Interferometrické biosenzory - FBMI
Interferometrické biosenzory - FBMI
Interferometrické biosenzory - FBMI
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Jedná se o volný, nerecenzovaný překlad kapitoly z knihy : Optical<br />
Biosensors, Present and Future, Edited by F.S. Liegler and Ch.A. R.<br />
Tait, Elsevier 2002, str. 277- 304.<br />
Přeložil : Leopold Cudzik<br />
Upravil a modifikoval : Miroslav Jelínek<br />
Obrázky upravil a modifikoval : Tomáš Kocourek<br />
INTERFEROMETRICKÉ BIOSENZORY<br />
1 Daniel P. Campbell, PhD. a 2 Candice J. McCloskey, PhD.<br />
1 Georgia Tech Research Institute, Atlanta, GA 30332 USA<br />
2 Life University, School of Arts and Science, Marietta, GA 30060 USA<br />
Interferometrie je optická metoda, která sleduje rozdíly mezi dvěma optickými svazky, jež<br />
uběhly podobné dráhy. Pozorování biokonjugované reakce, která se odehrává v dráze jednoho<br />
ze svazků, tvoří základ biosensoru. Nejoblíbenější platformou interferometrických senzorů<br />
jsou planární vlnovody. Ty jsou preferovány z důvodu delší interakční dráhy. Evanescentní<br />
pole planárního vlnovodu je citlivé na změny indexu lomu materiálu, který je nad vlnovodem.<br />
Toto pole je schopné proniknout až do vzdálenosti 500 nm nad povrch vlnovodu. Pokud nad<br />
povrch umístíme chemicky aktivní vrstvu, chemická reakce se odehraje v tomto poli.<br />
Chemické i fyzikální interakce mění index lomu a tím ovlivňují rychlost šíření a fázi<br />
optického svazku (větší index lomu pak sníží rychlost šíření a naopak). Abychom mohli měřit<br />
tuto změnu, je potřeba umístit do blízkosti citlivého vlnovodu (citlivého na danou reakci),<br />
vlnovod referenční. Svazky z těchto dvou kanálů jsou pak opticky zkombinovány a vytvoří<br />
charakteristické interferenční proužky. Chemická, nebo fyzikální změna v senzorické části<br />
interferometru vede k posuvu interferenčních proužků. Toto posunutí je v prostoru<br />
charakterizováno sinusovkou (will shift producing sinusoidal output). V článku je<br />
prezentováno několik experimentálních uspořádání a jsou porovnány jejich citlivosti. Citlivost<br />
vzhledem k biochemické reakci je závislá na délce interakční oblasti a na rozsahu interakce<br />
mezi materiálem a evanescentním polem.<br />
Princip činnosti<br />
Interferometrie je technika schopná měřit tři veličiny optického svazku podél dané dráhy:<br />
změnu délky trasy, změnu vlnové délky, nebo změnu rychlosti šíření. Změna některé z těchto<br />
veličin se projeví změnou fáze vlny: Ta je podle rovnice (1) závislá na délce dráhy L, indexu<br />
lomu n a na vlnové délce λ.<br />
n<br />
Φ = 2π<br />
L<br />
(1)<br />
λ<br />
V oblasti biosenzorů se převážně uplatňuje závislost na indexu lomu. Biokonjugovaná reakce,<br />
jako např. navázání jednoho proteinu na druhý, má za následek změnu indexu lomu prostředí.
To pak přímo ovlivní rychlost šíření světla v daném prostředí. Abychom tuto změnu mohli<br />
měřit, je třeba sledovat rovněž referenční světelný svazek. Referenční svazek je potřeba vést v<br />
blízkosti měřícího svazku, nicméně nesmí dojit k jeho ovlivnění detekovanou událostí.<br />
Zkombinování měřícího svazku (ovlivněného detekovanou událostí) a referenčního vytvoří<br />
interferenční tmavé a světlé proužky. Chemická, nebo fyzikální změna v senzorickém ramenu<br />
interferometru vede k posuvu interferenčních proužků.<br />
Preferovaným typem interferometru v oblasti biosenzorů je Mach-Zenderův interferometr<br />
(nikoliv Michaelsonův důvěrně známý z FTIR). Michaelsonovým interferometrem se nejprve<br />
získá referenční interferogram, a poté interferogram za přítomnosti vzorku. Fourierova<br />
transformace jejich rozdílu nám poskytne spektrum vzorku. Mach-Zender je užíván častěji,<br />
protože v senzorové analýze je výhodné použít monochromatického zdroje světla. Rovněž<br />
přítomnost pohybujících se zrcadel (jako v případě FTIR) není vhodná. Tento interferometr<br />
také měří pouze reálnou část indexu lomu (ne imaginární část, tedy absorpci).<br />
Relativně jednoduchý mechanismus a elektronika Mach-Zenderova interferometru jej<br />
předurčují pro výrobu levných přenosných zařízení. Jednoduchost konstrukce může znamenat<br />
jistá omezení při měření ; to je vykompenzováno možností ovlivňovat složení a strukturu<br />
obou ramen interferometru. Nejjednodušší interferometry jsou konstruovány pomocí<br />
planárních vlnovodů.<br />
Historie<br />
Základy teorie interference a první interferometrické pokusy byly provedeny Thomasem<br />
Youngem v roce 1803 (Young, 1803). Pozorovaný jev položil základ teorie o vlnovém<br />
původu světla. Od té doby se interferometre používala nejčastěji pro prostorových/objemová<br />
měření. Pokud biokonjugovaná reakce proběhne uvnitř objemu pevné látky, nelze na tomto<br />
objemu pozorovat žádnou změnu. Až v době, kdy se podařilo biokonjugovanou reakci<br />
zafixovat na povrch, bylo možno pokročit v oblasti vývoje biosenzorů. V roce 1983, Lukosz a<br />
Tiefenthaler(1983a; Tiefenthaler a Lukosz, 1984a) při experimentech s mřížkovými<br />
vazebními členy pro planární vlnovody objevili, že vlhkost vzduchu ovlivňuje jejich<br />
vlastnosti. Reakce vodních par ve vzduchu s evanescentním polem vlnovodu změnila velikost<br />
ideálního úhlu pro navázání světla do vlnovodu, a tedy účinnost vazebného členu. Další<br />
experimenty potvrdily možnost využít těchto vlivů pro měření koncentrace plynů a vlhkosti<br />
(Thiefenthaler a Lukosz, 1984a; 1985). Poté se autoři věnovali zkoumání vlivu<br />
biokonjugovaných reakcí na mřížkové vazební členy a biosenzorům na bázi interferometrické<br />
analýzy v planárních vlnovodech (Nellen et al. 1988; Lukosz a Tiefenthaler, 1988, 1989;<br />
Lukosz, 1991).<br />
Technologie a současný stav<br />
Optické interferometrické <strong>biosenzory</strong> využívají poznatků několika velmi dynamicky se<br />
rozvíjejících oborů. Vlnovody a integrovaná optika se v široké míře uplatnily v oblasti<br />
telekomunikací. Technologie výroby, jako např. fotolitografie, leptání, či depozice jsou<br />
produkty polovodičového průmyslu. Kvalitní lasery a detektory jsou výsledkem pokroku<br />
v počítačové technice, kde se používají lasery v CD-ROM mechanikách a detektory např. ve<br />
webkamerách. Některé návrhy jsou převzaty z technologie MEMS. Technika biosenzorů se<br />
díky pokroku v těchto oblastech posouvá velmi rychle kupředu.
