Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
Farm Przegl Nauk, 2009,2, 48-51 Rekombinowane wektory wirusowe rAAV w terapii genowej nowotworów Recombinant adeno-associated virus vector (rAAV) preparations for cancer gene therapy Maciej Małecki 1,2 , karolina hajdukiewicz 2 , jan pachecka 2 1 zakład biologii komórki, centrum onkologii-instytut im. Marii skłodowskiej-curie, warszawa 2 katedra i zakład biochemii i chemii klinicznej, wydział farmaceutyczny, warszawski uniwersytet Medyczny, warszawa p.o. kierownika zakładu biologii komórki: doc. dr hab. Maciej Małecki kierownik katedry i zakładu biochemii i chemii klinicznej: prof. dr hab. jan pachecka Streszczenie W terapii genowej wykorzystuje się, zawierające kodujące sekwencje kwasów nukleinowych, preparaty genowe wprowadzane do komórek za pomocą nośników genów, czyli wektorów. Prawidłowy układ nośnik/gen decyduje o wydajnym procesie transfekcji oraz ekspresji genów, która warunkuje efekt terapeutyczny, odpowiedź biologiczną komórek, narządów. Prowadzone są intensywne badania nad uzyskiwaniem bezpiecznych dla pacjentów preparatów genowych. Wektory konstruowane w oparciu o genom wirusów związanych z adenowirusami (rAAV) efektywnie wnoszą geny do komórek, są nietoksyczne i niepatogenne. rAAV wykorzystywane są w badaniach podstawowych oraz w leczeniu chorych na nowotwory. Próby kliniczne terapii genowej z rAAV zostały przeprowadzone u chorych na nowotwory skóry oraz prostaty. Obecność rAAV w klinice odzwierciedla postęp w terapii genowej, a tym samym ujawnia kierunki rozwoju współczesnej farmacji. Słowa kluczowe: terapia genowa, wirusy związane z adenowirusami, nowotwory Wprowadzenie Terapia genowa, terapia fotodynamiczna czy wykorzystanie komórek macierzystych do celów terapeutycznych odzwierciedlają postęp w naukach farmaceutycznych, a ich obecność w klinice czyni możliwym leczenie pacjentów, dla których klasyczne środki i metody leczenia nie są do końca skuteczne. Terapia genowa, znana w klinice od lat 90. ubiegłego stulecia [1] wykorzystuje geny kodujące białka o funkcji terapeutycznej. W chwili obecnej w badaniach klinicznych terapii genowej wykorzystuje się nośniki genów konstruowane głównie w oparciu o genom adenowirusów, lentiwirusów oraz wirusów związanych z adenowirusami 48 Abstract Gene therapy methods are based on coding nucleic acid sequences that are administered directly to cells via carriers commonly recognized as DNA vectors. The correctly prepared cDNA/vector formula determines efficient transfection of cells, transgen expression, and therefore biological responses. The studies concerning the development of safe and efficient vectors are still conducted. Recombinant adeno-associated virus vectors (rAAV) are a most promising candidates for cancer gene therapy protocols. They are nonpathogenic and seem to be safer than other viral vectors. rAAV effectively infect cancer cells of broad range and permit stable and efficient transgene expression. In vivo studies show a promising observations and therapeutic implications. So far, recombinant adeno-associated based vectors are successfully used in the clinic for gene therapy of melanoma and prostate patients. Key words: gene therapy, adeno-associated viruses, cancers (AAV). Wiele opracowań wskazuje, iż preparaty genowe wirusowe, mimo iż efektywnie wnoszą geny do komórek, nie są bezpieczne dla pacjentów . Najczęściej opisywane niepożądane działania rekombinowanych wirusów to wysoka immunogenność oraz mutageneza insercyjna. W chwili obecnej wektory konstruowane w oparciu o genom AAV należą do najbezpieczniejszych. rAAV bardzo wydajnie infekują komórki gospodarza, a czas ekspresji transgenu jest długi. W próbach terapii genowej wykorzystuje się rAAV z uwagi na brak ich patogenności, toksyczności, wydajną infekcję komórek oraz długą i wysoką ekspresję wprowadzanych genów. Atrakcyjność kliniczną rAAV zwiększa również występowanie w przyrodzie serotypów AAV (AAV1-AAV12).
