official eppo translations of international phytosanitary texts
official eppo translations of international phytosanitary texts
official eppo translations of international phytosanitary texts
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
EUROPEAN AND MEDITERRANEAN PLANT PROTECTION ORGANIZATION<br />
ORGANISATION EUROPEENNE ET MEDITERRANEENNE POUR LA PROTECTION DES PLANTES<br />
ЕВРОПЕЙСКАЯ И СРЕДИЗЕМНОМОРСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПО КАРАНТИНУ И ЗАЩИТЕ РАСТЕНИЙ<br />
OFFICIAL EPPO TRANSLATIONS OF<br />
INTERNATIONAL PHYTOSANITARY TEXTS<br />
TRADUCTIONS OFFICIELLES DES TEXTES<br />
PHYTOSANITAIRES INTERNATIONAUX<br />
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ПЕРЕВОДЫ ЕОКЗР<br />
МЕЖДУНАРОДНЫХ ФИТОСАНИТАРНЫХ ТЕКСТОВ<br />
12/17949<br />
Translation № 74<br />
Перевод № 74<br />
REGIONAL STANDARDS FOR PHYTOSANITARY MEASURES<br />
EPPO STANDARD PM 7/98 (1)<br />
SPECIFIC REQUIREMENTS FOR LABORATORIES PREPARING<br />
ACCREDITATION FOR PLANT PEST DIAGNOSTIC ACTIVITY<br />
NORMES REGIONALES POUR LES MESURES PHYTOSANITAIRES<br />
NORME DE L’OEPP PM 7/98 (1)<br />
EXIGENCES SPECIFIQUES POUR LES LABORATOIRES SE PREPARANT<br />
A L'ACCREDITATION POUR UNE ACTIVITE DE DIAGNOSTIC<br />
PHYTOSANITAIRE<br />
РЕГИОНАЛЬНЫЕ СТАНДАРТЫ ПО ФИТОСАНИТАРНЫМ МЕРАМ<br />
СТАНДАРТ ЕОКЗР PM 7/98 (1)<br />
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ЛАБОРАТОРИЯМ, ВЕДУЩИМ<br />
ПОДГОТОВКУ К АККРЕДИТАЦИИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ В СФЕРЕ<br />
ДИАГНОСТИКИ ВРЕДНЫХ ДЛЯ РАСТЕНИЙ ОРГАНИЗМОВ<br />
(Russian text / Texte en russe / Текст на русском языке)<br />
2012 – 06<br />
OEPP/EPPO<br />
21 Boulevard Richard Lenoir<br />
75011 PARIS
Стандарты EОКЗР <br />
ФИТОСАНИТАРНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ<br />
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ЛАБОРАТОРИЯМ,<br />
ВЕДУЩИМ ПОДГОТОВКУ К АККРЕДИТАЦИИ<br />
ДЕЯТЕЛЬНОСТИ В СФЕРЕ ДИАГНОСТИКИ ВРЕДНЫХ<br />
ДЛЯ РАСТЕНИЙ ОРГАНИЗМОВ<br />
PM 7/98 (1)<br />
oepp<br />
<strong>eppo</strong><br />
Европейская и Средиземноморская организация по карантину и защите растений<br />
Франция, 75011, Париж, бульвар Ришар Ленуар, 21<br />
Сентябрь, 2009 года<br />
2
Серия РМ 7 – Диагностические протоколы для регулируемых вредных<br />
организмов / Diagnostic protocols for regulated pests /<br />
Protocoles de diagnostic pour les organismes réglementés<br />
Европейская и Средиземноморская организация по карантину и защите растений<br />
European and Mediterranean Plant Protection Organization<br />
Organisation Européenne et Méditerranénne pour la Protection des Plantes<br />
РМ 7/98 (1)<br />
Специфические требования к лабораториям, ведущим подготовку к аккредитации<br />
деятельности в сфере диагностики вредных для растений организмов 1 / Specific<br />
requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity /<br />
Exigences spécifiques pour les laboratoires se préparant à l'accréditation pour une activité de<br />
diagnostic phytosanitaire<br />
Особая сфера применения<br />
Настоящее руководство содержит специфические требования к управлению качеством<br />
для лабораторий, ведущих подготовку к аккредитации в соответствии со Стандартом ISO/IEC<br />
17025 «Общие требования к компетенции испытательных и калибровочных лабораторий»<br />
(приводятся ссылки на соответствующие пункты Стандарта ISO/IEC 17025). Следует<br />
отметить, что в стандартах ЕОКЗР глагол «следует» обозначает наивысшую степень<br />
долженствования.<br />
Утверждение и пересмотр<br />
Настоящий стандарт впервые утверждѐн в сентябре 2009 года.<br />
1. Введение<br />
Разработка систем управления качеством (которые также упоминаются как системы<br />
управления или системы качества) и аккредитация стали проблемными вопросами для<br />
многих лабораторий в регионе ЕОКЗР. Стандарт PM 7/84 «Основные требования к<br />
управлению качеством в лабораториях по диагностике вредных для растений организмов»<br />
был утвержден в 2007 году. В Стандарте PM 7/84 описываются основные требования с целью<br />
оказания помощи лабораториям, проводящим диагностику вредных для растений<br />
организмов, в создании системы управления качеством. В настоящем новом стандарте<br />
описываются дополнительные требования для лабораторий, подающих заявку на<br />
аккредитацию. Он основывается на Стандарте ISO/IEC 17025 «Общие требования к<br />
компетенции исследовательских и калибровочных лабораторий», и его следует использовать<br />
вместе со Стандартом PM 7/84. Как правило, лаборатории подают заявку только на<br />
1 Аккредитация в сфере диагностики вредных для растений организмов – это новая развивающаяся<br />
сфера, поэтому настоящий стандарт пересматривается начиная с 2011 года с учѐтом опыта его<br />
использования в лабораториях до этого срока.<br />
3
аккредитацию проведения диагностики наиболее значимых для них вредных организмов, а не<br />
всех вредных организмов, диагностику которых они могут проводить.<br />
Аккредитация на соответствие Стандарту ISO/IEC 17025 проводится национальными<br />
органами по аккредитации. Важно, чтобы лаборатории разработали эффективные процедуры<br />
осуществления коммуникации и установили постоянный контакт со своим национальным<br />
органом по аккредитации на время всего процесса.<br />
Настоящий документ касается качества диагностики, а вопросы здоровья и<br />
безопасности особым образом в нѐм не рассматриваются. Однако деятельность лаборатории<br />
должна соответствовать национальным регламентациям в области здоровья и безопасности.<br />
2. Сфера применения аккредитации: фиксированная и гибкая<br />
Исторически сложилось так, что аккредитация лабораторий, как правило, основывается<br />
на фиксированной сфере применения, которая чѐтко и однозначно определяет серию тестов,<br />
на которые распространяется аккредитация (например, иммунофлюоресцентный анализ на<br />
выявление Ralstonia solanacearum в клубнях картофеля). Однако это не позволяет с<br />
легкостью добавлять новые или модифицированные тесты в сферу деятельности лаборатории<br />
даже в том случае, если компетентность лаборатории в проведении и валидации сходных<br />
тестов уже была оценена органом по аккредитации. Несмотря на то, что заявки на<br />
расширение сферы деятельности можно подавать в любое время, сроки проведения<br />
аккредитации в действительности могут помешать быстрому реагированию на требования<br />
клиента. Вследствие этого была разработана концепция гибкой сферы применения<br />
аккредитации.<br />
Гибкая сфера применения аккредитации позволяет лаборатории выполнять<br />
определѐнные тесты и сообщать о результатах, как об аккредитованных, даже в том случае,<br />
если эти тесты чѐтко не указаны в сфере деятельности лаборатории («Требования к<br />
аккредитации с гибкой сферой применения» EA-2/15, 2008). Примерами ситуаций, когда<br />
может возникнуть необходимость в гибкой сфере применения аккредитации, являются<br />
нижеследующие:<br />
оптимизация исходного теста;<br />
модификация существующего теста с целью расширения области его применения<br />
(например, для работы с новыми природными субстратами);<br />
включение теста, эквивалентного уже аккредитованному.<br />
Концепция гибкой сферы применения аккредитации предполагает такую степень<br />
гибкости, которая, как правило, согласовывается с органом по аккредитации. Тем не менее,<br />
следует отметить, что эта степень гибкости по-разному интерпретируется на национальном<br />
уровне. В настоящее время опыт фитосанитарных лабораторий показывает, что при гибкой<br />
сфере применения аккредитации лаборатория несѐт больше ответственности за<br />
подтверждение надѐжности и достоверности тестов, их соответствия обстоятельствам<br />
использования и подтверждение того, что они проводятся компетентно и единообразно. Если<br />
лаборатория принимает решение заявить, что тест аккредитован, а проведѐнный<br />
впоследствии аудит выявляет проблемы с используемыми процедурами, результаты тестов<br />
могут быть недостоверными, и может возникнуть необходимость в отмене всех выданных<br />
результатов диагностики. Поэтому настоятельно рекомендуется наработать опыт с<br />
фиксированной сферой применения аккредитации перед тем, как лаборатория подаст заявку<br />
на аккредитацию с гибкой сферой применения, поскольку в обоих случаях должны<br />
4
выполняться все требования Стандарта ISO/IEC 17025. Однако лаборатория уже может быть<br />
аккредитована на выполнение другой деятельности отличной от диагностики вредных для<br />
растений организмов. Опыт с фиксированной сферой применения аккредитации в<br />
выполнении другой деятельности может быть достаточным для прямой подачи заявки на<br />
аккредитацию с гибкой сферой применения в отношении деятельности, связанной с<br />
диагностикой вредных для растений организмов.<br />
3. Термины и определения<br />
Определения терминов, используемых в настоящем стандарте, приведены в Стандарте<br />
PM 7/76 «Использование диагностических протоколов ЕОКЗР» (пересмотренная версия<br />
находится на стадии подготовки). Определения критериев эффективности приведены во<br />
введении к стандартам ЕОКЗР серии РМ 7.<br />
В настоящем стандарте термин «тест» подразумевает применение метода по<br />
отношению к определѐнному вредному организму и определѐнному природному субстрату.<br />
Методы, о которых идет речь, включают в себя биотесты, биохимические методы, методы<br />
пептидных карт, методы выделения или экстрагирования, молекулярные методы,<br />
морфологические и морфометрические методы, оценку патогенности и серологические<br />
методы.<br />
4. Требования к управлению (Стандарт ISO 17025, пункт 4)<br />
Лаборатория должна установить, и далее применять и поддерживать систему<br />
управления качеством, охватывающую все материально-технические средства и<br />
деятельность, находящуюся в сфере аккредитованной диагностики вредных для растений<br />
организмов.<br />
Система управления должна включать описания материально-технических средств и<br />
мероприятий (включая подробную информацию о клиентах и диагностируемых вредных<br />
организмах), на которые она распространяется. Система качества должна быть оформлена<br />
документально, а документы, касающиеся качества, должны храниться в архиве (смотрите<br />
также ниже).<br />
Как указано в Стандарте PM 7/84, система управления в лаборатории должна<br />
