmínili u kondenzorů).<br />
Průměry pupil (vstupní / výstupní) určují numerickou aperturu a tím i jas obrazu. Jsou závislé na<br />
parfokální vzdálenosti Delší parfokální vzdálenost dovoluje vyšší numerickou aperturu.<br />
Názvy objektivů se u různých výrobců liší, přesto však mají hlavní skupiny podobné názvy,<br />
popisující<br />
jejich vlastnosti. Podle toho rozeznáváme:<br />
• achromáty - mají barevnou zbytkovou<br />
vadu odstraněnou jen pro dvě barvy, optimální<br />
barevná korekce je provedena pro žlutozelenou barvu, na kterou je oko nejcitlivější. Korekce<br />
pro modrou a červenou barvu nemusí být tak dokonalá. Achromáty jsou nejekonomičtější<br />
objektivy, mohou však být výhodné např. při fluorescenci, protože jsou složeny z méně čoček,<br />
takže pohlcují méně ultrafialového záření. Nové objektivy NIKON CFI Achromat FF jsou již<br />
dokonale korigovány na rovinatost obrazu (FF znamená "flat field" = rovinaté pole).<br />
• plan-objektivy, např. planachromáty, mají dokonale odstraněnou vadu sklenutí, používají se<br />
hlavně pro mikrofotografické práce. Korekce barevné vady je stejná, jako u achromátů.<br />
• apochromáty - mají již provedenou korekci barevné vady pro tři základní barvy spektra.<br />
Dosahují vyšší numerické aparatury a lepšího rozlišení pozorovaných detailů.<br />
• planapochromáty spojují vlastnosti apochromátů s plan-objektivy. Patří k nejlepším<br />
a k nejdražším objektivům.<br />
• fluoritové objektivy, - např. plan fluory (označení objektivů NIKON), využívají vynikajících<br />
optických vlastností fluoritového<br />
skla, které dobře propouští ultrafialové záření. Používají se<br />
22
hlavně pro speciální účely, např. při fluorescenční mikroskopii. Fluoritové objektivy NIKON<br />
plan fluory spojují vlastnosti kvalitních planachromátů s vysokou propustností pro krátkovlnné<br />
záření<br />
a jsou vhodné nejen pro fluorescenci, ale též pro pozorování ve světlém poli. Objektivy NIKON<br />
CFI Plan Fluor DLL lze použít pro fázový kontrast, epifluorescenci, světlé pole i pro<br />
diferenciální interferenční kontrast.<br />
Barevné označení objektivů. Pro objektivy se vžilo označení barevnými proužky, aby se usnadnila<br />
rychlá orientace při otáčení revolverovým nosičem objektivů.<br />
Tak má např. NIKON následující označení:<br />
černá 1x<br />
hnědá 2x<br />
červená 4x<br />
žlutá 10x<br />
zelená 20x<br />
světle modrá<br />
40x<br />
(světle modrá<br />
50x)<br />
kobaltově modrá 60x<br />
bílá 100x<br />
Imerzní objektivy.<br />
Objektivy se dále mohou lišit tím, zda jsou “suché” nebo určené pro imerzi. U<br />
suchých objektivů je korekce provedena tak, že mezi objektivem a krycím sklem preparátu se<br />
předpokládá vrstva vzduchu. K imerzi se nejčastěji používá zvláštní imerzní olej, méně často voda.<br />
Imerzní olej má podobný index lomu jako sklo, takže vznikne opticky homogenní prostředí: krycí<br />
sklo ›<br />
imerzní olej › objektiv, ve kterém objektiv zachytí maximum světla, které tvoří obraz v mikroskopu<br />
Tento olej má být dobré kvality, předepsaný index lomu má být 1,5130. Dříve často užívaný cedrový<br />
olej zanechává nepříjemné zbytky na objektivu. Olejová imerze se používá u objektivů s vyšším<br />
zvětšením, nejčastěji u zvětšení 100x.<br />
Podobný - i když slabší - účinek má vodní<br />
imerze. Index lomu vody je vyšší, než vzduchu, avšak<br />
nižší, než u imerzního oleje. Objektivy pro vodní imerzi mají význam hlavně tehdy, pozorujeme-li<br />
objekty, plovoucí ve vodě. Práce s vodní imerzí je méně náročná, objektivy není třeba pracně čistit od<br />
imerzního oleje.<br />
Objektivy pro práci<br />
bez krycího skla. Dále můžeme rozlišovat objektivy, vyžadující krycí sklo a<br />
objektivy pro práci bez krycího skla, označované NCG (no cover glass). Krycí sklo je součástí optické<br />
soustavy mikroskopu a musí mít tloušťku, na kterou jsou objektivy korigovány ( 0,17 mm). Rozdíly v<br />
tloušťce krycího skla mohou být příčinou pro snížení jakosti pozorovaného obrazu. Objektivy,<br />
korigované na práci bez krycího skla se používají hlavně v hematologii. Dokonalejší objektivy jsou<br />
vybaveny možností pro korekci na tloušťku krycího skla. Provádí se otočným prstencem na objektivu.<br />
Tato korekce má zvláštní význam<br />
u inverzních mikroskopů.<br />
Objektivy s irisovou clonou.<br />
Některé velmi kvalitní objektivy mohou být opatřeny irisovou clonou,<br />
která má podobnou funkci jako u fotografických objektivů. Vliv zaclonění objektivu mikroskopu na<br />
hloubku ostré kresby je však vzhledem k malým pozorovacím vzdálenostem velmi omezený, irisová<br />
clona se používá hlavně k omezení světelného toku objektivem.<br />
Optická délka tubusu. Objektivy jsou konstrukčně přizpůsobeny tzv. optické délce tubusu, která se<br />
může shodovat s jeho mechanickou délkou. Až donedávna byla optická (a současně i mechanická)<br />
délka tubusu u většiny mikroskopů 160mm. V posledních letech se vyrábějí <strong>mikroskopy</strong> s<br />
“nekonečnou” délkou tubusu, které mají četné výhody. Objektivy pro délku tubusu 160 mm nelze<br />
používat u mikroskopů s “nekonečnou” délkou tubusu a naopak. Mechanická délka tubusu u<br />
mikroskopů NIKON ECLIPSE je 200 mm, optická délka je "nekonečná".<br />
Délka tubusu v milimetrech bývá na objektivech vyznačena číslem (např. 160), případně<br />
symbolem<br />
pro nekonečno. NIKON například označuje tyto nové objektivy značkou CFI60.<br />
23
Odpružené objektivy. Výstupní čočka objektivů s velkým zvětšením je při zaostření na preparát velmi<br />
blízko krycímu sklu a může dojít k mechanickému dotyku. Proto jsou objektivy s velkým zvětšením<br />
vybaveny pružným uložením vstupní čočky, která se při dotyku krycího skla částečně zasune do<br />
pouzdra, čímž je objektiv chráněn před poškozením. Takovým objektivům se říká “odpružené”.<br />
Objektivy pro speciální pracovní postupy. Jak jsme se již zmínili, některé metody vyžadují<br />
objektivy, upravené pro tyto metody. Sem patří fázový kontrast, Hoffmanův kontrast, případně<br />
Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC). Objektivy pro DIC musí být doplněny<br />
hranoly v revolverovém nosiči objektivů a v kondenzoru. Dříve bylo pro metodu DIC nutné používat<br />
speciální objektivy, avšak NIKON CFI Plan Fluor DLL je univerzální objektiv, který lze použít k běžným<br />
postupům i pro tuto náročnou metodu.<br />
Metody různých fázových kontrastů nacházejí svoje uplatnění při pozorování objektů, které nelze<br />
barvit, jako např. při fertilizaci in vitro (metoda<br />
tzv. asistované reprodukce, umělé oplodňování).<br />
Pozorování v polarizovaném světle. Mikroskop může též sloužit pro pozorování v polarizovaném<br />
světle. Tato metoda – pokud se používá pro kvantitativní stanovení polarizačního úhlu – vyžaduje<br />
speciální okuláry a objektivy, které nemají vlastní polarizační účinky (bez vnitřního pnutí). Mikroskop<br />
musí být doplněn o polarizátor a analyzátor, může být vybaven kruhovým otočným stolkem se<br />
stupnicí. Kvalitativní polarizace v procházejícím světle se provádí s běžnými objektivy a s jednoduchou<br />
výbavou. K polarizačním mikroskopům se užívají kruhové stolky.<br />
Osvětlovací souprava mikroskopů střední a vyšší kvality je založena na principu Köhlerova<br />
osvětlení. Úplné Köhlerovo osvětlení se skládá ze zdroje světla, kolektorové<br />
čočky a irisové clony (je<br />
to dříve zmíněná polní clona). Pro naše účely stačí nastavit do optimální polohy clonu osvětlovacího<br />
systému, clonu kondenzoru (“aperturní” clona) a polohu kondenzoru. Jednoduché stativy mikroskopů<br />
mohou být vybaveny jen částečným Köhlerovým osvětlení, většinou nemají polní clonu a kolektorovou<br />
čočku.<br />
1. Umístíme preparát a zaostříme s objektivem 1:20.<br />
2. Uzavřeme clonu svítícího pole (polní clona).<br />
3. Kondenzor zvyšujeme nebo snižujeme tak dlouho, až je obraz svítícího pole ostře<br />
ohraničený. To nastává většinou v případě, když<br />
je kondenzor značně vysoko.<br />
4. Obraz svítícího pole posuneme (centrovacími šrouby kondenzoru) do středu zorného<br />
pole<br />
5. Clonu svítícího pole (polní clonu) otevřeme tak, až se okraje jejího obrazu právě shodují s<br />
okrajem zorného pole.<br />
6. Vyjmeme z tubusu okulár a pozorujeme clonu kondenzoru (aperturní clonu), kterou<br />
uzavřeme tak, aby zůstalo<br />
osvětleno ještě 2/3 průměru výstupní clony objektivu.<br />
Nemá-li mikroskop polní clonu, nastavujeme jen polohu kondenzoru a aperturní clonu. Kondenzor<br />
může být pevně uložen při výrobě, pak toto nastavení odpadá.<br />
Barevné a neutrální filtry. Součástí osvětlovací soustavy jsou filtry, které se vkládají do dráhy světla.<br />
Mohou se pokládat na výstupní čočku osvětlovací soustavy ve stativu<br />
mikroskopu, nasazovat na<br />
kondenzor nebo jsou uloženy ve stativu a vkládány pomocnými mechanizmy (páčkou apod.).<br />
Filtry můžeme rozdělit na pestré (barevné) a nepestré (neutrálně šedé). Barevné filtry mění<br />
chromatičnost pozorovaného obrazu. Běžný je modrý filtr, používaný při pozorování i při fotografické<br />
