Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
Farm Przegl Nauk, 2009,2 czy CYP2B1/2. Obecnie w leczeniu zatruć GE stosuje się specyficzne odtrutki, jak etanol czy 4-metylopirazol [1]. W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych porównawczych dotyczących oceny skuteczności i ryzyka stosowania obu tych terapii. Ponadto często zatruciu glikolem etylenowym towarzyszy spożycie alkoholu etylowego. W takich przypadkach zastosowanie 4-metylopirazolu może doprowadzić do wystąpienia interakcji pomiędzy ksenobiotykami. Wykazano bowiem, że równoczesne podanie etanolu i 4-metylopirazolu zdrowym ochotnikom powoduje o około 40% obniżenie szybkości eliminacji etanolu i 50% obniżenie wydalania 4-metylopirazolu utrzymujące się do 8 godzin od podania ksenobiotyków [2, 3]. Te wzajemne modyfikacje mogą mieć kliniczne implikacje u wielu pacjentów, którzy równocześnie spożyli etanol i glikol etylenowy. W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych czy podobne interakcje mogą zachodzić również po łącznym podaniu glikolu etylenowego, etanolu i 4-metylopirazolu. Badania ostatnich lat wykazały, że glikol etylenowy może być również utleniony do formaldehydu z uwolnieniem nadtlenku wodoru. Istotny udział w tej reakcji odgrywa cytochrom P450, a zwłaszcza jego izoforma CYP2E1 oraz izoenzymy indukowane fenobarbitalem i 3-metylocholantrenem. Utlenianie glikolu etylenowego do formaldehydu za pośrednictwem cytochromu P450 prowadzi do wytworzenia nadtlenku wodoru. Powstające w obecności Fe(II) rodniki ponadtlenkowe odpowiedzialne są za wywoływanie stresu oksydacyjnego związanego z naruszeniem równowagi pomiędzy procesami generacji aktywnych form tlenu i procesami antyoksydacyjnymi. W latach 70-tych w doświadczalnym zatruciu glikolem etylenowym u zwierząt wykazano skuteczność 4-metylopirazolu. W 1998 roku 4-metylopirazol został dopuszczony w USA do stosowania klinicznego jako specyficzna odtrutka w leczeniu zatruć glikolem etylenowym u osób powyżej 12. roku życia [4]. 4-Metylopirazol skuteczniej niż etanol ogranicza przemiany glikolu etylenowego zachodzące za pośrednictwem dehydrogenazy alkoholowej, zarówno u zwierząt jak i u ludzi [5, 6]. Ponadto jego działanie inhibicyjne utrzymuje się znacznie dłużej stąd też 4-metylopirazol zalecany jest w przypadkach ostrych i ciężkich zatruć [6, 7]. Glikol etylenowy jest inhibitorem cytochromu P450. W biotransformacji glikolu bierze udział wiele izoenzymów cytochromu P450. Izoformy CYP2E1 i CYP2B1/2 biorą udział w tym metabolizmie w stopniu istotnym. Dane literaturowe wskazują, że CYP2E1 efektywnie bierze udział w metabolizmie glikolu i sugerują, że glikol ten jest induktorem CYP2E1. Wydaje się, że delikatny wpływ stymulujący glikol ma także na CYP2B1/2, ale w stosunku do innych izoform ma on raczej charakter inhibitorowy. W świetle powyższych danych celem niniejszej pracy była ocena przydatności 4-metylopirazolu w postępowaniu leczniczym w zatruciach pojedynczych glikolem etylenowym. Dokonano oceny aktywności enzymów biorących udział w metabolizmie glikolu etylenowego. Materiały i metody Zwierzęta Badania przeprowadzono na dojrzałych szczurach samcach szczepu Wistar. Każde zwierzę przebywało osobno 62 w klatkach plastikowych a hodowla była prowadzona w tym samym pomieszczeniu. Grupy liczyły po 5 zwierząt