обеспечивать, чтобы:<br />
имелись ресурсы, подходящие для проведения диагностики, например, персонал,<br />
материально-технические средства и расходные материалы (также смотрите<br />
раздел «Технические требования»);<br />
приобретѐнные ресурсы, реагенты и расходные материалы соответствовали их<br />
предполагаемому использованию;<br />
обязанности и задачи персонала были чѐтко определены (например,<br />
организационными схемами) и соответствующим образом распределены;<br />
возможные конфликты интересов между персоналом и выполняемой<br />
деятельностью вовремя распознавались и предотвращались;<br />
обучение документировалось и оценивалось (также смотрите раздел<br />
«Технические требования»);<br />
персонал имел доступ к процедурам и инструкциям и применял их; это<br />
относится и к стандартным операционным процедурам (СОП);<br />
5
заказчик информировался по запросу о значимой для него информации,<br />
касающейся диагностики его образца;<br />
любая субподрядная работа выполнялась такой лабораторией, которая бы<br />
соблюдала требования настоящего стандарта, что должно проверяться основной<br />
аккредитованной лабораторией (как минимум, должна быть составлена<br />
декларация о соответствии);<br />
заказчику гарантировалась конфиденциальность результатов диагностики 2 ;<br />
существовал и применялся механизм работы с жалобами;<br />
существовали и применялись механизмы записи, анализа и исправления всех<br />
отклонений от процедур или требований заказчика;<br />
вся документация, указанная выше, хранилась и архивировалась. Система<br />
управления качеством должна периодически пересматриваться руководителями.<br />
Это означает периодическое проведение оценки всех компонентов системы, а<br />
также повседневный учѐт отклонений в системе и последующих<br />
корректирующих действий, которые были предприняты.<br />
4.1 Обязанности руководителей (Стандарт ISO 17025, пункт 4.2.3)<br />
Руководители лаборатории должны выполнять обязанности по достижению целей<br />
управления качеством и постоянно совершенствовать эффективность системы управления.<br />
Они должны предоставлять подтверждение выполнения этих обязанностей.<br />
4.2 Постоянное совершенствование (Стандарт ISO 17025, пункт 4.10)<br />
Руководители должны периодически пересматривать систему управления<br />
лабораторией, включая проведение тестов, для обеспечения того, чтобы эта система<br />
продолжала быть пригодной и эффективной, а также для того, чтобы вносились необходимые<br />
изменения или усовершенствования. Лаборатория должна применять программу<br />
непрерывного совершенствования. Внутренние механизмы и внешняя оценка могут<br />
предоставлять необходимую информацию. Внутренние механизмы включают в себя:<br />
Определение задач в сфере качества и соответствующих индикаторов качества<br />
(например, уменьшение количества жалоб в следующем году на Х %). Эти<br />
показатели должны пересматриваться руководителями.<br />
Организацию собраний персонала для того, чтобы:<br />
o запланировать профилактические мероприятия и оценить эффективность<br />
корректирующих действий;<br />
o провести тщательный анализ результатов внутреннего аудита;<br />
o провести анализ жалоб и связанных с ними корректирующих действий и т.п.;<br />
o определить потребности в обучении;<br />
o собрать предложения персонала по совершенствованию работы.<br />
Процедуры получения обратной связи от заказчиков.<br />
Для постоянного совершенствования важными элементами также являются оценка с<br />
помощью внешнего аудита и результаты квалификационных или других межлабораторных<br />
тестов.<br />
2 Тем не менее, лабораториям рекомендуется разработать процедуру уведомления НОКЗР об<br />
обнаружении регулируемых вредных организмов в том случае, если НОКЗР не является заказчиком.<br />
6
5 Технические требования (Стандарт ISO 17025, пункт 5)<br />
5.1 Общие положения (Стандарт ISO 17025, пункт 5.1)<br />
Смотрите тот же раздел в Стандарте PM 7/84.<br />
5.2 Персонал (Стандарт ISO 17025, пункт 5.2)<br />
Смотрите тот же раздел в Стандарте PM 7/84.<br />
5.3 Помещения и условия окружающей среды (Стандарт ISO 17025,<br />
пункт 5.3)<br />
Смотрите тот же раздел в Стандарте PM 7/84.<br />
5.4 Методы диагностики (Стандарт ISO 17025, пункт 5.4)<br />
5.4.1 Общие положения (Стандарт ISO 17025, пункт 5.4.1)<br />
Лаборатория должна применять подходящие методы и процедуры для всех тестов в<br />
рамках своей сферы деятельности. Это относится к методам отбора образцов (в<br />
соответствующих случаях), способам обращения с образцами, транспортировке, хранению,<br />
приготовлению препаратов и проведению анализов образцов. Предполагается, что<br />
диагностические лаборатории должны понимать биологию организмов и принимать еѐ во<br />
внимание при вторичной выборке образцов и/или при подготовке образца для анализа.<br />
Приобретѐнные реагенты и расходные и другие материалы должны соответствовать их<br />
предполагаемому использованию.<br />
Все инструкции, стандарты, технические руководства и справочная информация,<br />
необходимые для работы лаборатории, должны постоянно обновляться, и у персонала всегда<br />
должен быть к ним доступ. Отклонение от СОП при применении тестов может иметь место<br />
только в том случае, если оно оформлено документально, технически обосновано и<br />
разрешено соответствующим лицом.<br />
5.4.2 Выбор тестов (Стандарт ISO 17025, пункт 5.4.2)<br />
Лаборатория должна использовать диагностические тесты, которые соответствуют<br />
имеющимся условиям (смотрите Стандарт ЕОКЗР PM 7/76 «Применение диагностических<br />
протоколов ЕОКЗР»). Тесты, описанные законодательно (например, в законодательстве ЕС<br />
или национальном законодательстве), являются обязательными для соответствующей страны.<br />
Если обязательный тест отсутствует, то предпочтение следует отдавать тестам,<br />
опубликованным в качестве международных, региональных или национальных стандартов. В<br />
тех случаях, когда такие тесты отсутствуют, или если они могут быть усовершенствованы, то<br />
можно использовать разработанные в лаборатории или адаптированные тесты.<br />
Лаборатория должна обеспечить, чтобы использовалась последняя и признанная<br />
надѐжной и достоверной версия теста, если это соответствует ситуации и является<br />
возможным. В случае необходимости к тесту должна прилагаться дополнительная подробная<br />
информация для обеспечения последовательности в его применении.<br />
Лаборатория, проводящая подготовку к аккредитации, должна использовать только те<br />
тесты, которые прошли валидацию. Тесты могли пройти валидацию, если для этого имелись<br />
подходящие данные. В противном случае тесты должны пройти процедуру валидации в<br />
7
лаборатории (смотрите пункт 5.4.3). При использовании прошедшего валидацию теста,<br />
лаборатория должна предоставить объективное подтверждение того, что она может<br />
проводить этот тест в соответствии с установленными характеристиками эффективности<br />
(смотрите пункт 5.4.4). Тест считается полностью прошедшим валидацию, если он даѐт<br />
данные, соответствующие следующим критериям эффективности: аналитической<br />
чувствительности, аналитической специфичности, воспроизводимости и<br />
повторяемости. В зависимости от сферы применения теста может также возникнуть<br />
необходимость в определении его селективности. Если лаборатория вносит изменения в<br />
тест, прошедший валидацию, следует проанализировать и документально оформить решение,<br />
требуется ли проведение валидации или проверки этого изменения.<br />
Не все тесты, включѐнные в диагностические протоколы ЕОКЗР, имеют критерии<br />
эффективности. Проведѐнная в 2008 году проверка по использованию тестов, включѐнных в<br />
диагностические протоколы ЕОКЗР (Petter et al., 2009), показала, что широко используются<br />
те тесты, которые представлены в Дополнении 1 (в стадии подготовки). Следовательно,<br />
можно считать, что эти тесты имеют подходящий уровень надѐжности в отношении<br />
повторяемости, воспроизводимости и селективности. Лаборатория, применяющая эти тесты,<br />
должна, по меньшей мере, предоставить данные для валидации в отношении аналитической<br />
чувствительности. Также может понадобиться предоставить дополнительные данные по<br />
аналитической специфичности в зависимости от местных условий (например, вероятность<br />
ложных реакций на близкородственных организмах). Как только такие данные<br />
предоставляются, эти тесты считаются прошедшими валидацию. Программа регулярного<br />
пересмотра диагностических протоколов ЕОКЗР включает в себя добавление данных о<br />
валидации.<br />
Тесты, прошедшие валидацию и имеющие предоставленные критерии эффективности, в<br />
настоящем документе считаются «стандартными тестами», а в стандарте ISO 17025 они<br />
называются «стандартными методами».<br />
5.4.3 Валидация тестов (Стандарт ISO 17025, пункт 5.4.5)<br />
Валидация проводится для предоставления объективных данных о том, что данный тест<br />
подходит к условиям его использования (смотрите Стандарт ЕОКЗР PM 7/76, в котором<br />
описаны разные типы предполагаемого использования). В сфере диагностики вредных для<br />
растений организмов тест должен быть подходящим для проведения повседневной<br />
диагностики. Как уже говорилось ранее, минимальными критериями эффективности теста,<br />
которые должны быть определены, являются аналитическая чувствительность, аналитическая<br />
специфичность, повторяемость, воспроизводимость и, в соответствующих случаях,<br />
селективность. В том случае, если значения для этих критериев отсутствуют, или к ним нет<br />
доступа (например, к опубликованным источникам), лаборатория должна сама восполнить<br />
недостающие данные или обосновать, почему они не могут быть получены. Если значения<br />
критериев эффективности доступны частично, лаборатория должна проверить, что она может<br />
проводить тест в соответствии с ними (смотрите пункт 5.4.4). Валидация должна проводиться<br />
на справочном материале (смотрите определение в Стандарте PM 7/84), включая<br />
искусственно заражѐнные («обогащенные») образцы. При использовании культур или<br />
изолятов для биологических тестов необходимо обеспечить подтверждение их<br />
вирулентности.<br />
Также можно проводить валидацию теста путѐм сравнения со «стандартным тестом».<br />