dokumentaci (označený běžně jako filtr pro "denní světlo") a zelený interferenční filtr (označovaný<br />
zkratkou "GIF"), velmi prospěšný při pozorování ve fázovém kontrastu. Nepestré - neutrálně šedé<br />
-<br />
filtry slouží k zeslabení intenzity osvětlení (podobně jako "polní" clona), přitom se však nemění<br />
chromatičnost. NIKON označuje tyto filtry počátečními písmeny ND ("neutral density").<br />
24
Kromě těchto filtrů se používají také filtry, absorbující tepelné záření.<br />
Pozorování v tmavém poli (v zástinu): Při pozorování v tmavém poli je z obrazu vyloučeno světlo,<br />
které by dopadalo přímo do objektivu. Prázdné zorné pole je při tomto postupu tmavé. Teprve to<br />
světlo, které se rozptýlí při dopadu na preparát, prochází částečně objektivem<br />
a vytváří obraz objektu,<br />
složený ze zářících bodů. Pro suché objektivy s numerickou aperturou do 0,65 není třeba zvláštních<br />
kondenzorů pro tmavé pole, stačí zastínit výstupní čočku kondenzoru clonou pro tmavé pole, která<br />
je ve volitelné výbavě mikroskopu. Protože se při tomto pozorování využívá jen zlomku světlené<br />
intenzity zdroje, má mít tento zdroj dostatečný výkon. Z hlediska světelné optiky je důležité, že při<br />
pozorování v tmavém poli září na tmavém podkladě ty části objektu, na kterých dochází ve<br />
vlastnostech světla k dostatečnému rozdílu při průchodu pozorovaným objektem, jako např. na<br />
hranách. Při tvorbě obrazu v tmavém poli nemají význam rozdíly v indexu lomu, které jsou podstatné<br />
při pozorování ve fázovém kontrastu.<br />
Pozorování ve fázovém kontrastu: Fyzikální principy fázového kontrastu nejsou snadno přístupné.<br />
Naopak praktické používání fázového kontrastu ve světlené mikroskopii nečiní většinou žádné potíže.<br />
Stručně můžeme říci, že po průchodu preparátem se světlo mění dvěma způsoby: změna amplitudy<br />
procházejícího světla nám zprostředkuje vnímání detailů kontrastů jak intenzity, tak i barev. Výsledný<br />
vjem je běžný kontrastní barevný obraz. Změna fáze světla, která nastává při průchodu objektem, není<br />
zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily, lišící se kontrastem, je pro lidský zrak průhledný,<br />
čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti převažují a proto je zrakem obtížně identifikujeme.<br />
Mikroskop, vybavený pro pozorování ve fázovém kontrastu, nám umožňuje pozorovat i takové objekty,<br />
které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší poznatky o tomto principu jsou součástí fyzikální<br />
optiky.<br />
Mikroskop pro pozorování ve fázovém kontrastu musí být pro tuto metodu vybaven. Potřebujeme<br />
objektivy pro fázový kontrast a kondenzor pro fázový kontrast. Oba tyto optické díly jsou opatřeny tak<br />
zvanými<br />
fázovými prstenci. U objektivů jsou jejich trvalou částí, u kondenzoru jsou používány podle<br />
potřeby. Objektivy pro fázový kontrast mají na jedné ze svých čoček nanesený neprůhledný "fázový"<br />
prstenec, na kterém nastává posun fáze světelné vlny. Objektivy pro fázový kontrast mohou sloužit<br />
též pro pozorování bez fázového kontrastu, avšak prstenec v objektivu způsobuje v tomto případě<br />
mírné snížení jakosti obrazu - udává se přibližně 10 %. U objektivu s malým zvětšením se toto<br />
zhoršení prakticky neprojevuje.<br />
Fázový kontrast je značně závislý na seřízení mikroskopu. K tomu se dodává účelná pomůcka, tzv.<br />
středící (centrovací) dalekohled. Ten se nasadí místo jednoho okuláru a pak pozorujeme polohu<br />
fázových prstenců, které můžeme<br />
vystředit pomocí nastavovacích prvků. Přesný postup je v návodu<br />
ke každému mikroskopu, nicméně vyžaduje trochu zkušeností. Je běžné používat pro světlé pole a<br />
fázový kontrast společné objektivy až do zvětšení 40x, pro vyšší zvětšení je téměř nutné používat pro<br />
každou metodu jednoúčelový objektiv.<br />
Kondenzor pro fázový kontrast bývá u jednoduchých mikroskopů vybaven tzv. šoupátkem,<br />
nesoucím 1 nebo 2 fázové prstence. Tyto fázové prstence jsou svým tvarem přizpůsobeny vždy<br />
objektivu s určitým zvětšením. Dokonalejší<br />
<strong>mikroskopy</strong> jsou vybaveny univerzálním otočným<br />
kondenzorem, vybaveným třemi fázovými prstenci, prstencem pro pozorování v tmavém poli a<br />
otvorem pro pozorování ve světlém poli. Volba se provádí otáčením karuselu, nesoucím jednotlivé<br />
prstence. Pozorování při fázovém kontrastu se podstatně zlepší, použijeme-li zelený interferenční<br />
filtr. Tento filtr propouští zelené světlo vlnové délky kolem 540nm, které zvyšuje vjem kontrastů.<br />
Oko<br />
je na tuto vlnovou délku světla maximálně citlivé.<br />
Fluorescenční mikroskopie<br />
Fluorescenční mikroskopie se dělí na dvě metody: pozorování v odraženém světle (epifluorescence)<br />
a pozorování v procházejícím světle (diafluorescence). Fluorescenční pozorování v procházejícím<br />
světle se v současné době téměř<br />
nepoužívá, pod pojmem fluorescence budeme rozumět výhradně<br />
pozorování odraženého fluorescenčního světla, tj. epifluorescenci.<br />
Podstatou fluorescence je buzení viditelného záření v objektech, které obsahují chemické sloučeniny<br />
(fluorochromy), schopné specificky měnit dopadající ultrafialové záření na “odražené” barevné<br />
viditelné záření. Některé biologické objekty již takové sloučeniny samy obsahují (např. chlorofyl), jiným<br />
25
je musíme dodávat specifickým barvením. Takové preparáty jsou často<br />
zdrojem viditelného záření<br />
pouze dočasně.<br />
Pro fluorescenci potřebujeme samostatnou osvětlovací soustavu. Jednak musí světlo dopadat na<br />
objekt (podstata epifluorescence) a za druhé musí mít určitou vlnovou délku, často z oblasti<br />
ultrafialového záření.<br />
Výbava mikroskopu pro fluorescenci se skládá ze zdroje záření, nástavce pro<br />
osvětlení dopadajícím světlem, držáku s výměnnými fluorescenčními filtry a ochranného oranžového<br />
štítu.<br />
Zdrojem záření je téměř vždy vysokotlaká rtuťová výbojka, méně často halogenová žárovka.<br />
Výbojka je napájená ze sítě přes samostatný zdroj ze sítě 220V/50H, obecně zvaný “startér”. Je<br />
umístěna<br />
v lampové skříňce, která souvisí s nástavcem pro osvětlení dopadajícím světlem. Tyto díly je<br />
nutné stavebnicově vsadit do stativu mikroskopu, současně s držákem fluorescenčních filtrů. Výbojku<br />
v lampové skříňce je nutné vystředit a zaostřit tak, aby její světelný tok při dopadu na preparát byl<br />
maximální. To se provádí pomocí kolektorové čočky a středících šroubů na lampové skříňce při<br />
pozorování obrazu výboje ve středící pomůcce, která se upevní místo jednoho objektivu v<br />
revolverovém nosiči. Dokonalé vystředění výbojky je podmínkou pro dobrý výsledek a je nutné občas<br />
kontrolovat. Výbojka má životnost kolem 200 h, délka jejího života se měří hodinovým počitadlem na<br />
startéru. Život výbojky může být i delší, po překročení mezní doby nehrozí imploze, avšak uvnitř<br />
výbojky se usazuje kovový nálet, který snižuje její světelný výkon.<br />
Důležitou součástí fluorescenční výbavy jsou fluorescenční filtry. Fluorescenční filtr je obvykle<br />
vyroben jako “kostka”, která se skládá z excitačního filtru, závěrného filtru a dichroického zrcadla.<br />
Filtry se od sebe liší vlnovými délkami, které vymezují pásma propustnosti<br />
excitačního a závěrného<br />
filtru. Dichroické zrcadlo odráží přednostně krátkovlnné záření na preparát a propouští dlouhovlnné<br />
"fluorescenční" záření do okuláru. Pro praxi je důležité, že ke každému fluorescenčnímu barvivu je<br />
nutné přiřadit určitý fluorescenční filtr (mluvíme o jednom filtru, ačkoliv jde o soustavu dvou filtrů a<br />
zrcadla v kostce). Výrobci nabízejí množství různých filtrů, některé z nich jsou i vícepásmové.<br />
Metodiky práce předepisují určitá barviva a k ním specifické filtry, takže uživatel má ušetřenou<br />
namáhavou a finančně náročnou práci s jejich zkoušením. Běžné filtry jsou označeny písmenem,<br />
určujícím barevnou oblast světla (B = modrá, G = zelená), ve které pracují. Čísla v označení pak<br />
charakterizují pásma vlnových délek pro závěrný a excitační filtr, případně pro dichriocké zrcadlo.<br />
NIKON zveřejnil obsáhlou tabulku, ve které jsou k jednotlivým barvivům (fluorochrómům) uvedeny<br />
doporučené filtry, popsané kódovým označením výrobce (názvem) a vlnovými délkami budících a<br />
závěrných filtrů. Volba správného filtru je podstatnou podmínkou pro úspěšnou metodiku fluorescenční<br />
mikroskopie.<br />
Dokumentace v mikroskopii<br />
Mikrofotografie<br />
Mikrofotografický způsob trvalého záznamu<br />
obrazu z mikroskopu je dnes již klasická metoda,<br />
používaná od doby, kdy fotografie dosáhla potřebné technické úrovně. Pro mikrofotografii jsou<br />
k dispozici zařízení<br />
různé dokonalosti (a pořizovací ceny). Mikrofotografická zařízení jsou vybavena<br />
různým stupněm automatizace.<br />
NIKON má automatizovaná mikrofotografická zařízení řady MICROFLEX.<br />
Při méně náročných postupech může být k fotografické dokumentaci použito těleso fotografického<br />
přístroje (bez objektivu), např. NIKON<br />
F-70 (F-90X, F-5) s příslušným nástavcem fotoadaptérem)<br />
a projektivem.<br />
