Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 

Farmaceutyczny 

www.fpn.info.pl 

Cena 24,50 zł 

PISMO POD PATRONATEM 

Przegląd 

WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU 

Naukowy 

MEDYCZNEGO W KATOWICACH IC Value - Current 3.66 

MNiSW 4 

ROK VI (X) 

Nr 2/2009 (49) 

Miesięcznik 

ISSN 1425-5073 1425-5073 

Scientific Review in Pharmacy 

AnAlizA zrefundowAnych recept nA Antybiotyki 

przez opolski oddziAł nfz w lAtAch 2005 i 2006 

u osób powyżej 6-go roku życiA objętych 

podstAwową opieką zdrowotną 

cukrzycA typu 2 – nowoczesne leczenie 

interAkcje dziurAwcA zwyczAjnego 

(Hypericum perforatum) 

ModyfikAcjA dostępności fArMAceutycznej 

piroksykAMu z tAbletek z udziAłeM 

wybrAnych solubilizAtorów 

osłAbienie sygnAłu generowAnego 

przez receptor β1 integrynowy 

orAz ekspresji receptorA igf-i 

jest odpowiedziAlne zA indukowAne 

przez stres oksydAcyjny upośledzenie 

biosyntezy kolAgenu i wzrostu fibroblAstów. 

wpływ stopniA ufosforylowAniA 

bAkteryjnych endotoksyn 

nA ich Aktywność biologiczną 

profil ekspresji genów kodujących biAłkA 

związAne z AktywnościA biologiczną leptyny 

w rAku endoMetriuM 

rekoMbinowAne wektory wirusowe rAAV 

w terApii genowej nowotworów 

bAdAnie zAleżności poMiędzy strukturą 

i dziAłAnieM pochodnych benzodiAzepiny. 

część i. nie-nukleozydowe inhibitory 

odwrotnej trAnskryptAzy wirusA hiV-1 000 

wątrobowy i nerkowy ukłAd MonooksygenAz 

zAleżnych od cytochroMu p450: 

wpływ glikolu etylenowego 

i 4-MetylopirAzolu 

1


PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH 

Miesięcznik 

Redaktor Naczelny: 

Prof. dr hab. Krystyna Olczyk 

Adres redakcji: 

41-200 Sosnowiec, ul. Jedności 8 

Tel. 500 722 219 

Fax. 032/364-11-34 

Mail: fpn@kwiecinski.pl 

Konsultacyjna Rada Naukowa 

Przewodniczący: 

Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec 

Członkowie: 

Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok 

Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków 

Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź 

Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak -Lublin 

Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań 

Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin 

Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec 

Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice 

Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa 

Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok 

Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław 

Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin 

Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk 

Sekretarz Naukowy: 

Dr n. med. Robert D. Wojtyczka 

Członkowie Kolegium Redakcyjnego: 

Dr n. farm. Paweł Olczyk 

Dr n. biol. Małgorzata Kępa 

Mgr Anna Szeremeta 

Mgr Agnieszka Jura – Półtorak 

Wydawca: 

Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego 

Adres Wydawcy: 


ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała 

tel. (0-33) 817-28-79 fax (0-33)817-36-31 

Prezes: dr n. med. Adam Kwieciński 

Marketing Manager: 

Agnieszka Romańska 

agnieszka.romanska@kwiecinski.pl 

Opracowanie graficzne: 

Robert Cyganik 

Skład: 

Jerzy Partyka 

Nakład: do 7 000 egz. 

Przegląd NaukowyIndex 

Copernicus 2,51 


Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione 

są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja 

zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe 

jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja 

nie odpowiada. 

Spis treści 

AnAlizA zrefundowAnych recept nA Antybiotyki 

przez opolski oddziAł nfz w lAtAch 2005 i 2006 

u osób powyżej 6-go roku życiA objętych 

podstAwową opieką zdrowotną 7 

cukrzycA typu 2 – nowoczesne leczenie 14 

interAkcje dziurAwcA zwyczAjnego 

(Hypericum perforatum) 19 

ModyfikAcjA dostępności fArMAceutycznej 

piroksykAMu z tAbletek z udziAłeM 

wybrAnych solubilizAtorów 24 

osłAbienie sygnAłu generowAnego 

przez receptor β1 integrynowy 

orAz ekspresji receptorA igf-i 

jest odpowiedziAlne zA indukowAne 

przez stres oksydAcyjny upośledzenie 

biosyntezy kolAgenu i wzrostu fibroblAstów. 28 

wpływ stopniA ufosforylowAniA 

bAkteryjnych endotoksyn 

nA ich Aktywność biologiczną 35 

profil ekspresji genów kodujących biAłkA 

związAne z AktywnościA biologiczną leptyny 

w rAku endoMetriuM 43 

rekoMbinowAne wektory wirusowe rAAV 

w terApii genowej nowotworów 48 

bAdAnie zAleżności poMiędzy strukturą 

i dziAłAnieM pochodnych benzodiAzepiny. 

część i. nie-nukleozydowe inhibitory 

odwrotnej trAnskryptAzy wirusA hiV-1 52 

wątrobowy i nerkowy ukłAd MonooksygenAz 

zAleżnych od cytochroMu p450: 

wpływ glikolu etylenowego 

i 4-MetylopirAzolu 61

Szanowni Państwo, 

Koleżanki i Koledzy, 

Drodzy Czytelnicy 

Serdecznie zapraszam na łamy kolejnego numeru Farmaceutycznego 

Przeglądu Naukowego. Zawiera on prace 

o zróżnicowanej tematyce z zakresu nauk farmaceutycznych, 

ale i pokrewnych dziedzin biomedycznych. W niniejszym 

numerze zamieszczamy także krótki, anglojęzyczny 

artykuł pod tytułem „Community pharmacy in Turkey”, a to 

w związku ze zbliżającym się, 69. Międzynarodowym Kongresem 

FIP (International Pharmaceutical Federation), 

który odbędzie się w Stambule, w dniach 3 – 8 września 

bieżącego roku. 

Artykuł pokrótce omawia sytuację społeczno – polityczną 

w Turcji, oczekującej od 1999 roku na przyjęcie 

w poczet członków Unii Europejskiej, i na tym tle – sytuację 

farmaceutów – pracowników aptek ogólnodostępnych, 

także w aspekcie obecnego i prognozowanego zatrudnienia. 

Zamieszcza informacje na temat wybranych zagadnień 

prawa farmaceutycznego, wskazuje najważniejsze zmiany 

w przeddyplomowym kształceniu farmaceutów, odnosząc 

się także do kwestii kształcenia techników farmaceutycznych. 

Warto przeczytać ten syntetyczny opis najważniejszych 

problemów nurtujących farmaceutów w Turcji, kwestii 

wcale nie tak odległych od tych, które napotykamy na 

co dzień i u nas. Autor artykułu wyraża nadzieję, iż nadcho- 

dzący Kongres stanie się sposobnością do żywej dyskusji 

na temat wszystkich problemów nurtujących środowisko 

farmaceutów na całym świecie, do wymiany doświadczeń, 

a nie wykluczone – i sformułowania propozycji dobrych 

rozwiązań, jak i ich wdrożenia tam, gdzie w oparciu o doświadczenia 

innych można je zastosować. 

Szanowni Państwo, 69. Międzynarodowy Kongres FIP, 

to nie jedyne międzynarodowe wielkie wydarzenie o charakterze 

naukowym i edukacyjnym. Znacznie wcześniej 

bowiem, w dniach 18 – 20 czerwiec bieżącego roku, odbędzie 

się coroczna konferencja Europejskiego Stowarzyszenia 

Wydziałów Farmaceutycznych – EAFP (European 

Association of Faculties of Pharmacy), w Oslo, a poświęcona 

będzie ona nowym zagadnieniom w szkoleniu podyplomowym 

farmaceutów. Informację na ten temat przedstawię 

w kolejnym numerze naszego FPN. 

A tymczasem, tradycyjnie, zachęcam Państwa do nieustawania 

w publikowaniu prac w Farmaceutycznym Przeglądzie 

Naukowym, dla dobra nas wszystkich – i czytelników 

i autorów. 

Życząc fascynującej lektury oraz twórczego natchnienia; 

serdecznie pozdrawiam. 

Redaktor Naczelny 

Prof. dr hab. n. med. Krystyna Olczyk

A photo taken at the “That’s Enough!” 

Pharmacy Demonstration on December 21, 

2009 in Ankara, Turkey 

(Courtesy of the Turkish Pharmacists 

Association) 

FACTS & FIGURES 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Register at www.fip.org/istanbul2009

Register at www.fip.org/istanbul2009

Farm Przegl Nauk, 2009,2, 7-13 


Analiza zrefundowanych recept na antybiotyki 

przez Opolski Oddział NFZ w latach 2005 i 2006 u osób 

powyżej 6-go roku życia objętych Podstawową Opieką Zdrowotną 

An analysis of the refunded prescriptions for antibiotics by the 

Department of National Foundation of Health, Region Opole 

(Opolski Oddział NFZ), in the years of 2005 and 2006, in individuals 

above 6-year of age, in the Primary Care settings (POZ) 

krystian Adamik 1 , Adam tomczyk 1 , robert janiec 2 , witold lukas 1 , witold drzastwa 1 , 

elżbieta Mizgała 1 , kazimierz łukawiecki 3 , roman kolek 3 , lech panasiuk 4 

1 katedra i zakład Medycyny rodzinnej śląskiego uniwersytetu Medycznego 

2 katedra farmacji społecznej, zakład farmakoekonomiki, wydział farmaceutyczny 

z oddziałem Medycyny laboratoryjnej śląskiego uniwersytetu Medycznego 

3 opolski odział wojewódzki narodowego funduszu zdrowia 

4 instytut Medycyny wsi w lublinie 

katedra i zakład Medycyny rodzinnej śuM – prof. dr hab. n. med. witold lukas 

Wstęp. Nadużywanie antybiotyków w leczeniu ostrych 

stanów zapalnych dróg oddechowych w POZ jest istotnym 

problemem zdrowia publicznego. Celem pracy 

była analiza nawyków preskrypcyjnych lekarzy POZ 

dotyczących antybiotyków w dwóch grupach wiekowych 

pacjentów: 7-65. i powyżej 65. r.ż. z uwzględnieniem 

klasyfikacji chemiczno-terapeutycznej oraz 

porównanie ich w poszczególnych jednostkach administracyjnych 

województwa opolskiego w latach 2005 

i 2006. Materiał i metody. Przeprowadzono analizę 

702 417,35 zrefundowanych opakowań antybiotyków 

(332 263,57 w roku 2005 i 370 154.78 opakowań 

w roku 2006) podzielonych na 14 grup chemiczno-terapeutycznych 

w określonych obszarach administracyjnych 

województwa opolskiego dotyczących dwóch 

grup wiekowych pacjentów: 7-65. r.ż. i powyżej 65. roku 

życia. Porównano nawyki preskrypcyjne lekarzy POZ pracujących 

w środowisku miejskim i pozamiejskim. Wyniki. 

W grupie wiekowej 7-65. r.ż najczęściej przepisywano 

penicyliny o szerokim spektrum działania, cefalosporyny 

i ich pochodne oraz makrolidy a najrzadziej fluorochinolony, 

linkozamidy oraz połączenia sulfonamidów 

z trimetoprimem. W grupie wiekowej powyżej 65. r.ż. dominują 

pochodne nitrofuranu oraz cefalosporyny i ich pochodne. 

Stwierdzono istotnie statystyczny wzrost średnich ilości 

zrefundowanych opakowań antybiotyków, przypadających 

na jednego podopiecznego w obu analizowanych grupach 

wiekowych w 2006 w porównaniu do roku poprzedniego. 