Руководство по процедуре такого рода валидации приводится в Дополнении 2. Тем не менее,<br />
8
в таком случае валидируемый тест нельзя принимать в качестве «стандартного теста»,<br />
поскольку он не имеет всех критериев эффективности. Данный процесс может только<br />
показать, что этот тест является настолько же хорошим, как и стандартный тест.<br />
Собранные данные и результаты проведѐнных лабораторией валидаций (в особенности<br />
в отношении воспроизводимости), а также результаты межлабораторного сравнения (оценка<br />
эффективности того, как тест работает), также могут свидетельствовать о стабильности теста,<br />
например, до какой степени смена реагентов или изменение условий влияют на<br />
установленные значения эффективности теста. Также они могут предоставить данные о<br />
диагностической чувствительности и диагностической специфичности путѐм сравнения с<br />
альтернативным(и) тестом(ами).<br />
Процедуры валидации, описанные в настоящем документе (и в особенности пояснения,<br />
приведѐнные в таблицах 4-9 в Дополнении 5) следует рассматривать как общее руководство,<br />
в соответствии с которым можно проводить валидацию теста. Данные, приведѐнные в этих<br />
таблицах, основаны на опыте, который специалисты Группы экспертов ЕОКЗР по<br />
диагностике приобрели в процессе проведения валидаций. Может возникнуть<br />
необходимость в отклонении от настоящего руководства в зависимости от сочетаний<br />
вредных организмов и растений. В таких случаях следует документально фиксировать<br />
причины таких отклонений. В настоящем документе невозможно предоставить подробное<br />
описание для каждого сочетания.<br />
Тесты по диагностике вредных для растений организмов могут быть качественными<br />
или количественными. Качественный тест устанавливает присутствие или отсутствие<br />
вредного для растений организма в образце. Количественный тест устанавливает количество<br />
особей вредного для растений организма в образце. Во всех возможных случаях для теста<br />
необходимо определить порог возможностей обнаружения. Однако при выявлении вредных<br />
для растений организмов эти пороги не всегда могут быть точно установлены. Существуют<br />
организмы, которые невозможно выделить в культуру (облигатные патогены), количество<br />
которых нельзя определить (грибы), которые присутствуют только в растении, или которые<br />
нельзя выделить в чистом виде (например, фитоплазмы). По этой причине точная<br />
концентрация этих организмов не может и едва ли когда-нибудь сможет быть установлена<br />
точно, и поэтому необходимо использовать приблизительные подсчѐты. Даже в отношении<br />
организмов, которые можно выделить в чистую культуру (многие бактерии и вирусы),<br />
концентрация может быть подсчитана только приблизительно (например, КОЕ или мг/мл).<br />
Такая оценка часто бывает основана на непрямом измерении.<br />
Процесс валидации<br />
Как указано в Стандарте ISO 17025 «лаборатория должна вести официальные записи о<br />
полученных результатах и процедурах, использованных для валидации».<br />
Общий процесс валидации описан ниже (также смотрите Рисунок 1). Более подробное<br />
руководство приводится в таблицах 4-9 в Дополнении 5.<br />
1. Определите область использования теста, например, выявление и/или идентификация<br />
организма Х в природном субстрате У методом Z с учѐтом всех специфических<br />
требований, связанных с условиями применения теста (примеры описаны в Стандарте<br />
PM 7/76).<br />
2. Рассмотрите технические требования для определения рабочих характеристик<br />
эффективности: аналитической специфичности, селективности, воспроизводимости и<br />
повторяемости, принимая во внимание руководство, приведенное в таблицах 1-6,<br />
9
согласно требованиям. Затем определите тип и состав образцов, необходимых для<br />
валидации.<br />
3. Запланируйте и проведите валидацию по отдельным или комбинированным<br />
характеристикам эффективности. Рекомендуется следовать этапам, приведѐнным на<br />
Рисунке 1.<br />
4. Представьте результаты в отчѐте по валидации с заключением о соответствии теста<br />
требованиям, определѐнным в пункте 1.<br />
5. Использование бланка «Заявление о валидации теста» может быть важным, и его можно<br />
представить по форме, приведѐнной в Дополнении 3.<br />
10
Определите организм<br />
Определите природный субстрат<br />
Определите тест<br />
Определите предполагаемые критерии характеристик эффективности<br />
Сверьтесь с таблицами 1-6<br />
Определите тип/состав материала для проведения валидации<br />
Составьте план проведения валидации<br />
Аналитическая специфичность/селективность*<br />
хорошая<br />
плохая<br />
Аналитическая чувствительность*<br />
хорошая<br />
Повторяемость/воспроизводимость<br />
хорошая<br />
Отчет о валидации<br />
плохая<br />
плохая<br />
Заявление о том, что тест успешно охватывает<br />
сферу его применения<br />
Рис. 1 Процесс валидации<br />
совершенствование<br />
путем корректировки<br />
теста<br />
СТОП<br />
тест не может быть признан валидным<br />
совершенствование<br />
путем корректировки<br />
теста<br />
СТОП<br />
тест не может быть признан валидным<br />
совершенствование<br />
путем корректировки<br />
теста<br />
СТОП<br />
тест не может быть признан валидным<br />
Выберите<br />
новый тест<br />
Выберите<br />
новый тест<br />
Выберите<br />
новый тест<br />
*в зависимости от предполагаемого<br />
использования теста оценка аналитической<br />
чувствительности может проводиться до<br />
оценки специфичности и селективности<br />
11
5.4.4 Проверка эффективности работы лаборатории по проведению<br />
определѐнного теста (ISO пункт 5.4.2, второй параграф, последнее<br />
предложение)<br />
Лаборатория должна подтвердить, что она может должным образом проводить<br />
выбранный стандартный тест для предполагаемого использования. В случае внесения какихлибо<br />
изменений в стандартный тест, проверка должна быть проведена повторно.<br />
Процесс, необходимый для предоставления объективного подтверждения того, что<br />
лаборатория является компетентной для проведения стандартного теста в соответствии с<br />
установленными для него характеристиками эффективности, описан ниже.<br />
Тесты, которые выходят за рамки первоначальной сферы применения, требуют<br />
повторной валидации согласно пункту 5.4.3 (например, при выявлении на новом хозяине).<br />
Если лаборатория вносит существенные изменения в стандартный тест, он должен вновь<br />
пройти валидацию. Проверка может быть осуществлена путѐм участия в квалификационных<br />
тестах или в межлабораторных сравнительных тестах (например, ринг-тестах и совместных<br />
исследованиях), при условии, что они позволяют выполнять требования, приведѐнные в<br />
Таблице 1.<br />
Выбор реактива может иметь решающее значение для эффективности теста. Изменение<br />
реактива (или его марки или партии) или получение реактива у другого поставщика может<br />
повлиять на эффективность теста. В таких случаях проверка эффективности реактива должна<br />
проводиться путѐм сравнения с ранее использовавшимся реактивом или в соответствии с тем,<br />
что указано в колонке 1 и 2 Таблицы 1.<br />
Таблица 1 Руководство по проверке рабочих критериев<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Проведите анализ не<br />
менее 5-10 образцов<br />
с установленным<br />
порогом<br />
возможностей<br />
выявления.<br />
Эту проверку можно<br />
сочетать с проверкой<br />
повторяемости и<br />
воспроизводимости<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Выберите несколько из<br />
наиболее значимых<br />
организмов-мишеней<br />
(например, разные<br />
штаммы) и организмов,<br />
не являющихся<br />
мишенями. Тесты<br />
должны проводиться со<br />
средними уровнями<br />
численности<br />
организмов.<br />
Повторяемость Воспроизводимость<br />
Проведите не менее 2<br />
опытов с 3 уровнями<br />
численности<br />
организма-мишени 1<br />
(низким 2 /средним/<br />
высоким), причем<br />
тесты должны<br />
проводиться одним и<br />
тем же лицом, на<br />
одном оборудовании и<br />
в один и тот же день.<br />
1 можно использовать искусственные выборки, созданные из одного образца<br />
2 около порога возможностей выявления<br />
Процесс проверки (Рис. 2)<br />
Проведите не менее 3<br />
опытов с 3 уровнями<br />
численности организмамишени<br />
1<br />
(низким 2 /средним/<br />
высоким), но в разное<br />
время, по возможности<br />
разными лицами, а в<br />
случае, когда это<br />
существенно, - с<br />
использованием разного<br />
оборудовании.<br />
1. Проведите валидированный тест согласно описанию или с небольшими<br />
изменениями для того, чтобы учесть местные условия (например, поставщика<br />
реактива или оборудования, если на этот счѐт нет специфических требований для<br />
проведения валидированного теста) с целью оценить соответствие лаборатории<br />
значениям критериев эффективности, приведѐнным в сведениях по валидации<br />
12
(смотрите руководство в Таблице 1). Необходимость проведения проверки<br />
селективности отсутствует.<br />
2. Результаты проверочного теста:<br />
3. Несоответствие значениям критериев эффективности: переходите к пункту 3;<br />
4. Соответствие значениям критериев эффективности: лаборатория может применять<br />
этот тест в повседневном режиме – переходите к пункту 4.<br />
5. Если отклонение от условий, описанных в прошедшем валидацию тесте, влияет на<br />
результаты, изучите причины этого отклонения. Откорректируйте и выполните<br />
повторную проверку теста или, если потребуется, повторную валидацию в<br />
соответствии с процедурой, описанной в разделе «Валидация тестов». Если<br />
соответствие значениям критериев эффективности отсутствует, исследуйте,<br />
являются ли причиной этого те минимальные изменения, которые были внесены в<br />
тест. Если это не так, займитесь поиском консультации извне (например, свяжитесь<br />
с автором теста).<br />
6. Представьте результаты в отчѐте о проверке с заключением, соответствует ли<br />
проверенный тест требованиям, указанным в пункте 1.<br />
7. Использование бланка «Заявление о проверке теста» может быть важным, и его<br />
можно представить в форме, приведѐнной в Дополнении 4.<br />
5.4.5 Ненадѐжность измерения (ISO 17025 5.4.6)<br />
Лаборатории должны стараться определить факторы, влияющие на ненадѐжность теста,<br />