Projektiv zastupuje při mikrofotografii okulár a má podobné vlastnosti. Žádoucí je, aby projektiv<br />
vyrovnával rovinu obrazu. Projektivy se vyrábějí s různým faktorem zvětšení - 1x až 5x. Je nutné si<br />
uvědomit, že zorné<br />
pole okuláru je kruhové, zatímco obrazové pole fotografického přístroje je<br />
obdélník. Při mikrofotografii nastává téměř vždy dodatečné zvětšení, protože úhlopříčka obrazového<br />
pole je kratší, než průměr zorného pole okuláru. Je-li toto zvětšení na závadu, lze je kompenzovat<br />
projektivy s proměnnou ohniskovou vzdáleností - jsou však nákladné.<br />
K badatelskými mikroskopům může být připojeno současně několik fotografických kamer popřípadě<br />
s<br />
26
paralelním provozem televizní kamery. Pro mikrofotografii jsou vhodné objektivy typu planachromát (a<br />
lepší), osvětlení mikroskopu by mělo být provedeno halogenovou žárovkou s dostatečnou intenzitou<br />
světleného toku.<br />
Při barevné fotografii musíme brát ohled na teplotu chromatičnost světla (dříve nazývanou "barevná<br />
teplota") v osvětlovací soustavě mikroskopu. Používají se většinou barevné filmy pro "denní světlo",<br />
které předpokládají teplotu chromatičnosti světla kolem 5600 K. Není-li tato teplota dosažitelná přímo,<br />
používají se tzv. konverzní<br />
barevné filtry, známé z běžné fotografické praxe (např. modrý filtr pro<br />
"denní světlo"). Mikroskopy NIKON ECLIPSE jsou vybaveny v obvodu regulace osvětlení tlačítkem,<br />
které po stisknutí nastaví halogenovou žárovku na konstantní teplotu chromatičnosti.Tato možnost<br />
velmi usnadňuje reprodukovatelnost postupu při mikrofotografii.<br />
Mikrofotografie na klasickém filmovém nosiči je postupně nahrazována digitální mikrofotografií, při<br />
které se obraz ukládá jako datový soubor do paměti ROM. Nicméně však klasický film uloží větší<br />
objem paměti (uvádí se 8,5 MB na 1 políčko), než dosud uloží digitální fotografický záznam.<br />
Pozorování obrazů z mikroskopu na monitoru<br />
Je-li mikroskop vybaven trinokulárním tubusem nebo samostatným výstupem pro kameru, může<br />
být<br />
obraz snímán televizní kamerou a pozorován na monitoru. Pro dobrou kvalitu obrazu na monitoru<br />
musí mít kamera i monitor vysoké rozlišení (450 i více<br />
čar) a věrné barevné podání. Obrazy, získané<br />
tímto způsobem, lze vytisknout (videoprinterem nebo laserovou tiskárnou) nebo zpracovat v počítači<br />
pomocí tzv. obrazové analýzy.<br />
Jednoduchá cesta vede z kamery přes kompozitní nebo Y/C signál do monitoru a videoprinteru. Zde je<br />
využit analogový signál kamery. Dokonalejší cesta je podmíněna digitalizací obrazu. Signál z kamery<br />
se vede do počítače, který musí být vybaven obrazovou kartou. Počítač i monitor musí mít vlastnosti,<br />
které tento způsob zobrazovaní umožní. Velmi efektivní je obrazová databanka, do které se ukládají<br />
jednotlivé obrazy s komentářem a která velmi usnadňuje archivaci takto uložených obrazů.<br />
Televizní kamery, monitory a další prvky nejsou výrobky NIKON – dodávají se podle výběru uživatele,<br />
např. výrobky SONY.<br />
Automatizace obsluhy mikroskopu<br />
Badatelské <strong>mikroskopy</strong> mohou být vybaveny různým stupněm automatizace obsluhy. Jednotlivé prvky<br />
mikroskopů mohou být ovládány servomotorky, jejich<br />
nastavení ovládá řídící jednotka, případně<br />
počítač (mikroskop je vybaven propojením, většinou RS 232). Data o nastavení těchto dílů se<br />
zobrazují na displeji, případně ukládají do paměti počítače. Byly vypracovány postupy, umožňující<br />
automatické zaostřování mikroskopu. Nákladnost takových automatizačních prvků však brání jejich<br />
rozšíření.<br />
Mikroskop s vysokým stupněm automatizace je NIKON ECLIPSE E1000. Řada obslužných prvků<br />
tohoto mikroskopu je ovládána motoricky, E1000 se nastavuje programovatelnou kartou, základní<br />
údaje se vkládají<br />
pomocí čárového kódu čtecí tužkou.<br />
Adresa - httpmicro.magnet.fsu.eduprimeranatomyanatomy.html<br />
Introduction to Photomicrography<br />
The use of photography to capture images in a microscope dates back to the invention of the<br />
photographic process. Early photomicrographs were remarkable for their quality,<br />
but the techniques<br />
were laborious and burdened with long exposures and a difficult process for<br />
developing emulsion<br />
plates. The primary medium for photomicrography was film until the past decade when improvements<br />
in electronic camera and computer technology made digital imaging cheaper and easier to use than<br />
conventional photography. This section will address photomicrography both on film and with electronic<br />
analog and digital imaging systems.<br />
27
The quality of a photomicrograph, either digital or recorded on film, is dependent upon the quality of<br />
the microscopy. Film is a stern judge of how good the microscopy has been prior to capturing the<br />
image. It is essential that the microscope be configured using Köhler illumination, and that the field<br />
and condenser diaphragms are adjusted correctly and the condenser height is optimized. When<br />
properly adjusted, the microscope will yield images that have even illumination over the entire field of<br />
view and display the best compromise of contrast and resolution.<br />
Almost all microscopists will, at some point, have the need or desire to record the images seen<br />
through the microscope. The main mechanism, for many years, of<br />
producing such photomicrographs<br />
was through the use of film, although in recent years most scientists have begun to capture images by<br />
means of electronic cameras. The main purpose of this tutorial is to enable the microscopist to record<br />
the observed images on film or digital media, and to do so with accuracy of image reproduction and<br />
with fidelity of color when color film is being used. The further aim is to empower the<br />
photomicrographer to secure excellent pictures without having to struggle through the already existing,<br />
far more complex reference literature. Use the links below to navigate to various topics in our<br />
discussions of photomicrography.<br />
Troubleshooting Problems in Photomicrography - Photography through the microscope is<br />
undergoing a transition from film to digital imaging. New digital technologies are producing higher<br />
resolution micrographs, but the quality still falls short of that obtainable with film. Microscope<br />
configuration errors represent the greatest obstacle to quality photomicrographs, followed by errors<br />
in<br />
filter selection, film choice, aberration, dirt and debris, and processing mistakes.<br />
Adresa: http://www.biomed.cas.cz/d331/vade/<strong>mikroskopy</strong>.html<br />
8. Mikroskopy<br />
1. Optický mikroskop<br />
2.Zobrazení buněk v kultuře mikroskopem invertovaným<br />
3. Zobrazení buněk v tkáňových řezech mikroskopem přímým<br />
4. Zeiss a Olympus<br />
5. Zvětšení mikroskopu<br />
6. Numerická aperura objektivu<br />
7. Koehlerovo osvětlení<br />
8. Fázový kontrast<br />
9. Nomarského diferenciální interferenční<br />
kontrast (DIC)<br />
10. Hoffmanův modulační kontrast (HMC)<br />
11. Dodtův infračervený<br />
gradientový kontrast (Dodt gradient contrast (DGC)<br />
2. Fluoresnční mikroskop<br />
2. Epifluorescence<br />
3. Monochromátor<br />
4. Videomokroskopie<br />
3. Konfokální mikroskop<br />
4. Pojmy<br />
1. Optický mikroskop<br />
2. Zobrazení buněk v kultuře mikroskopem invertovaným<br />
3. Zobrazení buněk v tkáňových řezech mikroskopem přímým<br />
4. Zeiss a Olym pus<br />
5. Zvětšení mikroskopu<br />
6. Numerická apertura objetivu<br />
7. Koehlerovo osvětlen<br />
8. Fázový kontrast<br />
28
9. Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)<br />
10. Hoffmanův modulační kontrast (HMC)<br />
11. Dodtův infračerve ný gradientový kontrast (Dodt gradient contrast DGC).<br />
2. Fluorescenční mikroskop<br />
2. Epifluorescence<br />
3. Monochromátor<br />
4. Videomokroskopie<br />
5. Molecular probes<br />
3. Konfokální mikroskop<br />
4. Pojmy<br />
1. Optický mikroskop<br />
Obyčejný optický mikroskop se skládá z objektivu, který vytváří převrácený obraz objektu a<br />
okuláru, kterým tento obraz pozorujeme jako lupou. Součástí<br />
mikroskopu je i zdroj světla s<br />
kondenzorem, který zabezpečující optimální osvětlení objektu. Pro elektrofyziologické<br />
snímání z buněk v kultuře či tkáňových řezech se používají dva základní typy optických<br />
mikroskopů lišících se konstrukcí a způsobem uspořádání osvětlovací soustavy, t.j. mikroskop<br />
invertovaný a přímý. Kvalita zobrazení buněk závisí na třech hlavních faktorech: na<br />
dostatečném zvětšení obrazu, rozlišovací schopnost mikroskopu a na kontrastu obrazu.<br />
Rozlišovací schopnost mikroskopu závisí na numerické apertuře objektivu a kondenzoru a na<br />
kvalitě osvětlení preparátu t.j. na optimálním nastavení Koehlerova osvětlení. Buňky jsou<br />
objekty nezbarvené, které neabsorbují světlo. Kontrast při zobrazování buněk lze velmi<br />
efektivně zvýšit pomocí cytologických a histologických barviv, které se vyznačují vysokou<br />