Możliwość konstruowania in vitro serotypów rAAV pozwala na przygotowywanie preparatów genowych wnoszących geny do określonych narządów człowieka. Dalsze badania przedkiniczne i kliniczne wskażą czy i kiedy rAAV staną się uniwersalnymi nośnikami genów w terapii genowej i rozszerzą tym samym spektrum środków leczniczych współczesnej farmakoterapii. Wirusy związane z adenowirusami (AAV) Wirusy AAV należą do rodziny Parvoviridae, rodzaju Dependovirus. AAV mają średnicę około 25 nm, symetrię ikozahedralną i zawierają pojedynczą nić DNA, składającą się z 4680 par zasad (AAV2). Genom wirusa AAV zbudowany jest z dwóch otwartych ramek odczytu lewej rep i prawej cap, oskrzydlonych sekwencjami ITR (ang. inverted terminal repeats) złożonymi ze 145 par zasad. Sekwencje ITR są niezbędne do replikacji, pakowania i integracji DNA AAV do genomu gospodarza. W wirusowym genomie można wyróżnić trzy promotory: p5, p19 i p40. Dwa pierwsze odpowiedzialne są za ekspresję genów białek Rep, natomiast promotor p40 reguluje ekspresją białek kapsydowych Cap. Zmienność składu aminokwasowego białek kapsydowych determinuje występowanie w przyrodzie serotypów AAV wykazujących tropizm narządowy. AAV nie posiadają zdolności do samodzielnego namnażania się w komórce gospodarza, a do replikacji genomu wymagają obecności wirusa wspomagającego. Wśród najczęściej opisywanych wirusów ko-infekujących opisuje się adenowirusy oraz herpeswirusy. Unikalną cechą AAV jest również zdolność do miejscowo-specyficznej integracji własnego DNA do chromosomu 19 człowieka (19q13.4, AAVS1) [2]. Wnikanie AAV (transdukcja, infekcja) do komórek jest procesem wieloetapowym, w którym można wyróżnić przyłączenie wirusa do powierzchni komórki, transport wewnątrzkomórkowy, zdarzenia jądrowe. Rozpoznanie i związanie AAV z błona komórkową wiąże się z oddziaływaniem białek kapsydu wirusów z receptorami komórkowymi. W przypadku wirusa AAV serotyp 2 (AAV2) najczęściej opisywanymi receptorami są proteoglikany bogate w siarczan heparanu (HSPG). W wiązaniu błonowym AAV biorą także udział receptory pomocnicze - ko-receptory, np. dla AAV2 ko-receptorami są np. integryny oraz receptor dla czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGFR1) [3]. Rekombinowane wektory AAV jako potencjalne środki lecznicze Środki lecznicze współczesnej farmakoterapii mają zdefiniowaną strukturę, postać, cechuje je ściśle określony skład ilościowy i jakość, uzyskiwane są dzięki powtarzalnym procedurom syntezy. Znana jest ich aktywność biologiczna, działania niepożądane, a znaczenie kliniczne jest już najczęściej dobrze udokumentowane. Preparaty genowe, których podstawą są kwasy nukleinowe, są w chwili obecnej wykorzystywane głównie w pracach eksperymentalnych na liniach komórkowych i zwierzętach oraz stanowią przedmiot wstępnych prób klinicznych terapii genowej na pacjentach. Biochemiczna formuła preparatu genowego sprowadza się do sekwencji DNA kodujących wybrane copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 białka o funkcji terapeutycznej, zaś postać farmaceutyczna – determinowana bezpośrednio przez rozwój technologii farmacji stosowanej – sprowadza się do formy wektora – wirusowego lub niewirusowego nośnika genów. Zainteresowanie wirusowymi wektorami AAV wynika bezpośrednio z ich charakterystyki molekularno-biochemicznej. Uzyskiwane in vitro - rekombinowane AAV- efektywnie wnoszą geny do komórek oraz pozwalają na długą ekspresję transgenów, są nieimmunogenne i niepatogenne dla gospodarza. Obecność serotypów AAV zwiększa ich atrakcyjność kliniczną. W chwili obecnej, dzięki metodom inżynierii genetycznej, możliwym jest w warunkach laboratorium konstruowanie i namnażanie wirusów AAV niosących wybrane geny terapeutyczne. Formuła uzyskiwania rAAV przewiduje także przygotowanie preparatów genowych rAAV do stosowania w klinice, czyli spełniających farmakopealne