такие как персонал, оборудование и биологические свойства (например, серотипы,<br />
патотипы). Во всех возможных случаях, должны применяться подходящие меры для<br />
контроля возможной ненадѐжности. Если меры не приняты, должны фиксироваться причины<br />
такой ситуации, а заказчик должен быть полностью информирован о ненадѐжности в тесте.<br />
Несмотря на то, что в большинстве случаев тесты, используемые для диагностики вредных<br />
для растений организмов, дают не количественные результаты, эти результаты могут<br />
основываться на измерениях (морфометрических данных, подсчѐте клеток). Они могут<br />
представлять собой всего лишь часть диагностического процесса, но если это является<br />
важным с точки зрения диагностики, то еѐ ненадѐжность должна быть оценена.<br />
5.5 Оборудование (ISO пункт 5.5)<br />
Смотрите тот же раздел в Стандарте PM 7/84.<br />
5.6 Справочные материалы (ISO пункт 5.5.3)<br />
Смотрите тот же раздел в Стандарте PM 7/84<br />
5.7 Отбор образцов (ISO пункт 5.7)<br />
Смотрите тот же раздел в Стандарте PM 7/84<br />
5.8 Обращение с образцами (ISO пункт 5.8)<br />
Смотрите тот же раздел в Стандарте PM 7/84<br />
13
Рис.2 Процесс проверки<br />
Выберите прошедший валидацию (стандартный) тест<br />
Определите изменѐнные реагенты или условия проведения теста<br />
Проведите тест<br />
Определите, являются ли значения<br />
эффективности такими же, как и в<br />
тесте, прошедшем валидацию<br />
есть<br />
Отчет о проверке<br />
Лаборатория может проводить<br />
тест в соответствии с<br />
установленными критериями<br />
эффективности<br />
Соответствие<br />
значениям<br />
эффективности<br />
нет<br />
Выясните<br />
причины<br />
не выяснены<br />
Лаборатория не может<br />
проводить тест в соответствии<br />
с установленными критериями<br />
эффективности<br />
проведите<br />
корректировку<br />
выяснены<br />
Консультация<br />
извне<br />
14
5.9 Обеспечение качества диагностики (ISO пункт 5.9)<br />
Смотрите тот же раздел в Стандарте PM 7/84<br />
6 Оповещение о результатах (ISO пункт 5.10.3)<br />
Смотрите Стандарт ЕОКЗР РМ 7/77 «Ведение документации и оповещение о<br />
диагностике».<br />
Справочная литература<br />
Группа AFNOR (1995). XP V03-111 «Анализ сельскохозяйственных и продовольственных<br />
продуктов: протокол внутрилабораторной оценки альтернативного метода<br />
качественного анализа по сравнению со справочным методом», Французская ассоциация<br />
стандартизации/Association Française de Normalisation, La Plaine Saint-Denis (FR).<br />
Европейская ассоциация по аккредитации / EA (2008) EA-2/15 «Требования к аккредитации с<br />
гибкой сферой применения», http://www.eurolab.org/docs/EA/EA-2_15.pdf. (по состоянию<br />
на 16 сентября 2009 года).<br />
Петтер Ф. / Petter F, Сюффер М. / Suffert M и Мак Мюллен М. А. С. / McMullen MAS (2010):<br />
Результаты опроса по использованию диагностических протоколов ЕОКЗР. Бюллетень<br />
ЕОКЗР, т. 40, стр. 121 6 126.<br />
Хьюз К. Дж. Д. / Hughes KJD, Гриффин Р. Л. / Griffin RL, Томлинсон Дж. А. / Tomlinson JA,<br />
Бунхэм Н. /Boonham N, Инман А. Дж. / Inman AJ и Лейн С. / Lane C (2006) «Разработка<br />
одноэтапного анализа ПЦР в реальном времени для диагностики Phytophthora ramorum».<br />
Фитопатология/Phytopathology 96: 975-981.<br />
ISO/IEC (2005) Стандарт 17025 «Общие требования к компетенции испытательных и<br />
калибровочных лабораторий» (доступен на сайте: http://www.iso.org).<br />
ISO (2003) ISO 16140 «Микробиология продуктов питания и кормов животных: протокол по<br />
валидации альтернативных методов» (доступен на сайте: http://www.iso.org).<br />
15
Дополнение 1 (в процессе подготовки): перечень тестов, внесѐнных в<br />
диагностические протоколы ЕОКЗР и имеющих широкое применение<br />
Этот перечень будет подготовлен совместно с соответствующими группами экспертов<br />
ЕОКЗР по диагностике.<br />
Дополнение 2: Процедура валидации теста путѐм его сравнения со<br />
«стандартным тестом»<br />
Сравнение теста со «стандартным тестом» должно проводиться следующим образом:<br />
Проведите тест 3 раза с организмом-мишенью и 3 раза с организмами, не являющимися<br />
мишенями, как это указано в Таблице 2. Образцы обрабатываются двумя тестами<br />
одновременно. Следует отметить, что данная процедура может быть не применима ко всем<br />
областям, например, к морфологической идентификации насекомых.<br />
Количество образцов, указанное в этой таблице, было определено путѐм сравнения с<br />
опубликованными стандартами, например, Стандартом ISO 16140 «Микробиология<br />
продуктов питания и кормов для животных: протокол по валидации альтернативных<br />
методов» (ISO, 2003 г.) и Стандарта AFNOR XP V03-111 «Анализ сельскохозяйственных и<br />
продовольственных продуктов. Протокол по внутрилабораторной оценке альтернативного<br />
метода качественного анализа по сравнению со справочным методом» (AFNOR, 1995 г.).<br />
Соотношение результатов, полученных при помощи стандартного теста и нового теста,<br />
должны оцениваться для различных уровней численности вредных организмов. Результаты<br />
могут быть представлены так, как показано в Таблице 3, и могут быть рассчитаны<br />
сравнительные характеристики эффективности.<br />
Таблица 2: Минимальное количество образцов, необходимое при<br />
проведении сравнения теста со «стандартным тестом».<br />
Тип материала Уровень численности организма<br />
Низкий Средний Высокий<br />
Изоляты чистых культур<br />
организма-мишени или образцы,<br />
искусственно заражѐнные<br />
10<br />
7<br />
5<br />
организмом-мишенью<br />
Изоляты чистых культур<br />
организма, не являющегося<br />
мишенью, или образцы, искусственно<br />
заражѐнные организмом,<br />
не являющимся мишенью<br />
Образцы, заражѐнные<br />
организмом-мишенью<br />
естественным образом<br />
-<br />
от 22 до 44 *<br />
Готовятся соответствующие серии разбавлений с 15<br />
положительными образцами, которые были предварительно<br />
идентифицированы при помощи стандартных тестов, с целью<br />
достижения порога возможностей выявления стандартного теста.<br />
* общее количество образов организмов, не являющихся мишенью, не должно превышать<br />
общее количество образцов организма-мишени более чем в два раза.<br />
-<br />
16
Дополнение 3<br />
Название теста:<br />
Сфера применения теста:<br />
Дополнительные комментарии :<br />
Заявление о валидации теста<br />
Документы по прохождению теста валидации и требования, которым он должен<br />
соответствовать, имеются и хранятся в лаборатории. Документы включают в себя<br />
лабораторные справочники и прочую информацию, указанную ниже, которая демонстрирует,<br />
каким образом процедуры проходили валидацию в этом исследовании.<br />
Характеристики<br />
эффективности<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Селективность (в<br />
соответствующих случаях)<br />
Повторяемость<br />
Воспроизводимость<br />
Прочая информация (не<br />
обязательна)<br />
A B C D Где найти документацию<br />
A = Данные, полученные в экспериментах, проведѐнных самой лабораторией.<br />
B = Данные, полученные при проведении квалификационных тестов или ринг-тестов.<br />
C = Информация, полученная от производителей.<br />
D = Внешняя информация (литература и т.д.).<br />
Таблица 3: Пример результатов сравнения стандартного и нового теста<br />
Новый тест<br />
+ 69<br />
- 6<br />
Итого 75<br />
Стандартный тест<br />
+<br />
-<br />
ПС ПО<br />
ОО ОС<br />
Итого<br />
3 72<br />
12 18<br />
15 90<br />
17
Таблица 3 основана на работе Хьюза и др. / Hughes et al., 2006. Цифры в таблице<br />
приведены для наглядности.<br />
ПС (положительное совпадение), ПО (положительное отклонение), ОО (отрицательное<br />
отклонение), ОС (отрицательное совпадение).<br />
Положительные (+) и отрицательные (-) результаты для 90 образцов,<br />
проанализированных при помощи обоих тестов, показывают диагностическую<br />
чувствительность (ПС/(ПС+ND)), диагностическую специфичность (ОС/(ОС+ПО)) и<br />
относительную точность (ПС+ОС)/(ПС+ПО+ОО+ОС). Диагностическая чувствительность =<br />
92 %, Диагностическая специфичность = 80%; Относительная точность = 90%.<br />
Диагностическая чувствительность<br />
Диагностическая специфичность<br />
Где найти документацию<br />
На основании приведѐнного выше заявления тест считается прошедшим валидацию и<br />
соответствующим сфере его применения.<br />
Имя заглавными буквами: Должность эксперта в лаборатории:<br />
Подпись: Дата:<br />
Имя заглавными буквами: Должность эксперта в лаборатории:<br />
Подпись: Дата:<br />
18
Дополнение 4<br />
Название теста:<br />
Стандартный тест:<br />
Область применения стандартного теста:<br />
Небольшие изменения:<br />
Заявление о проверке теста<br />
Документы по прохождению теста валидации и требования, которым он должен<br />
соответствовать, имеются и хранятся в лаборатории. Документы включают в себя<br />
лабораторные справочники и прочую информацию, указанную ниже, которая демонстрирует,<br />
каким образом проводился проверочный тест в этом исследовании.<br />
Критерии<br />
эффективности<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Повторяемость<br />
Воспроизводимость<br />
Значения,<br />
полученные<br />
в<br />
стандартном<br />
тесте<br />
Соответствует<br />
требованиям<br />
стандартного<br />
теста<br />
(да или нет)<br />
Где найти документацию<br />
На основании приведѐнного выше заявления проверка теста считается подтверждающей<br />
его соответствие сфере его применения.<br />
Имя заглавными буквами: Должность эксперта в лаборатории:<br />
Подпись: Дата:<br />
Имя заглавными буквами: Должность эксперта в лаборатории:<br />
Подпись: Дата:<br />
19
Дополнение 5 – Таблицы, в которых даѐтся подробное руководство для процесса валидации по сфере<br />
деятельности (бактериология, ботаника, энтомология, нематология и вирусология)<br />
Таблица 4. Бактериология<br />
Данные, приведѐнные в таблицах, основаны на опыте по валидации, полученном специалистами групп<br />
экспертов ЕОКЗР, занимающихся вопросами диагностики. Может возникнуть необходимость в отклонении от<br />
данного руководства в зависимости от сочетаний вредных организмов и растений. В таких случаях следует<br />
документально фиксировать причины этих отклонений.<br />
Метод выделения организма-мишени из природного субстрата<br />
Примечание: валидация метода выделения всегда проводится при помощи теста.<br />
Аналитическая<br />