specificitou vůči určitým buněčným strukturám, toto barvení se však zpravidla neslučuje s<br />
procesy probíhajícími v živých buňkách. Živé buňky však lze pozorovat pokud se od okolního<br />
prostředí liší alespoň indexem lomu, který spolu s jejich tloušťkou mění fázi procházejícího<br />
světelného vlnění. Kontrast buněk tak lze zvyšovat optickými metodami, které převádějí<br />
rozdíly v indexech lomu na jasový kontrast obrazu. Na tomto principu jsou založeny metody<br />
jako je např. fázový kontrast, Nomarského diferenciální interferenční kontrast a Hoffmanův<br />
modulační kontrast. Zvětšený obraz buněk detekujeme nejdříve okem, pak přes analogovou či<br />
digitální videokameru zobrazujeme na monitor či do počítače.<br />
1.2.Zobrazení buněk v kultuře mikroskopem invertovaným<br />
Buňky v kultuře jsou objekty průhledné, které neabsorbují světlo, lze je pozorovat pomocí<br />
invertovaného mikroskopu v procházejícím světle. Buňky jsou osvětleny ze shora, světlo<br />
projde buňkami a stěnou misky do objektivu umístěném pod miskou. Výhodou je, že nad<br />
buňkami je dostatečně velký prostor pro umístění snímací elektrody i aplikačních trubiček.<br />
1.3.Zobrazení buněk v tkáňových řezech mikroskopem přímým<br />
Tkáňové řezy jsou však objekty neprůhledné, buňky v povrchových vrstvách by nebyly v<br />
procházejícim světle vidět, lze je však pozorovat pomocí přímého (up-right) mikroskoipu v<br />
dopadajícím světle. Světlo přichází zhora, buňky jsou zobrazeny odraženým světlem a<br />
pozorovány přes imerzní objektiv ponořený do roztoku nad buňkami. Mezi buňkami a<br />
objektivem tedy není vzduch ale čirá kapalina, takže světlo prochází od buněk až k objektivu<br />
prostředím o téměř stejném indexu lomu, a nepůsobí zde odraz a lom na rozhraní mezi<br />
prostředími o různém indexu lomu. Tímto způsobem se zvýší numerická apertura objektivu<br />
mikroskopu, na které závisí rozlišovací schopnost mikroskopu. Nevýhodou však v tomto<br />
případě je velmi malý pracovní prostor mezi objektivem a buňkami (3mm při použití<br />
objektivu 40x). V důsledku toho se elektroda k buňce přikládá pod šikmým úhlem a pod<br />
objektivem je místo pouze pro jednu společnou aplikační trubičku.<br />
29
1.4. Zeiss a Olympus<br />
Nejlepší pro elektrofyziologická a fluorescenční měření jsou <strong>mikroskopy</strong> firem Zeiss a<br />
Olympus (Olympus CZ):<br />
Axioskop 2 FS upright Microscope (Zeiss )<br />
Olympus IX 70 - inverted Microscope (Olympus)<br />
30
1.5. Zvětšení mikroskopu<br />
Zvětšení obrazu mikroskopem je dáno zvětšením okulárů a zvětšením objektivu. Okuláry<br />
mikroskopu během pokusu neobměňujeme, nejčastěji používáme okuláry zvětšující 20x -<br />
25x.. Pro zobrazení buněk a hrotu elektrody si však s jedním objektivem nevystačíme a<br />
musíme použít postupně aspoň dva objektivy. Pro první pohled na buněčný preparát a<br />
nastavení elektrod používáme objektiv s menším zvětšením, nejčastěji objektiv zvětšující 10x.<br />
Pak musíme nad vybraným místem nastavit objektivem o větším zvětšení, obyčejně<br />
používáme objektiv 40x nebo 60x, pod kterým již vidíme jednotlivé buňky a provádíme<br />
měření. Maximální užitečné zvětšení mikroskopu je však určeno i rozlišovací schopností<br />
objektivu. Za podmínek, kdy je minimální vzdálenost dvou rozlišitelných bodů srovnatelná<br />
s rozlišovací schopností lidského oka, obraz se nezlepší ani při použití silně zvětšujících<br />
okulárů, kdy dostaneme jen rozměrnější obraz bez nových detailů.<br />
1.6.Numerická apertura objetivu<br />
Odhad minimální vzdáleností dvou rozlišitelných bodů (Ymin) je dán vztahem::<br />
Ymin = konst.(λ/n.sinυ), kde λ je vlnová délka světla ve vákuu, n je index lomu prostředí před<br />
objektivem, a υ je polovina vrcholového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do<br />
objektivu. Veličina (n.sinυ) je tzv. numerická apertura objektivu, NA. U nejkvalitnějších<br />
imerzních objektivů bývá NA ~ 1.3 až 1.4. Pro nejkratší vlnové délky viditelného záření (λ≅<br />
400 nm) se pak rozlišovací schopnost těchto objektivů blíží hodnotě 0,17 µm.<br />
31
1.7. Koehlerovo osvětlen<br />
Koehlerovo osvětlení nastavujeme pohybem kondenzoru nahoru a dolu, a pomocí clonek<br />
kondenzoru, kterými je přiváděno světlo z osvětlovacího zdroje.<br />
Jak nastavíme optimální osvětlení preparátu v přímém mikroskopu ?<br />
Ve snížené poloze kondenzoru naplno otevřeme otvor clonky kondenzoru a clonu vymezující<br />
vstup paprsků světla do objektivu. Pak zúžíme otvor clony vymezující vstup světelných<br />
paprsků a nastavíme pomocnými šrouby jeho střed doprostřed zorného pole. Zdviháme<br />
kondenzor a rozšiřujeme světelné pole, až jeho obraz plně a právě zaplní.zorné pole. Tím<br />
vymezíme vstup světla ze zdroje a zamezíme vstupu světla pocházejícího z okolí. Dále<br />
nastavíme clonku kondenzoru, která určuje numerickou aperturu osvětlovacího systému.<br />
Doporučuje se nastavit hodnotu NA kondenzoru na 70 - 80 % NA objektivu. Tímto<br />
nastavením omezíme rozptyl světla a dosáhneme lepšího rozlišení, kontrastu i hloubky<br />
ostrosti.<br />
1.8. Fázový kontrast<br />
R. 1932 holandský fyzik Frederik Zernike uveřejnil princip fázového kontrastu v mikroskopu.<br />
Při fázovém kontrastu je do přední ohniskové roviny kondenzoru vložena kondenzorová<br />
maska (apertura ve tvaru úzkého mezikruží), která je kondenzorem a za ním následujícím<br />
objektivem zobrazena do zadní ohniskové roviny objektivu.<br />
Zde se nachází skleněná podložka s nanesenou fázovou maskou (tenká transparentní vrstva o<br />
vhodném indexu lomu) ve tvaru mezikruží, které se překrývá s obrazem kondenzorové<br />
apertury. Fázová maska mění fázi procházejícího záření o úhel α, případně může procházející<br />
záření také částečně absorbovat. Kontrast obrazu fázového objektu vůči pozadí roste s<br />
klesající propustností fázové masky. Fázová destička bývá zhotovena tak, že mění fázi buď o<br />
úhel π /2 nebo -π /2. Při fázovém kontrastu se intenzita světla v obrazu objektu mění lineárně<br />
se změnou fáze světla procházejícího objektem. S fázovou maskou měnící fázi o -π /2 se<br />
silnější části objektu jeví tmavší, tzv. pozitivní fázový kontrast. Při změně fáze o π /2 je<br />
tomu naopak, tzv. negativní fázový kontrast. Při fázovém kontrastu se často používá<br />
kvazimonochromatického osvětlení (žlutozelené světlo), při použití bílého světla bude obraz<br />
vzorku zbarvený, neboť úhel a o který fázová maska mění fázi procházejícího světla, závisí na<br />
vlnové délce. Nejmenší rozdíly v tloušťce různých buněčných struktur, které můžeme pomocí<br />
fázového kontrastu zaznamenat se tedy blíží k hodnotě 0.1 µm.<br />
Nevýhody: Při pozorování silně lomivých objektů (např kvasinek) vzniká tzv halo, což je<br />
jasně zářící rozhraní mezi objektem a okolním prostředím, v němž se ztrácejí skutečné hranice<br />
objektů. Druhým nedostatkem fázového kontrastu je to, že silně absorbující zbarvené objekty<br />
nemusí být ve fázovém kontrastu vůbec viditelné.<br />
1.9. Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)<br />
Německá firma Carl Zeiss vyvinula r.1959 interferenční mikroskop, který umožnil vytváření a<br />
vyhodnocování optických interferencí ve zvětšeném biologickém preparátu. Umožnil tak<br />
zvláště povrchovou topologii preparátu.<br />
Od běžného mikroskopu se liší vloženým párem Wollastonových dvojlomných hranolů a<br />
párem zkřížených polarizátorů světla. Světlo vstupující do kondenzoru je nejprve lineárně<br />
polarizováno polarizátorem P1. Pak prochází prvním hranolovým děličem, přičemž směr jeho<br />
polarizace svírá s optickými osami hranolového děliče úhel 45°. Druhý hranol shodně<br />
orientovaný s hranolem prvním, se nachází těsně za zadní ohniskovou rovinou objektivu.<br />
Následuje polarizátor P2, který je kvůli lepšímu kontrastu zobrazení zkřížen s P1. V důsledku<br />
32
ozdělení původně polarizovaného světla hranolem vzniknou dva identické obrazy předmětu,<br />
které jsou vůči sobě laterálně posunuty, vznikne zvětšený rozdvojený obraz. Wollastonovy<br />
hranoly pro DIC se vyznačují tím, že úhlový rozdíl vystupujících paprsků je velmi malý (asi<br />
10 -4 radiánu), laterální posun dvou obrazů je za těchto podmínek pod hranicí rozlišovací<br />
schopnosti mikroskopu. V předmětové rovině je ekvivalentem tohoto posunu vzdálenost<br />
odpovídající 0.1 mm. Analyzátor P2 orientovaný pod úhlem 45o vůči vzájemně kolmým<br />
polarizacím dvou laterálně posunutých obrazů, vytváří podmínky pro jejich interferenci.<br />
Prvním (objektivovým) hranolem způsobené fázové rozdíly však nejsou stejné pro světlo<br />
pocházející z různých míst plošného světelného zdroje. Úkolem druhého hranolu<br />
(kompenzačního) je proto učinit fázový rozdíl konstantní v celé ploše objektivového hranolu.<br />
Hodnotu konstantního fázového rozdílu lze plynule měnit laterálním posouváním obou<br />
Wollastonových hranolů vůči sobě, čímž se výrazně ovlivňuje vzhled obrazu. Platí, že pokud<br />
určitý gradient optické dráhy vede ke zvýšení jasu obrazu, pak opačný gradient se projeví<br />