Omówienie wyników. Zwraca uwagę odmienność 

profilu stosowanych antybiotyków w analizowanych 

grupach wiekowych, zwiększanie się ilości przepisywanych 

antybiotyków na jednego mieszkańca oraz 

różnice przepisywalności antybiotyków w powiecie 

w porównaniu do miasta. 

Wnioski. 1. W obserwowanym okresie 2005-2006 

stwierdzono w województwie opolskim istotny wzrost 

ilości przepisywanych opakowań antybiotyków przypadających 

na jednego mieszkańca. 2. Stwierdzono 

znamiennie większą przepisywalność antybiotyków 

w populacji osób powyżej 65. r.ż. w porównaniu do pacjentów 

z grupy 7-65. r.ż.. 3.Obserwowano odmienność 

profilu stosowanych antybiotyków z dominacją pochodnych 

nitrofuranu, w grupie powyżej 65. r.ż. w porównaniu 

do grupy 7-65. r.ż.. 

Introduction. Overuse of antibiotics in treatment of the 

acute inflammations of the respiratory tract, in the Primary 

Care settings (POZ), represents an important problem 

of the public health system. Objective. The purpose 

of this study was an analysis of the prescribing habits 

of the Primary Care (POZ) physicians, related to the use 

antibiotics in patients within the two age groups: 7-65 

year-old and above 65 year-old, considering the ATC 

(anatomical-therapeutic-chemical) classification (according 

to WHO), and their comparison in all the particular 

administrative units of the region “opolskie”, in the year 

of 2005 and 2006. Material and Methods. An analysis 

of 702 417, 35 of the refunded boxes of antibiotics was 

conducted (332 263, 57 boxes - in the year of 2005, and 

370 154,78 boxes - in the year of 2006), divided into 

14 ATC groups, according to the specific administrative 

units of the region “opolskie”, with relation to the 

two age groups: 7-65 year-old and above 65 year-old. 

Prescribing habits of Primary Care (POZ) physicians, 

working in the urban settings vs. non- urban settings 

(e.g.: suburban or rural) were compared. Results. In the 

age group of 7-65 years, the most commonly prescribed 

antibiotics included: penicillins with the broad spectrum 

7

Farm Przegl Nauk, 2009,2 

WSTĘP 

Nadużywanie antybiotyków w leczeniu ostrych stanów 

zapalnych dróg oddechowych w POZ jest istotnym 

problemem zdrowia publicznego. Antybiotyki stanowią 

12% spośród wszystkich leków zlecanych przez lekarzy 

POZ [1,2]. W porównaniu do całego systemu opieki zdrowotnej, 

ponad 80% terapii antybiotykowej jest zlecanych 

w POZ, a nie ma wskazań do ich stosowania aż w 50%. 

Systematyczny przegląd piśmiennictwa wskazuje na małą 

skuteczność antybiotykoterapii w leczeniu stanów zapalnych 

dróg oddechowych. Jest to uzasadnione, ponieważ 

przepisywanie antybiotyków w przypadku przeziębienia, 

zapalenia gardła, ostrego zapalenia oskrzeli, biorąc pod 

uwagę ich najczęstszą (70-80%) etiologię wirusową, daje 

marginalne efekty lecznicze. Związek pomiędzy narastaniem 

oporności bakterii a nadmiernym stosowaniem antybiotyków 

jest dobrze udokumentowany [3,4,5]. Szczególnie 

ważnym problemem jest narastanie oporności bakterii 

wskutek stosowania antybiotyków o szerokim spektrum 

działania. Zgodnie z rekomendacjami europejskimi jak 

i polskimi, antybiotyki o szerokim spektrum działania nie powinny 

być stosowane w POZ jako leki pierwszego rzutu [6]. 

Dobrze rozpoznany jest problem nadużywania antybiotyków 

u niemowląt i małych dzieci do 6. roku życia oraz osób dorosłych 

w aspekcie następstw klinicznych wynikających 

z nasilenia oporności, modyfikacji flory bakteryjnej oraz indukowania 

schorzeń alergicznych, natomiast zdecydowanie 

mniej badań dotyczy przepisywania antybiotyków w wieku 

podeszłym [3,4,5,]. Wpływ na podjęcie decyzji stosowania 

antybiotyków u osób powyżej 65. r.ż. ma szereg czynników 

w tym wielochorobowość, rodzaj schorzeń przewlekłych np. 

cukrzyca typu 2, zaburzenia procesów poznawczych, oczekiwania 

rodzin i opiekunów czy też poczucie bezpieczeństwa 

lekarza leczącego. W USA, w krajach europejskich jak 

również ostatnio w Polsce podjęto działania zmierzające do 

racjonalizacji stosowania antybiotyków zarówno u dzieci 

jak i dorosłych. Problemem otwartym jest skuteczność podejmowanych 

interwencji, czy to na szczeblu populacyjnym 

czy w warunkach praktyki POZ. Dobrym przykładem w tej 

8 

of action, cephalosporins and their derivatives, and macrolides. 

The least commonly prescribed antibiotics in 

this group included: fluorochinolones, linkozamides, 

and combinations of sulfonamides and trimethoprim. In 

the age group above 65 years, the derivatives of nitrofurantoin, 

as well as cephalosporins and their derivatives 

were predominant. A statistically significant increase 

of the mean amount of the refunded boxes of antibiotics 

“per capita” in both of the analyzed age groups in 

the year of 2006, in comparison with the previous year 

was noted. Discussion. A different profile of the used 

antibiotics in the analyzed age groups, an increase of 

the amount of prescribed antibiotics “per capita”, and 

differences in the pattern of prescribing antibiotics were 

noted between urban vs. non- urban settings. Conclusions. 

1.During the observed period 2005-2006, in the 

„opolskie” region, a statistically significant increase of 

the amount of prescribed boxes of antibiotics “per capi- 

ta” was found. 2. A considerable increase of the prescribing 

pattern of antibiotics in the population above 65 

years, in comparison to patients from the age group of 

7-65 years was also noted. 3. A different profile of the 

used antibiotics, including a predominance of the nitrofurantoin 

derivatives, in the group above 65 years, in 

comparison with the age group 7-65 years was observed 

as well. 

Słowa kluczowe: 

Nawyki preskrypcyjne; wiek podeszły; lekarz rodzinny; 

antybiotykoterapia; podstawowa opieka zdrowotna 

Key words: 

Prescription habits; alder people; family doctors; antibiotics 

therapy; primary care 

dziedzinie są interwencje polegające na udostępnieniu lekarzom 

POZ szybkich testów bakteryjnych oraz testów bakteryjnych 

z równoczesnym oznaczaniem poziomu CRP, a także systematyczne 

szkolenia dotyczące zasad stosowania antybiotyków. 

Stałe monitorowanie nawyków preskrypcyjnych lekarzy 

POZ może stanowić istotne źródło informacji o skuteczności 

podejmowanych działań mających na celu poprawę w tym zakresie 

sytuacji w Polsce. Procesom tym powinno towarzyszyć 

podnoszenie świadomości społeczeństwa na temat zagrożeń 

związanych z niewłaściwym stosowaniem antybiotyków. 

CELE PRACY 

1. Analiza nawyków preskrypcyjnych antybiotyków 

w dwóch grupach wiekowych: 7-65. i powyżej 65r.ż. 

z uwzględnieniem klasyfikacji chemiczno-terapeutycznej. 

2. Ocena wyników w poszczególnych jednostkach administracyjnych 

województwa opolskiego i ocena dynamiki 

zmian ilościowych i jakościowych przepisywanych antybiotyków 

w latach 2005 i 2006. 

3. Porównanie nawyków preskrypcyjnych lekarzy POZ 

pracujących w środowisku miejskim i pozamiejskim 

(podmiejskim i wiejskim). 

MATERIAŁ I METODA 

Przeprowadzono analizę danych udostępnionych 

przez Opolski Oddział NFZ pochodzących z zestawień 

refundacyjnych aptek otwartych z lat 2005 i 2006. Dane 

zawierały zagregowane roczne ilości zrefundowanych 

opakowań antybiotyków podzielonych na 14 grup chemiczno-terapeutycznych, 

z określonymi obszarami administracyjnymi 

miejsca realizacji recept z dokładnością 

do powiatu oraz określoną ilością zarejestrowanych 

w POZ podopiecznych w dwóch grupach: 7-65. r.ż. i powyżej 

65. roku życia. Podział na grupy wiekowe 0-6., 7-65. 

i powyżej 65. wynikał z przyjętego przez NFZ systemu rozliczeniowego. 

Grupa pacjentów w wieku od 0 do 6. r.ż. była 

poddana odrębnej analizie, której wyniki są przedstawione 

w osobnej publikacji.

Powiaty województwa opolskiego różnią się między 

sobą liczbą zarejestrowanych podopiecznych. Stwierdzono 

nieznaczny spadek liczby podopiecznych w analizowanych 

latach w obrębie tego samego powiatu. Celem 

uniknięcia wpływu różnic w liczbie zarejestrowanych 

podopiecznych w latach oraz różnic liczebności między 

powiatami część analiz porównawczych przeprowadzono 

zestawiając ilorazy rocznych ilości zrefundowanych opakowań 

antybiotyków i zarejestrowanych podopiecznych 

w przeliczeniu na jeden statystyczny powiat. Dla porównania 

nawyków proskrypcyjnych lekarzy POZ pracujących 

w środowisku miejskim i pozamiejskim wybrano miasto 

Opole i powiat opolski. Szczegółowej analizie poddano 

ponad 90% najczęściej refundowanych antybiotyków. 

Ocenę uzyskanych danych przeprowadzono w oparciu 

o statystykę opisową i wyznaczono wartości średnie. Ponadto 

dane poddano analizie wariancji (ANOVA/MANOVA), 

a w przypadku ujawnienia znamiennych statystycznie efektów 

głównych, znamienność statystyczną różnic średnich 

w grupach określono w trybie post hoc (test NIR). Celem 

uzyskania odpowiedzi na pytanie czy istnieją różnice w nawykach 

preskrypcyjnych pomiędzy lekarzami pracującymi 

w środowisku miejskim i pozamiejskim otrzymane dane 

znormalizowano metodą unitaryzacji klasycznej zgodnie ze 

wzorem: 

x – min(x ;xj) 

i i 

x = ij 

max(x ;xj) – min(x ;xj) 

i i 

(gdzie x ij są elementami porównywanych zbiorów). 

Wszystkie analizy statystyczne były przeprowadzane przy 

użyciu komputerowego programu STATISTICA Wer.7.1, 

StatSoft. 

WYNIKI BADAŃ 

Łącznie poddano analizie 702 417,35 opakowań 

antybiotyków (332 263,57 w roku 2005 

i 370 154,78 opakowań w roku 2006). W grupie wiekowej 

7-65 556 552,66 opakowań (262339,41 w roku 

2005, 294 213,25 w roku 2006) oraz 145 865,69 opakowań 

(69924,16 rok 2005, 75941,53 rok 2006) w grupie 

wiekowej powyżej 65. roku życia. Liczba osób w wieku 

7-65 zaoptowanych na listach aktywnych POZ województwa 

opolskiego w roku 2005 wynosiła 734 405, a w 2006 

727 768. W grupie powyżej 65. roku życia liczby te wynosiły 

odpowiednio 131 616 oraz 125 252. 

Stwierdzono duże różnice w ilości opakowań poszczególnych 

analizowanych antybiotyków w grupach wiekowych 

(Ryc.1). 

Celem określenia częstości przepisywania poszczególnych 

grup antybiotyków przeliczono ilość zrefundowanych 

opakowań na jednego podopiecznego. W grupie 

wiekowej 7-65. r.ż. najczęściej przepisywano penicyliny 

o szerokim spektrum działania nastepnie cefalosporyny 

i ich pochodne (o 28 % mniej) oraz makrolity (mniej o 31%), 

a najrzadziej fluorochinolony, linkozamidy oraz połączenia 

sulfonamidów z trimetoprimem (ponad 80% mniej). 