wymagania jakości [4]. Uzyskiwanie rekombinowanych wektorów AAV wiąże się z potrzebą klonowania molekularnego genów AAV w formie plazmidów. Istniejąca w chwili obecnej procedura przewiduje wykorzystanie plazmidów AAV (pAAV) niosących geny rep, cap, transgen oskrzydlony sekwencjami ITR oraz genów wirusów wspomagających np. adenowirusowe geny E1, E2A, E4, VA. Plazmidy wprowadza się do komórek pakujących hodowanych w warunkach in vitro w formie hodowli adhezyjnych lub zawiesinowych. Najczęściej wykorzystuje się komórki pakujące ustalonych linii komórkowych HEK293, HEK293T, HeLa, A549. Z komórek pakujących, transfekowanych pAAV izoluje się cząstki rekombinowanych wektorów AAV niosących wybrane geny terapeutyczne. Ilość cząstek wirusowych (miano) w uzyskanym preparacie ocenia się głównie poprzez określenie np. metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (ang. real time PCR) liczby kopii genomu rAAV w preparacie (gc/ml). Wyniki badań oceniających natomiast jakość uzyskanego preparatu – czystość biochemiczną, mikrobiologiczną, toksykologiczną warunkują wykorzystanie preparatu w warunkach klinicznych. Preparaty rAAV w terapii genowej nowotworów W terapii genowej chorych na nowotwory wykorzystywane są geny kodujące białka o zdefiniowanej aktywności antynowotworowej. Badania prowadzone są z rekombinowanymi wektorami AAV jako nośnikami genów kodujących białka proapoptotyczne, antyangiogenne, immunotropowe. Większość badań prowadzonych jest w warunkach eksperymentalnych – na komórkach linii komórkowych oraz na zwierzętach laboratoryjnych. Pierwsze próby kliniczne terapii genowej z rAAV zostały przeprowadzone u chorych na raka prostaty i czerniaka [1]. Geny samobójcze W terapii genowej nowotworów nierzadko wykorzystuje się rAAV niosące geny samobójcze. Do komórek nowotworowych wprowadza się rAAV kodujące białko enzymatyczne przekształcające nieaktywną formę leku (prolek) w postać toksyczną dla komórek. W pracach wskazuje się również, iż zasięg oddziaływania toksycznego metabolitu jest szerszy niż wynikający z wydajności infekcji komórek, z uwagi na efekt oddziaływania międzykomórko- 49
- Page 1: copyright © 2009 Grupa dr. A. R. K
- Page 4 and 5: Szanowni Państwo, Koleżanki i Kol
- Page 6 and 7: Register at www.fip.org/istanbul200
- Page 8 and 9: Farm Przegl Nauk, 2009,2 WSTĘP Nad
- Page 10 and 11: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Tabela I.
- Page 12 and 13: Farm Przegl Nauk, 2009,2 torzy [9].
- Page 14 and 15: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 14-18 Cuk
- Page 16 and 17: Farm Przegl Nauk, 2009,2 wyjaśnion
- Page 18 and 19: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Pochodne g
- Page 20 and 21: Farm Przegl Nauk, 2009,2 alkoholowe
- Page 22 and 23: Farm Przegl Nauk, 2009,2 diolu we k
- Page 24 and 25: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 24-27 1.
- Page 26 and 27: Farm Przegl Nauk, 2009,2 na skróce
- Page 28 and 29: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 28-34 Dep
- Page 30 and 31: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Fig. 3. We
- Page 32 and 33: Farm Przegl Nauk, 2009,2 DISCUSSION
- Page 34 and 35: Farm Przegl Nauk, 2009,2 45. Hart J
- Page 36 and 37: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Wprowadzen
- Page 38 and 39: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Ryc. 3. Mo
- Page 40 and 41: Farm Przegl Nauk, 2009,2 ne lipidy
- Page 42 and 43: Farm Przegl Nauk, 2009,2 49. Silipo
- Page 44 and 45: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Ryc. 1. Iz
- Page 46 and 47: Farm Przegl Nauk, 2009,2 selekcjono
- Page 50 and 51: Farm Przegl Nauk, 2009,2 wego (ang.
- Page 52 and 53: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 52-60 Bad
- Page 54 and 55: Farm Przegl Nauk, 2009,2 niezawiera
- Page 56 and 57: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Tabela 1.
