Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Farm Przegl Nauk, 2009,2
czy CYP2B1/2. Obecnie w leczeniu zatruć GE stosuje się
specyficzne odtrutki, jak etanol czy 4-metylopirazol [1].
W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych porównawczych
dotyczących oceny skuteczności i ryzyka stosowania
obu tych terapii. Ponadto często zatruciu glikolem etylenowym
towarzyszy spożycie alkoholu etylowego. W takich
przypadkach zastosowanie 4-metylopirazolu może doprowadzić
do wystąpienia interakcji pomiędzy ksenobiotykami.
Wykazano bowiem, że równoczesne podanie etanolu
i 4-metylopirazolu zdrowym ochotnikom powoduje
o około 40% obniżenie szybkości eliminacji etanolu i 50%
obniżenie wydalania 4-metylopirazolu utrzymujące się do
8 godzin od podania ksenobiotyków [2, 3]. Te wzajemne
modyfikacje mogą mieć kliniczne implikacje u wielu pacjentów,
którzy równocześnie spożyli etanol i glikol etylenowy.
W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych czy
podobne interakcje mogą zachodzić również po łącznym
podaniu glikolu etylenowego, etanolu i 4-metylopirazolu.
Badania ostatnich lat wykazały, że glikol etylenowy może
być również utleniony do formaldehydu z uwolnieniem nadtlenku
wodoru. Istotny udział w tej reakcji odgrywa cytochrom
P450, a zwłaszcza jego izoforma CYP2E1 oraz izoenzymy
indukowane fenobarbitalem i 3-metylocholantrenem.
Utlenianie glikolu etylenowego do formaldehydu za pośrednictwem
cytochromu P450 prowadzi do wytworzenia nadtlenku
wodoru. Powstające w obecności Fe(II) rodniki ponadtlenkowe
odpowiedzialne są za wywoływanie stresu oksydacyjnego związanego
z naruszeniem równowagi pomiędzy procesami generacji
aktywnych form tlenu i procesami antyoksydacyjnymi.
W latach 70-tych w doświadczalnym zatruciu glikolem
etylenowym u zwierząt wykazano skuteczność
4-metylopirazolu. W 1998 roku 4-metylopirazol został dopuszczony
w USA do stosowania klinicznego jako specyficzna
odtrutka w leczeniu zatruć glikolem etylenowym u osób
powyżej 12. roku życia [4]. 4-Metylopirazol skuteczniej niż
etanol ogranicza przemiany glikolu etylenowego zachodzące
za pośrednictwem dehydrogenazy alkoholowej, zarówno
u zwierząt jak i u ludzi [5, 6]. Ponadto jego działanie inhibicyjne
utrzymuje się znacznie dłużej stąd też 4-metylopirazol
zalecany jest w przypadkach ostrych i ciężkich zatruć [6, 7].
Glikol etylenowy jest inhibitorem cytochromu P450.
W biotransformacji glikolu bierze udział wiele izoenzymów
cytochromu P450. Izoformy CYP2E1 i CYP2B1/2 biorą
udział w tym metabolizmie w stopniu istotnym. Dane literaturowe
wskazują, że CYP2E1 efektywnie bierze udział
w metabolizmie glikolu i sugerują, że glikol ten jest induktorem
CYP2E1. Wydaje się, że delikatny wpływ stymulujący
glikol ma także na CYP2B1/2, ale w stosunku do innych
izoform ma on raczej charakter inhibitorowy.
W świetle powyższych danych celem niniejszej pracy
była ocena przydatności 4-metylopirazolu w postępowaniu
leczniczym w zatruciach pojedynczych glikolem etylenowym.
Dokonano oceny aktywności enzymów biorących
udział w metabolizmie glikolu etylenowego.
Materiały i metody
Zwierzęta
Badania przeprowadzono na dojrzałych szczurach samcach
szczepu Wistar. Każde zwierzę przebywało osobno
62
w klatkach plastikowych a hodowla była prowadzona
w tym samym pomieszczeniu. Grupy liczyły po 5 zwierząt
dla każdego z punktów czasowych w poszczególnych grupach
badawczych. W czasie trwania eksperymentu szczury
były hodowane w standardowych warunkach (21 O C, wilgotność
55-60%, dzień-noc 12:12 godz.).
Szczury karmiono paszą standardową (Labofeed), którą
usuwano na 12 godzin przed zabiciem, pozostawiając wolny
dostęp do wody. Szczury usypiano za pomocą ketaminy
podanej domięśniowo w dawce 10 mg/kg m.c. Natychmiast
pobierano wątroby oraz nerki i umieszczano je w lodowatym
roztworze soli fizjologicznej.
Materiał do badań (nerki, wątroba) pobierano od zwierząt
po 8; 12; 18; 24; 36 i 48 godzin od podania ksenobiotyku.
Traktowanie
Glikol etylenowy w dawce 3830 mg/kg m.c. (1/2
DL 50 ) był podawany per os sondą dożołądkowo, natomiast
4-metylopirazol w dawce 10 mg/kg m.c. dootrzewnowo
(jest to standardowa dawka stosowana w terapii).
Ksenobiotyki były podawane wg następującego schematu:
- grupa kontrolna
- zwierzęta otrzymujące glikol etylenowy
- zwierzęta otrzymujące 4-metylopirazol
- zwierzęta otrzymujące oba oceniane ksenobiotyki
Izolacja frakcji mikrosomalnej
Wątrobową i nerkową frakcję mikrosomalną izolowano
według metody Dallnera [8]. Po kilkukrotnym przepłukaniu
w roztworze soli fizjologicznej, wątroby cięto na niewielkie
skrawki i rozdrabniano w homogenizatorze Pottera-Elvehjema
z tłokiem teflonowym, przy 400 obrotach na minutę i czterech
pełnych ruchach tłoka. Środowiskiem homogenizacyjnym był
0,25 molowy roztwór sacharozy w 10 milimolowym buforze
Tris-HCl o pH=7,4. Na 1 gram tkanki dodawano 5 cm 3 tego
roztworu. Ten i kolejne etapy obróbki wątroby prowadzano
w temperaturze 2-4 0 C. Uzyskany homogenat poddano procesowi
wirowania różnicowego, w którym kolejno osadzano
frakcję jądrową (10 min., 900g), mitochondrialną (20 min.,
20000g) i wreszcie mikrosomalną (90 min., 105000g).
Czyste frakcje mikrosomalne zawieszano w zbuforowanym
20% o/o roztworze glicerolu tak, aby stężenie białka
było nie mniejsze niż 5 mg/cm 3 . Próby te natychmiast zamrażano
w temperaturze -20 0 C.
Metody oznaczania składników układu cytochromu P450
W uzyskanych mikrosomach wykonano oznaczenia:
- stężenia białka metodą Lowry’ego i wsp. [9].
- zawartości cytochromów P450 i b 5 - spektrofotometrycznie
wykonując tzw. widmo różnicowe, metodą Estabrooka
i Werringloera [10].
- aktywności reduktazy NADPH-cytochrom P450 i reduktazy
NADH-cytochrom b 5 - spektrofotometrycznie metodą
Hodgesa i Leonarda [11].
- analiza ekspresji białek P450 w komórkach wątroby
i nerek przeprowadzono techniką elekroforetyczną i
Western blottingu. Analiza ilościowa izoform 2E1, 1A2