3.1 Vlnovody<br />
Vlnovod je srdcem typického interferometrického senzoru. Vede světlo a zároveň se na jeho<br />
povrchu odehrává biokonjugovaná reakce. Délka vlnovodu určuje citlivost senzoru. Různé<br />
optické metody nabízí přibližně stejné citlivosti při stejných délkách interakční oblasti.<br />
Základními komponenty pro senzory jsou : laserový zdroj, vlnovod a detektor.<br />
Vlnovody poskytují prostor pro interferometrii, podobně jako optická vlákna. Optická vlákna<br />
jsou tvořena jádrem (core) z materiálu o vyšším indexu lomu a obalem (cladding) o nižším<br />
indexu lomu. Světlo se pak šíří jádrem díky totálnímu odrazu na rozhraní. Část<br />
elektromagnetického pole proniká i do obalu - tato část se nazývá evanescentní pole. Veškeré<br />
EM pole je omezeno objemem vlákna (tedy jádrem a obalem) a energie neproniká do<br />
okolního prostředí.<br />
Planární vlnovod si lze představit jako optické vlákno rozvinuté do roviny. Vrstva s vyšším<br />
indexem lomu (tedy ta, kterou je vedeno světlo) je teď nad oblastí s nižším indexem lomu.<br />
Evanescentní pole zasahuje i do oblasti nad vlnovodnou vrstvou a sleduje případné změny<br />
v indexu lomu nad vlnovodnou vrstvou.<br />
Obrázek 1: Profil indexu lomu gradientního vlnovodu a vlnovodu se skokovou změnou indexu lomu<br />
(step-index).<br />
Planární uspořádání vlnovodu usnadňuje přidávání či výměnu optických členů na podložce,<br />
do vlnovodné vrstvy, či na tuto vrtsvu. Je možné zařadit mřížky, které umožňují navázat, či<br />
vyvázat světlo z vlnovodu, zrcadla, děliče svazku, nebo modulátory.<br />
Ke konstrukci vlnovodu lze použít jakýkoliv opticky transparentní materiál - nejčastěji sklo,<br />
nebo některé polymery. Citlivost planárního vlnovodu je dána indexem lomu vodivé vrstvy,<br />
tloušťkou vlnovodu a indexem lomu substrátu (podložky), který také přispívá k intenzitě<br />
evanescentního pole nad vlnovodnou vrstvou. S rostoucím rozdílem mezi indexy lomu<br />
substrátu (podložky) a vlnovodné vrstvy se zvyšuje citlivost vlnovodu. Rozlišujeme dvě<br />
hlavní skupiny planárních vlnovodů : vlnovody se skokovou změnou indexu lomu, tzv. stepindex<br />
vlnovody a vlnovody s postupnou změnou indexu lomu (gradientní vlnovody) - tzv.<br />
graded index (viz. Obrázek 1).<br />
Vlnovod s postupnou změnou indexu lomu je charakterizován plynulým přechodem indexu<br />
lomu mezi substrátem a vrchní vrstvou vlnovodu. Ta má velký index lomu, přičemž jeho<br />
velikost se plynule snižuje směrem k substrátu. Tento typ vlnovodu se nejčastěji vyrábí
iontovou výměnou, kdy v substrátu (nejčastěji sklo) jsou přítomné jednoduché ionty, jako<br />
např. sodík, které lze vyměnit za stříbrné, cesiové, draselné, lithiové, thaliové, případně i jiné<br />
jednoduché ionty. Substrát se umístí do solné lázně, která obsahuje iont, který chceme dodat<br />
do substrátu. Volba chemického prvku, koncentrace jeho iontů a doba působení lázně - to vše<br />
ovlivní hloubku difúze do substrátu, a tedy tloušťku vodivé vrstvy, počet vlastních módů a<br />
profil indexu lomu. Tato metoda se občas modifikuje přiložením elektrického pole na substrát<br />
v lázni; případně žíháním vrstvy po vyjmutí z lázně. Pro gradientní vlnovody byly<br />
publikovány docílené změny indexu lomu v povrchové vrstvě v rozmezí 0.003 až 0.1. (Millar<br />
a Hutchins, 1978; Walker a Wilkinson, 1983; Gato a Srivastava, 1996).<br />
Step-index vlnovody vykazují skokovou změnu profilu indexu lomu. Toho lze dosáhnout<br />
depozicí materiálu s vyšším indexem lomu na substrát s nižším indexem lomu. Pro tvorbu<br />
polymerových a sol-gel vlnovodů se používají depoziční metody jako např. spin-coating a<br />
dip-coating. Pro skleněné substráty se používají tradiční metody polovodičového průmyslu:<br />
chemická depozice z pevné fáze (CVD), napařování a naprašování. Tyto metody umožňují<br />
jemnou regulaci depozičního procesu a docílení požadované citlivosti vlnovodu. Z teorie<br />
vlnovodů plyne, že tloušťka vlnovodu se nemůže zmenšovat do nekonečna - při jisté tloušťce<br />
vrstvy už vlnovod není schopen vést světlo. Největší citlivosti je dosaženo právě poblíž této<br />
mezní šířky (tzv. cutoff). Čím více se vlnovod zužuje (čím je vlnovodná vrstva tenčí), tím<br />
silnější je evanescentní pole mimo něj.<br />
Stanovit citlivost vlnovodných struktur lze například umístěním slaného roztoku na povrch<br />
vlnovodu a následným interferometrickým měřením změny fáze optického svazku vedeného<br />
vlnovodem. S rostoucí koncentrací solného roztoku roste index lomu roztoku. Vlnovody<br />
s postupnou změnou indexu lomu jsou principiálně méně citlivé než step-index vlnovody. Je<br />
to dáno tím, že prostou iontovou výměnou nelze dosáhnout velkého kontrastu indexů lomu.<br />
Pokud chceme získat strukturu s velkým rozdílem indexů lomu, je třeba použít vlnovody se<br />
skokovou změnou n.<br />
Příklad:<br />
Substrát ze skla BK-7 byl ponořen na 20 minut do solné lázně, která obsahuje 0.25molárních<br />
procent AgNO3 v NaNO3 při teplotě 325°C. Došlo ke změně indexu lomu o 0.001. To vedlo<br />
k fázovému posunu procházejícího svazku o 0.22π rad na 1cm dráhy. Ve druhém případě byla<br />
deponována pomoci CVD technologie vrstva Si3N4 (110 nm silná) na tavený křemen. Stejná<br />
změna indexu lomu (o 0.001) na stejné dráze (1 cm) vyvolala fázový posuv o 7.6π rad. Tento<br />
třicetičtyřnásobný nárůst citlivosti je způsoben malým kontrastem indexu lomu v gradientním<br />
vlnovodu (pouze o několik tisícin), oproti rozdílu 0.4 v případě Si3N4 vlnovodu na taveném<br />
křemeni.<br />
Vlnovod je schopen vést světlo pouze při dosažení kritických hodnot rozdílu indexů lomu a<br />
tloušťky vlnovodné vrstvy. Toto chování vlnovodu je podrobně popsáno v literatuře<br />
(Nishihara, et.al., 1985a). Pro senzorové aplikace je nutné si uvědomit, že vedení světla je<br />
možné pouze při splnění podmínky příčné rezonance.<br />
Tato podmínka říká, že vedený svazek musí být prodělat fázový posuv 2π v pravidelných<br />
vzdálenostech podél vlnovodu. Matematicky je tato podmínka přepsána pro transverzálně<br />
elektrické pole TE (rovnice 2) a pro transverzálně magnetické pole (rovnice 3). Obě rovnice<br />
uvažují fázový posuv způsobený šířením v prostředí (2 k nf W cosθ) a posuvy způsobené<br />
odrazy na rozhraních.
1<br />
1<br />
⎛<br />
⎞<br />
⎛<br />
⎞<br />
2 2 2<br />
2 2 2<br />
⎜<br />
2<br />
2<br />
( n f sin θ − nS<br />
) ⎟<br />
⎜ ( n f sin θ − nC<br />
) ⎟<br />
− 1<br />
− 1<br />
2kn<br />
fW<br />
cosθ<br />
− 2 tan ⎜<br />
⎟ − 2 tan ⎜<br />
⎟ = 2π<br />
m<br />
⎜ n f cosθ<br />
⎟<br />
⎜ n f cosθ<br />
⎟<br />
⎝<br />
⎠<br />
⎝<br />
⎠<br />
1<br />
1<br />
⎛<br />
⎞<br />
⎛<br />
⎞<br />
2 2 2 2<br />
2 2 2 2<br />
⎜<br />
2<br />
2<br />
n f ( n f sin θ − nS<br />
) ⎟<br />
⎜ n f ( n f sin θ − nC<br />
) ⎟<br />
− 1<br />
− 1<br />
2kn<br />
fW<br />
cosθ<br />
− 2 tan ⎜<br />
⎟ − 2 tan ⎜<br />
⎟ = 2π<br />
m<br />
2<br />
2<br />
⎜ nS<br />
n f cosθ<br />
⎟<br />
⎜ nC<br />
n f cosθ<br />
⎟<br />
⎝<br />
⎠<br />
⎝<br />
⎠<br />
kde m – je módové číslo (0,1,2 ...)<br />
nf – index lomu vlnovodné vrstvy<br />
nc – index lomu svrchní vrstvy vlnovodu<br />
nS – index lomu substrátu<br />
W – tloušťka vlnovodné vrstvy v nm<br />
Trasa paprsků a rozdělení energie ve vlnovodu pro první dva vlastní módy je na obrázku 2. Se<br />
zvětšující se tloušťkou vrstvy, případně se zvětšujícím se rozdílem indexů lomu vlnovodné<br />
vrstvy a substrátu, popř. vrchní vrstvy, se zvětšuje počet módů, které mohou být navázány.<br />
Povšimněte si rozdílu mezi rovnicemi (2) a (3) - viz násobící faktor ve výrazu tangens pro TM<br />
módy. Ve výsledku to znamená, že TM módy potřebují větší tloušťku vlnovodu, aby mohly<br />
být vedeny. V případě vedení módů TE i TM, jsou módy TE vedeny (soustředěny) blíže<br />
středu vlnovodu.<br />
Obrázek 2:Dráha paprsků a rozdělení elektrického pole prvních dvou vedených módů<br />
3.2 Metody navázání světla do vlnovodu<br />
Prvním problémem, který je třeba vyřešit při senzorové analýze, je navázání světla do<br />
vlnovodu. Existují tři nejčastěji používané metody: endfiring (přímé navázání), navázání<br />
pomocí optického hranolu, nebo pomocí mřížkového vazebného členu (viz. Obrázek 3).<br />
(2)<br />
(3)
Přímé navázání je nejjednodušší způsob, jak vybudit vedený mód ve vlnovodu. Světlo se<br />
navazuje na počátek vlnovodu ve směru jeho šíření. Svazek je buď fokusován čočkou, nebo je<br />
zaveden optickým vláknem přímo k vlnovodné vrstvě. Maximální účinnosti je dosaženo<br />
v případě, že profil svazku odpovídá profilu vybuzeného módu (Nishihara, 1985b). Pro nultý<br />
mód, který je používán nejčastěji, tomu odpovídá Gaussovský profil. Je žádoucí, aby vlnovod<br />
měl maximální účinnost navázání světla a minimální rozptyl. Proto se počátek vlnovodu buď<br />
pečlivě leští, nebo, jako v případě křemíkových substrátů, štípe (cleaving). Ačkoliv lze<br />
dosáhnout velmi vysoké účinnosti navázání, nejsou pro interferometrické <strong>biosenzory</strong><br />
požadavky tak přísné, a lze tolerovat jisté procento ztrát. Metoda přímého navázání funguje<br />
nejlépe pro vlnovody s větší šířkou vlnovodné vrstvy, např. pro vlnovody vytvořené iontovou<br />
výměnou. V případě step-index vlnovodů a vlnovodů z materiálů s vysokým indexem lomu, a<br />
pokud navíc chceme vybudit jen základní mód, je třeba pečlivě dbát na to, aby všechny<br />
optické členy byly justovány do jedné osy. Pokud má vlnovodná vrstva rozměr řádu 100 nm,<br />
pak jsou na vzájemné zjustování optických os laseru a vlnovodu kladeny velké požadavky.<br />
V případě použití kanálkových vlnovodů je justáž složitější. Problémy s vyrovnáním<br />
(justováním) celé soustavy do jedné osy ztěžuje integrování senzoru, hlavně v těch případech,<br />
kdy je nutné vlnovodný čip často měnit.<br />