snížením jasu. Zvětšený obraz vzorku se proto jeví jako šikmo osvětlený trojrozměrný objekt.<br />
Nevýhody: Je známo, že některé výrazně odlišné prostorové reliéfy objektů se mohou<br />
projevit prakticky shodnými reliéfy. U biologických preparátů se však optický reliéf zpravidla<br />
dostatečně shoduje s reálným prostorovým reliéfem. Pro DIC je typická velmi malá hloubka<br />
ostrosti (0.25 mm), což se přičítá efektu interference, pro níž se podmínky prudce mění při<br />
přeostření o zlomky vlnové délky.<br />
Výhody: Velkou předností DIC je, že obrazy zkoumaných objektů jsou bez rušivého halo,<br />
DIC umožňuje lepší kontrast zobrazení jemných fázových struktur objektu než fázový či<br />
Hoffmanův kontrast. Nomarskeho metodu lze také realizovat při horním osvětlení či při<br />
měření fluorescenčních. V kombinaci s infračerveným osvětlením ji lze použít pro vizualizaci<br />
těl i výběžků neuronů v živých mozkových řezech.<br />
1.10. Hoffmanův modulační kontrast (HMC)<br />
Vznik tohoto modulační kontrastu se datuje do r. 1975. Jde v podstatě pouze o velmi<br />
dokonalou verzí šikmého osvětlení, které se používá ke zvýraznění kontrastu neabsorbujících<br />
předmětů. Vznik kontrastu při HMC je důsledek asymetrické filtrace Fourierova obrazu, což<br />
je typické pro všechny metody využívající mimoosové (anaxiální) osvětlení. Virtuálním<br />
zdrojem světla zajišťujícím šikmé osvětlení je obdélníková štěrbina nacházející se v přední<br />
ohniskové rovině kondenzoru. V místě jejího obrazu v zadní ohniskové rovině objektivu je<br />
umístěn modulátor. Modulátorem je maska, jejíž tvar se kryje s obrazem štěrbiny kondenzoru.<br />
Štěrbina modulárotu z jedné strany sousedí s absorbující plochou (nepropustná zona, zabírá<br />
méně než 10% apertury objektivu), z druhé strany je neabsorbující plocha (propustná zona)..<br />
Záření zdroje se po průchodu vzorkem s gradientem optické tloušťky odchýlí od původního<br />
směru šíření, jednotlivé příspěvky k odchýlenému záření vytvoří v zadní ohniskové rovině<br />
objektivu dílčí obrazy kondenzorové clony, které jsou však posunuty vůči štěrbině<br />
modulátoru. Je=li gradient kolmý na osu štěrbiny, posune se její tvar v závislosti na znaménku<br />
tohoto gradientu buď do nepropustné nebo do čiré zony modulátoru. Takové posunutí je<br />
provázeno ztemněním, při opačném gradientu zjasněním, příslušného místa v<br />
mikroskopickém obrazu.<br />
Výhody: Výsledný obraz budí dojem šikmo osvětleného reliéfu a je velmi podobný zobrazení<br />
pomocí Nomarského DIC, cena potřebných doplňkových komponent mikroskopu je však při<br />
HMC podstatně nižší než při DIC. Hlavní předností HMC oproti DIC, kromě ceny, je<br />
možnost pozorovat objekty i na dvojlomných podložkách (např. buněčné kultury v<br />
33
plastikových miskách), které se pro DIC, kde je podstatná polarizace zobrazujícího světla,<br />
mohou stát zdrojem rušivých efektů.<br />
Nevýhody: Výrazně závisí na orientaci zobrazovaného objektu vůči štěrbině, neboť optické<br />
gradienty rovnoběžné se štěrbinou se v obrazu objektu neobjeví. Mezi biology je DIC zatím<br />
více oblíben než Hoffman, částečně proto, že je metodou s delší tradicí, zejména však kvůli<br />
tomu, že DIC často umožňuje lepší kontrast zobrazení jemných fázových struktur<br />
1.11. Dodtův infračervený gradientový kontrast (Dodt gradient contrast<br />
DGC).<br />
Tento kontrast byl vyvinut teprve nedávno pro vizualizaci buněk ve tkáňových řezech v<br />
minulých deseti letech, jeho princip dosud nebyl zveřejněn.. Tubus je namontován mezi zdroj<br />
světla a mikroskop, kontrast je vhodný pro všechny typy objektivů, neinterferuje s<br />
fluorescenčním snímáním.<br />
2. Fluorescenční mikroskop<br />
V r. 1910 pozoroval Kohler při mikroskopování s ultrafialovým světlem fluorescenci mnoha<br />
preparátů. První fluorescenční mikroskop s UV excitací vznikl r.1913. Jako zdrojů světla se<br />
používá převážně vysokotlakých výbojek plněných rtutí nebo xenonem. Tyto výbojky<br />
vydávají velké množství energie svého záření v ultrafialové oblasti. Jejich světlo je poměrně<br />
stabilní, výbojky vydrží zářit asi 500 pracovních hodin. Zažehávají se však<br />
vysokonapěťovými pulsy, je proto potřeba zapínat je dříve než ostatní elektronické přístroje v<br />
aparatuře. Fluorescenční mikroskop je používán k vizualizaci označených buněk, buněčných<br />
struktur či molekul a k měření koncentrací iontů uvnitř buněk. Typicky se měří změny<br />
koncentrace vápníku v cytoplazmě, které jsou v klidovém stavu udržovány v rozmezí 50 až<br />
200 nM a po stimulaci vstupu vápníku do buňky nebo po jeho uvolnění z intracelulárních<br />
zásob stoupají až destinásobně. Změny ve fluorescenčních vlastnostech sond po navázání<br />
iontu jsou registrovány a po porovnání s kalibrační křivkou přepočteny na komncentraci.<br />
pomocí mikrofluorescenčního měřícího systému MetaFluor od firmy Visitron.<br />
Fluorescenční mikroskopie používá většinou zesilovačů obrazu nebo chlazených CCD kamer<br />
(tzv. zesílená fluorescenční mikroskopie, IFM - Intenzified Fluorescence Microscopy)..<br />
Použití takových detektorů je nezbytné ve většině biologických vzorků, neboť intenzita jejich<br />
fluorescence nebývá postačující pro obyčejné videokamery. Musí se proto kombinovat s<br />
počítačovým zpracováním obrazu (videomikroskopie). Při IFM lze snižovat intenzitu buzení<br />
oproti intenzitě potřebné pro obyčejné vizuální pozorování, čímž lze úspěšně potlačit<br />
nežádoucí vybělování fluorescence.<br />
2.1. Epifluorescence<br />
Epifluorescence spočívá ve vertikálním fluorescenčním osvětlení excitačním světlem o<br />
požadované vlnové délce. Objekt je pozorován přes objektiv, světlo dopadá zhora přes<br />
excitační filtr a dichronické zrcadlo, obraz předmětu je pozorován přes emisní filtr.<br />
Dichronické zrcadlo odráží excitační světlo o určité vlnové délce směrem do vzorku a<br />
propouští ostatní vlnové délky. Bariérový filtr umístěný mezi objektiv a okulár blokuje<br />
nechtěné vlnové délky, čímž poskytuje černé pozadí k fluorescenčnímu obrazu. Spektrální<br />
charakteristiky vlnové délky transmitance a reflektance dichronického zrcadla se kříží, takže<br />
je zapotřebí použít vhodnou kombinaci excitačních a barierových filtrů v kombinaci s<br />
dichronickým zrcadlem, aby bylo dosaženo dobrého kontrastního obrazu. K fluorescenčním<br />
34
mikroskopům jsou proto dodávány různé optické kostky sestávající se ze 3 komponent:<br />
barierového a excitačního filtru a dichrnického zrcadla. Při excitaci barevného indikátoru ve<br />
vzorku při požadované vlnové délce je tak potřeba použít určitou optickou kostku. Pro<br />
přesnou práci se pro vyčlenění excitačního spektra používá monochromátoru. Epifluorescence<br />
může být používána v kombinaci s fázovým kontrastem i diferenciálním interferenčním<br />
kontrastem.<br />
2.2. Monochromátor<br />
Monochromátor je přístroj, který kontroluje vlnovou délku světla analogovým napětím.<br />
Monochromatické světlo je přivedeno k mikroskopu speciálním epifluorescenčním<br />
kondenzorem. Monochromátor se skládá ze dvou částí, t.j. ze zdroje světla (rtuťová výbojka)<br />
a vlastního monochromatického zařízení. Světlo z lampy je sbíráno dvěma čočkami a<br />
torodiálním zrcadlem, poté je fokusováno na vstupní štěrbinu ve stěně oddělující zdroj světla<br />
od monochromatické zařízení. Tam je světlo odráženo parabolickým zrcadlem na mřížku<br />
fixovanou ke galvanometrickému snímacímu zařízení (scaneru). Mřížka generuje spektrum,<br />
které je fokusováno na optické vlákno (vodič světla). Otáčením scaneru se mění úhel mřížky a<br />
tím i vlnová délka monochromatického světla. Nastavení monochromátoru znamená zaostřit<br />
světlo na štěrbinu tak, aby bylo dosaženo maximálního průchodu světla co do intenzity.<br />
2.3. Videomokroskopie<br />
Fluorescenční mikroskopie využívá videově umocněný kontrast, t.j. digitální zesílení relativně<br />
malých lokálních rozdílů v intenzitě světla, které při normálním způsobu zanikají v jasu<br />
pozadí. Zesílení spočívá v tom, že se napřed odečte pozadí zahrnující všechny nežádoucí<br />
odrazy a rozptyl světla v optické soustavě mikroskopu, tak neostré obrazy struktur<br />
nacházejících se mimo ohniskovou rovinu. Při fluorescenční mikroskopii lze tímto způsobem<br />
zesílit signál za podmínek, kdy není dost fotonů na to, aby vytvořily obraz bez šumu. Poměr<br />
signál/šum se tak zlepší integrací několika po sobě jdoucích obrazů..<br />
2.4. Molecular probes<br />
Změny koncentrace iontů se stanovují pomocí fluorescenčních sond, které daný iont<br />
specificky váží a po vazbě mění své fluorescenční vlastnosti. Nejznámějším výrobcem těchto<br />
sond je firma Molecular probes<br />
3.Konfokální mikroskop<br />
První laserový konfokální rastrovací mikroskop byl vyroben r.1978. Pomocí konfokálního<br />
mikroskopu se lze zbavit neostrostí v důsledku překrývání se zaostřeného obrazu s<br />
rozmazanými obrazy struktur, které se nacházejí mimo zaostřenou rovinu, což je obzvlášť<br />
rušivý jev při fluorescenční mikroskopii.<br />
Při konfokální mikroskopii je pozorovaný objekt osvětlen bodovým zdrojem, nejčastěji k<br />