dla każdego z punktów czasowych w poszczególnych grupach badawczych. W czasie trwania eksperymentu szczury były hodowane w standardowych warunkach (21 O C, wilgotność 55-60%, dzień-noc 12:12 godz.). Szczury karmiono paszą standardową (Labofeed), którą usuwano na 12 godzin przed zabiciem, pozostawiając wolny dostęp do wody. Szczury usypiano za pomocą ketaminy podanej domięśniowo w dawce 10 mg/kg m.c. Natychmiast pobierano wątroby oraz nerki i umieszczano je w lodowatym roztworze soli fizjologicznej. Materiał do badań (nerki, wątroba) pobierano od zwierząt po 8; 12; 18; 24; 36 i 48 godzin od podania ksenobiotyku. Traktowanie Glikol etylenowy w dawce 3830 mg/kg m.c. (1/2 DL 50 ) był podawany per os sondą dożołądkowo, natomiast 4-metylopirazol w dawce 10 mg/kg m.c. dootrzewnowo (jest to standardowa dawka stosowana w terapii). Ksenobiotyki były podawane wg następującego schematu: - grupa kontrolna - zwierzęta otrzymujące glikol etylenowy - zwierzęta otrzymujące 4-metylopirazol - zwierzęta otrzymujące oba oceniane ksenobiotyki Izolacja frakcji mikrosomalnej Wątrobową i nerkową frakcję mikrosomalną izolowano według metody Dallnera [8]. Po kilkukrotnym przepłukaniu w roztworze soli fizjologicznej, wątroby cięto na niewielkie skrawki i rozdrabniano w homogenizatorze Pottera-Elvehjema z tłokiem teflonowym, przy 400 obrotach na minutę i czterech pełnych ruchach tłoka. Środowiskiem homogenizacyjnym był 0,25 molowy roztwór sacharozy w 10 milimolowym buforze Tris-HCl o pH=7,4. Na 1 gram tkanki dodawano 5 cm 3 tego roztworu. Ten i kolejne etapy obróbki wątroby prowadzano w temperaturze 2-4 0 C. Uzyskany homogenat poddano procesowi wirowania różnicowego, w którym kolejno osadzano frakcję jądrową (10 min., 900g), mitochondrialną (20 min., 20000g) i wreszcie mikrosomalną (90 min., 105000g). Czyste frakcje mikrosomalne zawieszano w zbuforowanym 20% o/o roztworze glicerolu tak, aby stężenie białka było nie mniejsze niż 5 mg/cm 3 . Próby te natychmiast zamrażano w temperaturze -20 0 C. Metody oznaczania składników układu cytochromu P450 W uzyskanych mikrosomach wykonano oznaczenia: - stężenia białka metodą Lowry’ego i wsp. [9]. - zawartości cytochromów P450 i b 5 - spektrofotometrycznie wykonując tzw. widmo różnicowe, metodą Estabrooka i Werringloera [10]. - aktywności reduktazy NADPH-cytochrom P450 i reduktazy NADH-cytochrom b 5 - spektrofotometrycznie metodą Hodgesa i Leonarda [11]. - analiza ekspresji białek P450 w komórkach wątroby i nerek przeprowadzono techniką elekroforetyczną i Western blottingu. Analiza ilościowa izoform 2E1, 1A2
Ryc. 1. [nM/mg białka] 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 i 2B1/2 została przeprowadzona na podstawie pomiarów densytometrycznych blotów. Analiza statystyczna Wyniki oznaczeń biochemicznych, które przedstawiono w tym opracowaniu są średnią z pięciu niezależnych pomiarów. Istotność różnic w poszczególnych seriach, a także pomiędzy grupami czasowymi oceniano na podstawie testu ANOVA na poziomie p=0.05. Wyniki Układ monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 Wątroba * * Cytochrom P450 8h 12h 18h 24h 36h 48h Kontrola Glikol 4-Metylopirazol Glikol+4-Metylopirazol Traktowanie glikolem nie zmieniało zawartości cytochromu P450 do 18 godziny obserwacji. Począwszy od * * copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 * * * Ryc. 1. Stężenie cytochromu P450 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G) (*) – oznacza zmianę znamiennie statystyczną dla p=0.05 w stosunku do własnej grupy kontrolnej. Ryc. 2. [ [μM/min/mg białka] 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 Reduktaza NADPH-cytochrom P450 8h 12h 18h 24h 36h 48h Kontrola Glikol 4-Metylopirazol Glikol+4-Metylopirazol * * * * * * Ryc. 2. Aktywność reduktazy NADPH-cytochrom P450 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G) (*) – oznacza zmianę znamiennie statystyczną dla p=0.05 w stosunku do własnej grupy kontrolnej. * [Czas] 24 godziny, w której stwierdzono hamowanie do 82% kontroli, w kolejnych przedziałach czasu inhibicja pogłębiała się, osiągając 66% wartości grupy kontrolnej w 48 godzinie (Ryc. 1). Reduktaza współpracująca z cytochromem P450 w tym doświadczeniu w pierwszej dobie obserwacji wykazywała tendencję do wzrostu swojej aktywności, która zmieniała się w utrwaloną stymulację sięgająca 125% kontroli w 48 godzinie od zakończenia obserwacji (Ryc. 2). Od 18 godziny po podaniu glikolu zaczęła spadać zawartość cytochromu b 5 . Od 90% wartości grupy kontrolnej do około 65% po 48 godzinach obserwacji (Ryc. 3). Glikol nie miał natomiast żadnego wpływu na aktywność reduktazy współpracującej z cytochromem b 5 (Ryc. 4). Traktowanie 4-metylopirazolem doprowadziło po 8 godzinie obserwacji do 115% wzrostu zawartości cytochromu P450, który rósł do 24 godziny, gdzie osiągał około 125% wartości kontroli. Do końca obserwacji wartość ta nie uległa zmianie (Ryc. 1). W tych warunkach narażenia, aktywność * * [Czas] 63
- Page 12 and 13: Farm Przegl Nauk, 2009,2 torzy [9].
- Page 14 and 15: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 14-18 Cuk
- Page 16 and 17: Farm Przegl Nauk, 2009,2 wyjaśnion
- Page 18 and 19: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Pochodne g
- Page 20 and 21: Farm Przegl Nauk, 2009,2 alkoholowe
- Page 22 and 23: Farm Przegl Nauk, 2009,2 diolu we k
- Page 24 and 25: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 24-27 1.
- Page 26 and 27: Farm Przegl Nauk, 2009,2 na skróce
- Page 28 and 29: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 28-34 Dep
- Page 30 and 31: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Fig. 3. We
- Page 32 and 33: Farm Przegl Nauk, 2009,2 DISCUSSION
- Page 34 and 35: Farm Przegl Nauk, 2009,2 45. Hart J
- Page 36 and 37: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Wprowadzen
- Page 38 and 39: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Ryc. 3. Mo
- Page 40 and 41: Farm Przegl Nauk, 2009,2 ne lipidy
- Page 42 and 43: Farm Przegl Nauk, 2009,2 49. Silipo
- Page 44 and 45: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Ryc. 1. Iz
- Page 46 and 47: Farm Przegl Nauk, 2009,2 selekcjono
- Page 48 and 49: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 48-51 Rek
- Page 50 and 51: Farm Przegl Nauk, 2009,2 wego (ang.
- Page 52 and 53: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 52-60 Bad
- Page 54 and 55: Farm Przegl Nauk, 2009,2 niezawiera
- Page 56 and 57: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Tabela 1.
- Page 58 and 59: Farm Przegl Nauk, 2009,2 H39 7,33 3
- Page 60 and 61: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Tabela 5.