Obrázek 3: Metody navázání světla do vlnovodu: a) přímé navázání – endfiring; b) navazování optickým<br />
hranolem; c) navazování optickou mřížkou<br />
Navázání světla pomocí optického hranolu umožňuje docílení vysoké účinnost navázání.<br />
Prizma musí být umístěna nad vlnovodnou vrstvou. Hranol vybudí mód ve vlnovodu tak, že<br />
dojde ke zfázování příchozí vlny s vlastním módem vlnovodu. Používají se prizmy s vysokým<br />
indexem lomu, jako např. z těžkého flintového skla (n=2.009), nebo z rutilu (TiO2 ; no = 2.584,<br />
ne = 2.872). Hranol musí být v těsném kontaktu s vlnovodnou vrstvou. Jelikož jsou hranol a<br />
vlnovod „tlačeny“ k sobě, je důležité, aby jejich povrchy byly pečlivě očištěny. Jakmile lze<br />
pozorovat interferenční proužky, nebo navázané světlo ve vlnovodu, je kontakt dostatečný.<br />
Stěna prizmy, která je v kontaktu s vlnovodem je velmi pečlivě leštěna a zabroušena tak, aby<br />
vznikla malá vzduchová mezera, kterou se světlo naváže do vlnovodu. K navázání světla<br />
dojde, když je splněna podmínka β = k nf sinθ , kde β je konstanta šíření, k je vlnové číslo<br />
2π/λ a nf je index lomu vlnovodu. θ je úhel dopadu. V praxi tedy měníme úhel θ a tím si<br />
vybíráme, které módy budou vybuzeny ve vlnovodu.<br />
Nicméně použití hranolů výrobu senzoru komplikuje. Je nutno používat šroubového<br />
mechanismu pro zajištění dostatečného tlaku hranolu na vlnovod. Další komplikaci<br />
představuje otočný mechanismus pro změnu úhlu θ. V naší laboratoři (tj. laboratoři autora<br />
článku) se uspořádání s hranolem používá převážně pro testování kvality vlnovodů, a méně
často pro senzorovou analýzu. K největší komplikacím dochází když je cela používána<br />
v aplikacích s vodním roztokem. Izolace v kontaktu s vlnovodem obvykle způsobí vyvázáni<br />
světla z vlnovodu. Proto potřebuje vlnovod jistý způsob ochrany, která jej izoluje od cely a<br />
umožní šíření světla ve vlnovodu. Další obtíže nastávají v oblastech přechodu mezi hranolem<br />
a ochrannou celou, nebo mezi celou a vlastní oblastí senzoru. Z těchto důvodu jen málo<br />
výzkumných pracovišť používá hranoly pro navazování světla do vlnovodu.<br />
Třetí variantou je navázání světla do vlnovodu prostřednictvím mřížkového vazebného členu<br />
vyrobeného přímo ve vlnovodu. Mřížkový vazební člen je struktura s periodicky se měnícím<br />
profilem indexu lomu ve vlnovodné vrstvě, nebo v substrátu. Vyrábí se převážně ražením,<br />
leptáním, nebo iontovou výměnou. Ražení probíhá tak, že se komerčně vyráběná mřížka<br />
obtiskne do vlnovodu z měkkého materiálu, jako jsou např. sol-gely, nebo polymery.<br />
Například sol-gel (koloidní roztok) SiO2- TiO2 je nanesen na substrát technikou dip-coating a<br />
nechá se částečně vysušit. Poté je po dobu několika minut přitlačena k povrchu mřížková<br />
forma - tlakem 40- 50 kg (Lukosz a Tiefenhaler, 1983b; Hengerger a Lukosz 1986; Ramos<br />
et.al, 1996). Poté se forma uvolní a sušení se dokončí termicky. Při návrhu výrobního<br />
postupu je vždy zapotřebí uvažovat úbytky hmotnosit. Touto metodou byly vyrobeny mřížky<br />
o rozměrech v rozmezí 250 – 850 nm s účinností 10-25%. Lze použít i polymery - nicméně<br />
jsou tvrdší, nejsou tak inertní a mají větší dn/dt než sol-gely.<br />
Mřížkové vazební členy bývají pokryty ochrannou vrstvou např. SiO2 tak, aby byly izolovány<br />
od vnějšího prostředí. Vrstva SiO2 pak tvoří vrchní vrstvu nad vlnovodnou vrstvou z SiO2/TiO2<br />
a tyto materiály pak vytváří kontrast indexu lomu pro mřížku.<br />
Dalším způsobem výroby mřížek je použitím fotorezistů a fotomasek. Masku lze vyrobit<br />
mnoha způsoby. Jedním z nich je použitím dvou překřížených (protínajících se) laserových<br />
svazků. Vzor mřížky může být zaznamenán jak do vlnovodu, tak do substrátu. Vlastní mřížka<br />
je pak vyrobena leptáním reaktivními ionty, nebo chemickým leptáním (Hartman et. al, 1998).<br />
Opět se může přidat izolační vrstva z oxidu křemičitého jež chrání mřížku od okolí. Kontrast<br />
v profilu indexu lomu je pak dán buď rozhraním vlnovod/izolační vrstva, nebo<br />
vlnovod/substrát. Tyto mřížky mají podobnou účinnost, jako mřížky vytvořené ražením.<br />
Mřížky vyrobené iontovou výměnou mají menší rozdíl indexů lomu a jejich efektivita je tudíž<br />
nižší.<br />
Jednou z výhod, které mřížky nabízejí, je možnost navázat do vlnovodu světlo ze spodní<br />
strany. To umožňuje na vlnovod umístit testovací celu a testová kapalina je pak nad<br />
vlnovodem. Mřížkové vazební členy nejsou (ve srovnání s „end- firingem“) tak citlivé na<br />
justování do jedné optické osy. Vlnovodné čipy mohou být snadno vyměněny a získáváme tak<br />
„plug and play“ senzory. Mřížkové vazební členy nicméně nejsou vhodné pro navazování do<br />
kanálkových vlnovodů, protože tam ztrácíme jeden stupeň volnosti (oproti planárnímu<br />
vlnovodu). Rovněž nastavení požadovaného profilu svazku je obtížnější. Mřížky jsou rovněž<br />
citlivé na vlnovou délku (v závislosti na úhlu), což je výhodné, pokud nemáme<br />
monochromatický zdroj. Navíc, mřížkové členy o velkých rozměrech mohou sloužit se<br />
stejnou účinnosti pro více interferometrů na jednom čipu.
Obrázek 4:Schéma Mach-Zenderova interferometru<br />
3.3 Interferometry<br />
Z vlnovodu se šíří evanescentní pole, které je citlivé na změny v blízkém okolí povrchu<br />
vlnovodu. Umístíme- li do tohoto prostoru chemicky selektivní citlivou vrstvu, pak tato vrstva<br />
zprostředkovává kontakt mezi vnějším prostředím a světlem, které je vedeno vlnovodem.<br />
Chemická či fyzikální interakce prostředí s vlnovodem mění index lomu této vrstvy a tím<br />
ovlivňuje rychlost světla, či jeho fázi. Pro měření této změny je svazek zkombinován<br />
s referenčním za vzniku interferenčních proužků. Schéma měření je na obrázku 4.<br />
Dojde – li k fyzikální, nebo chemické interakci, pak to má za následek změnu posuvu<br />
interferenčních proužků, přičemž tento posuv sleduje průběh funkce sinus. Fázový posuv je<br />
definován pomocí efektivního indexu lomu neff, což je číslo charakteristické pro vlnovod a je<br />
závislé na indexech lomu vlnovodné vrstvy, substrátu i vrchní vrstvy. Na interakční délce L<br />
pak dochází k fázovému posuvu:<br />
Φ<br />
=<br />
2π<br />
( Δ<br />
λ<br />
neff<br />
Spodní detekční hodnota je dána šumem (jak termickým, tak mechanickým), dále vlnovodem,<br />
stabilitou laseru a charakteristikami detektoru. Typicky jsou detekovatelné změny indexu<br />
lomu v řádu 10 -6 .<br />
<strong>Interferometrické</strong> senzory nabízí přímou „label-less“ biodetekci, eliminují vliv tepelného a<br />
mechanického šumu, parazitních signálů i změny indexu lomu bulkového (objemového)<br />
materiálu. Další výhodou interferometrických senzorů je možnost optické integrace pro další<br />
zvýšení stability, jejich kompaktnosti, rozměrů a nízká cena. Bylo studováno několik typů<br />
interferometrů. Každý má jiný způsob konfigurace senzorického a referenčního ramena,<br />
stejně tak se liší i uspořádáním směšovačů optických svazků z těchto ramen. Každé schéma<br />
má své výhody i nevýhody a neexistuje ideální konfigurace. Vláknové senzory, které<br />
potřebují nejen klasické, ale i vláknové optické členy, se zdají být poněkud těžkopádné pro<br />
praktické využití. Senzory se vyvinuly z několika druhů interferometrů. Převážně se jednalo o<br />
tato uspořádání: s diskrétními a oddělenými optickými dráhami, s „side-by- side“ kanály na<br />
jednom povrchu a s vrstevnatou strukturou v kolineárním uspořádání kanálů.<br />
)<br />
(4)
Vlnovodné interferometry jsou důsledkem rozvoje telekomunikačního průmyslu. Ten vyvinul<br />
optická vlákna pro přenos signálu a planární vlnovody pro usnadnění integrace a manipulace<br />
se signálem. Zpočátku využívala optická vláknová interferometrie kombinaci klasické a<br />
vláknové optiky. S pokračujícím vývojem byly postupně všechny klasické optické členy<br />
nahrazeny členy vláknovými. Tyto struktury se jako senzory používaly převážně pro měření<br />
tlaku a teploty. Různé varianty vláknové interferometrie jsou popsány v souhrnném článku<br />
od Kinseyho (1990). Někteří vědci používali tyto senzory také pro biosenzorové aplikace -<br />
například (Choquette a Locascio-Brown, 1994) měřili teplotu s cílem monitorování tepla<br />
vznikajícího při enzymatické reakci. Choquette umístil jeden reaktant na optické vlákno a<br />
vedle něj umístil referenční vlákno. Reakce katalýzy s peroxidem vodíku (H2O2)<br />
vyprodukovala teplo, které pak bylo měřeno interferometrem. (pozn. překl.: katalyza -<br />
enzym, který katalyzuje odstranění toxického peroxidu vodíku z buňek. Přítomen ve všech<br />
živočišných orgánech).<br />
Vývoj vláknových interferometrů pak směřoval do oblastí akustiky, gyroskopie a do měření<br />
tlaku a teplot. V chemii se interferometry používaly převážně pro měření absorbance a<br />
fluorescence. Většina interferometrických měření se provádí planárními vlnovody. Planární<br />
uspořádání má výhodu (díky možnosti vyrobit velmi tenkou vrstvu) ve větším dosahu<br />
evanescentního pole. Dále umožňuje snadnější integraci optických komponent.<br />
Zásadním problémem vlnovodné interferometrie je v návrhu referenčního kanálu. Jelikož<br />
základním principem interferometre je měření rozdílu mezi senzorickým a referenčním<br />
kanálem, musí být druhý kanál (referenční) navržen tak, aby došlo k maximálnímu<br />
vynulování nežádoucích signálů. Signál pozadí má původ v tepelných jevech, mechanických<br />
změnách, případně ve změnách indexu lomu „bulkového“ materiálu. Dále je třeba vzít v potaz<br />
změnu indexu lomu vzorkovacího média a nespecifické reakce (čili další chemické reakce,<br />
které ovšem nechceme detekovat). Je žádoucí, aby referenční rameno bylo umístěno co<br />
nejblíže k senzorickému kanálu, a aby mělo stejnou strukturu, délku a i ostatní vlastnosti.<br />
Jediným rozdílem musí být citlivost na danou specifickou reakci, kterou chceme detekovat.<br />