Метод должен позволять выделить жизнеспособные клетки бактерии-мишени из материала образца<br />
чувствительность<br />
для обеспечения чувствительного выявления. Проведите выделение из не менее трех образцов с<br />
высоким, средним и низким уровнями заражѐнности.<br />
Образцы могут состоять из материала с явными признаками заражения (диагностика), или они могут<br />
быть подготовлены путѐм добавления заражѐнного материала с известной концентрацией клеток<br />
бактерии-мишени к материалу образца (выявление латентного заражения или засорения)<br />
Аналитическая<br />
Данный параметр не является важным. Выделение организма-мишени из образца является<br />
специфичность<br />
неспецифичным по определению.<br />
Селективность Данный параметр не является важным. Выделение организма-мишени из образца по определению не<br />
является специфичным.<br />
Повторяемость Проведите выделение из 8-и репликатных образцов. Для выявления латентного заражения,<br />
повторяемость должна быть подтверждена около порога аналитической чувствительности.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и,<br />
в соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Молекулярные методы, например, гибридизация, ПЦР и ПЦР в реальном времени<br />
Примечание: этот этап также включает в себя методы выделения ДНК из материала образцов.<br />
Аналитическая<br />
Проведите анализ не менее 3-х серий экстрактов заражѐнных образцов в пределах от 10 до 10<br />
чувствительность<br />
6 клеток<br />
организма-мишени на миллилитр. Предпочтительно проводить данную процедуру путѐм<br />
десятикратного разбавления суспензий клеток бактерии-мишени в экстрактах образцов. Определите<br />
наименьшую концентрацию клеток, обеспечивающую положительный результат теста.<br />
Если после трех серий не получены стойкие результаты, следует подготовить дополнительные серии и<br />
провести их анализ. Аналитическая чувствительность связана со специфическим рядом параметров<br />
теста, которые необходимо точно определить и стандартизировать, например, с торговой маркой<br />
20
Аналитическая<br />
специфичность<br />
реагентов для ПЦР (в частности, ДНК-полимеразы), а также с условиями проведения цикла ПЦР.<br />
Проведите анализ (во-первых) штаммов бактерии-мишени, распространяющийся на генетическое<br />
разнообразие, разное географическое происхождение и растения-хозяева и (во-вторых) ряда бактерий,<br />
не являющихся мишенями, в особенности тех бактерий, которые встречаются в образцах. Используйте<br />
суспензии клеток чистых культур в соотношении, примерно, 10 6 клеток на миллилитр.<br />
Кроме того, результаты теста могут быть подтверждены компьютерным (in silico) сравнением<br />
последовательностей зонда и праймера с последовательностями в геномных библиотеках.<br />
Селективность Определите относительную нечувствительность теста к вариациям материала образца, например,<br />
используя различные сорта растения-хозяина.<br />
Повторяемость Проведите анализ 8-и репликатов экстрактов заражѐнных образцов со средним и низким уровнями<br />
заражѐнности. Для выявления латентной инфекции, повторяемость должна быть подтверждена около<br />
порога аналитической чувствительности.<br />
Эта оценка позволяет получить данные об уровне недостоверности результата теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Серологические методы: IF и ELISA<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Проведите анализ не менее 3-х серий экстрактов заражѐнных образцов в пределах от 100 до 10 6 клеток<br />
организма-мишени на миллилитр. Предпочтительно проводить данную процедуру путѐм<br />
десятикратного разбавления суспензии клеток бактерии-мишени в экстрактах образцов. Определите<br />
наименьшую концентрацию клеток, обеспечивающую положительный результат теста при рабочем<br />
значении разбавления антисыворотки или антител.<br />
Если после трех серий не получены стойкие результаты, следует подготовить дополнительные серии и<br />
провести их анализ. Аналитическая чувствительность связана со специфическим рядом параметров<br />
теста, которые необходимо точно определить и стандартизировать, например, с количеством<br />
микроскопических полей для чтения в IF-анализе, а также с порогом оптической плотности в анализе<br />
ELISA.<br />
Проведите анализ специфичности антител (во-первых) на штаммах бактерии-мишени,<br />
распространяющийся на генетическое разнообразие, разное географическое происхождение и<br />
растения-хозяева и (во-вторых) на ряде бактерий, не являющихся мишенями, в особенности тех<br />
бактерий, которые встречаются в материале образцов. Используйте суспензию чистых культур клеток<br />
в концентрации примерно 10 6 клеток на миллилитр, а также разбавленные в рабочей концентрации<br />
антитела или антисыворотку.<br />
Селективность Определите относительную нечувствительность теста к вариациям материала образца, например,<br />
используя различные сорта растения-хозяина.<br />
Повторяемость Проведите анализ 8-и репликатов экстрактов заражѐнных образцов со средним и низким уровнями<br />
заражѐнности. Для выявления латентного заражения, повторяемость должна быть подтверждена около<br />
21
порога аналитической чувствительности.<br />
Эта оценка позволяет получить данные об уровне недостоверности результатов теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Методы посева на питательную среду: выделение на селективной среде<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Проведите анализ не менее 3-х серий экстрактов искусственно зараженных образцов в пределах от 10<br />
до 10 6 клеток организма-мишени на миллилитр.<br />
Предпочтительно проводить данную процедуру путѐм десятикратного разбавления суспензии клеток<br />
бактерии-мишени в экстрактах образцов. Определите наименьшую концентрацию клеток,<br />
обеспечивающую положительный результат.<br />
Если после трех серий не получены стойкие результаты, следует подготовить дополнительные серии и<br />
провести их анализ.<br />
Аналитическая чувствительность связана с рядом специфических параметров теста, которые<br />
необходимо точно определить и стандартизировать, например, с торговой маркой ингредиентов для<br />
приготовления среды (в особенности антибиотиков и препаратов исходных растворов), а также с<br />
условиями инкубации.<br />
Определите специфичность питательной среды (во-первых) на штаммах бактерии-мишени, с учѐтом<br />
генетического разнообразия, разного географического происхождения и разных растений-хозяев и (вовторых)<br />
на ряде бактерий, не являющихся мишенями, в особенности на тех бактериях, которые<br />
встречаются в материале образцов. Используйте суспензию клеток в концентрации примерно 10 6<br />
клеток на миллилитр и проведите анализ путѐм разбавления посева раствора.<br />
Селективность Определите относительную нечувствительность теста к вариациям материала образца, например,<br />
используя различные сорта растения-хозяина.<br />
Повторяемость Проведите анализ 8-и репликатов экстрактов заражѐнных образцов со средним и низким уровнями<br />
заражѐнности.<br />
Для выявления латентного заражения, повторяемость должна быть подтверждена около пределов<br />
аналитической чувствительности.<br />
Эта оценка позволяет получить данные об уровне недостоверности результатов теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Методы биоопытов: селективное обогащение в растениях-хозяевах<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Проведите анализ не менее 3-х серий экстрактов заражѐнных образцов в пределах от 100 до 10 6 клеток<br />
организма-мишени на миллилитр. Предпочтительно проводить данную процедуру путѐм<br />
десятикратного разбавления суспензии клеток бактерии-мишени в экстрактах образцов. Определите<br />
22
Аналитическая<br />
специфичность<br />
наименьшую концентрацию клеток, обеспечивающую положительный результат. Это требует<br />
выделения из тестируемых растений с симптомами инфекции и без.<br />
Если после трех серий не получены стойкие результаты, следует подготовить дополнительные серии и<br />
провести их анализ. Аналитическая чувствительность связана со специфическим рядом параметров<br />
анализа, которые необходимо точно определить и стандартизировать, например, со стадией развития<br />
подопытных растений, методом инокуляции и условиями инкубации.<br />
Определите специфичность биотеста (во-первых) на штаммах бактерии-мишени, с учѐтом<br />
генетического разнообразия, разного географического происхождения и растений-хозяев и (во-вторых)<br />
на ряде бактерий, не являющихся мишенями, в особенности на тех бактериях, которые встречаются в<br />
материале образцов. Используйте суспензию клеток в концентрации около 10 6 клеток на миллилитр.<br />
Селективность Определите относительную нечувствительность анализа к вариациям материала образцов, например,<br />
используя различные сорта растения-хозяина, включая наиболее восприимчивые сорта.<br />
Повторяемость Проведите анализ 8-и репликатов экстрактов заражѐнного образца со средним и низким уровнями<br />
заражѐнности. Для выявления латентного заражения повторяемость должна быть подтверждена около<br />
пределов аналитической чувствительности.<br />
Эта оценка позволяет получить данные об уровне недостоверности результатов теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Тест на патогенность<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Данный параметр не является существенным при проведении теста на патогенность, который обычно<br />
проводится с суспензиями, содержащими около 10 6 клеток на миллилитр. Тем не менее, аналитическая<br />
чувствительность может рассматриваться при инокуляции на различных стадиях роста растения-<br />
хозяина.<br />
Определите специфичность теста на патогенность на ряде штаммов бактерии-мишени, с учѐтом<br />
генетического разнообразия, разного географического происхождения и растений-хозяев, а также на<br />
ряде бактерий, не являющихся мишенями, в особенности на тех бактериях, которые встречаются в<br />
материале образцов. Используйте суспензии клеток в концентрации около 10 6 клеток на миллилитр.<br />
Положительный результат предполагает проявление симптомов и повторное выделение бактериимишени<br />
(постулаты Коха).<br />
Селективность Определите относительную нечувствительность анализа к вариациям материала образцов, например,<br />
используя различные сорта растения-хозяина.<br />