W grupie wiekowej powyżej 65. r.ż. dominują pochodne nitrofuranu 

oraz cefalosporyny i ich pochodne. Zwraca uwagę 

wysoka pozycja tetracyklin i fluorochinolonów. Najrzadziej 


9


Tabela I. Ilość podopiecznych, średnia ilość opakowań na podopiecznego oraz różnica w latach 2005 

i 2006 w powiatach woj. opolskiego w grupie wiekowej 7-65 r.ż. 

powiaty 

Ilość podopiecznych 

2005 2006 

Ilość opakowań na podopiecznego 

2005 2006 Δ 

Miasto Opole 89643 89052 0,32 0,36 0,04 

Powiat opolski 84385 83835 0,38 0,41 0,03 

Powiat strzelecki 52669 52366 0,38 0,43 0,04 

Powiat prudnicki 41228 41142 0,43 0,43 0,00 

Powiat kluczborski 51143 50412 0,34 0,36 0,02 

Powiat kędzierzyńskokozielski 

70744 70153 0,37 0,39 0,02 

Powiat głubczycki 36580 36175 0,40 0,51 0,11 

Powiat brzeski 71164 70443 0,39 0,44 0,05 

Powiat krapkowicki 47296 46957 0,34 0,41 0,07 

Powiat namysłowski 32528 32297 0,29 0,35 0,05 

Powiat nyski 111251 109540 0,35 0,42 0,07 

Powiat oleski 45774 45396 0,28 0,34 0,06 

Tabela II. Ilość podopiecznych, średnia ilość opakowań na podopiecznego oraz różnica w latach 

2005 i 2006 w powiatach woj. opolskiego u osób wieku powyżej 65 r.ż. 

powiaty 

Ilość podopiecznych 

2005 2006 

Ilość opakowań na podopiecznego 

2005 2006 Δ 

Miasto Opole 15706 15001 0,41 0,58 0,17 

Powiat opolski 15960 15207 0,59 0,70 0,12 

Powiat strzelecki 9775 9304 0,54 0,58 0,04 

Powiat prudnicki 8717 8337 0,55 0,58 0,03 

Powiat kluczborski 8784 8316 0,57 0,59 0,03 

Powiat kędzierzyńskokozielski 

13105 12534 0,46 0,46 0,00 

Powiat głubczycki 6781 6393 0,58 0,76 0,18 

Powiat brzeski 11901 11313 0,61 0,67 0,06 

Powiat krapkowicki 7990 7605 0,46 0,53 0,07 

Powiat namysłowski 5349 5060 0,41 0,54 0,13 

Powiat nyski 19074 18076 0,49 0,64 0,15 

Powiat oleski 8474 8106 0,58 0,59 0,01 

z pośród szczegółowo analizowanych grup przepisywane 

były linkozamidy i połączenia sulfonamidów z trimetoprimem 

(ponad 90% mniej). Porównując częstość przepisywania 

poszczególnych klas antybiotyków w grupach wie- 

10 

kowych stwierdzono różnice 

w ich profilu. I tak w grupie 

wiekowej powyżej 65. r.ż. 

o 414% częściej przepisuje 

się pochodne nitrofuranu, 

a o 326% fluorochinolony. 

Wysoką pozycję zajmują też 

cefalosporyny i tetracykliny, 

natomiast penicyliny o szerokim 

spektrum działania są 

o 31% rzadziej przepisywane 

niż w młodszej grupie (Ryc. 2). 

Stwierdzono istotnie statystyczny 

wzrost średnich ilości 

zrefundowanych opakowań 

antybiotyków, przypadających 

na jednego podopiecznego 

w grupie wiekowej 7-65. 

r.ż. we wszystkich powiatach 

woj. opolskiego w 2006 w porównaniu 

do roku poprzedniego 

(p=0,017). Średnio w 2005 

przypadało 0,36 opakowania 

na jednego podopiecznego 

a 2006 0,40 (Ryc.3). 

Stwierdzono również 

istotnie statystyczny wzrost 

średnich ilości zrefundowanych 

opakowań antybiotyków, 

przypadających na jednego 

podopiecznego u osób powyżej 

65. roku życia we wszystkich 

powiatach woj. opolskie- 

Tabela III. Średnie ilości zrefundowanych opakowań antybiotyków w latach 2005 i 2006 w mieście Opole i powiecie opolskim na 

jednego podopiecznego 7-65 r.ż. stanowiących ponad 90% wszystkich zrefundowanych antybiotyków (ilość opakowań/ 

ilość podopiecznych/rok [‰]). 

gr. 

7-65 

gr. 

pow.65 

penicyliny o szerokim 

spektrum działania 

cefalosporyny i ich 

pochodne 

makrolidy 

połączenie penicyliny 

z inhibitorami 

b-laktazmy 

tetracykliny 

pochodne nitrofuranu 

fluorochinolony 

go w 2006 w porównaniu do roku poprzedniego (p=0,014). 

Średnio w 2005 przypadało 0,52 opakowania na jednego 

podopiecznego a 2006 0,60 (Ryc.4). 

linkozami-dy 

połączenia 

sulfonamidów z 

trimetoprimem i jego 

poch. 

‘05 ‘06 ‘05 ‘06 ‘05 ‘06 ‘05 ‘06 ‘05 ‘06 ‘05 ‘06 ‘05 ‘06 ‘05 ‘06 ‘05 ‘06 

Opole 

miasto 

56 51 58 68 70 77 38 40 37 44 19 31 14 17 8 11 8 8 

Opole 

powiat 

Opole 

85 82 77 82 59 60 43 48 38 46 22 31 13 16 12 15 12 10 

miasto 

Opole 

36 34 58 68 70 77 38 40 37 44 88 142 14 17 7 10 8 8 

powiat 69 61 77 82 59 60 43 48 38 46 103 166 13 16 8 11 12 10

Ponadto stwierdzono istotnie statystyczny wzrost przepisywalności 

antybiotyków w grupie osób powyżej 65. roku życia 

w porównaniu do grupy z przedziału wiekowego 7-65. zarówno 

w 2005 jak i 2006. Średnia ilość opakowań z dwóch lat 

w grupie 7-65. wyniosła 0,38 opakowania, a w grupie osób 

powyżej 65. wyniosła 0,56 opakowania średnio na rok 

(p


torzy [9]. Zjawisko to może być uzasadnione dobra skutecznością, 

tolerancją i bezpieczeństwem tych leków i ,przede 

wszystkim, stanem klinicznym pacjenta. 

W grupie 7-65 dominują penicyliny o szerokim spektrum 

działania, a makrolidy stosowane są na równi z cefalosporynami. 

Na dominację tej grupy penicylin mogły 

mieć wpływ również dzieci i młodzież w wieku 7 -18 lat. 

Niezależnie jednak od czynników wpływających na przedstawione 

nawyki preskrypcyjne w tej grupie chorych uderza 

fakt niezgodności z obowiązującymi rekomendacjami, 

zwraca uwagę minimalny udział penicylin o wąskim spektrum 

działania i znacząca obecność makrolidów. Związek 

pomiędzy narastaniem oporności bakterii a nadmiernym 

stosowaniem antybiotyków jest dobrze udokumentowany 

[3,4,5,6,8,9]. Wiąże się to zjawisko z selekcją opornych 

szczepów bakteryjnych, co prowadzi do rozprzestrzenienia 

genów opornych poprzez przenoszenie na inne bakterie 

i redukuje skuteczność antybiotykoterapii [5]. Narastanie 

oporności bakterii stało się wyzwaniem dla zdrowia 

publicznego na całym świecie [8]. Należy podkreślić, 

że oporność na antybiotyki narasta w alarmującym stopniu 

zarówno w lecznictwie szpitalnym jak i otwartym. Badania 

amerykańskie wskazują, że wrażliwość na penicyliny w latach 

1994 -2000 zmalała z 76% do 66%, na erytromycynę 

z 90% na 74%, a 1/3 izolatów pneumokoków jest niewrażliwa 

na penicyliny [6]. 

Analiza nawyków preskrypcyjnych powinna również 

uwzględnić miejsce funkcjonowania lekarza POZ. 

Znaczenie dla podjęcia decyzji terapeutycznej i zastosowania 

antybiotyku może mieć różny dostęp w środowisku 

miejskim i pozamiejskim do ośrodków referencyjnych, 

nocnej i świątecznej ambulatoryjnej i wyjazdowej 

opieki lekarskiej, dostęp do placówek POZ jak również 

dostępność do różnego rodzaju zdarzeń edukacyjnych. 

W badanym materiale stwierdzono znamiennie częstsze 

przepisywanie antybiotyków przez lekarzy pracujących 

w ośrodkach pozamiejskich w porównaniu do lekarzy zatrudnionych 

na terenie miasta. 

Podsumowując, zaletą przedstawianej analizy była możliwość 

korzystania z kompletnej, elektronicznej bazy obejmującej 

wszystkie zrealizowane zlecenia na antybiotyki 

w aptekach województwa opolskiego. Ponadto możliwe było 

zidentyfikowanie miejsca działalności świadczeniodawcy 

– powiat, środowisko miejskie i pozamiejskie. Ograniczeniem 

był brak dostępu do danych klinicznych pacjenta, stosunkowo 

szeroki podział grup wiekowych determinowany 

systemem finansowania. 

Niezależnie od kampanii prowadzonych przez media 

medyczne, jak i instytucje publiczne, na rzecz ograniczania 

stosowania antybiotyków lekarze POZ nadal nie dysponują 

odpowiednimi narzędziami sprzyjającymi racjonalizacji leczenia 

stanów zapalnych. Przede wszystkim, konieczny jest 

szybki i szeroki dostęp do systematycznie aktualizowanych 

rekomendacji, umożliwienie stosowania szybkich testów 

bakteryjnych oraz łatwiejszego korzystania z szerokiej diagnostyki 

mikrobiologicznej. Ważne jest szkolenie w zakresie 

zasad antybiotykoterapii lekarzy i pielęgniarek, jak również 

wdrażanie strategii polegającej na podnoszeniu świadomości 

zdrowotnej pacjentów, zachęcanie ich do współuczestniczenia 

w procesie podejmowania decyzji terapeutycznej. Szczegól- 

12 

nie ważnym dla lekarza POZ jest poświęcenie odpowiedniej 

ilości czasu podczas konsultacji lekarskiej na przekonanie 

pacjenta o nieskuteczności stosowania terapii antybiotykowej 

w przypadku infekcji wirusowej. Kluczową rolę 

w odwróceniu trendu nadkonsumpcji antybiotyków powinni 

spełnić lekarze POZ a przede wszystkim lekarze 

rodzinni. 

WNIOSKI 

1. W obserwowanym okresie 2005-2006 stwierdzono w województwie 

opolskim istotny wzrost ilości przepisywanych 

opakowań antybiotyków przypadających na jednego 

mieszkańca. 

2. Stwierdzono znamiennie większą przepisywalność antybiotyków 

w populacji osób powyżej 65. r.ż. w porównaniu 

do pacjentów z grupy 7-65. r.ż.. 

3. Obserwowano odmienność profilu stosowanych antybiotyków 

z dominacją pochodnych nitrofuranu, w grupie 

powyżej 65. r.ż. w porównaniu do grupy 7-65. r.ż.. 

Piśmiennictwo 

1. Wood F., Simpson S., Butler C.C.:Socially responsible 

antibiotic choices in primary care: a qualitative study 

of GPs’ decisions to prescribe broad-spectrum and 

fluroquinolone antibiotics. Family Practice 2007;24, 

427-434. 

2. Wise R, Hart T, Cars O et al. Antimicrobial resistance: is 

a major threat to public health. BMJ 1998 17:609-610 

3. Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al. Increasing 

prevalence of multidrug-resistant Streptococcus 

pneumonia in the United States.N Engl J Med. 