Vláknová optika nemůže soupeřit s možnostmi vlnovodů, protože senzorové vlákno je<br />
fyzicky odděleno od referenčního vlákna. V případě planárních vlnovodných interferometrů<br />
jsou kanály umístěny na jedné struktuře a jsou od sebe vzdáleny méně než 1mm. Tato blízkost<br />
eliminuje tepelné, nebo mechanické vlivy na měření. Bohužel vliv lokálních změn indexu<br />
lomu materiálu nelze tímto způsobem zcela vyeliminovat a je třeba ji ve fluidní dynamice<br />
cely uvažovat. V ideálním systému by se změna indexu lomu projevila v obou kanálech<br />
současně.<br />
Existují dvě základní skupiny interferometrických konstrukcí: polarimetrické a dvou- módové<br />
interferometry. Tato uspořádání umožňují minimalizovat vlivy způsobené rozdíly mezi<br />
kanály. Trasy referenčního a senzorového svazku jsou v tomto případě kolineární, čili oba<br />
svazky procházejí stejným objemem vlnovodu a to eliminuje vliv tepelných a mechanických<br />
efektů, které se projevovaly v uspořádání se dvěma sousedními kanály. Nicméně i v tomto<br />
případě ovlivní bulkové změny indexu lomu výsledky měření. Index lomu ovlivňuje oba<br />
módy, nebo polarizaci. V uspořádání se dvěma kanály („side- by- side model“) je důležitý<br />
fluidní pohyb částic materiálu. V kolineárním uspořádání jsou změny bulkového indexu lomu<br />
detekovány současně, ale rozdílným způsobem - a to díky rozdílu v šíření evanescentního<br />
pole těchto dvou módů.<br />
Většina interferometrických schémat, včetně materiálů a výrobní technologie, byla převzata<br />
z oblasti telekomunikací. Děliče svazku, Y – uzly (symetrické rozvětvení buzené do společné<br />
větve) a modulátory se dodnes používají při návrhu a vývoji referenčních kanálů a pro<br />
docílení maximální detekce. Ranganath a Wang (1977) navrhli vlnovod využívající Mach-
Zenderův interferometrický modulátor; spíše než chemické změny jsou to elektronické<br />
interakce, které ovlivní fázi světla v kanálu inteferometru. Tento optický modulátor pomáhá<br />
odstínit vlnovod před nežádoucími vlivy okolí. Naopak senzory se snaží zvýraznit vliv okolí<br />
na fázi vedeného světla. Ramena interferometru slouží jako senzor (interrogator) a jako<br />
reference. Pokud je referenční rameno skryto pod inertní vrstvou a senzor je vystaven<br />
vnějším vlivům, dojde k ovlivnění světla v senzorickém ramenu díky změně indexu lomu<br />
okolí. Tyto indikované změny mohou být způsobeny specifickou interakcí, nespecifickou<br />
interakcí, nebo změnou indexu lomu prostředí Většinou se jedná o kombinaci všech výše<br />
uvedených vlivů. V případě detekce specifických jevů, jako např. vazeb antibody (protilátka)<br />
– antigen je referenčního kanál vystaven vlivu prostředí a tím se stane citlivým vůči<br />
nespecifickým, nebo bulkovým, změnám indexu lomu. Kvalitní návrh referenčního kanálu je<br />
zásadní pro maximalizaci detekce požadovaného analytu.<br />
Kanálkové Mach-Zenderovy interferometry mají kanálky vyrobeny „na“ nebo „v“ planární<br />
podložce. Y-spojky se používají pro rozdělování a slučování světelných svazků. Existují dva<br />
základní druhy kanálků: vzniklé iontovou výměnou (v substrátu) (Helmers et.al., 1996; Drapp<br />
et al., 1997; Luff et al. , 1998), nebo deponované pásky (Fisher a Müller, 1992; Brosinger et<br />
al. 1997; Schipper et al., 1997; Stamm et al., 1998; Weisser et al., 1999) (Obrázek 5).<br />
V prvním případě (u iontové výměny) se nejprve deponuje vzorovaná kovová maska, přičemž<br />
zůstává odkryta struktura kanálků. Pak se ponoří substrát s maskou do taveniny obsahující<br />
žádoucí iont. Ionty difundují do kanálků a vytvářejí vlnovodnou strukturu. Na senzorickou<br />
oblast je poté deponovaná vrchní vrstva.<br />
Obrázek 5:Schéma dvou typů kanálkového Mach-Zenderova interferometru<br />
Výroba páskových kanálkových vlnovodů probíhá deponováním vrstvy s vysokým indexem<br />
lomu na substrát z nižším indexem lomu. Vlastní kanálek z této vrstvy je pak vytvořen<br />
fotolitograficky, buďto vyleptáním, nebo tzv. technikou lift-off.<br />
Vlnovody pro obě metody musí být dostatečně dlouhé, protože divergenční úhel, který svírají<br />
ramena Y-členu musí být velmi malý. Je- li úhel malý, pak je vyžadována větší délka ramen<br />
tak, aby se kanálky dostatečně separovaly pro chemickou či biochemickou funkcionalizaci.<br />
Dalším stavebním blokem je zúžení do Y-členu (symetrické rozvětvení buzené do<br />
„výstupních větví“) ; také v tomto případě je potřeba pečlivý návrh členu, aby nedošlo ke<br />
konverzi energie do dalších příčných módů. Šířka kanálů musí být navržena tak, aby
neumožňovala šíření dalších příčných módů. Hrany kanálků musí být hladké, aby se<br />
minimalizoval rozptyl na nerovnostech - s tímto problém se setkáváme nejčastěji u<br />
deponovaných vlnovodů.<br />
Pro oba typy kanálkových přístrojů jsou snímací a referenční okna deponována na horní<br />
(svrchní) vlnovodnou strukturu. Světlo se naváže do jednoho konce vlnovodu buď pomocí<br />
fokuzační čočky, nebo optického vlákna pečlivě justovaného s osou vlnovodu (Nishihara et.<br />
al., 1985b). Pro vlnovody vyrobené na křemíkovém substrátu je možno použít V-groove ( Vdrážka)<br />
technologii pro srovnání členů do jedné osy (Fischer a Müller 1992)<br />
Obrázek 6: Mach-Zender s trojvlnovodným vazebným členem<br />
Kanálkový Mach-Zenderův interferometr je prostředkem k rozdělení světla z bodového zdroje<br />
do dvou, nebo více kanálů a ke zkombinování dvou signálů do jednoho kanálu<br />
interferenčního. Nicméně je obtížné nastavit pozici fáze výstupního signálu blízko kvadratury<br />
(quadrature; signál je v prostoru sinusový, pokud by detektor byl ve vrcholu sinusovky,měření<br />
by bylo málo citlivé, snahou je aby před měřením byl detektor v lineární oblasti funkce sinus<br />
a odchylka byla lépe měřitelná) , k dosažení maximální lineární citlivosti. Úmyslná změna<br />
indexu lomu (o známou hodnotu) v jednom z ramen zařízení umožní určit jak pozici fáze tak<br />
i minim a maxim na začátku experimentu.<br />
Kvadraturní problém lze zmírnit (Luff a Wilkinson, 1998) použitím vazebního členu se tří-<br />
vlnovodným vazebním členem – jako se používá v telekomunikačním průmyslu. Tento<br />
vazební člen (Obrázek 6) se skládá ze 3 paralelních (přilehlých, sousedních) vlnovodů; dvou<br />
ramen interferometru a třetího, umístěného mezi nimi. Výstupní signály jsou vzájemně mezi<br />
sebou rozfázovány o 2π/3. Alespoň jeden výstup se vždy nachází poblíž kvadratury. Součet<br />
všech tří výstupních signálů je konstantní a to umožňuje monitorování stability laserového<br />
záření, nebo změny absorpce v interferometru.<br />
Zajímavou variantou kanálkového Mach-Zenderova interferometru je Youngův interferometr<br />
(Brandenburg, 1997, Brandenburg et.al, 2000) (obr.7). Má useknutou druhou polovinu<br />
zařízení, nemá rekombinaci; a světlo po průchodu oběma větvemi propouští ven z vlnovodu<br />
(aniž by je předtím smísil). Díky divergenci výstupního svazku dojde v jisté vzdálenosti<br />
k překryvu signálů z vlnovodu a k vytvoření interferenčních vzorků. Youngův interferometr<br />
nepotřebuje žádnou přídavnou optiku a umožňuje kompletní pozorování interferenčních<br />
proužků. Při použití jednoho bodového detektoru mohou být pružky pro min a max
skanovány posunem detektoru nebo použitím zrcadla. Detekce proužků bez translace je<br />
možná použitím pole detektorů.<br />
Obrázek 7:Schéma Youngova interferometru<br />
Nevýhodou Youngova uspořádání je vzdálenost mezi výstupem vlnovodu a detektorem, která<br />
λ L<br />
je potřebná pro dosažení maximálního rozlišení proužků. Perioda proužků je rovna , kde<br />
d<br />
L je vzdálenost od konce vlnovodu a d je vzdálenost mezi dvěma kanály. Jelikož interferenční<br />
proužky existují v prostoru, může být detektor umístěn v libovolné vzdálenosti a vzdálenost<br />
detektoru je často je dána vlastnostmi detektoru.<br />
Vzdálenost mezi kanály rovněž ovlivňuje velikost proužků. Jejich velikost se zvětšuje<br />
s klesající vzdáleností mezi kanály a je diktována minimální vzdáleností potřebnou pro<br />
funkcionalizaci detekce a pro referenční chemii. Použitím kombinace fotolitografických<br />
metod v kombinací se změnami povrchové energie se tato vzdálenost pohybuje v řádu 100<br />
mikrometrů.<br />
Ne-kanálkový (bezkanálový) Mach-Zenderův interferometr dělí a slučuje svazky mimo čip<br />
(off-chip uspořádání). Namísto Y-členu jsou použity dělič svazku a čočky. Tento<br />
zjednodušený model (obrázek 4) se skládá ze slabového (destičkového) vlnovodu<br />
s detekčními a referenčními oblastmi definovanými detekční chemií a překryvovou vrstvou.<br />
Světlo není navazováno přímou metodou (end-firing). Častěji se tento systém používá buď<br />
pro navazování hranolem, nebo mřížkou vyrobenou ve vlnovodu. Nekanálkový Mach-<br />
Zenderův interferometr se svazky kombinují nejčastěji pomocí čoček. Minimální vzdálenost<br />
kanálů je dána vlastnostmi děliče svazku, typicky 1mm – takže vzdálenost mezi<br />
interferenčními proužky je pak velmi malá. Proužky vznikají pouze v oblasti překryvu dvou<br />
svazků (convergence of beams). Mikroskopický objektiv poté rozšiřuje interferenční obrazec<br />
buďto na aperturu (štěrbinu) s bodovým detektorem, nebo na pole detektorů (bez použití<br />
štěrbiny). Umístění zrcadla do dráhy interferujících svazků (mezi objektiv a detektor) umožní<br />
mechanickou manipulaci s pozicí proužků, čehož lze využít jak pro určení minim a maxim,<br />
tak i pro nastavení bodového detektoru do oblasti kvadratury . Jedna praktická metoda pro<br />
určení minima a maxima interferenčních proužků a nastavení detektoru do kvadratury<br />
(Heideman a Kooyman, 1994) zahrnuje umístění fázového posuvu do jedné z větví<br />
interferometru. Fázový posuv je vlastně rotující skleněná destička umístěná vně vlnovodu.