- Page 64 and 65: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Ryc. 3. [n
- Page 66 and 67: Farm Przegl Nauk, 2009,2 reduktazy
- Page 68 and 69: Farm Przegl Nauk, 2009,2 12 godzina
- Page 70 and 71: Farm Przegl Nauk, 2009,2 70 wym. Iz
- Page 72: Farmaceutyczny PISMO POD PATRONATEM
Ryc. 1.<br />
[nM/mg białka]<br />
1,2<br />
1<br />
0,8<br />
0,6<br />
0,4<br />
0,2<br />
0<br />
i 2B1/2 została przeprowadzona na podstawie pomiarów<br />
densytometrycznych blotów.<br />
Analiza statystyczna<br />
Wyniki oznaczeń biochemicznych, które przedstawiono<br />
w tym opracowaniu są średnią z pięciu niezależnych pomiarów.<br />
Istotność różnic w poszczególnych seriach, a także<br />
pomiędzy grupami czasowymi oceniano na podstawie testu<br />
ANOVA na poziomie p=0.05.<br />
Wyniki<br />
Układ monooksygenaz zależnych od cytochromu P450<br />
Wątroba<br />
*<br />
*<br />
Cytochrom P450<br />
8h 12h 18h 24h 36h 48h<br />
Kontrola Glikol 4-Metylopirazol Glikol+4-Metylopirazol<br />
Traktowanie glikolem nie zmieniało zawartości cytochromu<br />
P450 do 18 godziny obserwacji. Począwszy od<br />
*<br />
*<br />
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
* * *<br />
Ryc. 1. Stężenie cytochromu P450 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol<br />
(4-MP) oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G)<br />
(*) – oznacza zmianę znamiennie statystyczną dla p=0.05 w stosunku do własnej grupy kontrolnej.<br />
Ryc. 2.<br />
[ [μM/min/mg<br />
białka]<br />
0,14<br />
0,12<br />
0,1<br />
0,08<br />
0,06<br />
0,04<br />
0,02<br />
0<br />
Reduktaza NADPH-cytochrom P450<br />
8h 12h 18h 24h 36h 48h<br />
Kontrola Glikol 4-Metylopirazol Glikol+4-Metylopirazol<br />
*<br />
*<br />
* * *<br />
*<br />
Ryc. 2. Aktywność reduktazy NADPH-cytochrom P450 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy<br />
(G), 4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP<br />
+ G)<br />
(*) – oznacza zmianę znamiennie statystyczną dla p=0.05 w stosunku do własnej grupy kontrolnej.<br />
*<br />
[Czas]<br />
24 godziny, w której stwierdzono hamowanie do 82%<br />
kontroli, w kolejnych przedziałach czasu inhibicja pogłębiała<br />
się, osiągając 66% wartości grupy kontrolnej<br />
w 48 godzinie (Ryc. 1). Reduktaza współpracująca z cytochromem<br />
P450 w tym doświadczeniu w pierwszej dobie<br />
obserwacji wykazywała tendencję do wzrostu swojej<br />
aktywności, która zmieniała się w utrwaloną stymulację<br />
sięgająca 125% kontroli w 48 godzinie od zakończenia<br />
obserwacji (Ryc. 2).<br />
Od 18 godziny po podaniu glikolu zaczęła spadać zawartość<br />
cytochromu b 5 . Od 90% wartości grupy kontrolnej do<br />
około 65% po 48 godzinach obserwacji (Ryc. 3). Glikol nie<br />
miał natomiast żadnego wpływu na aktywność reduktazy<br />
współpracującej z cytochromem b 5 (Ryc. 4).<br />
Traktowanie 4-metylopirazolem doprowadziło po 8 godzinie<br />
obserwacji do 115% wzrostu zawartości cytochromu<br />
P450, który rósł do 24 godziny, gdzie osiągał około 125%<br />
wartości kontroli. Do końca obserwacji wartość ta nie uległa<br />
zmianie (Ryc. 1). W tych warunkach narażenia, aktywność<br />
*<br />
*<br />
[Czas]<br />
63
Change language