Molekulární diagnostika

Laboratorní medicína
Minulost, přítomnost a
budoucnost

Vzdálená minulost!
První laboratorní testy
Starověk
• Moč se rozlije na podlahu. Pokud moč obsahuje cukr, je přilákán
hmyz (mravenci).
Tento test byl používán ještě před 20 lety v některých částech
Afriky.
• Hippocrates (300 př. n.l.) – první diagnostické protokoly –
smyslové sledování – chuť a vzhled moči (sedimenty, bubliny),
krve

Odběry krve
♦ Zavedeny až ve 20. století jako diagnostický nástroj
♦ Předtím byl odběr většího množství krve považován
za léčivý
pouštění žilou (16. století pijavice)
George Washington – denní odběry krve – zemřel
zřejmě na následky velkých ztrát krve
Stále se používá – cyanotická kongenitální srdeční
vada (tvoří se přemíra červ. Krvinek, pravidelně se
odstraňují z krevního oběhu)

Vybavení v medicínské
laboratoři: 1920
Moderní 200-300lůžková nemocnice by
byla velmi dobře vybavená, kdyby měla:
váhy
mikroskop
centrifuga
Bunsenův hořák
kolorimetr (předchůdce spetrofotometru)

Klinická biochemie v
nemocniční laboratoři
1970
♦ Váhy
♦ Spektrofotometr
♦ Plamenový fotometr (stanovení K, Na, Ca)
♦ Van Slykův aparát (měření plynů v krvi)
♦ Klettův kolorimeter (měření hemoglobinu)
♦ Centrifuga

V roce 1970
Nepoužívaly se počítače ani počítačky. Používaly se
posuvné stupnice!
Bez automatizace
Bez propracované kontroly kvality
Bez laboratorního informačního systému
Informační technika – pouze telefon (ne FAX, email,
internet)

Stav na počátku
sedmdesátých let

Současnost
Point-of-Care testování
Molekulární diagnostika
Sofistikované přístroje, analyzátory (tandemová
hmotnostní spektrometrie, mnohobarevná
průtoková cytometrie)
Testování mnoha parametrů na jediném
analyzátoru (konsolidace testování)
Konsolidace laboratoří

Odběr
vzorku
Léka kařsk ské vyšet vy etřen ení
Příjem a
zpracování
vzorku
Lékař
potřebuje
výsledek
Provedení testu
Laboratorní
informační
systém
Zadání
výsledku
do zprávy

Identifikace
MIKROBIOLOG
MI ROBIOLOGIE IE
Identifikace
mikroorganismu
(bakterie, plísn pl sně, , viry,
parazité), parazit ), který
způsobil zp sobil infekci.
Testování efektivních
efektivn ch
antibiotik.
Testov
Bakteriáln Bakteri lní kultury

MIKROBIOLOGIE
Odpovědi na otázky typu:
•jsou zdravotní obtíže pacienta infekčního původu?
Průkaz infekčního agens
•Je přímá souvislost mezi výsledky z laboratorního vyšetření a
určitými obtížemi pacienta?
•Jaká bude terapie?
•Jaký je epidemiologický význam získaných údajů?
rizika infekce, hrozí nebezpečí šíření, jak zabránit šíření

VIROLOGIE
Přímý mý (antigen, nukl. nukl.
kyselina) vs. nepřímý nep mý průkaz pr kaz
viru (protilátky)
(protil tky)
Monitoring průběhu pr hu onemocnění
onemocn
dle DNA viru
dle protilátek protil tek v séru s ru
Běž ěžné infekce
Akutní Akutn průjmy pr jmy
Akutní Akutn respirační respira onemocnění
onemocn
Hepatitidy, HIV
Klíš Klíšťov
ová encefalitida
Herpesviry,
Herpesviry,
cytomegalovirus, cytomegalovirus,
EBV