2000,343,1917-1924. 

4. Hyde TB, Gay K, Stephens DS, et al. Macrolide resistance 

among invasive Streptococcus isolates. JAMA. 

2001,286,1857-1862. 

5. Jackson C. i wsp.: Promoting adherence to antibiotics: A 

test of implementation intentions. Patient Education and 

Counseling 2006;61, 212-218. 

6. Kelley M. Feasibility of a Primary Care Intervention to 

Decrease Oral Antibiotics for Acute Upper Respiratory 

Tract Infections: A Pilot Study.NC Med J 2006;67,4, 

249-254. 

7. Veyssier P. Antibiotic therapy in the elderly [Antibiotherapie 

chez le sujet age].Rev Prat 2003;53(14) 

1566-71. 

8. Crigger N.J. I wsp.: Development of the choices and 

acquisition of antibiotics model from a descriptive study 

of a lay Honduran population. Int J Nurs Stud 2004;41, 

745-53. 

9. Mazzaglia G., Caputi A.P., Rossi A., Bettoncelli G., 

Stefanini G., Ventriglia G., Nardi R., Brignoli O., Cridelli 

C.: Exploring patient- and doctor-related variables 

associated with antibiotic prescribing for respiratory 

infections in primare care.Eur J Clin Pharmacol 

2003;59,651-657. 

10. Bradley CP, Decision making and prescribing pattern-a 

literature review. Fam Pract 1991;8:276-287.


11. Hrissos S., Eccles M., Johnston M., Francis J., Kaner 15. Sahlan S. I wsp.: Reducing unnecessary prescriptions of 

E.F.S., Steen N., Grimshaw J. An intervention modeling antibiotics for acute cough: adaptation of a leaflet aimed 

experiment to change GPs’ intentions to implement evi- at Turkish immigrants in Germany.BMC Family Practice 

dence-based practice: using theory-based interventions 2008; 9:57, 1-7. 

to promote GP management of upper respiratory tract 16. Guarner F., Malagelada J.R. Gut flora in health and diseinfection 

without prescribing antibiotics.BMC Health ase. Lancet 2003,361,512- 519. 

Services Research 2008;8:10 doi:10.1186/1472-6963- 17. San Joaquin VH, Stull TL: Antibacterial agents in pedia- 

8-10. 

trics. Infect Dis Clin North Am 2000,14,341-355. 

12. Dosh S. Antibiotics for upper respiratory infections. Let- 18. Kozyrskyj A.L., Ernst P., Becker A.B.: Increased risk of 

ters to the Editor.J Fam Med 2000;49,(10). 

childhood asthma from antibiotic use in early life. Chest 

13. Panasiuk L.,Lukas W. Paprzycki P.:Empirical first- 2007,131,1753-9 

line antibioticotherapy In adult rural patients with 19. Lacey D.:Tube feeding, antibiotics, and hospitalization 

acute respiratory tract infections.AAEM 2007; 14, of nursing home residents with end-stage dementia:Pre- 

159-167. 

scription of key medical decision-makers. Am J Alzhe- 

14. Chlabicz S., Ołtarzewska A.M. Pytel-Krolczuk B.:Re- imers Dis Other Demen 2005; 20(4) 211-9. 

spiratory tract infections:diagnosis and use of antibiotics 20. Walker S. I wsp.: Why are antibiotics prescribed for 

by family physicians in north-eastern Poland.Int J Anti- asymptomatic bacteriuria in institutionalized elderly pemicrob 

Agents 2004;23, 446-450. 

ople? CMAJ 2000;163(3), 273-277. 

Adres do korespondencji: 

Krystian Adamik 

ul. 3-go Maja13-15; 41-800 Zabrze 

Tel. 32/271 91 22 

E – mail: krystian.adamik@poz.opole.pl 

13


Cukrzyca typu 2 – nowoczesne leczenie 

dominik kołodziej, dorota jabłecka, dominika grigier, dominika drużba 

katedra i zakład toksykologii 

śląskiego uniwersytetu Medycznego w sosnowcu 

kierownik placówki: prof. dr hab. jerzy kwapuliński 

Streszczenie 

Cukrzyca jako zaburzenie metaboliczne o wieloczynnikowej 

etiologii, charakteryzuje się przewlekłą hiperglikemią 

oraz towarzyszącymi zaburzeniami gospodarki 

węglowodanowej, lipidowej i białkowej wynikającymi 

z zaburzeń wydzielania insuliny i/lub defektu jej działania 

w poszczególnych tkankach. Cukrzyca typu 2 

jest następstwem interakcji czynników genetycznych 

i środowiskowych, prowadzących do defektów sekrecji 

i działania insuliny. Patogeneza cukrzycy typu 2 jest kompleksowa 

i nie do końca wyjaśniona, jednakże głównym 

czynnikiem etiologicznym jest oporność komórek na endogenna 

insulinę. Poważnym problemem osób chorych 

na cukrzycę jest zwiększone ryzyko powikłań w postaci 

mikroangiopatii (retinopatie i nefropatie) oraz makroangiopatii 

wpływające na skrócenie średniego czasu życia 

w porównaniu do populacji ogólnej. Nie bez znaczenia 

pozostaje również spadek jakości życia osób chorych na 

cukrzycę. Liczba chorych cierpiących z powodu cukrzycy 

systematycznie rośnie. Przewiduje się iż w 2030 roku 

na cukrzycę będzie chorowało 4,4% ludności świata. 

W pracy przedstawiono aktualne standardy i leki stosowane 

w leczeniu cukrzycy typu 2. 

Słowa kluczowe: cukrzyca, powikłania naczyniowe, doustne 

leki przeciwcukrzycowe 

Cukrzyca (diabetes mellitus), czyli zespół zaburzeń polegających 

na nieprawidłowej regulacji metabolizmu węglowodanów, 

lipidów i białek z powodu upośledzenia wydzielania 

insuliny i/lub spadku wrażliwości tkanek obwodowych 

na insulinę, staje się coraz częściej diagnozowaną jednostką 

chorobową, zarówno w Polsce jak i na świecie. 

Z roku na rok liczba chorych na cukrzycę systematycznie 

rośnie. W 1994 roku w Polsce zdiagnozowano 775 tysięcy 

przypadków cukrzycy typu 2, a w roku 2000 już 1 147 

tysięcy. Szacuje się, iż w 2010 roku na cukrzycę typu 2 

w Polsce będzie chorowało 1 519 tysięcy osób. Biorąc 

pod uwagę powyższe dane, można stwierdzić, iż cukrzyca, 

w tym szczególnie cukrzyca typu 2, jest jednym z głównych 

problemów zdrowotnych początku XXl wieku. 

Patogezeza 

Cukrzyca, ze względu na wieloczynnikową etiologię 

oraz zróżnicowany przebieg nie jest chorobą jednolitą. 

Współczesny podział obejmuje cukrzycę typu 1, typu 2 oraz 

określone, specyficzne typy cukrzycy (np. cukrzyca ciężarnych). 

14 

Summary 

Diabetes, as a functional disorder of multiple-factor 

aetiology, is characterised by a chronic hyperglycaemia 

and the accompanying carbohydrate, protein and lipid 

metabolism disorders resulting from aberration in the 

secretion of insulin and/or its dysfunction in individual 

tissues. Type 2 diabetes is a consequence of interaction 

of genetic and environmental factors, leading to defects 

in the secretion and action of insulin. The pathogenesis of 

type 2 diabetes is complex and still not fully explained. 

Nevertheless, cell resistance to the endogenous insulin 

(insuline resistance, IR) seems to be the major factor. The 

increased risk of complications such as microangiopathy 

(retinopathies and nephropathies) or macroangiopathy, 

lowering the life expectance in relation to the general population, 

is a serious problem of people suffering from 

type 2 diabetes. The reduction in the quality of life of 

people with diabetes is significant as well. The number 

of people affected by diabetes increases systematically. 

It is expected that in 2030, 4,4 % of world’s population 

will be suffering from diabetes. The work presents the 

current standards and drugs used in the treatment of type 

2 diabetes. 

Key words: diabetes, vascular complications, oral antidiabetic 

drugs 

Cukrzyca typu 2 (dawniej nazywana insulinoniezależną) 

to najczęstsza postać cukrzycy występująca u 85-90 % 

wszystkich chorych. Do rozwoju cukrzycy przyczyniają się 

zarówno predyspozycje genetyczne, jak i czynniki środowiskowe 

(mała aktywność fizyczna, zbyt duża podaż kalorii, 

przewlekły stres, depresja, nadużywanie alkoholu i nikotynizm). 

Do najważniejszych czynników patogenetycznych cukrzycy 

typu 2 zalicza się dysfunkcję komórek β trzustki oraz 

insulinooporność, jednakże zakres ich występowania może 

znacznie różnić się u poszczególnych chorych. 

Rozwój naturalny cukrzycy przedstawia schemat na sąsiedniej 

stronie. 

Do tej pory nie udało się jednoznacznie stwierdzić co 

jest głównym czynnikiem indukującym rozwój cukrzycy. 

Powyższy wykres pokazuje jednak, iż insulinooporność 

rozwija się podczas całego życia, natomiast wzrost ten 

nie jest jednoznaczny z wystąpieniem objawów cukrzycy 

z uwagi na mechanizmy kompensacyjne w postaci zwiększonej 

produkcji insuliny w komórkach β trzustki. Dopiero 

spadek insulinosekrecji, spowodowany dysfunkcją komórek 

β, prowadzi do wystąpienia nieprawidłowego stężenia glu-

kozy na czczo (glikemia na czczo w granicach 100 – 125 mg/ 

dl) oraz zaburzonej tolerancji glukozy (glikemia 2 godziny 

po doustnym obciążeniu 75g glukozy w przedziale 140 – 199 

mg/dl), a z upływem czasu do pełnoobjawowej cukrzycy. 

Uważa się, że insulinooporność może mieć charakter 

przedreceptorowy (przyspieszony metabolizm insuliny, 

synteza insuliny o nieprawidłowej budowie), receptorowy 

(nieprawidłowy receptor insulinowy oraz zmniejszenie 

liczby receptorów w organizmie) i poreceptorowy (mutacja 

genów białek odpowiedzialnych za wewnątrzkomórkową 

transmisję sygnału pobudzenia receptora oraz dysfunkcja 

transporterów glukozy – głównie GLUT4). Na skutek rozwoju 

insulinooporności w wątrobie dochodzi do wzrostu 

glukoneogenezy, w mięśniach szkieletowych do spadku 

wychwytu i zużycia glukozy, a w adipocytach do nasilenia 

lipolizy. Wywołaną insulinoopornością, długotrwale utrzymującą 

się wtórną hiperinsulinomię uważa się za jeden 

z najważniejszych czynników zwiększających ryzyko wystąpienia 

powikłań cukrzycowych dotyczących zarówno 

dużych naczyń (makroangiopatie) jak i retino i nefropatii 

(mikroangiopatie). 

Dysfunkcja komórek β rozwija się w wyniku toksycznego 

działania glukozy (glukotoksyczność) oraz wolnych 

kwasów tłuszczowych (lipotoksyczność), które powodują 

nasiloną apoptozę i przyczyniają się do wyeksploatowania 

komórek β oraz spadku ich masy. Słabo rozwinięty system 

antyoksydacyjny komórek β czyni je bardzo podatnymi na 

stres oksydacyjny występujący zarówno podczas ostrej, jak 

i przewlekłej hiperglikemii. 