tomu slouží laserový paprsek fokusovaný na clonku, která je pak objektivem mikroskopu<br />
zobrazena na vzorek do bodu o průměru rovnajícím se minimální vzdáleností dvou<br />
rozlišitelných bodů. Stejný objektiv pak sbírá světlo vzorkem odražené a rozptýlené, případně<br />
fluorescenci. Při zpětném průchodu tohoto záření objektivem vznikne další obraz bodové<br />
clonky, který je pomocí děliče paprsků lokalizován před fotonásobič. V místě tohoto obrazu<br />
se nachází druhá konfokální bodová clonka, která blokuje detekci záření pocházejícího z míst<br />
vzorku mimo rovinu právě zaostřenou. Obraz celé této roviny získáme rastrováním bod po<br />
bodu. Existují tři různé způsoby rastrování, t.j. cestou rozmítání laserového paprsku nebo<br />
příčným posouváním vzorku před objektivem, případně posouváním objektivu před vzorkem.<br />
35
Při rastrování je signál z fotonásobiče registrován počítačem spolu s informací o souřadnicích<br />
analyzovaných bodů. Celý soubor těchto dat je pak převeden na obraz pozorovaného vzorku.<br />
Tento obraz již díky prostorové filtraci záření dopadajícího na detektor neobsahuje neostré<br />
pozadí mimofokálních oblastí vzorky. Konfokální obrazy jsou proto vždy zaostřené a<br />
představují optické řezy vzorkem. S imerzním objektivem o numerické apertuře NA=1.3 a při<br />
použití modrozelené čáry argonového laseru (488nm) činí jejich tloušťka asi 0.4 µ m<br />
4. Pojmy<br />
Abbeho teorie mikroskopu.<br />
Ernas Abbe (1873) vysvětlil a experimentálně doložil fyzikální podstatu vzniku obrazu v<br />
optickém mikroskopu. Základní myšlenka jeho teorie spočívá v představěm že každý bod<br />
osvětleného objektu se stává zdrojem sekundárních sférických vln (Huygensův princip).<br />
Záření prošlé vorkem vstupuje v podobě sekundárních vln do objektivu a dostává se do zadní<br />
ohniskové roviny objektivu. Změny amplitudy a fáze světelných vln procházejících vzorkem<br />
Abbe popsal transmisní funkcí F (x,y), jejíž proměnné x a y značí souřadnice v předmětové<br />
rovině, která je kolmá na optickou osu mikroskopu.<br />
Zadní ohnisková rovina objektivu<br />
F = nejkritičtější místo mikroskopu, v této rovině se setkávají paprsky, které opouštějí<br />
předmětovou rovinu šíříce se stejným směrem a vstoupily do objektivu.<br />
Airyho kroužky<br />
Žádný objektiv nezobrazí bod opět jako bod , ale obrazem bodu jsou difrakční obrazce<br />
vznikající ohybem světla na výstupní pupile objektivu (Airyho kroužky). Při zobrazení dvou<br />
blízkých bodů se mohou příslušné difrakční kroužky překrývat, až se při jisté minimální<br />
vzdálenosti stanou nerozlišitelnými.<br />
Kontrast<br />
Kontrast (K) je definován pomocí rozdílu mezi jasem pozadí (Ip) a jasem pozorovaného<br />
objektu (I) jako poměr: K= (I-Ip)/Ip<br />
Wollastonův hranol<br />
Wollastonův hranolu rozdělí původně lineárně polarizované zobrazující světlo na dvě<br />
vzájemné kolmo polarizované složky (odpovídající řádnému a mimořádnému paprsku), které<br />
z děliče vystupují různým směrem.<br />
Fluorescence<br />
Fyzikální proces při němž dochází k přeměně vlnové délky budícího záření na vlnovou délku<br />
luminiscenčního emisního záření, které doznívá delší dobu. Absorpce fotonů molekulami má<br />
za následek přechod elektronů do vyšších energetických hladin a při zpětném návratu<br />
elektronů dochází k emisi světla. Emisi lze charakterizovat fluorescenčním excitačním<br />
spektrem t.j.závislostí intenzity emise na vlnové délce excitačního světla. Když je vzorek<br />
ozářen světlem s určitou excitační vlnovou délkou, emituje světlo o viditelně delší vlnové<br />
délce (Stokesovo pravidlo)<br />
Dichronické zrcadlo<br />
36
Dichronické zrcadlo usměřuje excitační světlo přes objektiv na vzorek, tak aby byl dostatečně<br />
osvětlen. Je umístěno se sklonem 45° od optické osy přicházejícího světla, takto nakloněno<br />
odráží excitační světlo směrem do vzorku a propouští ostatní vlnové délky<br />
Adresa – maturita.cz<br />
Jak vznikl mikroskop?<br />
První mikroskop sestrojili kolem roku 1590 bratři Zacharias a Jan Jannesové v Nizozemsku.<br />
Pro svou nepatrnou zvětšovací a rozlišovací schopnost nebylo možno tohoto přístroje<br />
používat k vědecké práci. Teprve kolem roku 1650 jej zdokonalil Antony van Leeuwenhoek,<br />
který jako první objevil neznámý dosud svět drobnohledných ústrojenců a vytvořil základy<br />
nejen mikroskopické techniky (mikroskopie a mikrotechnika), ale ve skutečnosti i základy<br />
mikrobiologie jako samostatné vědy. Optickou teorii mikroskopu vytvořil kolem roku 1873<br />
německý fyzik E. Abbe. Ve svém dalším velmi živém vývoji se stal mikroskop<br />
nepostradatelným prostředkem poznání nejen ve vědách biologických (včetně lékařství), ale i<br />
přírodních a technických.<br />
Co to vlastně je mikroskop?<br />
Mikroskop je dokonalejší přístroj než lupa, určený rovněž k pozorování drobných předmětů.<br />
Zatímco lupou lze dosáhnout maximálního zvětšení kolem čtyřiceti, může mikroskop<br />
zvětšovat dvoutisíckrát až třítisíckrát. Vlastní mikroskop se skládá ze tří základních částí:<br />
- z optické soustavy<br />
- Osvětlovací soustavy<br />
- Mechanického zařízení<br />
Optická soustava mikroskopu je složena ze tří hlavních součástí:<br />
objektivu, okuláru a tubusu. Úkolem objektivu je vytvořit zvětšený, skutečný a převrácený<br />
obraz předmětu (který se klade za jeho předmětové ohnisko) ve vzdálenosti D od obrazového<br />
ohniska. Úkolem okuláru je pak umožnit pozorování tohoto obrazu neakomodovaným okem.<br />
Předmětové ohnisko okuláru musí být tedy vzdáleno od od obrazového ohniska objektivu o D<br />
. Nastavení této vzájemné polohy objektivu a okuláru zajišťuje tubus. Veličina D se nazývá<br />
optickou délkou /intervalem) mikroskopu.<br />
Způsob konstrukce optické soustavy jako celku závisí na určení a způsobu využití<br />
mikroskopu. <strong>Optické</strong> soustavy jsou konstruovány buď pro pozorování jedním okem<br />
(monokulární <strong>mikroskopy</strong>), nebo oběma očima (binokulární <strong>mikroskopy</strong>). Binokulární<br />
<strong>mikroskopy</strong> jsou výhodnější, neboť při pozorování oběma očima dochází k menší únavě.<br />
Optická soustava binokulárního mikroskopu je buď složena ze dvou samostatných<br />
monokulárních soustav (stereoskopický mikroskop), nebo je tvořena dvěma okuláry a jedním<br />
společným objektivem.<br />
Všimneme si podrobněji způsobu konstrukce a vlastností objektivu a okuláru. Základními<br />
parametry objektivu jsou ohnisková vzdálenost ¦ób , příčné zvětšení bo a číselná apertura A.<br />
Pro příčné zvětšení platí vztah<br />
bo= D ¤ ¦ób<br />
Ohnisková vzdálenost objektivu nebývá zpravidla menší než 1,50mm a pro slabé objektivy<br />
může být 20 až 30 mm.Optická délka tubusu leží obvykle v rozmezí hodnot 150 až 200 mm.<br />
Odtud pro maximálně dosažitelné zvětšení plyne hodnota poněkud přesahující 100.<br />
Ohnisková vzdálenost Zvětšení (délka tubusu D=170mm) Číslo apertura Druh<br />
39,1 3x 0,10 suchý<br />
24,2 6x 0,15 suchý<br />
16,9 10x 0,30 suchý<br />
37
9,1 20x 0,45 suchý<br />
6,1 30x 0,65 suchý<br />
4,1 45x 0,65 suchý<br />
3,1 60x 0,85 suchý<br />
1,95 100x 1,25 Olej.imerse<br />
Parametry mikroskopických objektivů Meopta.<br />
Jak uvidíme později, je pro posouzení jakosti objektivu velmi důležitá jeho číselná apertura<br />
A=N sin sA . Je-li prostor mezi krycím sklíčkem předmětu a objektivem vyplněn vzduchem o<br />
indexu lomu N = 1, je teoreticky maximálně dosažitelná hodnota číselné apertury 1. Prakticky<br />
je možno získat nejvýše hodnotu 0,95. Hodnotu číselné apertuty lze zvětšit použitím tzv.<br />
imerse, která spočívá v tom, že se prostor mezi objektivem a krycím sklíčkem vyplní<br />
prostředím o indexu lomu N > 1. K tomuto účelu se obvykle užívá vhodné kapaliny. Tak<br />
např. s použitím monobromnaftalenu, který má velký index lomu, je možno dosáhnout<br />
hodnoty A=1,6. Kromě monobromnaftalenu se také často užívá vody, nebo cedrového oleje,<br />
který má tu zvláštní vlastnost, že jeho index lomu je velmi blízký indexu lomu skla. V tomto<br />
případě mluvíme o tzv. homogenní imersi.<br />
Dalším kritériem jakosti objektivu je stupeň korekce jednotlivých vad. Podle stupně, jakým<br />
jsou korigovány zejména barevné vady, rozeznáváme tzv. achromáty, poloachromáty a<br />
apochromáty.<br />
Jako okuláru se u mikroskopu užívá pro běžné pozorování okuláru Huygensova. Huygensův<br />
okulár je složen ze dvou ploskovypuklých čoček, obrácených rovinnými plochami k oku.<br />
První z obou čoček, bližší k oku, se nazývá čočka oční, druhá má název kolektiv. Zvláštností<br />
Huygensova okuláru je, že má virtuální předmětovou ohniskovou rovinu mezi kolektivem a<br />
oční čočkou. V důsledku toho je u mikroskopů s Huygensovým okulárem nutno umístit clonu<br />
zorného pole dovnitř optické soustavy okuláru. Tato clona se zpravidla umisťuje do<br />
předmětové ohniskové roviny oční čočky. V tomto případě padne totiž vstupní průhled<br />
soustavy mikroskopu do roviny předmětu a zorné pole je ostře ohraničeno.Do předmětového<br />
ohniska roviny oční čočky se často vkládá planparalelní deska se stupnicí. Takto vybavený<br />