PARAZITOLOGIE
ARAZITOLOGIE
Jednobuněč
Jednobuněčné
vs. složit slo ité mnohobuněč
mnohobuněčné
organismy
Gastrointestináln
Gastrointestin lní trakt, trakt,
močov mo ové, , pohlavní pohlavn cesty a krev
(vzorky stolice, moč, mo , stěry st ry sliznic)
Přímý mý důkaz d kaz – identifikace patogenního patogenn ho agens (nukleové (nukleov
kys., kys.,
mikroskopie, kultivace)
Nepřímý Nep mý důkaz d kaz – protilátky protil tky v séru s ru (Borrelie ( Borrelie, , Toxoplazmy)
Toxoplazmy
Trichomonas vaginalis
Trypanasoma

HEMATOLOGIE
Pracuje s čerstvou erstvou nesraženou nesra enou krví krv
Počet Po et a charakterizace krevních krevn ch buněk bun k - krevní krevn
obraz a diferenciáln
diferenci lní rozpočet rozpo et (analyzátor), (analyz tor), krevní krevn
nátěr r – mikroskop (barvení (barven – morfologie buněk) bun k)
Diagnostika onemocnění onemocn (anemie)
Detekce malignit (leukemie ( leukemie)
Sledování Sledov stavu nemoci, efektivity léčby l by
Rozlišen Rozli ení typů typ infekce
Srpkovítá anémie
Testy srážlivosti sr livosti krve

LEUKEMIE
Abnormáln
Abnorm lní nekontrolovatelný růst r st krevních krevn ch buněk bun
Buňky Bu ky nejsou schopny maturovat do konečných kone ných stádi st dií
Následkem sledkem nádorov n dorového ho bujení bujen se nedostatečne
nedostate ne vyvíjej vyv její i
ostatní ostatn krevní krevn řady ady (destičky, (desti ky, červen ervené krvinky)
Diagnóza na základě vyšetření různých vzorků tkání
na několika odděleních
Hematologie: krevní krevn obraz
Imunologie, Patologie: buněč buněčné
markery (krev, kostní kostn
dřeň)
Cytogenetika: Cytogenetika:
chromozomáln
chromozom lní přestavby estavby

Transfúzn Transf zní oddělen odd lení
Krev poskytovaná poskytovan bezplatně bezplatn dobrovolnými dárci d rci
Výroba krevních krevn ch přípravk p pravků a derivátů deriv
Testování Testov krevních krevn ch skupin
Provádí Prov se zkoušky, zkou ky, kterými se určuje ur uje
kompatibillita příjemce jemce a dárce: d rce:
Velká Velk křížov ová zkouška zkou ka – sérum rum příjemce p jemce se mísí m s
erytrocyty dárce d rce
Testy na vyloučen vylou ení infekčnosti
infek nosti darované darovan krve –
vyloučen vylou ení přenosu enosu infekčních infek ch onemocnění onemocn (AIDS,
hepatitidy)

Transfuzní Transfuzn přípravky pravky a deriváty deriv ty
Transfuzní přípravky: pravky:
připravovan ipravované separací separac
darované darovan krve přímo p mo na
transfuzním transfuzn m oddělen odd lení
Transfuzn
Plná Pln krev, erytrocytový
koncentrát,
koncentr t, krevní krevn destičky, desti ky,
plazma
Výroba krevních krevn ch derivátů deriv
farmaceutické farmaceutick firmy: firmy
obvykle mix od několika n kolika
dárc rců lidský albumin,
imunoglobiliny, imunoglobiliny,
faktory
srážen sr ení

Testování Testov tkání tk
HISTOPATOLOGIE
HISTOPATOLOGIE
Odběr Odb r vzorku (operace, biopsie)
Transport a zpracování
zpracov
Řezy ezy a barvení barven (značen (zna ení)
Mikroskopické Mikroskopick vyhodnocení
vyhodnocen
Diagnóza Diagn za
Používání Pou klasických technik, nutné nutn získat skat zkušenost zku enost v
příprav pravě i odečítání ode vzorků vzork
Automatizace nepostupuje tak rychle
Ček eká se dlouho na výsledek