Heideman (Heideman et. al., 1994, 1996) používal při svém výzkumu elektrooptický material<br />
ZnO2, který umístil do jedné z větví interferometru. Aplikací elektrického pole na tento<br />
materiál došlo ke změně indexu lomu a tedy k fázovému posuvu. To samozřejmě způsobilo<br />
posun interferenčního obrazu. Tímto mechanizmem můžeme nastavit detektor do lineární,<br />
nejcitlivější polohy, do tzv. kvadratury. Samozřejmě můžeme také měřit napětí na<br />
elektrooptickém členu a poté kvantifikovat změny efektivního indexu lomu Neff při vlastním<br />
měření.<br />
Výhoda vlnovodu použitého v nekanálkovém Mach-Zenderově interferometru je ve snadné<br />
výrobě vlnovodu, což umožňuje a ulehčuje měření různých úloh v detekční chemii. Hlavní<br />
nevýhodou je požadavek na zařazení vícenásobných optických členů do detekčního schématu.<br />
Tyto vícenásobné komponenty zvyšují celkový mechanický šum detektoru a najednou lze<br />
použít pouze jeden interferometr.<br />
Nekanálková varianta Youngova interferometru použije výstupy z dvou ramen vlnovodu a<br />
difraktuje je na štěrbině (Hradetsky a Brandenburg, 2000). Pokud vezmeme v úvahu<br />
přirozenou divergenci laserového svazku, budou tyto dva svazky spolu po jisté době<br />
interagovat a vytvoří interferenční obrazec bez použití další externí výstupní optiky.<br />
V souosém (kolineárním) uspořádání lze u polarimetrických nebo diferenčních interferometrů<br />
minimalizovat teplotní a mechanické vlivy (Stamm a Lukosz, 1993,1994; Lukosz 1995).<br />
V tomto uspořádání (Obrázek 8) se senzorický a referenční svazek šíří společně stejným<br />
objemem vlnovodu. Detekovaná událost se potom objeví díky rozdílům v rozšířeném<br />
evanescenčním poli těchto dvou polarizací příčného elektrického a magnetického pole. Jak již<br />
bylo zmíněno TE mód se šíří v tenčí vrstvě než mód TM. Tlustší vlnovod povede TE módy a<br />
umožní šíření TM módů. Evanescentní pole TM módu je nad vlnovodem silnější než pole TE.<br />
Mezimódové interferometry využívají různé citlivost jednotlivých vedených módů na<br />
fyzikální a chemické změny nad vlnovodem. Různé fázové posuvy různých módů pak<br />
poskytují možnost kvantifikovat daný jev.<br />
Obrázek 8:Schéma diferenčního(polarimetrického) interferometru<br />
Obě polarizace jsou navázány do vlnovodu rotováním (otočením) laserového záření o úhel asi<br />
45° od normály. Jednotlivé polarizace mají různé účinnosti navázání a šíření a abychom<br />
dosáhli u obou stejných úrovní, je potřeba jednu z polarizací ovlivnit, naklonitt (biasing). Obě<br />
polarizace se šíří vlnovodem , s tím, že fáze TM polarizace je více ovlivněna než polarizace<br />
TE. Oba svazky jsou poté vyvázány, a odděleny děličem svazku, dvěma Wollastonovými<br />
hranoly, a čtvrtvlnnou a půlvlnnou destičkou a jsou navedeny na čtyři fotodetektory, kde je<br />
proměřen fázový rozdíl.(Lukosz et al., 1997).
Toto erejové uspořádání může být dále zjednodušeno. Jednou možností je použití<br />
Wollastonova hranolu a polarizátoru, další variantou je pak použití mřížky, čočky a<br />
polarizátoru, s tím že výsledný interferenční obrazec je poté zaznamenán na CCD čip<br />
(Lukosz et al., 1997). Tato dvě uspořádání generují interferenční obrazce buď ortogonální (v<br />
prvním případě), nebo mimo- osový, čímž se otevírá možnost umístění vícenásobných<br />
senzorů na jednom substrátu a možnost použití pro analýzu pouze jednoho 2D pole detektorů<br />
(Lukosz et al., 1997).<br />
Aby bylo možno využít maximálně polarimertického schématu, je nutné, aby vlnovod byl<br />
pečlivě navržen tak, aby maximalizoval rozdíl v citlivostmi dvěma (oběma) módy. Nejlepších<br />
výsledků se dosahuje použitím jednomódových „step-index“ vlnovodů, jejichž tloušťka je jen<br />
o málo větší, než kolik potřebuje první TM mód pro šíření. První výzkumy probíhaly na<br />
vlnovodech vytvořených metodou sol-gel z TiO2-SiO2 s indexy lomu 1.8-2.0 a tloušťkou<br />
vrstvy asi 200 nm.<br />
Referenční kanál interferometru je při měření rovněž ovlivněn a tím se potlačí rozdíl mezi TE<br />
a TM módy (v tomto případě jeho roli hraje TE mód). V závislosti na typu vlnovodu je možno<br />
tento negativní jev omezit až na 50% v porovnání s interferometry s oddělenými kanály<br />
(„side- by side“ Mach Zender interferometr). Je třeba zmínit, že TE a TM módy reagují různě<br />
na změnu indexu lomu materiálu vlnovodu (bulk materialu). Špatně navržená reference sníží<br />
citlivost interferometru vůči detekované události a sníží schopnost kompenzovat změny<br />
indexu lomu bulkového materiálu. To co získáme vysokou teplotní a mechanickou stabilitou<br />
tohoto uspořádání nemusí stačit pro vykompenzování zmíněných problémů, pokud nejsme<br />
schopni minimalizovat změny indexu lomu bulkového materiálu vlnovodu, a změny vzniklé<br />
díky zvýšení specifických vazeb nad vazby nespecifické.<br />
Polarimetrické, nebo rozdílové (diference) interferometry, nejsou schopny rozlišit mezi<br />
detekovanou událostí a změnou indexu lomu bulkového materiálu, případně změnou teploty.<br />
Nicméně existuje způsob jak se vyrovnat s tímto nedostatkem a to současným použitím dvou<br />
vlnových délek; tak obdržíme další informaci, abychom byli schopni odlišit vliv reakce a vliv<br />
změn indexu lomu materiálu, nebo vliv reakce a vliv teploty (ale není možno odlišit ovlivnění<br />
teplotou a změnou indexu lomu) (Stamm et al., 1998). Toto uspořádání vyžaduje použití<br />
dalšího laseru; v tomto případě se k He-Ne laseru (633nm) přidal Ar- ion laser (488nm). Lze<br />
použít i polovodičové lasery. Tím jsme ovšem omezení pouze na přímé navázání světla (endfiring)<br />
– tedy pokud se chceme vyhnout problémům, které vznikají při navazování mřížkou<br />
(pro každý laser je potřeba nastavit jiný úhel navázání). Pro zajímavost, bylo rovněž navrženo<br />
provést rozlišení těchto dvou efektů použitím dvou interferometrů s vlnovody o různých<br />
tloušťkách, ale operujícími na stejné vlnové délce. Citlivost, kterou má vlnovod na dvou<br />
různých vlnových délkách lze popsat pomocí analogie s popisem modelu vlnovodu na dvou<br />
vlnových délkách, při jedné tloušťce vlnovodu. (Lukosz 1995).<br />
Také v Mach-Zenderově interferometru se dvěma sousedními kanály („side by side“) je třeba<br />
započítat mimo vlivu detekované události rovněž vlivy změn indexu lomu materiálu a teploty.<br />
Nevýhodou těchto kompaktních senzorů je právě nutnost zařazení vícenásobných optických<br />
zařízení k analýze výstupu jak z polarizačního , tak z diferenčního interferometru. V<br />
posledních pracech (Koster et al., 2000) došlo k integrování polarizační optiky přímo na<br />
vlnovodný čip (Obrázek 9). Součástí zařízení je také konvertor polarizace, jež je schopen<br />
proměnit část energie jednoduše (singly) polarizovaného TE módu do energie TM módu.<br />
Tyto dva svazky poté procházejí detekční oblastí. Za touto oblastí je umístěn další polarizační<br />
konvertor umožňující jejich smísení. Poté jsou oba módy postupně vyvázány. Celé zařízeni<br />
zakončuje detektor integrovaný na křemíkovém substrátu. Pouze laser zůstává externí.