okulár, kterým je možné měřit rozměry pozorovaného předmětu, se nazývá okulární<br />
mikrometr. Dělení stupnice bývá zpravidla rovno 1/10 nebo 1/20 mm. Skutečná hodnota<br />
jednoho dílku vzhledem k rozměrům předmětu (tzv. mikrometrická hodnota) závisí však na<br />
zvětšení objektivu a kolektivu okuláru. Proto je nutné před měřením provést kalibraci tak, že<br />
na stolek mikroskopu umístíme mikrometrickou stupnici (objektivový mikrometr) známého<br />
dělení a její dělení srovnáme s dělením stupnice okulárního mikrometru.<br />
Kromě Huygensova okuláru se v měřicích mikroskopech užívá často okuláru Ramsdenova.<br />
Předmětové ohnisko tohoto okuláru je reálné a leží před jeho optickou soustavou. Proti<br />
Huygensovu okuláru má tedy nevýhodu v tom, že je optická soustava mikroskopu delší. Na<br />
druhé straně dává lepší možnost umístění mikrometrické stupnice, která se v tomto případě<br />
pozoruje celou soustavou okuláru.<br />
Pro náročnější účely se mimo Huygensův a Ramsdenův okulár užívá složitějších typů okulárů<br />
(např. okuláry periplantické nebo ortoskopické), které mají lépe korigovány jednotlivé druhy<br />
vad a dovolují použít většího zvětšení a zorného pole.<br />
U běžných druhů okulárů se pohybuje ohnisková vzdálenost mezi 50 a 10 mm. Tomu<br />
odpovídá zvětšení 5-25 .<br />
Pořadové číslo Druh Ohnisková vzdálenost (mm) Zvětšení<br />
1 Huygensův okulár 41,7 6<br />
2 Huygensův okulár 31,3 8<br />
3 Huygensův okulár 25,0 10<br />
4 Huygensův okulár s mikrometrem 31,3 8<br />
5 Periplantický okulár 25,0 10<br />
38
6 Periplantický okulár 16,7 15<br />
7 Periplantický okulár 12,9 20<br />
Parametry okulárů Meopta<br />
Pro měřicí úkoly se kromě již popsaných okulárních mikrometrů často používají tzv. měřicí<br />
okuláry, které mají v rovině clony umístěnu jednak planparalelní desku se stupnicí, jednak<br />
pohyblivou značku, eventuálně nitkový kříž. Pohyb této značky je ovládán mikrometrickým<br />
šroubem se stupnicí, takže lze odečítat velmi malé hodnoty posuvu.<br />
Na vlastnostech objektivu a okuláru jsou závislé vlastnosti optické soustavy mikroskopu jako<br />
celku. Optická soustava mikroskopu je charakterizována hlavně zvětšením , zorným polem a<br />
rozlišovací schopností.<br />
Osvětlovací soustava mikroskopu zajišťuje osvětlení pozorovaného předmětu. Mikroskopem<br />
mohou být pozorovány předměty průhledné i neprůhledné. V prvním případě se předmět<br />
osvětluje procházejícím světlem, v druhém případě světlem odraženým.<br />
Způsob konstrukce osvětlovací soustavy závisí zřejmě na tom, k jakému druhu pozorování<br />
bude mikroskop použit. Především záleží na tom, půjde-li o pozorování v procházejícím nebo<br />
odraženém světle. Kromě toho je v obou případech možné konstruovat osvětlovací soustavu<br />
pro práci v tmavém nebo ve světlém poli. Velmi často jsou <strong>mikroskopy</strong> zařízeny pro práci v<br />
polarizovaném světle, v takovém případě bývají osvětlovací soustavy vybaveny<br />
polarizátorem.<br />
Pro náročnější účely se k osvětlení preparátu užívá výhradně umělých zdrojů, které bývají<br />
zpravidla malých rozměrů. Aby se využilo celé apertury objektivu, je v tomto případě nutné<br />
použít kondenzor, kterým se zobrazí zdroj do roviny předmětu. Optická soustava kondenzoru<br />
musí mít ovšem dostatečně velkou aperturu.<br />
Dále se budeme podrobněji zabývat jednotlivými parametry optické soustavy jako celku, a to<br />
zejména způsoby jejich zjišťování.<br />
Zvětšení. Zvětšení mikroskopu Zm je podobně jako u lupy definováno poměrem<br />
Zm = u ¤ u´<br />
U´je úhel, pod kterým vidíme obraz předmětu, vytvořený mikroskopem neakomodovaným<br />
okem, u je úhel, pod kterým vidíme tentýž předmět prostým okem z konvenční zrakové<br />
vzdálenosti. Označíme-li bo příčné zvětšení objektivu a Zo zvětšení okuláru, platí<br />
Zm = bo . Zo<br />
V případech, kdy nejsou hodnoty bo k dispozici, lze zjistit zvětšení měřením přímou metodou.<br />
Uspořádání této metody je modifikací metody použité pro lupu. Při měření položíme nejprve<br />
na stolek mikroskopu objektivový mikrometr M. Těsně před okulár umístíme polopropustné<br />
zrcátko Z tak, aby svíralo s osou tubusu úhel 45°. Ve vzdálenosti 25 cm od zrcátka umístíme<br />
milimetrové měřítko S rovnoběžné s osou tubusu tak,abychom je mohli současně porovnat s<br />
obrazem mikrometrické stupnice vytvořeným mikroskopem . Srovnáním dělení obou stupnic<br />
lze pak určit zvětšení mikroskopu. Nastavíme-li však mikroskop tak, abychom viděli obě<br />
stupnice ostře, pozorujeme obraz v mikroskopu okem akomodovaným na konvenční zrakovou<br />
vzdálenost a zvětšení, které takto měříme, není totožné se Zm podle vztahu Zm = bo . Zo .<br />
Označíme-li toto naměřené zvětšení Zo a předpokládáme-li, že zvětšení objektivu zůstává v<br />
obou případech stejné, dostaneme rovnici: Zd = bo (d ¤ ¦ok + 1 ) = Zm + b<br />
Zm = Zd - b<br />
K praktickému měření zvětšení mikroskopu přímou metodou lze také použít kreslicího<br />
zařízení, které se někdy dodává jako příslušenství mikroskopu. Toto zařízení se skládá ze<br />
skleněné krychle složené ze dvou pravoúhlých hranolů a z rovinného zrcadla. Krychle je<br />
vsazena v objímce, která se nasadí na tubus mikroskopu tak, aby krychle byla umístěna před<br />
okulárem. Vzhledem k tomu, že přeponová stěna jednoho z hranolů je polopropustně<br />
pokovena, může krychle působit stejně jako polopropustné zrcadlo.<br />
Pomocí kreslicího zařízení je možné současně pozorovat obraz předmětu vytvořený<br />
39
mikroskopem a list papíru položený vedle mikroskopu. Vhodný poměr jasů obou obrazů bývá<br />
možné dosáhnout pomocí některého filtru, jimiž bývá zařízení vybaveno.<br />
Zorné pole. Předmětové ohnisko celé soustavy leží v blízkosti předmětové roviny objektivu,<br />
její obrazové ohnisko leží poblíž oční čočky okuláru; do obrazové ohniskové roviny se<br />
zpravidla klade oční pupila. Aperturní clonu mikroskopu tvoří buď obruba některé čočky<br />
objektivu, nebo clona umístěná v blízkosti obrazového ohniska objektivu. Vstupní pupila celé<br />
soustavy je pak obraz této clony vytvořený čočkami objektivu ležícími „před“ ní a výstupní<br />
pupila je obraz vytvořený čočkami soustavy ležícími „za“ ní. Výstupní pupila leží vždy velmi<br />
blízko obrazové ohniskové roviny celé soustavy. Průměr výstupní pupily mikroskopu je ve<br />
většině případů menší než průměr oční pupily.<br />
Vzhledem k uvedeným okolnostem může být oční pupila umístěna vždy do roviny výstupní<br />
pupily soustavy. Zorné pole, které můžeme pozorovat, je tedy omezeno jen clonou zorného<br />
pole okuláru. Zorné pole mikroskopu je pak v lineární míře definováno jako průměr toho<br />
kruhu v předmětové rovině, jehož obraz vyplní celou plochu clony zorného pole okuláru.<br />
Jsou 2případy : buď je clona zorného pole umístěna „před“ optickou soustavou okuláru<br />
(Ramsdenův okulár), nebo je umístěna uvnitř jeho optické soustavy (Huygensův okulár).<br />
Označíme-li dz průměr clony zorného pole, bude v prvním případě zorné pole mikroskopu<br />
rovno :<br />
rm = dz ¤ bo<br />
a v druhém případě :<br />
rm = Dz ¤ bo<br />
Dz = dz. ¦´ok ¤ ¦ć , ¦´ok je ohnisková vzdálenost okuláru a ¦ć ohnisková vzdálenost oční čočky.<br />
Veličina Dz vyjádřená v milimetrech se nazývá číslo zorného pole okuláru<br />
Huygensovy okuláry<br />
Zvětšení Číslo zorného pole<br />
6 18,4<br />
8 16,2<br />
10 13,4<br />
Periplanatické okuláry<br />
Zvětšení Číslo zorného pole<br />
10 16,6<br />
15 13,6<br />
20 8,7<br />
Rozlišovací schopnost. Pro rozlišovací schopnost mezí optické soustavy d byl uveden vztah :d<br />
= 0,61. l ¤ A , v němž l je vlnová délka a A číselná apertura. K tomuto vztahu se dospělo ze<br />
studia difrakce vznikající při průchodu světelných paprsků vycházejících ze dvou svítících<br />
bodů. Při kolmém osvětlení vychází pro rozlišovací dm platí vztah : dm = l ¤ A<br />
Menší mez rozlišení lze dosáhnout při šikmém osvětlení. Za předpokladu, že aperturní úhel<br />
kondensoru je roven aperturnímu úhlu objektivu, platí pro rozlišovací mez : dm = l ¤ 2A<br />
Danou rozlišovací mezí je také omezeno použitelné zvětšení mikroskopu. Úsečku délky do,<br />
kterou vidíme z konvenční zrakové vzdálenosti d pod úhlem u = do ¤ d , pozorujeme<br />
mikroskopem pod úhlem u´= do Zm ¤ d . Má-li být tato vzdálenost rozlišena okem, musí být<br />
u´>1´. Na druhé straně nemá cenu smysl zvětšovat u´daleko nad tuto hranici zvětšování Zm.<br />
Při dané vlnové délce a číselné apertuře nelze totiž na předmětu rozlišit více detailů. Obvykle<br />
se pro u´volí hranice 1´< u´
Druhy mikroskopů..<br />
Optický mikroskop je mikroskop, v němž je obraz zvětšován dvěma sadami spojných<br />
čoček:objektivem a okulárem. V biologii se pro účely optické mikroskopie užívají objektivy<br />
různé síly, tj. různé zvětšovací schopnosti ; okulár již jen zvětšuje obraz vržený objektivem.<br />
Největší zvětšení , kterého jde docílit v obyčejném světle , je asi 1500krát , kdy má optický<br />
mikroskop ještě využitelnou rozlišovací schopnost. Při použití nejsilnějších objektivů je nutno<br />