Histologie – rozmanité rozmanit techniky
značen zna ení
Klasické Klasick barvení barven hematoxylin, eosin – struktura tkáně tk
Enzymová Enzymov histochemie (průkaz (pr kaz přítomnosti p tomnosti a aktivity enzymů enzym
ve tkáni) tk ni)
Imunohistochemie (detekce navázaných nav zaných protilátek)
protil tek)
Fluorescenční Fluorescen značen zna ení
Zdokonalují Zdokonaluj se přístroje p stroje na přípravu pravu řez ezů, , elektronový mikroskop
Automatizace nepostupuje tak rychle
Karcinom prsu – H/E barvení
Karcinom prsu – imunohisto barvení (tumor marker)

mikroskopické vyšet vy etřen ení
jednotlivých buněk bun k rozetřených
rozet ených
na podložním podlo m skle - chybí chyb
kontinuita vyšet vy etřovan ované tkáně tk v
histologickém
histologick m řezu ezu
mikroskopick
Metoda dle Papanicolaua (Pap Pap
screen): screen):
detekce časných asných stádi st dií
karcinomu dělo d ložního ho čípku. pku.
prava prepátu prep tu, , značen zna ení, ,
odečítání ode a vyhodnocení vyhodnocen (%
abnormáln
abnorm lních ch buněk) bun k)
Příprava
Vyšet etřen ení výpotků,cytologie
výpotk ,cytologie
štítn tné žlázy, zy, plicní plicn cytologie
(lav laváž), ), cytologie lymfatických
uzlin
Vy
CYTOLOGIE
Pap screen pod mikroskopem

Klinická Klinick biochemie
Zpracování Zpracov sražen sra eného ho krevního krevn ho vzorku - sérum rum
Stanovení Stanoven množstv mno ství specifických elementů element
přítomných tomných v krevním krevn m oběhu ob hu
Proteiny, Cukry, Tuky
Meziprodukty metabolismu
Hormony
Toxiny
Onkologické Onkologick markery

KLINICKÁ KLINICK BiOCHEMIE
Vysoký stupeň stupe automatizace:
analyzátory
analyz tory
Multidisciplináln
Multidisciplin lní
Buněč ěčný ný metabolismus (buněč (buněčná
biologie)
Bun
Hormonáln
Hormon lní interakce (endokrinologie)
Imunitní Imunitn odpověď odpov (imunologie)
anatomie

Infek
IMUNOLOGIE
Infekční imunita - bakteriáln
bakteri lní, , virová, virov , plísňov pl ová
onemocnění
onemocn
Sledování imunitní imunitn odpovědi odpov di (imunitní (imunitn stav organizmu,
imunopatologie)
imunopatologie
Hypersensitivní reakce (alergie)
Imunodeficity
Autoimunitní onemocnění
onemocn
Onkologická hemagologická hemagologick onemocnění
onemocn
Protinádorov dorová imunita
Sledov
Hypersensitivn
Imunodeficity
Autoimunitn
Onkologick
Protin
Základn kladní přístupy: stupy:
Automatizace: Analyzátory
Analyz tory – protilátky, protil tky, antigeny
Sofistikované Sofistikovan metody: průtokov pr toková cytometrie
Funkční Funk testy lymfocytů: lymfocyt : laboratorní laboratorn zkušenost, zku enost, nelze
automatizovat

TOXIKOLOGIE
Detekce a monitorování monitorov toxických látek l tek (alkohol, drogy,
jedy, léky): l ky):
Studium rozdělen rozd lení, , příznak p znaků a projevů, projev , průběhu, pr hu, klinických
nález lezů, , možnost mo ností prevence a léčby l by otrav (intoxikací)
(intoxikac
Diferenciáln
Diferenci lní diagnostika intoxikace a její jej záva važnosti nosti ve
vztahu ke zdravotnímu zdravotn mu stavu a nebo chování chov pacienta
Monitorování Monitorov optimáln optim lního ho účinku inku a příp. p p. možných mo ných
interferenc
interfer ncí látek tek při p i medikamentosní medikamentosn terapii
Sledování Sledov dodržov dodr ování léčebn ebného ho režimu re imu
Soudní Soudn (forezn forezní) ) toxikologie

CHROMATOGRAFIE
CHROMATOGRAFIE
Separační Separa technika
Nutná Nutn úprava prava vzorku, časov asově náro ročnější ší, , odborně odborn
personáln person lně náro ročnější ší
HMOTNOSTNÍ HMOTNOSTN SPEKTROMETRIE
Látky tky se dělí d dle molekulové molekulov hmotnosti
Nejúčinn Nej innější ší detekce: tandemová tandemov plynová plynov chromatografie s
hmotnostní hmotnostn detekcí detekc GC-MS GC MS
Screening neznámé nezn noxy (jedu)