Rozpoznanie i kryteria wyrównania 

Diagnozę cukrzycy można postawić posługując się trzema 

równorzędnymi kryteriami: 

• 

• 

• 

Obecność typowych objawów cukrzycy (wielomocz, 

polidypsja, osłabienie) połączone z glikemią przygodną 

oznaczoną o dowolnej porze, niezależnie od posiłku, 

wynoszącą co najmniej 200 mg/dl 

Glikemia na czczo – dwukrotne stwierdzenie wartości 

wynoszącej co najmniej 126 mg/dl 

Glikemia przekraczająca 200 mg/dl po upływie 2 godzin, 

w doustnym teście tolerancji glukozy (OGTT) 


1. 

Oznaczanie wartości HbA1c nie powinno 

być wykorzystywane jako metoda diagnostyczna, 

a jedynie jako wskaźnik wyrównania 

metabolicznego w cukrzycy. 

Nie powinno się prowadzić diagnostyki stanów 

hiperglikemicznych u pacjentów w ostrej 

fazie choroby zapalnej, po urazie, po zabiegu 

operacyjnym lub w okresie krótkotrwałego stosowania 

leków zwiększających stężenie glukozy 

we krwi. 

Według Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego 

prawidłowo leczony chory na cukrzycę 

powinien mieć dobrze wyrównaną zarówno 

glikemię, jak i ciśnienie tętnicze oraz 

profil lipidowy. O ile to możliwe, w trakcie 

leczenia należy dążyć do następujących wartości: 

Glikemia 

*glikemia na czczo w osoczu żylnym < 110 mg/dl 

*glikemia na czczo podczas samokontroli < 70-90 mg/dl 

*HbA1c poniżej 6,1 – 6,5 % 

2. Ciśnienie tętnicze 

U chorych na cukrzycę (z uwagi na to, że cukrzyca 

jest jednym z niezależnych czynników ryzyka choroby 

niedokrwiennej serca) obowiązują bardziej rygorystyczne 

kryteria wyrównania wynoszące 130/80 mm Hg. 

3. Gospodarka lipidowa 

*cholesterol całkowity < 175 mg/dl 

*LDL < 100 mg/dl 

*HDL > 40 mg/dl dla mężczyzn i >50 mg/dl dla kobiet 

*TG < 150 mg/dl 

Ażeby móc osiągnąć powyższe kryteria wyrównania 

pacjent chory na cukrzycę typu 2 poza leczeniem niefarmakologicznym 

najczęściej musi przyjmować leki z grupy 

hipotensyjnych, przeciwcukrzycowych, hipolipemicznych, 

a czasami również innych (np. przy współistniejącej chorobie 

wieńcowej). Poniżej zostaną omówione leki obecnie 

stosowane do wyrównania glikemii oraz zapobiegania powikłaniom 

narządowym u pacjentów z cukrzycą typu 2. 

Leczenie – doustne leki przeciwcukrzycowe 

1. 

Biguanidy 

Biguanidy są pochodnymi guanidyny, związku występującego 

naturalnie w nasionach rutwicy lekarskiej (Galega officinalis). 

Pierwsze próby zastosowania tej grupy związków 

do leczenia hipoglikemizującego sięgają lat 30 XX wieku, 

jednakże ze względu na działania niepożądane dopiero 

wprowadzenie fenforminy, a później metforminy umożliwiło 

ich bezpieczne stosowanie u chorych na cukrzycę. 

Mechanizm działania metforminy jest złożony, a niektóre 

właściwości farmakodynamiczne nie zostały w pełni 

15


wyjaśnione. Biguanidy zmieniają potencjał elektrostatyczny 

błony mitochondrialnej, co prowadzi do zmniejszenia stężenia 

ATP, a tym samym wpływa na hamowanie glukoneogenezy 

wątrobowej, nasilenie glikolizy beztlenowej w tkankach 

obwodowych oraz hamowanie wchłaniania jelitowego 

glukozy, witaminy B12, kwasu foliowego i aminokwasów. 

Metformina zwiększa wrażliwość na insulinę zarówno hepatocytów, 

jak i mięśni szkieletowych, nie wpływając przy 

tym na wydzielanie insuliny. Dodatkowo wykazano korzystne 

działanie metforminy na przemianę lipidową (obniżanie 

stężenia tri glicerydów, VLDL i LDL przy jednoczesnym 

niewielkim wzroście HDL) oraz na właściwości reologiczne 

krwi (hamowanie agregacji płytek krwi oraz nasilenie fibrynolizy). 

Biodostępność dla organizmu preparatów metforminy 

wynosi 50 – 60%. Po podaniu doustnym biguanidy wchłaniają 

się w dwunastnicy oraz początkowym odcinku jelita 

cienkiego. Maksymalne stężenie w osoczu występuje po 

2-3 godzinach po zażyciu, przy czym pokarm może opóźnić 

wchłanianie. 

Biguanidy mogą być stosowane w monoterapii lub 

w terapii skojarzonej z pochodnymi sulfonylomocznika, glinidami 

lub z insuliną. 

Po zastosowaniu biguanidów działania niepożądane obserwuje 

się u około 20 – 30% chorych. Do najczęstszych 

działań niepożądanych należą dolegliwości żołądkowo-jelitowe 

(suchość w jamie ustnej, uczucie metalicznego smaku, 

brak apetytu, nudności, wzdęcia, biegunka lub zaparcia). 

W większości przypadków objawy te są przemijające, 

a dodatkowo można je ograniczyć poprzez stopniowe zwiększanie 

dawki leku. Z innych działań niepożądanych należy 

wymienić zaburzenia wchłaniania witaminy B 12 i kwasu foliowego, 

co może prowadzić do niedokrwistości oraz kwasicę 

mleczanową występującą jednak bardzo rzadko, a wynikającą 

głównie ze współistnienia innych schorzeń u chorego 

na cukrzycę (niewydolność nerek, wątroby czy też wstrząs 

kardiogenny lub septyczny). 

Przeciwwskazaniem do stosowania metforminy jest 

uczulenie na biguanidy, wiek powyżej 75. lat, obecność 

ostrych powikłań cukrzycy, niewydolność wątroby, ostre 

infekcje ciężkiego stopnia, okres okołooperacyjny, niewydolność 

nerek oraz ciąża i laktacja. 

2. 

16 

Pochodne sulfonylomocznika 

Pochodne sulfonylomocznika są sulfonamidami o ogólnym 

wzorze chemicznym R1-SO2NHOCNH-R2. Pierwsza 

generacja pochodnych sulfonylomocznika (tolbutamid, 

chlorpropamid) posiada na końcu R 1 pierścień fenolowy, 

a na końcu R 2 pierścień alifatyczny. W przypadku pochodnych 

sulfonylomocznika drugiej generacji (glibenklamid, 

gliklazyd, glipizyd i glimepiryd) zarówno podstawnik R 1 

jak i R 2 posiadają pierścienie aromatyczne. Poprzez zastą- 

pienie alifatycznego podstawnika R 2 ugrupowaniem aromatycznym 

zwiększono swoistość wiązania pochodnych 

sulfonylomocznika z receptorem SUR kanału potasowego 

w komórkach β oraz siłę działania. 

Pochodne sulfonylomocznika działają hipoglikemizująco 

poprzez zwiększanie wydzielania insuliny przez komórki 

β trzustki. Zwiększone wydzielanie insuliny jest wynikiem 

pobudzenia receptorów SUR1 (podjednostek kanałów potasowych 

komórek β trzustki), co skutkuje zamknięciem kanałów 

potasowych, depolaryzacją błony komórkowej, która 

z kolei wywołuje otwarcie bramkowanych napięciem kanałów 

wapniowych. Napływ jonów wapnia do komórki wyzwala 

wydzielanie insuliny z ziarnistości wydzielniczych. 

Poza wspólnym dla pochodnych sulfonylomocznika wpływem 

na komórki β, wykazują one szereg specyficznych 

działań pozatrzustkowych, różnie wyrażonych w przypadku 

poszczególnych pochodnych. Do najważniejszych należy 

tutaj: zwiększanie glikolizy, lipogenezy oraz wątrobowej 

syntezy glikogenu, zmniejszanie glukoneogenezy oraz utleniania 

kwasów tłuszczowych. W mięśniach szkieletowych 

powodują zwiększanie transportu glukozy oraz stymulują 

syntezę glikogenu. W przypadku niektórych pochodnych 

sulfonylomocznika (gliklazyd) opisuje się również działanie 

antyoksydacyjne. 

Aktualnie dostępne na rynku pochodne sulfonylomocznika 

drugiej generacji mimo wspólnego mechanizmu działania 

na receptor SUR, różnią się pod względem niektórych 

właściwości farmakokinetycznych. 

Glipizyd jest szybko działającą pochodną sulfonylomocznika. 

Godzinę po podaniu osiąga maksymalne stężenie 

w osoczu. Jednocześnie przy czasie półtrwania wynoszącym 

7 godzin, glipizyd klasyfikuje się jako lek krótkodziałający. 

W celu umożliwienia podawania glipizydu raz na dobę, 

a więc zagwarantowania wygodnego dla pacjentów dawkowania, 

stworzono postać z przedłużonym uwalnianiem 

– glipizyd GITS. System GITS oparty jest na 2 warstwach: 

pierwszej nieprzepuszczalnej dla wody, posiadającej jedynie 

jeden mikroskopijny otwór wykonany promieniem laserowym 

oraz drugiej, złożonej głównie z tlenku polietylenu. 

Wewnętrzna warstwa tabletki chłonąc wodę pęcznieje, 

powodując wypychanie rozpuszczonej substancji czynnej 

przez mikroskopijny otwór, zapewniając stałe stężenie leku 

w surowicy. Z działań pozatrzustkowych glipizydu wymienić 

należy: poprawę parametrów krzepnięcia krwi oraz 

korzystny wpływ na profil lipidowy chorych na cukrzycę. 

Dawkowanie glipizydu GITS wynosi 5 – 10 mg na dobę. 

Gliklazyd charakteryzuje się podwójnym działaniem: 

metabolicznym i naczyniowym. Oprócz wpływu na komórki 

β zmniejsza adhezję i agregację płytek, poprawia funkcję 

wydzielniczą śródbłonka oraz wykazuje właściwości antyoksydacyjne. 

Maksymalne stężenie w osoczu osiąga po 

2 – 6 godzinach, a okres połowicznego wydalania wynosi 12 

godzin. W celu zmniejszenia skutecznej dawki gliklazydu 

oraz zapewnienia optymalnego, dobowego profilu farmakokinetycznego 

powstała forma gliklazydu MR. Oparta jest 

ona na hydrofilnej macierzy, która chłonąc wodę przechodzi 

w stan żelu, z którego w sposób kontrolowany uwalnia 

się substancja czynna. Gliklazyd MR podawany jest raz na 

dobę w dawce 30 -120 mg. 

Glimepiryd to pochodna sulfonylomocznika drugiej ge-

neracji, posiadająca aktywny hipoglikemicznie metabolit. 

Dzięki temu może być stosowany raz na dobę bez konieczności 

modyfikacji budowy tabletki. Maksymalne stężenie 

w surowicy osiąga 2,5 godziny po podaniu, a okres półtrwania 

wynosi 5 – 8 godzin. Glimepiryd działa również obwodowo 

zmniejszając insulinooporność. Stosowany jest raz na 

dobę w dawce 1 – 6 mg. 

Po zastosowaniu pochodnych sulfonylomocznika mogą 

wystąpić działania niepożądane 

w postaci: hipoglikemii, zmian w obrazie szpiku kostnego, 

zmian skórnych, zaburzeń czynności wątroby. 

Nie należy stosować pochodnych sulfonylomocznika 

w przypadku nadwrażliwości na dany preparat, kwasicy ketonowej, 

stanów przedśpiączkowych oraz ciąży. 

3. 

Inhibitory α-glukozydazy 

Inhibitory α-glukozydazy to związki chemiczne posiadające 

w swojej strukturze aminocukier, który z powodu wiązania 

C-N nie może ulec enzymatycznej hydrolizie przez 

α-glukozydazy. Najlepiej poznanym lekiem z tej grupy jest 

pseudotetrasacharyd – akarboza. 