- Page 58 and 59: Farm Przegl Nauk, 2009,2 H39 7,33 3
- Page 60 and 61: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Tabela 5.
- Page 62 and 63: Farm Przegl Nauk, 2009,2 czy CYP2B1
- Page 64 and 65: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Ryc. 3. [n
- Page 66 and 67: Farm Przegl Nauk, 2009,2 reduktazy
- Page 68 and 69: Farm Przegl Nauk, 2009,2 12 godzina
- Page 70 and 71: Farm Przegl Nauk, 2009,2 70 wym. Iz
- Page 72: Farmaceutyczny PISMO POD PATRONATEM
Możliwość konstruowania in vitro serotypów rAAV pozwala<br />
na przygotowywanie preparatów genowych wnoszących<br />
geny do określonych narządów człowieka. Dalsze badania<br />
przedkiniczne i kliniczne wskażą czy i kiedy rAAV staną się<br />
uniwersalnymi nośnikami genów w terapii genowej i rozszerzą<br />
tym samym spektrum środków leczniczych współczesnej<br />
farmakoterapii.<br />
Wirusy związane z adenowirusami (AAV)<br />
Wirusy AAV należą do rodziny Parvoviridae, rodzaju<br />
Dependovirus. AAV mają średnicę około 25 nm, symetrię<br />
ikozahedralną i zawierają pojedynczą nić DNA, składającą<br />
się z 4680 par zasad (AAV2). Genom wirusa AAV zbudowany<br />
jest z dwóch otwartych ramek odczytu lewej rep<br />
i prawej cap, oskrzydlonych sekwencjami ITR (ang. inverted<br />
terminal repeats) złożonymi ze 145 par zasad. Sekwencje<br />
ITR są niezbędne do replikacji, pakowania i integracji<br />
DNA AAV do genomu gospodarza. W wirusowym genomie<br />
można wyróżnić trzy promotory: p5, p19 i p40. Dwa pierwsze<br />
odpowiedzialne są za ekspresję genów białek Rep, natomiast<br />
promotor p40 reguluje ekspresją białek kapsydowych<br />
Cap. Zmienność składu aminokwasowego białek kapsydowych<br />
determinuje występowanie w przyrodzie serotypów<br />
AAV wykazujących tropizm narządowy. AAV nie posiadają<br />
zdolności do samodzielnego namnażania się w komórce<br />
gospodarza, a do replikacji genomu wymagają obecności<br />
wirusa wspomagającego. Wśród najczęściej opisywanych<br />
wirusów ko-infekujących opisuje się adenowirusy oraz herpeswirusy.<br />
Unikalną cechą AAV jest również zdolność do<br />
miejscowo-specyficznej integracji własnego DNA do chromosomu<br />
19 człowieka (19q13.4, AAVS1) [2]. Wnikanie<br />
AAV (transdukcja, infekcja) do komórek jest procesem wieloetapowym,<br />
w którym można wyróżnić przyłączenie wirusa<br />
do powierzchni komórki, transport wewnątrzkomórkowy,<br />
zdarzenia jądrowe. Rozpoznanie i związanie AAV z błona<br />
komórkową wiąże się z oddziaływaniem białek kapsydu wirusów<br />
z receptorami komórkowymi. W przypadku wirusa<br />
AAV serotyp 2 (AAV2) najczęściej opisywanymi receptorami<br />
są proteoglikany bogate w siarczan heparanu (HSPG).<br />
W wiązaniu błonowym AAV biorą także udział receptory<br />
pomocnicze - ko-receptory, np. dla AAV2 ko-receptorami są<br />
np. integryny oraz receptor dla czynnika wzrostu fibroblastów<br />
1 (FGFR1) [3].<br />
Rekombinowane wektory AAV<br />
jako potencjalne środki lecznicze<br />
Środki lecznicze współczesnej farmakoterapii mają<br />
zdefiniowaną strukturę, postać, cechuje je ściśle określony<br />
skład ilościowy i jakość, uzyskiwane są dzięki powtarzalnym<br />
procedurom syntezy. Znana jest ich aktywność biologiczna,<br />
działania niepożądane, a znaczenie kliniczne jest<br />
już najczęściej dobrze udokumentowane. Preparaty genowe,<br />
których podstawą są kwasy nukleinowe, są w chwili<br />
obecnej wykorzystywane głównie w pracach eksperymentalnych<br />
na liniach komórkowych i zwierzętach oraz stanowią<br />