GENETIKA – DNA technologie
Dokončena Dokon ena kompletní kompletn sekvence
lidského lidsk ho genomu
Studium dědi d dičných ných onemocnění
onemocn
Studium geneticky dané dan
náchylnosti chylnosti k onemocněním
onemocn m
Techniky analýzy DNA prolínaj prol nají do
ostatních ostatn ch laboratorních laboratorn ch oborů obor
(patologie, mikrobiologie)
PCR – polymerázov
polymer zová řet etězov zová
reakce
Rozvíjej jející se obor: čipov ipové
technologie
Rozv

Ochrana veřejn ve ejného ho zdraví zdrav
Mikrobiologické Mikrobiologick zkoušky zkou ky potravin, vody
Fyzikáln Fyzik lní zkoušky zkou ky pracovního pracovn ho prostřed prost edí
normy pro osvětlen osv tlení
hluk
proudění proud vzduchu
Radiace

Konsolidace laboratoří+
Automatizace
Vzniknou centrální laboratoře
– konsolidace mikrobiologie, imunologie a
klinické chemie
– nemocnice střední velikosti má asi 80 %
testů automatizovaných
– centrální laboratoře mohou přeřazovat
pracovníky mezi různými technologiemi
– vyšetření se provádí na poměrně malé ploše
– centrální laboratoře mají silnou pozici při
vyjednávání nízkých cen činidel

Výhody konsolidace laboratoří
• redukce možných zdrojů chyb
• redukce nákladů
• eliminace potřeby alikvotování
• zvýšení bezpečnosti
• maximální využití mikrovzorků
• technická dokonalost

Blízká budoucnost
Snížení nároků na laboratorní síly
Dramatický nárůst POCT a domácího testování
Neinvazivní testování
Zavádění složitých metod (tandemová
hmotnostní spektrometrie)
Molekulární diagnostika (Čipy a SNP), single cell
analýzy
Automatizace, robotika

Neinvazivní testování
Bez nutnosti odebírání vzorků tkání
Kontinuální testování hladiny
glukózy bez nutnosti odběru krve
detekce analytů voku (změny
koncentrace odpovídají změnám v
detekci emitovaného IR záření)
Pokroky v zobrazovacích metodách
vysoce citlivé ultrazvukové skenery
střírozměrným zobrazovacím
softwarem
zobrazovací zařízení vybraných
oblastí srdce na principu resonanční
spektroskopie
GLUCOWATCH

MOLEKULÁRNÍ
DIAGNOSTIKA

Význam
molekulární diagnostiky
Laboratorní výsledky
určují ze 70%, jak jsou
vynaloženy prostředky
na léčbu
Nejrychleji rostoucí
laboratorní obor
1953 – struktura DNA
1985 – objev PCR techniky
Molekulární diagnostika zpřesňuje
diagnozu oněmocnění, umožňuje
lépe léčit a předcházet
onemocněním

Molekulární diagnostika:
Lepší péče o pacienta
Infekční onemocnění (kvantifikace virové nálože) &
testování rezistence
Revoluční zejména v oblasti onkologie:
Zpřesnění diagnózy – výběr efektivní léčby
Zpřesnění prognózy onemocnění
Sledování průběhu onemocnění (citlivá detekce metastáz,
relapsu onemocnění)
Výběr vhodného dárce pro transplantaci kostní dřeně –
HLA typizace
Personalizovaná medicína – výběr léku na míru

Cytogenetika
Molekulární diagnostika:
3 základní přístupy
na úrovni chromozomů – chromozomální abnormality
(abnormality v počtu, přestavby chromozomů –u
onkologických onemocnění)
Molekulární genetika
na úrovni DNA, metoda polymerázové řetězové reakce =
PCR, čipové technologie
Průtoková cytometrie
na úrovni buněk: detekce buněčných znaků