Mechanizm działania akarbozy polega na kompetycyjnym 

blokowaniu α-glukozydazy, jednego z enzymów 

znajdujących się w rąbku szczoteczkowatym kosmków jelita 

cienkiego. α-glukozydazy rozkładają oligosacharydy 

do monosacharydów, które ulegają wchłanianiu. Na skutek 

zablokowania α-glukozydazy dochodzi do spowolnienia 

rozkładu węglowodanów, które przesuwają się do dalszej 

części jelita, gdzie są powoli wchłaniane. W ten sposób 

praktycznie nie wchłaniana do organizmu akarboza (1 – 2%) 

przyczynia się do „spłaszczenia” krzywej glikemii po przyjęciu 

posiłku węglowodanowego. 

Akarboza jest lekiem słabszym od pochodnych sulfonylomocznika, 

metforminy czy tiazolidinedionów. Wskazana 

jest do leczenia cukrzycy typu 2 w początkowych stadiach, 

w terapii złożonej z innymi doustnymi lekami przeciwcukrzycowymi, 

a także insuliną. 

Głównym działaniem niepożądanym akarbozy, wynikającym 

z jej mechanizmu działania, są zaburzenia ze strony 

przewodu pokarmowego, spowodowane nadmierną fermentacją 

w jelitach. U 35 – 50% chorych leczonych akarbozą 

może się to manifestować wzdęciami, biegunką, uczuciem 

przelewania w jamie brzusznej a czasem również bólem. 

Przeciwwskazaniem do stosowania akarbozy jest zespół 

upośledzonego wchłaniania, stany zapalne jelit, niewydolność 

wątroby oraz stany zaawansowanych zaparć. 

Akarbozę powinno się podawać w dawkach podzielonych 

(3 razy dziennie) 25 - 100 mg. 

4. 

Tiazolidinediony (glitazony) 

Tiazolidinediony zbudowane są z pierścienia tiazolidyno-2,4-dionowego 

oraz łańcuchów bocznych, charakterystycznych 

dla poszczególnych leków. Pierwszym lekiem 

z grupy glitazonów był troglitazon, a następnie zostały 

wprowadzone rozyglitazon i pioglitazon. 

Mechanizm działania glitazonów jest związany z oddziaływaniem 

na jądrowe receptory aktywujące proliferację 

peroksysomów (określane jako PPAR), pełniących w orga- 


nizmie funkcję czynników transkrypcyjnych. Konsekwencją 

interakcji tiazolidinedionów z PPARγ (izoforma występująca 

głównie w tkance tłuszczowej) jest zmiana ekspresji 

ponad 100 różnych genów, w tym regulujących wychwyt, 

magazynowanie i metabolizm lipidów, wychwyt i zużywanie 

glukozy, a także ekspresję adiponektyny, IL-6 i TNF-α. 

W odróżnieniu od doustnych leków przeciwcukrzycowych 

z grupy pochodnych sulfonylomocznika glitazony nie 

zwiększają wydzielania insuliny i nie powodują występowania 

hipoglikemii. Glitazony zmniejszają wytwarzanie glukozy 

w wątrobie oraz uczulają tkanki na działanie insuliny. 

Ponadto zwiększają zużycie glukozy w mięśniach i innych 

tkankach. TZD wpływają również na profil lipidowy, przy 

czym wpływ ten różnie zaznacza się w przypadku poszczególnych 

leków. Coraz liczniejsze obserwacje sugerują, że 

TZD mogą wywierać ochronny wpływ na strukturę i funkcję 

komórek β trzustki. 

Obecnie w Polsce stosuje się tylko rozyglitazon, który 

działa ok. 100 razy silniej od troglitazonu. Maksymalne stężenie 

we krwi, po podaniu doustnym występuje po 1,75 h. 

Czas połowicznej eliminacji jest długi i wynosi 103 – 158 h. 

Rozyglitazon może być stosowany zarówno w monoterapii 

jak i terapii dwu, trzylejkowej z metforminą oraz pochodnymi 

sulfonylomocznika. 

Najczęstszymi działaniami niepożądanymi tej grupy leków 

są obrzęki, anemia oraz przyrost masy ciała. W ostatnim 

czasie pojawiły się kontrowersyjne doniesienia dotyczące 

negatywnych skutków działania TZD na układ krążenia 

oraz możliwość wywoływania obrzęku plamki żółtej, 

jednak ażeby wyciągnąć jednoznaczne wnioski potrzebne są 

dalsze obserwacje. 

Przeciwwskazaniem do stosowania glitazonów jest 

niewydolność krążenia w każdej klasie oraz niewydolność 

wątroby. Leku nie wolno podawać kobietom w ciąży oraz 

w okresie karmienia. 

5. 

Glinidy 

Glinidy to pochodne kwasu karbamoilometylobenzoesowego, 

będące analogami meglitynidu. Stanowią nową grupę 

krótkodziałających stymulatorów wydzielania endogennej insuliny 

przez komórki β trzustki. Do obecnie dostępnych na rynku 

pochodnych meglitynidu należą: repaglinid oraz nateglinid. 

Mechanizm działania glinidów jest częściowo podobny 

do mechanizmu działania pochodnych sulfonylomocznika. 

Wiążąc się z zależnymi od ATP receptoremi kanałów potasowych 

(innym niż w przypadku pochodnych sulfonylomocznika) 

powodują zamknięcie tych kanałów. Prowadzi 

to do depolaryzacji błony komórkowej, następstwem czego 

jest otwarcie potencjałozależnych kanałów wapniowych. 

Napływ jonów wapnia do komórki stymuluje wydzielanie 

insuliny na drodze egzocytozy. Glinidy zaliczane są do leków 

regulujących glikemię spowodowaną spożyciem posiłku, 

a stymulacja wydzielania insuliny odbywa się w sposób 

zależny od stężenia glukozy. Glinidy są lekami bezpiecznymi, 

nie powodują hiperinsulinomii i hiperglikemii. 

Glinidy po podaniu doustnym przed posiłkiem wchłaniają 

się szybko, osiągając maksymalne stężenie w osoczu 

po ok. 1 godzinie. Okres połowicznej eliminacji z osocza 

wynosi również ok. 1 h. 

17


Pochodne glinidów można stosować zarówno w monoterapii, 

jak i leczeniu skojarzonym. 

Działania niepożądane glinidów są rzadkie a obejmują: 

hipoglikemię, zaburzenia żołądkowo-jelitowe, zaburzenia ze 

strony skóry i tkanki podskórnej, przejściowe zaburzenia widzenia 

oraz wzrost stężenia kwasu moczowego w surowicy. 

Przeciwwskazaniem do stosowania glinidów jest nadwrażliwość 

na preparat z tej grupy, zaburzenia czynności 

wątroby ciężkiego stopnia oraz ciąża i laktacja. 

6. 

18 

Syntetyczne analogi hormonów jelitowych 

Najnowszą grupą leków stosowanych do leczenia cukrzycy 

typu 2 stanowią inkretynomimetyki, których przedstawicielem 

jest eksenatyd. Związek ten jest syntetycznym 

agonistą receptora glukagonopodobnego peptydu 1 (GLP-1), 

odpornym na działanie dipeptydylopeptydazy lV (DPP lV 

- enzymu rozkładającego peptydy jelitowe). 

GIP oraz GLP-1 (glukagonopodobny peptyd 1) są naturalnymi 

hormonami inkretynowymi występującymi 

w organizmie człowieka. GLP-1 syntetyzowany jest głównie 

przez komórki L jelita krętego i okrężnicy w odpowiedzi 

na bodziec glikemiczny. Odpowiedzialny jest za stymulację 

wydzielania insuliny i supresję wydzielania glukagonu, 

ponadto opóźnia opróżnianie żołądka oraz zmniejsza apetyt 

i przyjmowanie pokarmów. Receptory dla GLP-1 znajdują 

się w komórkach β trzustki oraz tkankach obwodowych 

(OUN, nerki, serce, płuca i przewód pokarmowy). 

Eksenatyd, jako agonista receptora GLP-1, zwiększa 

wydzielanie insuliny w sposób zależny od stężenia glukozy, 

zmniejsza poposiłkowe stężenie glukagonu oraz spowalnia 

opróżnianie żołądka, co warunkuje wolniejsze narastanie 

stężenia glukozy. Wydzielanie insuliny stymulowane jest 

jedynie w warunkach hiperglikemii, a po osiągnięciu stanu 

okołonormoglikemii, stężenie insuliny obniża się do poziomu 

podstawowego. W wielu badaniach wykazano wpływ 

eksenatydu na zmniejszenie masy ciała. 

Eksenatyd jest odporny na DDP lV. Czas połowicznego 

rozpadu wynosi ok. 2,4 godziny, przy czym efekt kliniczny 

trwa 4 – 6 godzin po pojedynczej dawce. 


Mgr farm. Dominik Kołodziej 

Katedra i Zakład Toksykologii 

Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Sosnowcu 

Ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec 

e-mail: chemik81@interia.pl 

Najczęściej występującymi objawami niepożądanymi 

przy stosowaniu eksanatydu są nudności o łagodnym bądź 

umiarkowanym nasileniu oraz rzadziej wymioty. Obserwowano 

również hipoglikemię, chociaż najczęściej była ona 

lekka lub umiarkowana. 

Terapię eksenatydem rozpoczyna się od dawki 5 µg podawanej 

2 razy na dobę w formie podskórnych iniekcji. Po 

4 tygodniach dawka zwiększana jest do 2 x 10 µg. 

W leczeniu cukrzycy typu 2 zastosowanie znajdują również 

inhibitory dipeptydylopeptydazy lV (DPP lV). Inhibitory 

DPP IV podawane są doustnie. Podanie pojedynczej 

dawki leku powoduje 24-godzinne zahamowanie aktywności 

DPP IV i zwiększenie stężenia endogennej insuliny 

wskutek zahamowania rozpadu GLP-1 i GIP. W randomizowanym 

badaniu wykazano, że częstość hipoglikemii powodowanych 

przez inhibitory DPP IV była niska i nieistotna 

statystycznie w porównaniu z placebo. 

Piśmiennictwo: 

1. Sieradzki J. : Cukrzyca 2006 t 1 i 2. 

2. Maśliński S, Ryżewski J. :Patofizjologia 2002. 

3. Grzeszczak W. :Farmakoterapia w cukrzycy 2007. 

4. Janiec W, Krupińska J.: Farmakodynamika 2002. 

5. Kostowski W.: Farmakologia 2001. 

6. Kluz j, Adamiec R,: Nowe perspektywy terapii chorych 

na cukrzycę typu 2 oparte na glukagonopodobnym peptydzie 

1 (GLP-1) i żołądkowym peptydzie hamującym 

(GIP) Post Hig Med. Dośw 2006, 60, 15-23. 

7. Wróbel M, Szymborska-Kajanek A, Grzeszczak W, Strojek 

K, Miejsce eksenatydu w leczeniu chorych na cukrzycę 

typu 2: Przegląd kardiodiabetologiczny 2007;2,4: 

234-240. 

8. Małecki M.: Otyłość-insulinooporność-cukrzyca typu 2, 

Kardiol Pol 2006; 64: 10 (supl. 6): 561–566. 

9. Jasik M, Dęmbe K, Karnafel W: Doustne leki przeciwcukrzycowe 

w terapii cukrzycy typu 2, Przew Lek 2005; 

3: 74-80.