Повторяемость Проведите анализ 3-х репликатов ряда штаммов бактерии-мишени, учитывая вариабельность<br />
идентификационных тестов и вирулентность. Используйте суспензию клеток в соотношении примерно<br />
10 6 клеток/мл −1 .<br />
Положительный результат предполагает проявление симптомов и повторное выделение бактерии-<br />
23
мишени (постулаты Коха).<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Методы генетической экспертизы: анализ профиля белков, жирных кислот и ДНК<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Определите минимально необходимое количество бактерий, отобранных из селективной среды, для<br />
проведения надѐжного анализа.<br />
Параметры теста должны быть точно определены и стандартизированы, например, параметры<br />
питательной среды и стадии выращивания культуры для сбора клеток.<br />
Определите специфичность методов генетической экспертизы (во-первых) на штаммах бактериимишени,<br />
с учѐтом генетического разнообразия, разного географического происхождения и разных<br />
растений-хозяев и (во-вторых) на ряде бактерий, не являющихся мишенями, в особенности на тех<br />
бактериях, которые встречаются в материале образцов.<br />
Предоставьте маркѐры для дифференциации на уровне подвида или патотипа.<br />
Селективность Не применяется.<br />
Повторяемость Проведите анализ 3-х репликатов экстракта белка, жирной кислоты или ДНК.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
24
Таблица 5. Ботаника<br />
Данные, приведѐнные в таблицах, основаны на опыте по валидации, полученном специалистами групп<br />
экспертов ЕОКЗР, занимающихся вопросами диагностики. Может возникнуть необходимость в отклонении от<br />
данного руководства в зависимости от сочетаний вредных организмов и растений. В таких случаях следует<br />
документально фиксировать причины этих отклонений.<br />
Метод выделения организма-мишени из природного субстрата<br />
Примечание: валидация метода выделения всегда проводится при помощи теста.<br />
Аналитическая Определите количество семян сорняков, полученных с использованием этого метода выделения.<br />
чувствительность<br />
Аналитическая Не применяется<br />
специфичность<br />
Селективность Не применяется<br />
Повторяемость Используйте не менее 8-и образцов из партий семян или зерна, или других растительных продуктов для<br />
выделения тех же организмов-мишеней.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Морфологические и морфометрические методы, предназначенные для идентификации<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Определите минимальное количество организма-мишени (семян или растений), необходимое для проведения<br />
надежного анализа. Наименьшее количество организма-мишени зависит от состояния образца (от хорошего до<br />
очень плохого), стадии развития, известной межвидовой изменчивости, сложности интерпретации<br />
характеристик и т.д.<br />
Проведите скрининг по отношению к схожим организмам, являющимся и не являющимся мишенями.<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Селективность Не применяется.<br />
Повторяемость Проведите не менее 8-и идентификаций одного и того же организма-мишени (семян или растений) в качестве<br />
контрольного опыта в пределах ряда морфологически схожих организмов, являющихся и не являющихся<br />
мишенями. Контрольный опыт может быть проведѐн следующим образом: один и тот же организм-мишень<br />
помещается среди нескольких организмов, не являющихся мишенями. Этот процесс повторяется 8 раз.<br />
Организмы, не являющиеся мишенями, в разных повторностях могут быть разными.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
25
Таблица 6. Энтомология<br />
Данные, приведѐнные в таблицах, основаны на опыте по валидации, полученном специалистами групп<br />
экспертов ЕОКЗР, занимающихся вопросами диагностики. Может возникнуть необходимость в отклонении от<br />
данного руководства в зависимости от сочетаний вредных организмов и растений. В таких случаях следует<br />
документально фиксировать причины этих отклонений.<br />
Метод выделения организма-мишени из природного субстрата<br />
Примечание: валидация метода выделения всегда проводится при помощи теста.<br />
Аналитическая<br />
Выделение насекомых: если возможно, определите процент насекомых, полученных с использованием<br />
чувствительность<br />
этого метода выделения. Выделение ДНК: эта валидация включена в валидацию молекулярных<br />
методов.<br />
Аналитическая<br />
Не применяется<br />
специфичность<br />
Селективность Не применяется<br />
Повторяемость Не применяется<br />
Воспроизводимость Не применяется.<br />
Морфологические и морфометрические методы, предназначенные для идентификации<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Если возможно, установите минимальное количество особей или признаков для проведения надѐжного<br />
анализа, как минимум, с 3-я повторами. Наименьшее количество особей-мишеней зависит от<br />
состояния образца (от хорошего до очень плохого), стадии развития, известной межвидовой<br />
изменчивости, сложности интерпретации характерных признаков и т.д.<br />
Аналитическая<br />
Если возможно, проведите скрининг по отношению к морфологически схожим организмам,<br />
специфичность<br />
являющимся и не являющимся мишенями.<br />
Селективность Не применяется.<br />
Повторяемость Проведите не менее 8-и идентификаций одного и того же препарата-мишени в качестве контрольного<br />
опыта в пределах морфологически схожих организмов, не являющихся мишенями. Контрольный опыт<br />
может быть проведен следующим образом: один и тот же образец-мишень помещается среди<br />
нескольких организмов, не являющихся мишенями. Этот процесс повторяется 8 раз. Используемые<br />
образцы, не являющиеся мишенями, в разных повторностях могут быть разными.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Молекулярные методы, например, гибридизация, ПЦР<br />
Примечание: этот этап также включает в себя методы выделения ДНК из материала образца.<br />
Аналитическая<br />
Подготовьте необходимое количество особей. Это количество зависит от рода, вида и стадии развития.<br />
чувствительность<br />
Определите минимальное количество особей или частей особей, необходимых для их выявления.<br />
26
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Проведите не менее 3-х экспериментов. Если после трех серий не получены стойкие результаты,<br />
следует подготовить дополнительные серии и провести их анализ.<br />
Аналитическая чувствительность связана с рядом специфических параметров теста, которые<br />
необходимо точно определить и стандартизировать, например, с торговой маркой реагентов для ПЦР<br />
(в частности, ДНК-полимераза) и с условиями проведения цикла ПЦР.<br />
Проведите, как минимум, один скрининг по отношению к ряду организмов-мишеней, с учѐтом<br />
генетического разнообразия, разного географического происхождения и разных растений-хозяев, и по<br />
отношению к релевантным организмам, не являющимся мишенями, особенно к тем, которые могут<br />
быть обнаружены в материале образцов.<br />
Кроме того, результаты теста могут быть подтверждены компьютерным (in silico) сравнением<br />
последовательностей зондов и праймеров с последовательностями в геномных библиотеках.<br />
Селективность Определите относительную нечувствительность теста к вариациям материала образца, например,<br />
используя различные сорта растения-хозяина.<br />
Повторяемость Проведите анализ одного образца для каждого из 2-х уровней модальности (на границе порога<br />
выявления организма-мишени и выше), с использованием не менее 8-и репликатов экстракта образца.<br />
Этот анализ позволяет получить данные об уровне недостоверности результатов теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
27
Таблица 7. Микология<br />
Данные, приведѐнные в таблицах, основаны на опыте по валидации, полученном специалистами групп<br />
экспертов ЕОКЗР, занимающихся вопросами диагностики. Может возникнуть необходимость в отклонении от<br />
данного руководства в зависимости от сочетаний вредных организмов и растений. В таких случаях следует<br />
документально фиксировать причины этих отклонений.<br />
Метод выделения/изоляции организма-мишени из природного субстрата/методы приманок<br />
Примечание: валидация метода выделения всегда проводится при помощи теста.<br />
Аналитическая<br />
Метод должен позволять выделить и изолировать достаточное количество организма-мишени для<br />
чувствительность<br />
дальнейшего выращивания в культуре и проведения анализа. Во всех возможных случаях определите<br />
путѐм смешивания здоровой и заражѐнной тканей минимальное количество заражѐнной ткани или<br />
организмов (или их частей), необходимых либо для посева на питательную среду перед<br />
идентификацией, либо для непосредственной идентификации с тем, чтобы провести надѐжный анализ.<br />
Выделите или изолируйте организм-мишень из не менее, чем 3-х образцов (образцов, заражѐнных<br />
естественным или искусственным образом).<br />
Данная процедура может включать в себя промывание и использование мембран для улавливания<br />
спор.<br />
Аналитическая<br />
Данный параметр не является важным. Выделение организма-мишени из образца является<br />
специфичность<br />
неспецифичным по определению.<br />
Селективность Данный параметр не является важным. Выделение организма-мишени из образца является<br />
неселективным по определению.<br />
Повторяемость Используйте один образец с низкой концентрацией организма-мишени и подготовьте 8 подвыборок<br />
(экстрактов). Оцените эффективность метода выделения при помощи соответствующего теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Морфологические и морфометрические методы для идентификации:<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Определите минимальное количество характеристик, необходимое для проведения надѐжной<br />
идентификации, причем минимальное количество повторностей, по возможности, должно составлять<br />
3. Наименьшее количество характеристик зависит от состояния образца (от хорошего до очень<br />
плохого), стадии развития, известной межвидовой изменчивости, сложности интерпретации<br />
характеристик и т.п.<br />
Аналитическая<br />
Проведите скрининг по отношению к ряду морфологически схожих организмов, являющихся и не<br />
специфичность<br />
являющихся мишенями.<br />
Селективность Не применяется.<br />