Cytogenetika
metoda FISH (fluorescence in situ hybridization)
Strukturální změny na chromozomech -
přestavby
Genové přestavby (translokace)
Pracuje se speciálními fluorescenčně
značenými sondami
Downův syndrom Zdravý jedinec
Dědičná onemocnění
Onkologická onemocnění

Průtoková cytometrie
Technika pro počítání, analýzu a třídění buněk suspendovaných v
proudu tekutiny.
Analýza znaků na buňkách
Detailní analýza krevních buněk
onemocnění imunitního systému,
Leukémie (diagnostika, sledování)

Molekulární genetika
PCR = polymerázová řetězová reakce
-umožňuje namnožit libovolný úsek DNA a tak ho zpřístupnit analýze
Analýza mutací
dědičná onemocnění, nádory
Analýza polymorfismů – predikce
onemocnění
HLA typizace
Otcovství
Kriminalistika

Molekulární diagnostika:
Single cell analysis = analýza z jedné buňky
Preimplantační genetická diagnostika
Alternativní metoda k tradičním invazivním metodám prenatální
diagnostiky (odebírání vzorků choriových klků nebo
amniocentéza)
Genetická analýza a selekce embrya před implantací při IVF (in
vitro fertilizace)
umožňuje vybrat embrya, která nenesou genetický materiál,
způsobující onemocnění:
Downův syndrom (trizomie 21. chromozomu)
Cystická fibróza (mutace v genu pro chlor. Receptor)

Postup při preimplantační
genetické diagnostice
Příprava embrya při klasickém IVF cyklu
Růst embrya do velikosti cca 8 buněk (den3)
Biopsie (odstranění) embryonálních buněk
(blastomer) pro testování
Testování DNA (pro testy PCR) nebo celých jader (pro
testy FISH)

Biopsie Embrya

Biopsie embrya

MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA:
Čipové technologie
Výhody
Všechny potřebné testy (všech genů, co nás
zajímají) jsou provedeny naráz
Snížení ceny jednoho testu – cenově efektivní
Laboratoř může vyhovět zvyšujícím se
požadavkům
Snížení času zpracování - časově efektivní
Snížení nároků na počet laboratorních
pracovníků a laboratorní prostor
Úskalí
Nutná pečlivá optimalizace metod
Někdy se produkuje příliš mnoho zbytečných
výsledků
Náročné počítačové zpracování výsledků

Farmakogenetika :
Farmakogenetické testy mohou předpovědět, který lék bude u
daného jedince efektivní a který způsobí nežádoucí účinky
Použito u psychofarmak a léků při onemocnění srdce.
Hledají se interindividuální rozdíly na úrovni DNA, které jsou
spojeny s různou odpovídavostí na léčbu
Bylo identifikováno přibližně 70 léčiv, které jsou
katabolizovány enzymem cytochromem P450. Gen pro tento
enzym se vyskytuje ve více než 50 variantách.
poor (PM), intermediate (IM), normal (EM) or rapid
metabolizers (UM)

Pharmakogenetika
příliš mnoho enzymu - lék
je katabolizován příliš
rychle a ztrácí účinnost.
Málo enzymu - mohou se
začít projevovat účinky
předávkování.
Např. 30% lidí afrického
původu, 20% lidí z blízkého
východu, ale pouze 2%
Kavkazské populace nesou
3 nebo více kopií genu
CYP2D6, což způsobuje
příliš rychlý rozklad
některých léků
Pomocí čipu lze určit
typ metabolismu léků

NUTRIGENOMIKA
Vztah genotypu a zpracování živin
Identifikace jedinců se sníženým
metabolismem folátů
Gen pro 5,10-methylenehydrofolate
reduktázu (MTHFR).
Mutace v tomto genu: rizikový faktor pro
vrozené vady (riziko u těhotných žen). Tělo
není schopno dostatečně zpracovat kyselinu
listovou.

Vzdálená budoucnost…
PERSONALIZOVANÁ MEDICÍNA
PREVENTIVNÍ MEDICÍNA
Výrazně lepší výsledky léčby onemocnění v nižším stádiu
(karcinom tl. střeva – 90 vs 8%)
Stojí méně než léčba pokročilého onemocnění
UŽ NE “jedna velikost pastuje všem!“