Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

More documents

Recommendations

Info

Farm Przegl Nauk, 2009,2 Ryc. 1. Izoformy receptora leptyny; Ob-Ra – krótka izoforma receptora leptyny, Ob- Rb – długa izoforma receptora leptyny, Ob-Re – rozpuszczalna forma receptora leptyny, Lep – leptyna, regiony – box-1, box-2, box-3; JAK2 – kinaza tyrozynowa Janusa 2 (ang. Janus Kinase 2), Tyr 985 , Tyr 1077 , Tyr 1138 – reszty tyrozynowe w obrębie wewnątrz komórkowej domeny długiej izoformy receptora leptyny, p – fosforylacja, białka STAT (ang. the Signal Transducers and Activators of Transcription), MAP – kinazy aktywowane mitogenami (ang. mitogen-activated protein kinases) wymagana jest także obecność odcinka złożonego z 31-36 reszt aminokwasowych [2]. Długa izoforma receptora leptyny OB-Rb, ze względu na podobieństwo strukturalne do podjednostki gp 130, aktywuje po połączeniu się z ligandem ścieżki przekazu sygnału w komórce. Białko gp 130 oddziałuje z kinazami tyrozynowymi z rodziny JAK (Janus Kinase) i jest łącznikiem przenoszącym pobudzenie z aktywowanego receptora na kinazę tyrozynową Jak pokazano na rycinie 1, Ob-Rb posiada w obrębie wewnątrzkomórkowej domeny trzy konserwatywne reszty tyrozynowe; Tyr 985, Tyr 1077 i Tyr 1138, które wykazują różną zdolność aktywowania przekazu sygnału w komórce i określają plejotropową naturę receptora leptyny. Leptyna łącząc się na powierzchni komórki z receptorem OB-Rb powoduje jego dimeryzację i aktywuje poprzez transfosforylację kinazę tyrozynową Janusa JAK2, co w dalszej kolejności prowadzi do fosforylacji reszt tyrozynowych w obrębie wewnątrzkomórkowej domeny OB-Rb. Tyr 985 uczestniczy w aktywacji w komórce szlaku ERK1/2 – szlaku kinaz regulowanych przez sygnały zewnątrzkomórkowe (ang. extra cellular signal-regulated kinases). Kinaza tyrozynowa JAK 2 asocjuje z Ob-Rb za pośrednictwem domeny box1 oraz fragmentu złożonego z 31-36 aminokwasów. Ufosforylowane reszty tyrozynowe na powierzchni Ob-Rb stanowią miejsca przyłączania białek sygnałowych z domenami SH2 (ang. Src homology). Ufosforylowana reszta Tyr 985 przyłącza fosfatazę tyrozynową SHP-2, która następnie ulega fosforylacji i przyłącza białko adaptorowe Grb2. W konsekwencji w komórce zostaje uruchomiony przekaz sygnału za pośrednictwem kaskady kinaz MAP-2 białkowych kinaz aktywowanych przez czynniki mitogenne (ang. mitogen activated protein kinases), w który ostatecznie zaangażowane są kinazy ERK (ERK1; MAPK3 ang. extracelluarly regulated protein kinases1; mitogenactivated protein kinase 3 i ERK2; MAPK1 – extracelluarly regulated protein kinases2; mitogen-activated protein 44 kinase1) oraz kinazy MEK1/MAP2K1 i MEK2/MAP2K2 (ang. mitogen-activated protein kinase kinase 1; mitogenactivated protein kinase kinase 2) i kinaza Raf [2]. Kinazy MAP przemieszczają się do jądra komórkowego, gdzie dochodzi do fosforylacji i aktywacji czynników transkrypcyjnych, takich jak c-jun, c-fos, c-myc, erg-1 i w konse kwencji prowadzi do indukcji ekspresji genów związanych z procesami proliferacji i różnicowania]. Ufosforylowana Tyr 985 jest miejscem przyłączania się zarówno fosfatazy tyrozynowej SHP-2 jak i białka hamującego przekaz sygnału, białka SOCS3 (ang. suppressor of cytokine signaling 3). Przyłączenie białka SOCS3 do reszty Tyr 985 znosi sygnał przekazywany za pośrednictwem Ob-Rb z powodu uniemożliwienia przyłączenia się JAK2 do receptora. Białko SOCS3 oddziałuje poprzez domeny SH2 z ufosofrylowaną resztą Tyr 985 receptora leptyny blokując jego aktywność [2]. Badania ostatnich lat wykazały obecność jej receptorów (LEPR) w wielu komórkach i narządach, a co za tym idzie zaangażowanie leptyny w: angiogenezę, dojrzewanie układu rozrodczego, tworzenie kości, gojenie ran, a także funkcjonowanie układu immunologicznego [3,4,5,]. Badania ostatnich lat dowodzą, że leptyna indukuje wzrost komórek nowotworowych poprzez aktywację różnych ścieżek sygnałowych w komórce [6,7,8,9,10,]. Poznanie plejotropowej aktywności leptyny w komórkach zmienionych nowotworowo może w przyszłości być wykorzystane do projektowania strategii terapeutycznych w walce z rakiem. Chociaż ilość prac dotyczących funkcji