Повторяемость Не менее 8-и идентификаций одного и того же организма-мишени в качестве контрольного опыта в<br />
28
пределах ряда морфологически схожих организмов, являющихся и не являющихся мишенями.<br />
Контрольный опыт может быть проведен следующим образом: один и тот же организм-мишень<br />
помещается среди нескольких организмов, не являющихся мишенями. Этот процесс повторяется 8 раз.<br />
Организмы, не являющиеся мишенями, в разных повторностях могут быть разными.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Молекулярные методы, например, гибридизация и ПЦР<br />
Примечание: этот этап также включает в себя методы выделения ДНК из материала образцов.<br />
Аналитическая<br />
Определите минимальное количество организма-мишени (например, количество конидий или<br />
чувствительность<br />
пропорцию заражѐнного материла в здоровом материале), из которого можно получить поддающееся<br />
выявлению количество ДНК организма-мишени. Проведите не менее 3-х экспериментов при помощи<br />
8-и последовательных разбавлений, предпочтительно в ДНК растения-хозяина. Если после трѐх серий<br />
не получены стойкие результаты, следует подготовить дополнительные серии и провести их анализ.<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Аналитическая чувствительность связана с рядом специфических параметров теста, которые<br />
необходимо точно определить и стандартизировать, например, с торговой маркой реагентов ПЦР (в<br />
особенности, ДНК-полимеразы) и условиями проведения цикла ПЦР.<br />
Проведите, как минимум, один скрининг по отношению к ряду организмов-мишеней и значимых<br />
организмов, не являющихся мишенями (например, филогенетически близких грибов), которые могут<br />
присутствовать в образце и экстракте образца.<br />
Кроме того, результаты анализа могут быть подтверждены компьютерным (in silico) сравнением<br />
последовательностей зондов или праймеров с последовательностями в геномных библиотеках.<br />
Селективность Определите относительную нечувствительность анализа к вариациям образцов, например, с<br />
использованием различных сортов растений-хозяев.<br />
Повторяемость Проведите 3 эксперимента выше порога выявления и около порога выявления, как минимум, с 8-ю<br />
репликатами. Эта процедура может показать уровень недостоверности измерений.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Серологические методы: ELISA<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Определите порог выявления, например, количество конидий или массу заражѐнного материла в<br />
здоровом материале, путѐм проведения не менее 3-х экспериментов. Определите пороговый уровень,<br />
при котором достигается постоянная правильная диагностика (как правило, это в 2-3 раза превышает<br />
уровень отрицательного контроля). Если после трѐх экспериментов не получены стойкие результаты,<br />
следует провести дополнительные серии экспериментов.<br />
Проведите скрининг один раз по отношению к ряду родственных организмов-мишеней и к ряду<br />
неродственных организмов, не являющихся мишенями (например, филогенетически близких грибов),<br />
которые могут присутствовать в образце и экстракте образца.<br />
29
Селективность Определите относительную нечувствительность теста к вариациям образца, например, с<br />
использованием различных сортов растений-хозяев.<br />
Повторяемость Проведите 3 эксперимента выше порога выявления и около порога выявления, как минимум, с 8-ю<br />
репликатами в тот же день, тем же оператором и на той же среде. Данная проверка позволяет получить<br />
данные об уровне недостоверности результатов теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Методы биоопытов: метод приманок<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Определите необходимое количество природного субстрата или экстракта субстрата (например,<br />
граммов листьев или почвы) для получения симптомов. Проведите 3 эксперимента с 8 сериями<br />
разбавлений с 10-ю растениями.<br />
Если после трѐх циклов не получены стойкие результаты, следует подготовить дополнительные серии<br />
и провести их анализ.<br />
Аналитическая чувствительность связана с рядом специфических параметров теста, которые<br />
необходимо точно определить и стандартизировать, например, со стадией развития подопытного<br />
растения, с методом инокуляции и условиями инкубации.<br />
Определите специфичность биотеста (во-первых) на штаммах гриба-мишени, с учѐтом генетического<br />
разнообразия, разного географического происхождения, (во-вторых) на ряде грибов, не являющихся<br />
мишенями, в частности, на грибах, связанных с материалом образцов.<br />
Селективность Определите относительную нечувствительность теста к вариациям материала образца, например, с<br />
использованием различных сортов растений-хозяев.<br />
Повторяемость Проведите 3 эксперимента не менее, чем с 8-ю репликатами при минимальном и превышающем<br />
минимум количестве инокулята для получения симптомов.<br />
Для выявления латентного заражения, повторяемость должна быть подтверждена около предела<br />
аналитической чувствительности.<br />
Данная проверка позволяет получить данные об уровне недостоверности результатов теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
30
Таблица 8. Нематология<br />
Данные, приведѐнные в таблицах, основаны на опыте по валидации, полученном специалистами групп<br />
экспертов ЕОКЗР, занимающихся вопросами диагностики. Может возникнуть необходимость в отклонении от<br />
данного руководства в зависимости от сочетаний вредных организмов и растений. В таких случаях следует<br />
документально фиксировать причины этих отклонений.<br />
Метод выделения организма-мишени из природного субстрата<br />
Примечание: метод выделения всегда проходит валидацию при помощи теста.<br />
Аналитическая<br />
Определите процент нематод, полученных путем выделения, с использованием не менее 3-х образцов.<br />
чувствительность<br />
Аналитическая<br />
Не применяется.<br />
специфичность<br />
Селективность Оцените селективность теста по отношению к разным природным субстаратам (например, для<br />
цистовыделителей – к типу почв)<br />
Повторяемость Используйте один образец организма-мишени и сделайте 8 подвыборок (экстрактов). С помощью<br />
соответствующего метода анализа оцените, колеблется ли процент выделений в этих подвыборках в<br />
одинаковых пределах.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Морфологические и морфометрические методы, предназначенные для идентификации<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Определите минимальное количество особей для проведения надежной идентификации не менее чем в<br />
трѐх повторностях при возможности. Минимальное количество особей-мишеней зависит от состояния<br />
образца (от хорошего до очень плохого), стадии развития, известного межвидового разнообразия,<br />
сложности по интерпретации характерных признаков и т.п.<br />
Аналитическая<br />
Проведите скрининг по отношению к ряду морфологически сходных организмов, являющихся и не<br />
специфичность<br />
являющихся мишенями.<br />
Селективность Не применяется.<br />
Повторяемость Проведите не менее 8-и идентификаций как «тест вслепую» одного и того же микроскопического<br />
препарата в ряде морфологически схожих организмов, являющихся и не являющихся мишенями. Тест<br />
вслепую должен проводиться следующим образом: один и тот же препарат с организмом-мишенью<br />
представлен среди нескольких препаратов организмов, не являющихся мишенями. Тест вслепую<br />
повторяется 8 раз, а организмы, не являющиеся мишенями могут быть разными в разных<br />
повторностях.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
31
Молекулярные методы, например, гибридизация и ПЦР<br />
Примечание: этот этап включает в себя методы выделения ДНК из материала образцов.<br />
Аналитическая<br />
Подготовьте необходимое количество особей. Это количество зависит от рода, вида и стадии развития.<br />
чувствительность<br />
Определите минимальное количество особей или частей особей для выявления или идентификации.<br />
Проведите не менее 3-х опытов. Если после 3-х серий опытов не получены согласующиеся результаты,<br />
то необходимо подготовить дополнительные серии и провести тестирование. Аналитическая<br />
чувствительность связана со специфической группой параметров теста, которые должны быть чѐтко<br />
определены и стандартизированы, например, с торговой маркой реагентов для ПЦР (в особенности,<br />
полимеразы ДНК) и с условиями циклов ПЦР.<br />
Аналитическая<br />
Проведите скрининг, как минимум, один раз по отношению к ряду организмов-мишеней, с учѐтом<br />
специфичность<br />
генетического разнообразия, разного географического происхождения и разных растений-хозяев, а<br />
также подходящих организмов, не являющихся мишенями, в особенности тех, которые могут быть<br />
связаны с материалом образцов.<br />
Кроме того, результаты анализа могут быть подтверждены компьютерным (in silic) сравнением<br />
последовательностей зондов и праймеров с последовательностями в геномных библиотеках.<br />
Селективность Не является существенным для идентификации нематод, поскольку их заранее выделяют из субстрата.<br />
Если применяется ПЦР-тест в качестве теста на выявление, необходимо определить интенсивность<br />
теста в зависимости от природного субстрата (например, почвы или растения).<br />
Повторяемость Проведите анализ одного образца на каждом их двух уровней модальности (около порога выявления<br />
вредного организма и выше) как минимум с 8-ю репликатами экстракта образца.<br />
Этот анализ предоставит информацию об уровне недостоверности результата теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Биохимические методы: например, энзимный электрофорез, анализ протеинового профиля,<br />
Примечание: этот этап также включает в себя подготовку препарата образца.<br />
Аналитическая<br />
Определите минимальное количество особей для выявления, чтобы провести надѐжный анализ по<br />
чувствительность<br />
возможности с не менее чем тремя образцами. Минимальное количество особей-мишеней зависит от<br />
состояния образца (от хорошего до очень плохого), стадии развития, известного межвидового<br />
разнообразия, сложности интерпретации характерных признаков и т.п.<br />
Параметры теста должны быть чѐтко определены и стандартизированы.<br />
Аналитическая<br />
Проведите скрининг по отношению к ряду организмов-мишеней и организмов рода и/или вида, не<br />