Obrázek 9: Schéma integrovaného polarimetrického (diferenčního) interferometru<br />
Další návrh diferenčního interferometru (Hartman et al., 1988) využívá toho, že při stejné<br />
polarizaci mají různé módy různá evanescentní pole. Přestože toto uspořádání bylo<br />
patentováno (Hartman, 1990), nikdy nedošlo k jeho použití jako biosenzoru. Různé módy<br />
potřebují pro navázání různé úhly a tato podmínka přináší velké komplikace.<br />
Žádoucí pro senzorickou analýzu je zařízení, které je schopno zpracovat více analytů<br />
najednou, nebo v rychlém sledu bez větší potřeby přestávek, nebo výměny čipů. Toho lze<br />
dosáhnout pomocí několika nekanálkových Mach-Zenderových interferometrů na jednom<br />
čipu (Hartman et al., 1998). Tento čip obsahuje 13 interferometrů na ploše 1 x 2cm. Záření<br />
laseru je nasměrováno na širokou mřížku, která zavede světlo do všech interferometrů<br />
najednou. Vlnovod je tvořen vrstvou Si3N4 deponovanou na skleněném substrátu. Délka<br />
kanálů je definovaná vzory z tlusté vrstvy SiO2. Vlastní senzorická oblast (senzorická chemie)<br />
je umístěna uvnitř kanálů. Kanály jsou definovány spíše immobilizovanými chemickými<br />
procesy na povrchu vlnovodu, než vlastními světelnými svazky. Široké svazky jsou<br />
zkombinovány a poté prochází postupně reflektorem, děličem svazku a dalším reflektorem.<br />
Výsledný interfereční signál je vyvázán další širokou mřížkou a soustava interferenčních<br />
proužků je pak analyzována detektorovým erejem (Obrázek 10).<br />
Počet navržených interferometrů je v tomto případě je určen minimálním rozlišením<br />
detektoru. Je zapotřebí alespoň tří pixelů pro získání sinusovky interferenčního vzorku.<br />
Nedávný pokles cen detektorů a zvětšení jejich rozlišení zvýšily počet interferometrů, jež je<br />
možno umístit na jeden čip. Pole USB (Univerzální sériová sběrnice) kamer nabízí rozlišení 2<br />
bodů na úrovni 10-15μm, což odpovídá hustotě zhruba 50 interferometrů na čtvereční<br />
centimetr.<br />
Obrázek 10: Schéma čipu s třinácti integrovanými nekanálkovými Mach-Zenderovými interferometry
3.4. Další interferometrické metody<br />
V posledním desetiletí 20.století bylo navrženo několik dalších interferometrických principů.<br />
Jsou to především: Fabry-Perotova interference pomocí bílého světla, Zeemanova<br />
interferometrie, vrstevnatý Youngův interferometr , a fázová informace z povrchového<br />
resonančního plazmonu.<br />
První efekt (Farbry- Perotovo přiblížení) bylo pozorováno na konci vláken a na povrchu<br />
pórovitého křemíkového čipu (Gauglitz et al., 1993). Změna tloušťky a indexu lomu je<br />
v tomto případě způsobena navázáním proteinů, nebo vydutím povrchu vlákna v důsledku<br />
navázání polymeru na konec vlákna. To ovlivní délku optické dráhy bílého světla.<br />
Interference mezi příchozím a odraženým svazkem vytvoří Fabry-Perotovy interferenční<br />
proužky. Další změna reflektivity v důsledku chemické aktivity pak tyto proužky posouvá.<br />
Velikost posuvu tuto aktivitu kvantifikuje. Tento druh spektroskopie nicméně trpí malou<br />
citlivostí, protože změna optické dráhy je velmi malá v porovnání s délkou vlnovodu.<br />
Druhý jev, tedy interference tvořené porézním křemíkovým substrátem způsobil rozruch,<br />
když byl poprvé prezentován (Lin et al., 1997). Bylo to dáno skutečností, že bylo dosaženo<br />
nečekaně vysoké citlivosti. Tento materiál obsahuje vyleptané póry což velmi zvětšuje plochu<br />
povrchu. Bílé světlo dopadající na porézní povrch se odrazí jak od povrchu, tak i od dna pórů.<br />
Tyto dva odrazy spolu interferují a vytvářejí Fabry- Perotovy proužky. Pokud je v pórech<br />
nanesena protilátka (antibody) a ta je poté vystavená konjugovanému antigenu, pak se<br />
nterferenční proužky posunou. I když je rozdíl optických drah malý a póry jsou hluboké<br />
pouze 1-5 μm, je posuv proužků příliš velký, aby jej bylo možno přičíst pouze změně<br />
nanesené látky. Uvažovalo se, že chemická reakce se mění s koncentraci nosičů náboje<br />
v polovodiči a to díky vazbám. Další analýza ovšem ukázala, že výsledky daného pokusu byly<br />
chybné; že pozorovaný velký posun proužků byl způsoben oxidací pórů (Dancil, et al., 1999).<br />
Nicméně tento efekt byl dále prozkoumáván pro další využití při detekci fluorofosfátových<br />
nervových činidel vzniklých při leptání SiO2 produktem hydrolýzy HF (Sohn et al., 2000).<br />
Efekty doprovázející leptání základního materiálu byly použity také v technice planárních<br />
vlnovodů, a to dokonce ve větším měřítku díky zvětšené délce optické trasy. Campbel<br />
(nepublikováno) tímto způsobem snadno monitoroval rychlost leptání vlnovodu z Si3N4 při<br />
špatných podmínkách, pH 8, a stanovil ji na méně než 2Å/hod.<br />
Zeemanova interferometrie využívá Zeemanův laser a planární vlnovod. Tento interferometr<br />
využívá dvou frekvencí, které jsou generovány Zeemanovým laserem. V tomto případě jsou<br />
od sebe vzdáleny 250kHz (Grace et al., 1997). Dva módy se poté šíří vlnovodem a fázový<br />
rozdíl mezi módy se akumuluje v důsledku chemických změn na detekčním povrchu.<br />
Sinusová rozdílová frekvence 250kHz vznikne, když se zkombinují dva módy. Lze ji poté<br />
měřit na výstupu a porovnávat ji s referenčním svazkem z laseru. Fázový rozdíl indikuje<br />
změnu na povrchu vlnovodu. Ačkoliv se v tomto případě jednalo o chemický senzor, může<br />
být tato technika použita rovněž při měření biokonjugovaných reakcí. Stejně jako v případě<br />
polarimetrické interferometrie, je i toto souosé uspořádání náchylné k chybám v důsledků<br />
změn indexu lomu bulkového materiálu.<br />
Vrstevnatý Youngův interferometr byl objeven nedávno (Cross et al., 1999). Vlnovody jsou<br />
naskládány na sobě a mezi nimi je umístěna ochranná (buffer) vrstva. Difrakcí světla na<br />
výstupu jsou poté tvořeny interferenční vzory. Tento elegantní přístup je velmi užitečný<br />
v oblasti chemických senzorů, pokud je požadována ponořená (burried) reference. Nicméně
v případě biosenzorů skrytý referenční kanál snižuje akumulování chyb v důsledku změn<br />
bulkového indexu lomu.<br />
A nakonec, Nikitin použil unikátní přístup při měření změny fáze, která se obvykle neměří<br />
při experimentech s povrchovou plazmonovou rezonancí (SPR) (Kabashin a Nikitin, 1998;<br />
Grigorenko et al., 1999; Nikitin et al., 1999). Interferometr s otevřenou dráhou využívá<br />
pokovený povrch SPR prismy – stejně v jako již popsaném uspořádání Mach-Zenderova<br />
interferometru s rozšířeným svazkem. Odražený svazek opouštějící prismu je zkombinován<br />
s referenčním svazkem a produkuje interferenci. Na základě měření několika plynů byla<br />
stanovena citlivost měření indexu lomu na 4 x 10 -8 . Je možné také snímání povrchu. Tento<br />
přístup může snadno najít uplatnění při zkoumání genomu a bílkovin bez potřeby<br />
flourescenčních a kolorimetrických štítků (label).<br />
3.5. Funkcionalizace povrchu<br />
Po zvolení vhodného převodníku je na jeho povrchu imobilizován biokonjugovaný receptor.<br />
Skleněný povrch, jako např. Si3N4, TiO2, nebo SiO2 je zaplněn (populated) hydroxylovou<br />
skupinou. V případě . Si3N4 pouhé vyčištění povrchu způsobí nahrazení aminových skupin<br />
hydroxidy.<br />
Pro chemii umístění proteinů na povrch se využívá metod vyvinutých pro afinitní<br />
chromatografii. Na toto téma bylo napsáno několik knih (Hermanson, 1996). Pro připevnění<br />
(zachycení) reaktivních funkčních skupin na skleněný povrch se využívá organosilanové<br />
chemie. Tyto silany obvykle zreagují do aminových, karboxaldehydových (carboxaldehyde),<br />
nebo sulfhydrylových skupin. Proteinový receptor se naváže na aminovou skupinu po<br />
předchozí oxidaci, nebo se naváže po redukčním aminování (reductice amination).na<br />
karboxyaldehydovou skupinu. Sulfhydryly budou tvořit disulfidové vazby s cysteiny.<br />
Další schéma popisuje zachycení proteinu A na povrch, s následným zachycením (vazbou) k<br />
Fc části protilátky. Avidin se také používá jako funkcionalizovaný povrch pro biotinylated<br />
proteiny a DNA. Využívá se silné vazebné konstanty mezi avidinem a biotinem.<br />
Následné vyplnění mezer proteiny slouží k minimalizování nespecifických vazeb. S<br />
referenčním ramenem interferometrického senzoru (používá- li se v převodníku jedno<br />
rameno) je nakládáno podobně. Cílem je vytvořit referenční kanál zcela stejný, jako<br />
senzorický, kromě citlivosti na danou reakci. To bohužel není tak snadné. Zvláště při<br />
klinických testech dochází často i k jiným (nespecifickým) vazbám s volnými (errant)<br />
proteiny. Vynulování tohoto parazitního (nespecifického) signálu není tedy nikdy snadné.<br />