Wstęp 

Wielu pacjentów stosuje różne preparaty ziołowe wychodząc 

z założenia, że będąc lekami naturalnymi są one 

bardzo bezpieczne. Takie podejście powoduje gwałtowny 

wzrost użycia naturalnych preparatów ziołowych. Jak podaje 

Eisenberg i wsp. [1] w Stanach Zjednoczonych Ameryki 

Północnej pomiędzy rokiem 1990 a 1998 spożycie leków 

ziołowych wzrosło aż o 380%. Jednocześnie uwidoczniło 

się wiele problemów dotyczących interakcji i efektów 

ubocznych skojarzonych z przyjmowaniem tych wydawałoby 

się bezpiecznych medykamentów. 

Jednymi z bardzo popularnych leków ziołowych, szeroko 

dostępnymi w sprzedaży bez recepty, są preparaty sporządzone 

z Dziurawca zwyczajnego (Hypericum perforatum). 

Roślina ta nazywana również ziołem św. Jana znana 

była już w starożytności, a pisali o niej m.in.: Dioskurides 

i Hipokrates. W średniowieczu dziurawiec był uważany za 

roślinę magiczną, która miała chronić przed złymi duchami, 

a w XVI w. sławny lekarz i alchemik Paracelsus nazywał 

go „arniką dla nerwów”, co oznaczało, iż dziurawiec jest 

również znakomitym lekiem na nerwy. 

Ziele dziurawca (Herba hyperici) do Farmakopei Polskiej 

zostało wprowadzone dopiero w 1970 r. do wydania 

IV, mimo iż znane jest w medycynie ludowej od wieków. 

Surowiec, który wykorzystuje się do celów leczniczych 


Interakcje Dziurawca zwyczajnego (Hypericum perforatum) 

Interactions of St. John’s wort (Hypericum perforatum) 

daniel wolny, Agnieszka nowakowska-wolna, ewa chodurek, zofia dzierżewicz 

katedra i zakład biofarmacji, wydział farmaceutyczny z oddziałem Medycyny laboratoryjnej, 

śląski uniwersytet Medyczny, 

41-200 sosnowiec, ul. narcyzów 1 

kierownik katedry i zakładu biofarmacji: prof. dr hab. zofia dzierżewicz 

Streszczenie 

Jednymi z bardzo popularnych leków ziołowych, szeroko 

dostępnymi w sprzedaży bez recepty, są preparaty 

sporządzone z Dziurawca zwyczajnego (Hypericum 

perforatum). Leczenie dziurawcem jest uważne za 

bezpieczne, choć niestety nie wolne od ryzyka różnorakich 

objawów ubocznych i licznych interakcji z innymi 

lekami. W związku z tym, że producent specyfików 

ziołowych nie jest zobowiązany do prowadzenia badań 

dotyczących interakcji oraz zamieszczania stosownych 

informacji na opakowaniu lub ulotce swojego produktu, 

ciężar informowania o potencjalnych skutkach ubocznych 

czy możliwości wystąpienia interakcji z innymi 

lekami zażywanymi przez pacjenta spoczywa na farmaceutach. 

Słowa kluczowe: Dziurawiec zwyczajny, Hypericum 

perforatum, interakcje 

Abstract 

Preparations made of St. John’s wort (Hypericum perforatum) 

are very popular and very accessible by other 

the counter sale. The treatment by St. John’s wort is 

considered to be safe, but unfortunately is not devoid of 

adverse effects and interactions with drugs. Pharmacists 

have duty to inform patients about potential adverse effects 

or possibilities of drug interactions especially in 

the case of herbal remedy, because producers of this 

kind of products are not obligated to conduct clinical 

trials and to place proper information on the leaflet. 

Key words: St. John’s wort, Hypericum perforatum, 

interactions 

stanowią szczyty pędów, zbierane w początkowym okresie 

kwitnienia (maj, czerwiec) i wysuszone w warunkach naturalnych 

w miejscach przewiewnych i zacienionych [2]. 

Farmakopea Polska VI określa dla ziela dziurawca wymagania 

zawartości flawonoidów w przeliczeniu na hiperozyd 

(nie mniej niż 1,8%), natomiast Farmakopea Europejska 5.0 

przewiduje zawartości sumy hiperycyn, w przeliczeniu na 

hiperycynę (nie mniej niż 0.08%). Farmakopea Polska VI 

określa również zwykle stosowane dawki. Doustnie w odwarach 

i nalewkach oraz w preparatach psychotonizujących 

jednorazowa, a także dobowa dawka wynosi od 2g do 4g. 

W zastosowaniu zewnętrznym do okładów i przemywań 

stosuje się 5% do 10% odwar. Z surowca tego wytwarzane 

są różnego rodzaju postacie: napary, odwary, oleje, roztwory, 

wyciągi alkoholowe, tabletki, jak również stosuje się go 

do wyrobu mieszanek ziołowych. Jest on rośliną leczniczą, 

której aktywność farmakologiczna zależy od postaci leku. 

Wyciągi wodne z ziela dziurawca w postaci naparów (infusa) 

i odwarów (decocta) nie zawierają hiperforyny i hiperycyny, 

które są nierozpuszczalne w wodzie, lecz składniki 

hydrofilne, takie jak glikozydy flawonoidowe, fenolokwasy, 

garbniki. Dlatego też wykazują one głównie działanie ściągające, 

żółciopędne i spazmolityczne. Z kolei wyciągi olejowe 

(olea) działają przeciwzapalnie i są wykorzystywane do 

sporządzania okładów na trudno gojące się rany, owrzodzenia, 

oparzenia, stłuczenia i wybroczyny. Natomiast wyciągi 

19


alkoholowe ze świeżego ziela (intracta), soki (succi) oraz 

nalewki (tincturae) zawierające hiperforynę i hiperycynę, 

wykazują głównie działanie antydepresyjne [2, 3]. Obecnie 

na polskim rynku występują też liczne preparaty wyciągu 

z dziurawca zwyczajnego w postaci tabletek i kapsułek, jak 

np: Deprim, Deprim forte, Depresplant, Dziurawiec ziele, 

Don’t Worry, Hypercaps, Hyperherba, Hyperosedat, Perhip, 

Remotiv, Silenil. Jednakże prowadzone badania wykazały, 

że preparaty te wchodzą w interakcje z wieloma lekami 

z różnych grup powodując poważne skutki uboczne. 

Skład i działanie 

Dziurawiec zawiera szereg substancji chemicznych 

odpowiedzialnych za terapeutyczne efekty jego działania. 

W składzie tej rośliny można wyróżnić grupę pochodnych 

diantronowych i antranolowych (0.05 – 0.3%), którą tworzą 

między innymi hiperycyna, pseudohiperycyna oraz 

protohiperycyna, protopseudohiperycyna i cyklopseudohiperycyna, 

ulegające przekształceniu pod wpływem 

światła do hiperycyny i pseudohiperycyny. Kolejną dużą 

grupę składników tworzą flawonoidy (2 – 4%), do których 

zalicza się flawonole (kemferol, kwercetyna), flawony 

(luteolina, eter 5,3-dimetylowy luteoliny), glikozydy 

(hiperozyd (0.3 – 0.7%), rutyna, kwercytryna, izokwercytryna, 

glikozydy leteoliny), biflawonoidy (amentoflawon 

(0.01 – 0.05%), biapigenina (0.1 – 0.5%)). Zidentyfikowano 

także pochodne floroglucynowe, do których 

zalicza się hiperforynę (2 – 4.5%), adhiperforynę (0.2 

– 1.8%), furohiperoforynę, 1,3,6,7-tetrahydroksyksanton. 

W dziurawcu występują ponadto proantocyjanidyny, 

głównie katechiny i epikatechiny. Dalsze składniki tej 

rośliny to olejki eteryczne, takie jak: 2-metylooktan, n- 

nonan, 2-metylodekan, α– i β-pinen, terpineol, geraniol, 

β-kariofylen, hamulen i śladowe ilości monoterpenów. 

Ponadto stwierdzono obecność kwasów fenolowych (kawowy, 

chlorogenowy, p-kumarowy, ferulowy, izoferulo- 

20 

Ryc. 1 Składniki dziurawca: 

hiperycyna (A), 

hiperforyna (B) 

wy, p-hydroksybenzoesowy, wanilinowy), kwasy: izowalerianowy, 

nikotynowy, laurynowy, mirystynowy, palmitynowy, 

stearynowy, garbniki katechinowe, karotenoidy, 

cholinę, witaminę C, nikotynamid, pektyny, fitosterole 

i inne. W roślinie tej znajdują się także ksantony, związki 

rzadko występujące w roślinach, ale charakterystyczne 

dla rodziny Hypericaceae [4, 5]. 

Dziurawiec zwyczajny jest surowcem farmaceutycznym 

o szerokim spektrum działania na skórę (dermaticum), a także 

posiadający właściwości przeciwskurczowe (spasmolyticum), 

przeciwdepresyjne (psychosedativum), antyseptyczne 

(antisepticum). To wielokierunkowe działanie spowodowane 

jest bogactwem składu chemicznego tej rośliny leczniczej. 

Dziurawiec zwyczajny znalazł zastosowanie również 

w homeopatii. Jest używany w terapii uszkodzeń nerwów 

obwodowych spowodowanych np. zmiażdżeniem, cięciem 

lub rozerwaniem z towarzyszącymi silnymi bólami przebiegającymi 

wzdłuż nerwów. Bywa też wykorzystywany we 

wstrząsie mózgu lub rdzenia przedłużonego, jak również 

w mdłościach, niestrawności, bolesnych hemoroidach oraz 

stanach depresyjnych. 

Dziurawiec jest natomiast mało znany jako roślina 

wykorzystywana w kosmetyce, choć mają tu zastosowanie 

wszystkie jego formy. Wyciągi olejowe mają działanie 

gojące i regenerujące, a sam olejek dziurawcowy jest częstym 

składnikiem odżywek do włosów. Kremy zawierające 

wyciągi z dziurawca przeznaczone są do pielęgnacji skóry 

normalnej i tłustej. Natomiast ze względu na zawartość hiperycyny, 

czerwonego barwnika uczulającego na promienie 

słoneczne, dziurawiec jest wykorzystywany do produkcji 

kremów i maści do zewnętrznego leczenia odbarwień skóry 

(bielactwa) oraz kremów i emulsji przyciemniających barwę 

skóry, tzw. samoopalaczy. 

Składnik dziurawca – hiperforyna indukuje apoptozę 

różnych komórek nowotworowych, nie tylko guzów litych, 

ale także komórek białaczkowych. Ponadto, ten składnik 

dziurawca zmniejsza inwazyjność i zdolność do przerzutów 

komórek nowotworowych, a także wykazuje działanie hamujące 

angiogenezę. Właściwości te powodują, że hiperforyna 

jest w kręgu zainteresowania badaczy jako potencjalny 

lek antynowotworowy [6]. 

Leczenie dziurawcem jest uważne za leczenie bezpieczne, 

choć niestety nie wolne od ryzyka różnorakich objawów 

ubocznych i licznych interakcji z innymi grupami leków. 

Jednym z działań niepożądanych stosowania dziurawca 

może być uczulenie skóry na światło słoneczne, ujawniające 

sie w postaci zaczerwienienia, poparzeń, pęcherzy i ogólnego 

osłabienia. Związane jest to z hiperycyną, która jest substancją 

fotodynamiczną. Dlatego też osoby z jasną karnacją 

powinny unikać ostrego słońca i innych źródeł światła ultrafioletowego 

[7]. Do najczęstszych powikłań należą również: 

zaburzenia gastryczne (8%), zawroty głowy (4.5%), 

uczucie zmęczenia i nadmiernego uspokojenia polekowego 

(4.3%), suchość w ustach (4.0%), niepokój (2.6%), bóle 

głowy (1.7%) i bezsenność (0.9%). Oczywiście preparaty 

z Dziurawca zwyczajnego nie powinny być używane 

w czasie ciąży oraz karmienia piersią, jak również są przeciwwskazane 

w poważnych uszkodzeniach wątroby i nerek 

oraz w wysokiej gorączce [8].