специфичность<br />
являющихся мишенями.<br />
Селективность Не применяется.<br />
Повторяемость Проведите анализ 1 образца для каждого из двух уровней численности: выше минимального<br />
количества особей или соответствующего ему. Сделайте не менее 8-и репликатов из одного и того же<br />
экстракта образца.<br />
32
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Биотесты: включая методы приманок и тесты на патогенность<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Определите минимальное количество особей для получения симптомов или для размножения в<br />
растительном материале как минимум с 3-я повторностями по возможности.<br />
Аналитическая чувствительность связана с рядом специфических параметров теста, которые<br />
необходимо точно определить и стандартизировать, например, со стадией развития подопытного<br />
растения и с методом инокуляции.<br />
Аналитическая<br />
Проведите скрининг по отношению к ряду организмов-мишеней.<br />
специфичность<br />
Селективность Определите относительную нечувствительность теста к вариациям материала образцов, например, с<br />
использованием различных сортов растений-хозяев.<br />
Повторяемость Используйте не менее 3-х репликатов с минимальным количеством особей для получения симптомов.<br />
Эта проверка позволяет получить данные об уровне недостоверности результатов теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
33
Таблица 9. Вирусология<br />
Эта таблица распространяется на вирусы, вироиды и фитоплазмы.<br />
Данные, приведѐнные в таблицах, основаны на опыте по валидации, полученном специалистами групп<br />
экспертов ЕОКЗР, занимающихся вопросами диагностики. Может возникнуть необходимость в отклонении от<br />
данного руководства в зависимости от сочетаний вредных организмов и растений. В таких случаях следует<br />
документально фиксировать причины этих отклонений.<br />
Метод выделения организма-мишени из природного субстрата (геномного материала или организма)<br />
Примечание: метод выделения всегда проходит валидацию при помощи теста.<br />
Аналитическая<br />
Метод должен быть способен выделить достаточное количество организма-мишени или его ДНК, РНК<br />
чувствительность<br />
или белка из соответствующего опытного образца. Выделите организм-мишень не менее чем из 3-х<br />
образцов.<br />
Аналитическая<br />
Данный параметр не является важным. Выделение организма-мишени из образца является<br />
специфичность<br />
неспецифичным по определению.<br />
Селективность Селективность теста определяется так же, как описано для чувствительности, на различных сортах<br />
растений-хозяев.<br />
Повторяемость Используйте один образец с низкой концентрацией организма-мишени и подготовьте 8 подвыборок<br />
(экстрактов). Оцените эффективность выделения при помощи соответствующего теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Молекулярные методы, например, гибридизация, ПЦР и ПЦР в реальном времени.<br />
Примечание: этот этап включает в себя методы выделения ДНК или РНК из материала образца.<br />
Аналитическая<br />
Так как концентрация вирусов, вироидов и фитоплазм никогда не является известной, определите<br />
чувствительность<br />
максимальное разбавление выявленной ДНК или РНК. Определѐнная чувствительность является<br />
относительной чувствительностью, а не абсолютной.<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Проведите не менее 3-х экспериментов при помощи 8-и серий разбавлений. Если после трѐх серий не<br />
получены стойкие результаты, следует подготовить дополнительные серии и провести их анализ.<br />
Аналитическая чувствительность связана с рядом специфических параметров теста, которые<br />
необходимо точно определить и стандартизировать, например, с торговой маркой реагентов ПЦР (в<br />
особенности, ДНК-полимеразы) и с условиями проведения цикла ПЦР.<br />
Проведите скрининг по отношению к ряду организмов, являющихся и не являющихся мишенями,<br />
которые могут присутствовать в образце.<br />
Кроме того, результаты анализа могут быть подтверждены компьютерным (in silico) сравнением<br />
последовательностей зондов и праймеров с последовательностями в геномных библиотеках.<br />
34
Селективность Необходимо учитывать возможные воздействия на аналитическую чувствительность. Определите<br />
влияние природного субстрата путѐм добавления положительного образца в живицу различных сортов<br />
культуры.<br />
Повторяемость Используйте не менее одного образца для каждой из 2-х модальностей (с учѐтом результатов по<br />
аналитической чувствительности) с низким и средним уровнями численности организма-мишени, с<br />
минимумом в две подвыборки от каждой модальности, с не менее чем тремя, но предпочтительно, с<br />
восьмью репликатами в каждой подвыборке.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Серологические методы: ELISA и прямой иммунологический блот-анализ ткани.<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Так как концентрация вирусов никогда не является известной, то используйте один здоровый образец<br />
(того же природного субстрата, который должен пройти валидацию), подготовьте не менее 8-и<br />
подвыборок для определения стандартного отклонения оптической плотности (ОП) для определения<br />
фоновой реакции.<br />
Проведите не менее 3-х экспериментов с 8-ю сериями разбавлений положительного образца в<br />
здоровом материале. В каждом эксперименте проведите две повторности для каждого<br />
последовательного разбавления.<br />
Определите максимальное разбавление экстрактов образца, при котором организм-мишень может быть<br />
выявлен. Если после трѐх серий не получены стойкие результаты, следует подготовить<br />
дополнительные серии и провести их анализ.<br />
Чувствительность, установленная при этом, является относительной, а не абсолютной.<br />
Аналитическая чувствительность связана с рядом специфических параметров теста, которые<br />
необходимо точно определить и стандартизировать, например, с порогом оптической плотности (ОП) в<br />
тесте ELISA.<br />
Аналитическая<br />
Проведите скрининг антител по отношению к ряду родственных организмов-мишеней и значимых<br />
специфичность<br />
организмов, не являющихся мишенями, которые могут присутствовать в образце.<br />
Селективность Следует учитывать возможные воздействия на аналитическую чувствительность. Определите<br />
воздействие природного субстрата путѐм добавления положительного образца в живицу различных<br />
сортов культуры.<br />
Используйте не менее 2-х подвыборок для каждого организма-мишени.<br />
Повторяемость Используйте не менее 3-х образцов при низком уровне численности организма-мишени (с учѐтом<br />
результатов по аналитической чувствительности), с двумя подвыборками от каждого образца, а также с<br />
8-ю различными чашками (тестами) в каждой подвыборке.<br />
Этот анализ позволяет получить данные об уровне недостоверности результатов теста.<br />
35
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Методы биоопытов: анализ растений (главным образом используется в качестве анализа на подтверждение присутствия<br />
вирусов и вироидов, но не фитоплазм) заражѐнных непосредственно и путѐм прививки.<br />
Аналитическая<br />
Определите максимальное разбавление инокулята в буфере для получения симптомов или<br />
чувствительность<br />
размножения в растении. Это всего лишь приблизительный расчѐт разбавлений, которые могут быть<br />
использованы. Используйте 1 репрезентативный образец и 3 подвыборки для каждого разбавления.<br />
Чувствительность, установленная при этом, является относительной, а не абсолютной.<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Аналитическая чувствительность связана с рядом специфических параметров теста, которые<br />
необходимо точно определить и стандартизировать, например, со стадией развития подопытных<br />
растений, с методом инокуляции и условиями инкубации. Она не существенна для прививок.<br />
Определите специфичность теста (во-первых) на штаммах организма-мишени, с учѐтом генетического<br />
разнообразия, разного географического происхождения и разных растений-хозяев, и (во-вторых) на<br />
ряде организмов, не являющихся мишенями, в частности, на тех, которые встречаются в материале<br />
образцов.<br />
Селективность Определите относительную нечувствительность теста к вариациям материала образца, например, с<br />
использованием различных сортов растений-хозяев.<br />
Повторяемость Используйте один репрезентативный образец (с восьмью растениями для каждого хозяина)<br />
соответствующего разбавления, определѐнного в анализе на чувствительность, и используйте<br />
растения-хозяева, определѐнные в анализе на специфичность.<br />
Этот анализ позволяет получить данные об уровне недостоверности результатов теста.<br />
Воспроизводимость Так же, как и для повторяемости, но, по возможности, с другим(ми) оператором(ами), в другие дни и, в<br />
соответствующих случаях, с другим оборудованием.<br />
Биохимические методы: например, электрофорез и R-PAGE.<br />
Аналитическая<br />
чувствительность<br />
Аналитическая<br />
специфичность<br />
Определите максимальное разбавление особей-мишеней, нуклеиновой кислоты или белка для<br />
проведения надѐжного анализа. Чувствительность, установленная при этом, является относительной, а<br />
не абсолютной. Отметьте положительные и отрицательные реакции.<br />
Параметры теста должны быть чѐтко определены и стандартизированы.<br />
Сравните со значимыми организмами, белками или засоряющими веществами и покажите, что можно<br />
проводить дифференциацию. Также исследуйте межвидовую изменчивость. Определите, какие<br />
характеристики следует идентифицировать.<br />
Селективность Не применяется.<br />
Повторяемость Сделайте анализ не менее 8-и репликатов одного и того же экстракта образца с низкими уровнями<br />
численности организма-мишени. Эти уровни следует определять как пропорциональные<br />
аналитической чувствительности.<br />
36
Воспроизводимость Определяют, как и для повторяемости, но соответствующие условия, например, оператор, время<br />
проведения, задержка проведения и условия хранения после приготовления образца, варьируют для<br />
оценки гибкости теста. Для этого требуется не менее 8-и репликатов. Также можно варьировать<br />
реагенты и оборудование.<br />
Эти условия требуют не менее 3-х репликатов со сравнимыми результатами.<br />
37