Velký pokrok v eliminování těchto parazitních reakcí byl učiněn použitím povrchů, které<br />
zabraňovaly adsorpci proteinů. Polyetylén glykoly a jejich deriváty na sebe upoutaly největší<br />
pozornost a vypadá to, že fungují docela dobře. Byly testovány i další materiály, jako amidy,<br />
fosfoamidy, močovina, a různé sloučeniny polyetylén glokolů (Chapman et al., 2000). Právě<br />
schopnost omezit parazitní reakce nastavuje limit kolineárního polarimetrického uspořádání.<br />
Je to tím, že jak specifické, tak parazitní reakce jsou z hlediska převodníku identické.<br />
Uspořádání interferometru se dvěmi sousedními kanály je těmito reakcemi rovněž omezeno.<br />
Pokud převládají parazitní (nespecifické) vazby, pak lze pozorovat pouze velmi malé změny.<br />
Oddělená analýza obou ramen může alespoň kvantifikovat poměr signál/šum a určit<br />
spolehlivost detekce.<br />
3.6. Aplikace<br />
Literatura uvádí různá interferometrická uspořádání. Ve většině z nich bylo cílem ukázat<br />
jejich citlivost a všestrannost. Výzkum se nesnažil o vytvoření speciálních řešení pro<br />
konkrétní úlohy, převážně proto, že schopnost senzoru detekovat selektivně je odvislá od
převodníku (transduktoru). Vědomi si toho, vědci se snažili spíše vyhodnotit jednotlivé<br />
konstrukce s obecně použitelnou biokonjugovanou látkou. Hodně jich využilo IgG/anti-IgG<br />
test. Jako vzorky DNA se používaly části řetězce s 20ti páry bází. (Schneider et al., 1997).<br />
V některých případech se použilo celých buněk, jako např Salmonella (Schneider et al., 1997;<br />
Seo et al., 1999). Všechny používaly přímý label-free detekční systém využívají přirozených<br />
schopností interferometru.<br />
Jeden z pokusů jak zvýšit citlivost představuje tzv. sandwichová zkouška. V tomto<br />
uspořádání, poté, co první dávka protilátek zreagovala s antigenem, přišla na řadu ještě další<br />
část protilátky. Tyto částice mohly být spojeny s mikročásticemi (zlata, polystyrén). Tyto<br />
mikročástice zajistily zesílení signálu, protože mikročástice výrazně zvýšily změny indexu<br />
lomu (Schneider et al., 2000).<br />
Jako testovací úloha pro použití vlnovodných interferometrů se ustálilo detekování atrazinu,<br />
tj. herbicidu obsaženém v pitné vodě. Nejprve byl syntetizován atrazinový hapten (tj. část<br />
antigenu, která reaguje s protilátkou) a ten byl poté kovalentně připevněn k vlnovodu. Vzorek<br />
pitné vody se poté kápnul na vlnovod. V dalším kroku se do vody přidala protilátka atrazinu.<br />
Rozpuštěný herbicid poté reaguje s hapteny na povrchu vlnovodu. Pokud se v roztoku už<br />
nenachází žádný volný atrazin, pak došlo k navázání na hapten a tedy můžeme detekovat<br />
velký signál. Na druhou stranu, malý signál znamená malé množství navázaného atrazinu.<br />
Takto lze detekovat až 0.1μg/L, nebo 0.1 ppb atrazinu (Schipper a Bergevoet, 1997; Schipper<br />
a Rauchalles, 1998). Jelikož zachycený biokomjugát není protein, povrch lze regenerovat bez<br />
ztráty jeho aktivity a je připraven k další analýze.<br />
Nepřímé zkoušky analogické s tradiční zkouškou ELISA, s interferometrem jako čtečkou,<br />
byly zkoumány pouze zběžně (Campbell a Hartman, 1998). Výhodou tohoto přístupu je<br />
možnost opětovného použití senzoru pro další měření, nicméně ELISA s sebou přináší jisté<br />
kroky navíc. Není nutné, aby senzor měřil změnu barvy. Může detekovat jiný produkt<br />
enzymatické reakce, jako např. čpavek z moči.<br />
Pro doplnění: ostatní klinicky relevantní analyty jako čpavek a pH mohou být rovněž<br />
detekovány interferometry. V případě, že vrstva analytu je tlustší než evanescentní pole jsou<br />
blokovány efekty způsobené parazitními reakcemi a změny indexu lomu materiálu. Tlustá<br />
vrstva poskytuje dostatek reaktivního materiálu pro detekci sub-ppm množství amoniaku a pH<br />
ve vodných roztocích lze určit s přesností 0.01 (Campbell a Moore, 1998).<br />
Přestože se většina příkladů biosenzorů netýkala obtížných úloh lze konstatovat, že<br />
interferometry slouží pro detekci analytu v krvi, v různých sérech a v případě Salmonelly ve<br />
zbytcích kuřecích těl.<br />
Výhody a omezení<br />
Bylo uvedeno mnoho příkladů interferometrických a reflektrometrických vlnovodů. Každý<br />
z nich byl otestován, jak reaguje na biokonjugovanou vazebnou reakci. Bylo by nefér je<br />
přímo porovnávat. Citlivosti vlnovodných interferometrů jsou z podstaty ekvivalentní.<br />
Reflektometrické a vláknové interferometry jsou daleko méně citlivé, kvůli svým omezením;<br />
kratké optické dráhy pro reflektometrické, potažmo malé evanescentního pole v<br />
případě optického vlákna.<br />
Interferometry mohou být připraveny z různých materiálů použitých jak ve vlnovodu, tak<br />
v substrátu. Volba záleží jen na výrobních kapacitách výrobce. Pokud by všichni výzkumníci<br />
mohli používat stejné materiály a tloušťky vrstev, nebyly by žádné rozdíly v detekčních
minimech, daných citlivostí vlnovodu a změnou neff. To by vedlo k univerzálnímu limitu<br />
detekovatelnosti 1pg/mm 2 povrchu. To co nakonec omezuje detekovatelnost jsou fyzikální<br />
parametry: detekční schéma, schopnost potlačit mechanický a termický šum, vazebné<br />
konstanty biokonjugovaných látek a fluidicita. Výzkumník může kontrolovat také další<br />
aspekty, jako je mechanika vzorku, difúze a variace indexu lomu materiálu.<br />
Hlavní výhodou interferometru je jeho schopnost detekovat jakoukoliv chemickou reakci,<br />
protože každá reakce změní index lomu. Tedy není potřeba žádných značkovačů, sledování<br />
barvy, nebo rezonančních efektů, abychom pozorovali signál o reakci. Interferometr nabízí<br />
univerzální platformu pro měření libovolných chemických dějů. Ale jeho největší přednost<br />
znamená zároveň i jeho limit. Jelikož je citlivý na jakoukoliv chemickou událost, reaguje na<br />
každou změnu, jak detekovanou, tak i na parazitní reakci, na teplotu, nebo na změnu indexu<br />
lomu bulkového materiálu. Tedy návrh senzoru musí být cílený a reference vhodně zvolena,<br />
aby došlo ke oslabení vedlejších vlivů. Referenční rameno by nemělo reagovat na danou<br />
reakci a zároveň minimalizovat vliv pozadí, které ovlivňuje index lomu. Interferometr také<br />
potřebuje přesný návrh, aby byl schopen eliminovat jiné signály.<br />
Vysoké ceny laserů a detektorů se v průběhu let snížily a neměly by představovat<br />
významnější bariéru při vývoji interferometrických i jiných optických senzorů. V mnoha<br />
institucích se již vyskytují systémy pro depozici tenkých vrstev vhodných pro výrobu<br />
vlnovodů. Pokud ne, sol-gelový vlnovod je levnou a přizpůsobivou variantou. Limitním<br />
faktorem v současné době je spíše elektronika a software pro zpracovaní a vyhodnocení dat.<br />
Byl by to velký skok pro mnoho lidí mít místo senzoru připoutaného k počítači, kompletní<br />
samonosnou senzorovou jednotku.<br />
Možnosti zdokonalování současného provedení<br />
Kromě polarimetrického uspořádání, kdy je zapotřebí 4 detektorů, se senzory běžně konstruují<br />
s jediným detektorem. Použití jednoho detektoru umožnilo udržet cenu zařízení nízko.<br />
Nicméně samotným detektorem nejsme schopni určit v jaké části detekční sinusovky se<br />
pohybujeme, což limituje možnost přesné kvantifikace fázové změny. Skenování<br />
interferenčního proužku vyžaduje mechanické zařízení, které umožňuje umístit detektor do<br />
kvadratury. Elektrooptická zařízení fázového posunu budou posouvat fázi a potlačovat tak<br />
mechanický šum. Nicméně více navzorkovaných bodů podél křivky zlepšuje detekční<br />
možnosti. Tři body definují funkci sinus, ale pole detektorů umožní navzorkovat i více bodů.<br />
Vícenásobná detekce dalších interferenčních proužků je možná pokud máme dostatečné<br />
malou rozteč pixelů. Po pádu cen polí detektorů z tisíce dolarů na padesát dolarů za USB<br />
kameru není důvod používat cokoliv jiného. Zpracování několika interferenčních proužků<br />
nám nabízí rozlišení ve fází 0.01 rad. Tato analýza nám rovněž dovoluje odlišit mezi změnou<br />
intenzity a změnou fáze, čímž lze eliminovat vliv fluktuací laseru, nebo změnu absorbance<br />
vzorku.<br />
Jak vzrůstá rozlišení interferometru, projevují se další zdroje chyb, které je třeba potlačit tak,<br />
aby došlo k plnému rozvinutí potenciálu interferometrů. Kontrola teploty vzorku a převodníku<br />
umožňuje minimalizovat tepelný šum. K tomuto se používá hlavně Peltierův článek.<br />
Mechanický šum lze omezit integrováním většiny optické dráhy přímo do vlnovodu. Mřížky,<br />
zrcadla, děliče svazku a detektory již byly integrovány na jeden čip. Pouze laser zůstává<br />
externí. Je jen otázkou času, kdy dojde k integrování také laseru, alespoň v nějaké hybridní<br />
formě.