przedmiot wstępnych prób klinicznych terapii genowej<br />
na pacjentach. Biochemiczna formuła preparatu genowego<br />
sprowadza się do sekwencji DNA kodujących wybrane<br />
copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073<br />
białka o funkcji terapeutycznej, zaś postać farmaceutyczna<br />
– determinowana bezpośrednio przez rozwój technologii<br />
farmacji stosowanej – sprowadza się do formy wektora<br />
– wirusowego lub niewirusowego nośnika genów. Zainteresowanie<br />
wirusowymi wektorami AAV wynika bezpośrednio z<br />
ich charakterystyki molekularno-biochemicznej. Uzyskiwane<br />
in vitro - rekombinowane AAV- efektywnie wnoszą geny<br />
do komórek oraz pozwalają na długą ekspresję transgenów,<br />
są nieimmunogenne i niepatogenne dla gospodarza. Obecność<br />
serotypów AAV zwiększa ich atrakcyjność kliniczną.<br />
W chwili obecnej, dzięki metodom inżynierii genetycznej,<br />
możliwym jest w warunkach laboratorium konstruowanie<br />
i namnażanie wirusów AAV niosących wybrane geny terapeutyczne.<br />
Formuła uzyskiwania rAAV przewiduje także<br />
przygotowanie preparatów genowych rAAV do stosowania<br />
w klinice, czyli spełniających farmakopealne wymagania jakości<br />
[4]. Uzyskiwanie rekombinowanych wektorów AAV<br />
wiąże się z potrzebą klonowania molekularnego genów<br />
AAV w formie plazmidów. Istniejąca w chwili obecnej procedura<br />
przewiduje wykorzystanie plazmidów AAV (pAAV)<br />
niosących geny rep, cap, transgen oskrzydlony sekwencjami<br />
ITR oraz genów wirusów wspomagających np. adenowirusowe<br />
geny E1, E2A, E4, VA. Plazmidy wprowadza się<br />
do komórek pakujących hodowanych w warunkach in vitro<br />
w formie hodowli adhezyjnych lub zawiesinowych. Najczęściej<br />
wykorzystuje się komórki pakujące ustalonych linii<br />
komórkowych HEK293, HEK293T, HeLa, A549. Z komórek<br />
pakujących, transfekowanych pAAV izoluje się cząstki<br />
rekombinowanych wektorów AAV niosących wybrane geny<br />
terapeutyczne. Ilość cząstek wirusowych (miano) w uzyskanym<br />
preparacie ocenia się głównie poprzez określenie np.<br />
metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (ang. real<br />
time PCR) liczby kopii genomu rAAV w preparacie (gc/ml).<br />
Wyniki badań oceniających natomiast jakość uzyskanego<br />
preparatu – czystość biochemiczną, mikrobiologiczną, toksykologiczną<br />
warunkują wykorzystanie preparatu w warunkach<br />
klinicznych.<br />
Preparaty rAAV w terapii genowej<br />
nowotworów<br />
W terapii genowej chorych na nowotwory wykorzystywane<br />
są geny kodujące białka o zdefiniowanej aktywności<br />
antynowotworowej. Badania prowadzone są z rekombinowanymi<br />
wektorami AAV jako nośnikami genów kodujących<br />
białka proapoptotyczne, antyangiogenne, immunotropowe.<br />
Większość badań prowadzonych jest w warunkach eksperymentalnych<br />
– na komórkach linii komórkowych oraz na<br />
zwierzętach laboratoryjnych. Pierwsze próby kliniczne terapii<br />
genowej z rAAV zostały przeprowadzone u chorych na<br />
raka prostaty i czerniaka [1].<br />
Geny samobójcze W terapii genowej nowotworów nierzadko<br />
wykorzystuje się rAAV niosące geny samobójcze.<br />
Do komórek nowotworowych wprowadza się rAAV kodujące<br />
białko enzymatyczne przekształcające nieaktywną formę<br />
leku (prolek) w postać toksyczną dla komórek. W pracach<br />
wskazuje się również, iż zasięg oddziaływania toksycznego<br />
metabolitu jest szerszy niż wynikający z wydajności infekcji<br />
komórek, z uwagi na efekt oddziaływania międzykomórko-<br />
49
Change language