vložit mezi frontální čočku a krycí sklíčko mikroskopického preparátu kapku cedrového oleje<br />
se stejným lomem světla, jako má sklo,aby se světlo neztrácelo ( imerzní objektivy ) . Vyššího<br />
zvětšení lze docílit použitím světla o kratší vlnové délce, jako je ultrafialové světlo. Optický<br />
mikroskop byl sestrojen v roce 1590 v Nizozemsku a byl zdokonalen A. van Leeuwenhoekem<br />
1650, v současnosti existuje řada aplikací.<br />
Fluorescenční mikroskop – používá se zde ultrafialových paprsků, z elektrických<br />
obloukových lamp nebo ze rtuťových výbojek, které vyvolají světélkování předmětu v<br />
mikroskopu. Při osvětlení předmětu světlem , které nedopadá do objektivu, lze mikroskopem<br />
pozorovat částice průměru asi setiny mikronu, avšak nelze rozeznat jejich tvar..<br />
Ultramikroskop zkonstruoval v roce 1903 H. Siedentopf a R. Zsigmondy. Pro zobrazení ještě<br />
menších částic je třeba použít místo světelných paprsků proudu elektronů, které se uvolňují ze<br />
žhavých kovů uvedených na záporný potenciál. Proud elektronů prochází elektr. n. magnet.<br />
čočkami, tj. elektr. n. magnet. polem, které umožňuje měnit směr pohybu elektronů.<br />
Elektronový mikroskop pracuje s proudem elektronů ve vakuu. Proud elektronů –záření velmi<br />
malé vlnové délky. Elektronové <strong>mikroskopy</strong> se dělí na 2 druhy : transmisní elektronový<br />
mikroskop<br />
Rastrovací elektronový mikroskop<br />
TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP : viditelný obraz se vytváří na<br />
fluorescenčním stínítku svazkem elektronů, které prošly studovaným vzorkem, nebo které ve<br />
vzorku difraktovaly. Zdrojem proudu elektronů je kovová katoda, která po rozžhavení vysílá<br />
elektrony urychlované el. polem o napětí 50-200kV. Proud elektronů prochází tzv.<br />
elektronovou čočkou, kterou tvoří el. pole zvláštního kondenzátoru, nebo mag. pole cívky.<br />
Tato elektronová čočka soustřeďuje elektrony na pozorovaný předmět (preparát). Vrstva<br />
preparátu musí být velmi tenká, přibližně 1 mm, aby nepohlcovala elektrony . Proud elektronů<br />
pak prochází další elektronovou čočkou- objektivem a vytvoří první elektronový obraz. Část<br />
tohoto obrazu se elektronovou čočkou- projektivem- znovu zvětší a výsledný obrazec se<br />
promítá buď na stínítko pokryté vrstvou luminoforu, nebo se zachytí na fotografické desce či<br />
filmu. Tyto , a samozřejmě i další součásti elektronového mikroskopu jsou uloženy ve<br />
vzduchotěsné válcové nádobě, z níž je vyčerpán vzduch, aby se prou elektronů nezeslaboval.<br />
K přípravě vzorků pro transmisní elektronový mikroskop se používá několik metod :Metoda<br />
obtisků (replik) – povrch silnější než 10-50 nm se pokrývá replikou. To může být např. roztok<br />
celulózy, který se nakápne na pozorovaný povrch a nechá se roztéct. Po zaschnutí repliku<br />
sejmeme a pozorujeme.<br />
: Příprava ultratenkých řezů- používá se zařízení zvané ultramikroton. Obsahuje fixní<br />
skleněný nůž a masivní ocelovou tyč, na níž je upevněn vzorek. Tyč se otáčí a je ohřívána<br />
průchodem proudu, čímž dojde k jejímu prodloužení a uříznutí části vzorku<br />
: elektrochemické leptání – vzorek (cca 100 mm ) je elektrochemicky leptán nebo iontově<br />
poprašován. V místě, kde se vzorek proleptá jej pozorujeme.<br />
RASTROVACÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP : Rastrovací elektronový mikroskop<br />
pracuje tak, že na vzorek dopadá tenký svazek elektronů, který dopadá postupně na všechna<br />
místa vzorku. Odražený (emitovaný) paprsek se převádí na viditelný obraz.<br />
Mechanická clona – vybírá pouze část elektronů, které dopadnou na preparát.<br />
Projekční čočka – způsobí, aby zaostřený svazek elektronů dopadl na preparát. Zaostřený<br />
svazek elektronů musí po povrchu preparátu rastrovat synchronně s TV.<br />
41
Rozlišujeme 4 skupiny elektronů opouštějící povrch vzorku:<br />
1) zpětně odražené elektrony – poskytují informaci o topografii (reliéfu) vzorku a o<br />
materiálovém složení. Jejich rozlišovací schopnost je 50-200nm.<br />
2) Sekundární elektrony – poskytují informaci převážně topografickou. Rozlišovací schopnost<br />
je 5-15 nm.<br />
3) Augerovy elektrony – jsou vyráženy z materiálu a zjištěním jejich energie lze provádět<br />
prvkovou (kvalitativní) analýzu<br />
4) Primární elektrony – detekují se jako u transmisního elektronového mikroskopu (0,5nm)<br />
Dále pak můžeme detekovat i RTG záření nebo i viditelné světlo, což nám umožní získat další<br />
informace o zkoumaném vzorku. Vzorek může být 2-3 cm tlustý a 15 cm dlouhý a musí být<br />
kvalitně pokoven.<br />
Výhody a nevýhody elektronové mikroskopie<br />
Mezi největší výhody patří velmi velké zvětšení – řádově až 1 000 000 , což umožňuje<br />
pozorovat i opravdu velmi malé částice. U transmisních el. mikroskopů je nutné, aby vzorek<br />
byl velmi tenký, což lze považovat za nevýhodu. Další podstatná nevýhoda je to, že preparát<br />
musí být umístěn ve vakuu, což neumožňuje pozorovat živé organismy. El. mikroskop má<br />
také velké rozlišení (0,1 nm) a velkou hloubkou ostrosti (několik mm). Pohyb svazku<br />
elektronů lze řídit pomocí počítače , což umožňuje využít veškerý komfort, který tato technika<br />
poskytuje (zobrazit pouze výřez , odstranit šum snížením rastrovací rychlosti, tisknout<br />
obraz…). Výhoda je také to, že elektronový mikroskop může dát informaci nejen o topografii<br />
vzorku, ale i o jeho materiálovém složení. Za nevýhody lze dále považovat i velké nároky na<br />
prostor a vysokou pořizovací cenu.<br />
Elektronová mikroskopie se používá při studiu velmi malých částic, například v lékařství při<br />
studiu bakterií a virů. Jiné uplatnění nalézá např. v mikroelektronice, kde se využívá při<br />
vývoji a studiu čipů a polovodičových materiálů. Vzhledem k tomu, že dráhy elektronů<br />
ovlivňují také případné mag. pole povrchové vrstvy vzorku, můžeme např. pozorovat mag.<br />
pole, které vytváří pracující polovodičová součástka. Mikroskop se využívá i ke kvalitní<br />
(prvkové) analýze např. v chemii, biologii atd.<br />
Dále existuje mikroskop interferenční, který se využívá zejména v technické praxi, např. ve<br />
strojírenství .<br />
Polarizační mikroskop je určen pro studium optických vlastností krystalů. Tento mikroskop<br />
má v osvětlovacím zařízení a v tubusu zařazeno dvojí polarizační zařízení, které je otočné<br />
kolem optické osy.<br />
Stereoskopické <strong>mikroskopy</strong> dávají plastický obraz.<br />
Mikroskopy můžeme i fotografovat, dále se používá přístroj zvaný mikromanipulátor, který<br />
umožňuje operaci na buňkách za pomoci speciálních zařízení (mikrurgie)..<br />
7) Vady čoček + typy objektivů<br />
Z knížky<br />
Hlavní vady čoček<br />
Chromatická – způsobena různým lomem světla o různé lnové délce. Paprsky se<br />
nesoustřeďují v jediném ohnisku na ose čočky, ale každé světlo určité vlnové délky<br />
má své ohnisko.<br />
42
Kulová – paprsky rovnoběžné s osou se lámou různě podle jejich vzdálenosti od středu čočky.<br />
Ty, které dopadají dále od středu, se lámou více než středové<br />
Astigmatická – způsobena tím, že se paprsky, které dopadají na čočku ze strany (z bodu<br />
ležícího mimo optickou osu) neprotnou v jednom bodě, ale zobrazují se jako dvě linie na sebe<br />
kolmé<br />
Vyklenutí zorného pole – vzniká tím, že paprsky dopadající na čočku šikmo mají jiné ohnisko<br />
než rovnoběžné paprsky přímé.<br />
43
Koma – bod ležící mimo osu čočky je zobrazen jako protáhlá ploška.<br />
Distorze – okraje zorného pole jsou více či méně zvětšené než je střed.<br />
Vhodnou kombinací čoček objektivů a okuláru se v určité míře mohou tyto vady odstranit.<br />
Typy objektivů podle způsobu kompenzace optických vad:<br />
achromáty - mají barevnou zbytkovou vadu odstraněnou jen pro dvě barvy, optimální<br />
barevná korekce je provedena pro žlutozelenou barvu, na kterou je oko nejcitlivější. Korekce<br />
pro modrou a červenou barvu nemusí být tak dokonalá. Achromáty jsou nejekonomičtější<br />
objektivy, mohou však být výhodné např. při fluorescenci, protože jsou složeny z méně čoček,<br />
takže pohlcují méně ultrafialového záření.<br />
plan-objektivy, např. planachromáty, mají dokonale odstraněnou vadu sklenutí, používají se<br />
hlavně pro mikrofotografické práce. Korekce barevné vady je stejná, jako u achromátů.<br />
apochromáty - mají již provedenou korekci barevné vady pro tři základní barvy spektra.<br />
Dosahují vyšší numerické aparatury a lepšího rozlišení pozorovaných detailů.<br />
planapochromáty spojují vlastnosti apochromátů s plan-objektivy. Patří k nejlepším<br />
a k nejdražším objektivům.<br />
Seznam použitých adres:<br />
Mikroskopy.cz<br />
Zeiss.cz<br />
Leica.cz<br />
httpmicro.magnet.fsu.eduprimeranatomyanatomy.html<br />
44
httpstaffold.vscht.czktkwwwrootstaffkratkaBrno%202001.htm<br />
httpwww.physics.muni.cz~kubenaModerni%20metody31_souboryframe.htm<br />
httpwww.physics.muni.cz~kubenaoptika1sld001.htm<br />
Maturita.cz<br />
Nikonopteoteam.cz<br />
Olympus.cz<br />
httpwww.arid.cznikcovite.htm<br />
httpwww.biomed.cas.czd331vade<strong>mikroskopy</strong>.html#h3_0<br />
httpceg.fsv.cvut.czCZindex.htm<br />
45