Aby se omezil chemický šum je potřeba ještě omezit vliv proudění při vkládání vzorku.<br />
Jakmile je vzorek umístěn do testovací cely nad vlnovodem, dojde ke změně indexu lomu.<br />
Může to být jen malá změna, ale obě ramena interferometru ji musí postřehnout současně,<br />
jinak dojde k jejich rozfázování. Někteří výzkumníci navrhují ignorovat počáteční data a<br />
soustředit se až na následnou fázi změn způsobených detekcí. To může být správný postup,<br />
pokud ovšem nemáte automatizovanou linku na více vzorků, kde se tok může konstantně<br />
měnit. Blízkost senzorické a referenční větve senzoru tento rozdíl může minimalizovat.<br />
Kolineární polarimetry nemají problém s laterálními změnami indexu lomu, ale vertikální<br />
změny kompenzovány nejsou. Fluidicitě (vlivu proudění) a návrhu cel se musí věnovat další<br />
výzkum.<br />
Rychlost detekce je dána rychlostí difúze analytu k povrchu senzoru. Difuze velkých proteinů<br />
je pomalá a může trvat až hodinu, než senzor dosáhne rovnovážného stavu. Vhodný design<br />
fluidního systému může zrychlit pohyb proteinu (analytu) k povrchu senzoru.<br />
Dvoudimenzionální struktura senzoru nevyužívá v současnosti zcela oblast evanescentního<br />
pole. Vývoj třídimenzionálních matric by mohl vést ke zvětšení interakční oblasti a tím ke<br />
zkrácení detekčního času.<br />
Vývoj interferometrických senzorů se vydal po dvou rozbíhavých cestách, obě jsou vedeny<br />
aplikacemi. Jedna vede k integraci všech optických komponent: se zdrojem, vlnovodem a<br />
detektorem na jednom čipu. Tento přístup umožní vytvořit senzor pro delší dobu použití.<br />
Tento typ senzoru by se mohl uplatnit jako samostatný dlouhodobý senzor pro monitorování<br />
potravin a pro detekci bioteroristických látek.<br />
Druhou cestou je konstrukce jednoduchého vlnovodu s minimálními náklady, jež může být<br />
po použití recyklován. Tyto vlnovody budou obsahovat pouze otvory pro navázaní a vyvázaní<br />
světla se budou vhodné pro klinické aplikace, kde je následné zničení nejlepší prevencí před<br />
možností kontaminace. Tento typ senzoru bude obsahovat zdroj, optiku, detektor a procesor.<br />
Bude působit jako „plug and play“ zařízení do optického systému.<br />
S pomocí chemiků, kteří vyvinou způsob jak aktivovat povrch senzoru pro detekci<br />
požadované látky bez parazitních interferencí, a za současného rozvoje fluidic designu a<br />
dalšímu zlevňování a zlepšování technik zpracování signálu a jeho interpretace může nabrat<br />
rozvoj biosenzorů v budoucnu „rychlost světla“.<br />
6. Poděkování<br />
Autoři by rádi poděkovali Sheree Collinsové z GTRI za dodání obrázků použitých v této<br />
kapitole<br />
7. Literatura<br />
Brandenburg, A., 1997, Sens. Actuators B 38, 266.<br />
Brandenburg, A., R.Krauter, M.Künzel a H. Schulte, 2000, Appl. Opt. 39, 6396<br />
Brosinger, F., H. Freimuth, M. Lacher, W. Ehrfeld, E. Gedig, A. Katerkamp, F. Spencer, K.<br />
Cammann, 1997, Sens. Actuators B 44, 350.<br />
Campbell, D.P., N.F. Hartman, J.V. Suggs, J.L. Moore a J.M. Cobb, 1998, Proc. SPIE 3253,<br />
20.<br />
Campbell, D.P., J.L. Moore, J.M. Cobb, N.F. Hartman, B.H. Schneider a M.G. Venugopul,<br />
1998, Proc. SPIE 3540. 153.
Chapman, R.G., E.Ostuni, S. Takayama, R.E. Holmlin, L. Yan a G.M. Whitesides, 2000,<br />
J.Am. Chem. Soc. 122, 8303.<br />
Choquette, S.J. a L.Locascio-Brown, 1994, Sens. Actuators B 22, 89.<br />
Cross, G., Y. Ren a N.J.Freeman, 1999, J. Appl. Phys. 86, 6483<br />
Dancil, K-P.S., D.P. Greiner, a M.J. Sailor, 1999, J.Am. Chem. Soc. 121, 7925<br />
Drapp, B., J.Piehler, A. Brecht, G. Granglitz, B.J. Luff, J.S. Wilkinson a J. Ingenhoff, 1997,<br />
Sens. Actuators B 38, 277.<br />
Fisher, K. a J. Muller, 1992, Sens. Actuators B 9, 209.<br />
Gato, L. a R. Srivastava, 1996, Opt. Commun. 123, 483.<br />
Gauglitz, G., A. Brecht, G.Kraus, a W.Nahm, 1993, Sens. Actuators B 11, 21.<br />
Grace, K.M., K. Shrouf,S. Honkanen, P. Ägräs, P. Katila, M. Leppihalme, R.G Johnston, X.<br />
Yang, B. Swanson, B. and N. Peyghambarian, 1997, Electronic Lett. 33, 1651.<br />
Grigorenko, A.N., P.I. Nikitin a A.V. Kabashin, 1999, Appl. Phys. Lett. 75, 3917.<br />
Hartman, N.F., D.P. Campbell a M.Gross, 1988a, Proc. IEEE-LEOS ’88,298.<br />
Hartman, N., 1990, U.S. Patent No. 4,940,328.<br />
Hartman, N.F., J.Cobb a J.G. Edwards, 1998b, Proc. SPIE 3537,302.<br />
Heideman, R.G., R.P.H. Kooyman a J. Greve, 1994, Biosen. Bioelectron. 9, 33.<br />
Heideman, R.G. ,G.J. Veldhuis, E.W.H. Jager a P.V. Lambeck, 1996, Sens. Actuators B 35,<br />
23.<br />
Helmers, H., P.Greco, R. Rustad, R.Kherrat, G. Bouvier a P.Benech, 1996, Appl. Opt. 35,<br />
676.<br />
Hermanson, G.T., 1996, Bioconjugate Techniques, Academia Press, San Diego, 785 pp.<br />
Heuberger, K. a W. Lukosz, 1986, Appl. Opt. 25, 1499.<br />
Hradetzky, D. a A. Brandenburg, 2000, Europtrode V, 169<br />
Kabashin, A.V. a P.I. Nikitin, 1998, Opt. Commun. 150, 5.<br />
Kersey, A.D., 1990, Proc. SPIE 1367, 2.<br />
Koster, T., N. Posthuma a P.Lambeck, 2000, Europtrode V, 179.<br />
Lin, V.S.-Y, K.Motesharei, K-P.S. Dancil, M.J.Sailor a M.R. Ghadiri, 1997,Science 278, 840.<br />
Luff, B.J., J.S. Wilkinson, J.Piehler, U. Hollenback, J. Ingenhoff a N. Fabricius, 1998, J.<br />
Lightwave Tech. 16, 583.<br />
Lukosz, W. a K. Tiefenthaler, 1983a, 2 nd Eur. Conf. Integrated Optics, Florence, IEEE Conf.<br />
Proc. 227, 152.<br />
Lukosz, W. a K.Tiefenthaler, 1983b, Optics Lett. 8, 537.<br />
Lukosz, W. a K. Tiefenthaler, 1988, Sens. Actuators 15, 273.<br />
Lukosz, W. a K. Tiefenthaler, 1989, J.Opt. Soc Am. B 6, 209<br />
Lukosz, W. , 1995, Sens. Actuators B., 29, 37.<br />
Lukosz, W. , C. Stamm, H.R. Moser, R. Ryf a J. Dübendorfer, J., 1997, Sens. Actuators B. 38,<br />
316.<br />
Millar, C.A. a R.H. Hutchins, 1978, J.Phys. D; Appl. Phys. 11, 1567<br />
Nellen, Ph.M., K. Tiefenthaler a W. Lukosz, 1988, Sens. Actuators B 15, 285.<br />
Nikitin, P.I., A.A. Beloglazov, V.E. Kochergin, M.V. Valeiko, a T.I. Ksrenevich, 1999, Sens.<br />
Actuators B, 54, 43<br />
Nishihara, H., M. Haruna, T. Suhara, 1985a, Optical Integrated Circuits, Mgraw-Hill, USA<br />
Chapter 2<br />
Nishihara, H., M. Haruna, T. Suhara, 1985b, Optical Integrated Circuits, Mgraw-Hill, USA,<br />
p.226.<br />
Ramos, B.L., S.J. Choquette a N.F.Fell, Jr., 1996, Anal. Chem. 68, 1245.<br />
Ranganath, T.R. a S.Wang, 1977, IEEE, J. Quantum Electron. QE-13, 290.<br />
Schipper, E.F., A.J.H. Bergeovet, R.P.H., Kooyman, B. Hock a J. Greve, 1997, Anal. Chim.<br />
Acta 341, 171.
Schipper, E.F., A.M. Brugman, C. Dominiguez, L.M. Lechuga, R.P.H. Kooyman a J.Greve,<br />
1997, Sens. Actuators B 40, 147.<br />
Schipper, E.F., S. Rauchalles, R.P.H, Kooyman, B. Hock a J.Greve, 1998, Anal. Chem. 70,<br />
1192.<br />
Schneider, B.H., J.G. Edwards a N.F. Hartman, 1997, Clin. Chem. 43, 1757.<br />
Schneider, B.H., E.L.Dickinson, M.D. Vack, J.V. Hoijer, a L.V., Howard, 2000, Biosens.<br />
Bioelectron. 15, 13.<br />
Seo, K.H., R.E. Brackett, N.F. Hartman, N.F. a D.P. Campbell, 1999, J. Food Protecte. 62,<br />
431.<br />
Sohn, H., S Létant, M.J.Sailor, a W.C. Trogler, 2000, J.Am. Chem. Soc. 122, 5399.<br />
Stamm, Ch. a W.Lukosz, 1993, Sens. Actuators B 11, 177.<br />
Stamm, Ch. a W.Lukosz, 1994, Sens. Actuators B 18, 183<br />
Stamm, Ch., R. Dangel, a W.Lukosz, 1998, Opt. Commun. 1253, 347.<br />
Tiefenthaler, K. a W. Lukosz, 1984a, Optics Lett. 9, 137<br />
Tiefenthaler, K. a W. Lukosz, 1984b, Proc. SPIE, 514, 215.<br />
Tiefenthaler, K. a W. Lukosz, 1985, Thin Solid Films 126, 205.<br />
Tiefenthaler, K. a W. Lukosz, 1989 , J.Opt. Soc. Am. B 3, 209.<br />
Walker. R.G. a C.D.W. Wilkinson, 1983, Appl. Opt. 22, 1029.<br />
Weisser, M., G. Tovar, S. Mittler – Neher, W. Knoll, F. Brosinger, H. Greimuth, M.Lacher a<br />
W.Ehrfeld, 1999, Biosens. Bioelectron. 14, 409.<br />
Young, T. , 1804, Phil. Trans. R. Soc. London 94, 1.<br />
Tiefenthaler, K. a W. Lukosz, 1984a, Optics Lett. 9, 137