leptyny i jej receptora w różnych typach nowotworów stale wzrasta, to jednak nadal jest to temat nie do końca poznany. Do dzisiaj nie została w pełni poznana funkcja leptyny i jej receptora w progresji różnych typów nowotworów, w tym w raku endometrium, który jest piątym pod względem częstości występowania nowotworem złośliwym kobiet [11]. Nowotwory zaliczane na podstawie badania klinicznego i patomorfologicznego do tego samego stadium zaawansowania, leczone w ten sam sposób, w różnym stopniu poddają się terapii. Różnice te przypisywane są cechom molekularnym, które odpowiedzialne są za różny przebieg kliniczny nowotworów o podobnym obrazie histologicznym. Analiza molekularna nowotworów umożliwia poszukiwanie genów, które są zaangażowane w proces nowotworzenia. Duże nadzieje w leczeniu nowotworów wiąże się z terapią celowaną, której głównym przesłaniem jest poszukiwanie leków z grupy związków oddziałujących na receptory substancji będących czynnikami wzrostu. Szlaki przekazywania sygnału w komórce odgrywające rolę w regulacji proliferacji, apoptozie i transformacji nowotworowej stanowią podstawę badań mających na celu poszukiwanie potencjalnych markerów mających znaczenie w procesie nowotworzenia. Ponieważ zasadniczym założeniem terapii celowanej jest poszukiwanie leków, które byłyby w stanie hamować receptory komórkowe, za pośrednictwem których dochodzi w ko-
mórce do pobudzenia szlaków związanych z procesami nowotworzenia, coraz większe znaczenie mają badania prowadzone na poziomie całego, genomu, transkryptomu lub proteromu Celem przedstawionej pracy było porównanie transkryptomów związanych z aktywnością biologiczną leptyny w endometrium prawidłowym w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraku endometrium, wyznaczonych techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix). Materiał i metody Materiał do badań stanowiły wycinki endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej oraz gruczolakoraka endometrium G1-G4, pobieranych od chorych leczonych w Katedrze i Klinice Położnictwa i Ginekologii w Katowicach. Ekstrakcja całkowitego RNA: Po homogenizacji 50-100 mg wycinków endometrium przy użyciu homogenizatora Pozytron (Kinematyka AG, Szwajcaria), ekstrahowano RNA z użyciem odczynnika TRIZOL (Gibco BRL) (Invitrogen Life Technologies, Kalifornia, USA), zgodnie z protokołem producenta Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wykorzystaniem zestawu RNeasy Mini Kit, Qiagen w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń DNA. Ekstrakty RNA oceniano ilościowo przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia) Wartość absorbancji przy długości fali 260 nm była podstawą do obliczenia stężenia RNA, przy założeniu, że wynik pomiaru w kuwecie o drodze optycznej 1 cm równy 1 OD 260 odpowiada stężeniu 40 µg RNA w 1 cm 3 ekstraktu, oraz jakościowo techniką elektroforezy w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wyznaczanie transkryptomu metodą mikromacierzy oligonukleotydowych z zastosowaniem płytek HG- U133A (Affymetrix). Około 8 µg całkowitego RNA zostało wykorzystane do syntezy dwuniciowego cDNA (Gibco BRL SuperScript Choice system). W następnym etapie otrzymany cRNA wyznakowano biotyną (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego cRNA przeprowadzono hybrydyzację z mikromacierzą Test3 oraz HG-U133A (Affymetrix) Znakowanie produktów hybrydyzacji przeprowadzono kilkustopniowo kompleksem streptawidyna–fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi streptawidyna–fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGE- WS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej HG–U133A w przewodniku Gene Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix, Kalifornia, USA). W następnym etapie płytki mikromacierzy poddano skanowaniu skanerem Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent Technologies, Kalifornia, USA). Otrzymane wyniki intensywności fluoroscencji zostały zapisane i zarchiwizowane w programie Microarray Suite. Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wynikow copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Ryc 2. Geny związane z aktywnością biologiczną leptyny charakteryzujące się nadekspresją aktywności transkrypcyjnej w raku endometrium w porównaniu do aktywności transkrypcyjnej genów w endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej w programie RMA Expres wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.6,0, Excel oraz SAM (significance analysis of microarrays). Wyniki Analizę profilu ekspresji genów kodujących białka kaskad sygnałowych aktywowanych przez leptynę w wycinkach endometrium, rozpoczęto od porównania raportów wygenerowanych w programie Microarray Suite Affymetrix bezpośrednio po odczycie sygnałów fluorescencji na mikromacierzy. Rozkład sygnałów fluorescencji na płytce, zgodny z zaleceniami producenta mikromacierzy (Affymetrix „Technical Manual GeneChip Expression Analysis”) był podstawą do akceptacji kolejnych transkryptomów do analizy porównawczej, którą rozpoczęto od normalizacji wyników w programie RMA Express, w celu wyrównania zróżnicowanych wartości tła oraz szumu, zmniejszającego prawdopodobieństwo błędnej interpretacji wyników. Analizę porównawczą transkryptomów, rozpoczęto od grupowania transkryptomów wykonując aglomeracyjną analizę skupień. Jako miarę odległości między mikromacierzami wykorzystano odległość Czebyszewa, a zastosowaną metodą aglomeracji była metoda średnich połączeń ważonych. Oceniono w ten sposób zgodność grupowania wycinków na podstawie charakterystyki klinicznej, histopatologicznej i molekularnej. Do analizy porównawczej typowano te transkryptomy, które były kwalifikowane do tej samej grupy, niezależnie od zastosowanego kryterium podziału (klinicznego, histopatologicznego czy molekularnego). W dalszym etapie analizy porównawczej z grupy 22283 mRNA, które można analizować na mikromacierzy HG- U133A, na podstawie danych literaturowych oraz bazy NCBI i Affymetrix wyselekcjonowano 91 transkryptów, których geny kodują białka uczestniczące w ścieżkach przekazu sygnału w komórce, aktywowanych przez leptynę. Następnie wykorzystując technikę Blanda i Altmana wy- 45
Page 1: copyright © 2009 Grupa dr. A. R. K
Page 4 and 5: Szanowni Państwo, Koleżanki i Kol
Page 6 and 7: Register at www.fip.org/istanbul200
Page 8 and 9: Farm Przegl Nauk, 2009,2 WSTĘP Nad
Page 10 and 11: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Tabela I.
Page 12 and 13: Farm Przegl Nauk, 2009,2 torzy [9].
Page 14 and 15: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 14-18 Cuk
Page 16 and 17: Farm Przegl Nauk, 2009,2 wyjaśnion
Page 18 and 19: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Pochodne g
Page 20 and 21: Farm Przegl Nauk, 2009,2 alkoholowe
Page 22 and 23: Farm Przegl Nauk, 2009,2 diolu we k
Page 24 and 25: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 24-27 1.
Page 26 and 27: Farm Przegl Nauk, 2009,2 na skróce
Page 28 and 29: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 28-34 Dep
Page 30 and 31: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Fig. 3. We
Page 32 and 33: Farm Przegl Nauk, 2009,2 DISCUSSION
Page 34 and 35: Farm Przegl Nauk, 2009,2 45. Hart J
Page 36 and 37: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Wprowadzen
Page 38 and 39: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Ryc. 3. Mo
Page 40 and 41: Farm Przegl Nauk, 2009,2 ne lipidy
Page 42 and 43: Farm Przegl Nauk, 2009,2 49. Silipo
Page 46 and 47: Farm Przegl Nauk, 2009,2 selekcjono
Page 48 and 49: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 48-51 Rek
Page 50 and 51: Farm Przegl Nauk, 2009,2 wego (ang.
Page 52 and 53: Farm Przegl Nauk, 2009,2, 52-60 Bad
Page 54 and 55: Farm Przegl Nauk, 2009,2 niezawiera
Page 56 and 57: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Tabela 1.
Page 58 and 59: Farm Przegl Nauk, 2009,2 H39 7,33 3
Page 60 and 61: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Tabela 5.
Page 62 and 63: Farm Przegl Nauk, 2009,2 czy CYP2B1
Page 64 and 65: Farm Przegl Nauk, 2009,2 Ryc. 3. [n
Page 66 and 67: Farm Przegl Nauk, 2009,2 reduktazy
Page 68 and 69: Farm Przegl Nauk, 2009,2 12 godzina
Page 70 and 71: Farm Przegl Nauk, 2009,2 70 wym. Iz
Page 72: Farmaceutyczny PISMO POD PATRONATEM

Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?