Interakcje składników dziurawca 

z innymi lekami 

Składniki dziurawca wchodzą w interakcje z innymi 

lekami zarówno na poziomie farmakodynamiki, jak i farmakokinetyki. 

Moore i wsp. [9] w swoich doświadczeniach 

wykazali, że hiperforyna posiada zdolność do aktywacji 

jądrowego receptora pregnanu X (PXR), należącego do 

rodziny receptorów dla hormonów sterydowych. Zaktywowany 

receptor PRX łączy się z promotorem genu CYP3A4 

powodując ekspresję tego genu. Ponadto receptor ten indukuje 

gen oporności wielolekowej MDR1, co prowadzi do 

wzrostu wytwarzania glikoproteiny P. Zwiększona synteza 

CYP3A4 powoduję intensyfikację metabolizmu leków 

przekształcanych przez ten układ enzymatyczny, powodując 

interakcję farmakokinetyczne na poziomie metabolizmu. 

Natomiast zwiększona aktywność glikoproteiny P powoduje 

interakcje farmakokinetyczne na poziomie biodostępności. 

Białko to występujące w komórka jelita, wątroby i nerek 

odgrywa istotną rolę w absorbcji, dystrybucji i wydalaniu 

leków, zmniejszając transport komórkowy z przestrzeni 

jelita do komórek epitelium, oraz zwiększając wydalanie 

ksenobiotyków z hepatocytów i nefronów odpowiednio do 

przewodów żółciowych i kanalików nerkowych. Interakcje 

przetworów dziurawca z innymi lekami mogą powodować 

także inne składniki tej rośliny. Nebel i wsp. [10] postulują 

iż za interakcję dziurawca z teofiliną odpowiedzialna jest 

hiperycyna, która indukuje aktywność izoformy CYP1A2 

i CYP2C19 cytochromu P450. Stwierdzono także przypadki 

interakcji preparatów dziurawca z warfaryną, co wskazuję 

że składniki tej rośliny indukują także izoformę CYP2C9, 

która odpowiedzialna jest za metabolizm wspomnianego 

leku [11]. 

Ziele dziurawca stosowane jest z powodzeniem w łagodnej 

i średniej depresji. Wiele pacjentów stosuje preparaty 

z tej rośliny równolegle do syntetycznych leków antydepresyjnych. 

Hiperforyna oraz w mniejszym stopniu hiperycyna 

są inhibitorami zwrotnego wychwytu serotoniny. Stosowanie 

dziurawca łącznie z syntetycznymi inhibitorami wychwytu 

serotoniny takimi jak: sertralina, paroksetyna, nefazodon 

i wenlafaksyna prowadzi do wzajemnej interakcji tych środków 

na poziomie farmakodynamicznym, poprzez synergizm 

ich działania. Może to skutkować wystąpieniem syndromu 

serotoninowego objawiającego się zmianami nastroju, bólami 

głowy, nadpobudliwością ruchową, dolegliwościami 

żołądkowo-jelitowymi [12]. Barbenel i wsp. [13] opisali 

nawet przypadek wystąpienia manii u 28-letniej pacjentki 

przyjmującej jednocześnie sertralinę i preparat dziurawca. 

Ponadto Johne i wsp. [14] przeprowadzając próbę kliniczną 

wykazali obniżenie stężenia amitryptyliny we krwi i moczu 

u 12 pacjentów przyjmujących ten lek łącznie z dziurawcem. 

Obserwację tą można wyjaśnić faktem, iż amitryptylina 

jest substratem glikoproteiny P oraz jej metabolizm na 

drodze demetylacji, a następnie hydroksylacji zachodzi przy 

udziale CYP2C19 i CYP3A4, które są indukowane przez 

składniki dziurawca. 

Występują także interakcje dziurawca z benzodiazepinami: 

alprazolanem i midazolanem. Leki te są często wykorzystywane 

jako markery aktywności izoenzymu CYP3A4, 

ponieważ są poprzez ten enzym całkowicie metabolizowa- 


ne. Badania kliniczne z wykorzystaniem zdrowych ochotników 

wykazały obniżenie stężenia tych leków we krwi w 

wyniku koadministracji z dziurawcem [15, 16]. Ponadto 

obniżenie stężenia midazolamu we krwi było większe po 

podaniu doustnym niż dożylnym, co wskazuje że składniki 

dziurawca indukują aktywność CYP3A4 występującego 

zarówno w jelicie, jak i w wątrobie [15]. Kolejnym lekiem 

anksjolitycznym wchodzącym w interakcję z dziurawcem 

jest agonista receptora 5-HT1A, buspiron. Dannawi i wsp. 

[17] opisują przypadek syndromu serotoninowego wywołanego 

wzmożoną aktywacją receptorów serotoninowych 

w wyniku działania buspironu i inhibicji wychwytu serotoniny 

z przestrzeni synaptycznej przez hiperforynę i hiperycynę. 

Ponadto Spinella i Eaton [18] opisują przypadek 

uszkodzenia mózgu poprzedzonego hipomanią u pacjentki 

przyjmującej buspiron w połączeniu z zielem dziurawca 

i preparatem Ginko biloba. 

Istnieją kliniczne przesłanki, że niektóre leki roślinne 

mogą obniżać stężenie digoksyny we krwi. Do preparatów 

takich należy zaliczyć także dziurawiec, który po 10 dniach 

równoległego przyjmowania z digoksyną obniża poziom 

jej stężenia w surowicy pacjenta [19]. Prawdopodobnie za 

zjawisko to odpowiada indukcja glikoproteiny P przez hiperforynę, 

co zdaje się potwierdzać korelacja tej interakcji 

z dawką tego składnika dziurawca. Glikoproteina P w wyniku 

indukcji zwiększa wyrzut digoksyny z enterocytów do 

światła jelita, zmniejszając jej stężenie we krwi, co wobec 

wąskiego współczynnika terapeutycznego tego leku, objawia 

się nieskutecznością terapii. Sugimoto i wsp. [20] przeprowadzili 

badania mające na celu wykazanie istnienia interakcji 

pomiędzy preparatami dziurawca a lekami antyhiperlipidemicznymi: 

symwastatyną i prawastatyną. W wyniku 

prób klinicznych stwierdzili oni, że zachodzi interakcja tylko 

w przypadku pierwszego z tych leków, bowiem symwastatyna 

w przeciwieństwie do prawastatyny metabolizowana 

jest w ustroju ludzkim poprzez enzymy szlaku zależnego od 

cytochromu P-450 oraz stanowi substrat dla glikoproteiny P. 

Tannergreen i wsp. [21] donoszą, że regularne przyjmowanie 

dziurawca zmniejsza biodostępność werapamilu. 

Badacze ci sugerują, iż jest to spowodowane zwiększoną 

aktywnością enzymu CYP3A4 w jelicie, co zwiększa efekt 

pierwszego przejścia tego leku. Dodatkowo lek ten jest także 

substratem dla glikoproteiny P. Spośród leków działających 

na układ krążenia interakcję ze składnikami dziurawca 

wykazują także antykoagulanty, wspomniana wcześniej 

warfaryna oraz fenprokumon. Leki te w wyniku aktywacji 

układów enzymatycznych związanych z cytochromem P450 

ulegają szybszemu metabolizmowi, co objawia się zmniejszeniem 

ich działania przeciwzakrzepowego [22]. 

Istnieją doniesienia o występowaniu krwawień u kobiet 

przyjmujących doustne środki antykoncepcyjne w połączeniu 

z preparatami dziurawca. Informacje te znalazły 

potwierdzenie w dwóch próbach klinicznych z wykorzystaniem 

zdrowych ochotniczek przyjmujących etynyloestradiol 

i noretyndron [23, 24]. Ponadto były zgłaszane przypadki 

zajścia w ciąże przez kobiety przyjmujące środki antykoncepcyjne 

w połączeniu z dziurawcem: w Wielkiej Brytanii 

– siedem przypadków, w Niemczech – cztery oraz dwa 

w Szwecji [25]. Przyczyną tych zjawisk jest obniżanie przez 

preparaty dziurawca stężenia noretyndronu i etynyloestria- 

21


diolu we krwi, spowodowane indukcją izoformy CYP3A4 

odowiedzialnej za oksydatywny metabolizm tych środków 

hormonalnych. 

Interakcja składników dziurawca z cyklosporyną jest 

jedną z najlepiej udokumentowanych. Istnieją liczne opisy 

przypadków tej bardzo poważnej i potencjalnie śmiertelnej 

interferencji pomiędzy lekiem roślinnym a syntetycznym 

[26, 27, 28, 29]. Przypadki te dotyczą pacjentów po transplantacji 

serca, nerki i wątroby przyjmujących cyklosporynę, 

u których poziom tego leku we krwi uległ obniżeniu po 

przyjęciu terapeutycznej dawki preparatu z dziurawca, w następstwie 

czego pojawiały się niekiedy epizody ostrego odrzucenia 

przeszczepu. W przypadku odstawienia dziurawca 

obraz kliniczny ulegał poprawie. Mechanizm tej interakcji 

polega na obniżeniu absorbcji cyklosporyny, która jest substratem 

glikoproteiny P, w jelicie oraz przyspieszeniu metabolizmu 

tego leku przez izoformę CYP3A4. Ponadto dwie 

próby kliniczne przeprowadzone przez Mai i wsp. [30] oraz 

Herberta i wsp. [31] wykazały drastyczne obniżenie stężenia 

takrolimusa w koadministracji z dziurawcem. Lek ten 

jest intensywnie metabolizowany w wątrobie głównie przez 

CYP3A4 oraz jest substratem glikoproteny P. 

Stwierdzono przypadek obniżenia stężenia teofiliny we 

krwi związany z zażywaniem dziurawca i wykazano in vitro, 

że składnik dziurawca – hiperycyna, indukuje enzymy 

wątrobowe [10]. Jednakże późniejsze próby kliniczne dowiodły, 

iż w trakcie piętnastodniowego przyjmowania dziurawca 

farmakokinetyka teofiliny nie uległa zmianie [32]. 

Wang i wsp. [33] badając wpływ dziurawca na farmakokinetykę 

feksofenadyny zauważyli, że jednorazowe podanie 

zioła zwiększa, podczas gdy 14-dniowe obniża stężenie tego 

leku antyhistaminowego we krwi. Ponieważ feksofenadyna 

jest markerem aktywności glikoproteiny P, autorzy ci wysunęli 

hipotezę, że jednorazowa dawka hamuje, podczas gdy 

dłuższe przyjmowanie dziurawca, pobudza jelitową izoformę 

tego białka. 

Próby kliniczne wykazały interakcje przetworów dziurawca 

z lekami antyretrowirusowymi: indinavirem [34] oraz 

niverapiną [35]. Obniżenie stężenia tych leków u pacjentów 

zarażonych wirusem HIV pociąga za sobą konsekwencje 

w postaci zwiększonej odporności wirusów na leki a przez 

to nieskuteczności terapii. Należy zauważyć, że inne leki 

antyretrowirusowe również metabolizowane są przez izoformę 

CYP3A4, więc interakcja ta może dotyczyć także 

nich. Próba przeprowadzona na 12 pacjentach wykazała, 

że preparaty dziurawca wzmagają katalizowaną przez 

CYP3A4 sulfoksydację oraz zależną od CYP2C19 hydroksylację 

omeprazolu [36]. 

Spośród wszystkich raportów dotyczących interakcji 

pomiędzy lekami roślinnymi, a tradycyjnymi 79% dotyczy 

interakcji dziurawca, publikacji dotyczących tego zjawiska 

jest ponad 270 [37]. Wskazuje to na skalę w jakiej środek ten 

może wpływać na farmakokinetykę innych środków leczniczych. 

Główny mechanizm interakcji spowodowanych 

przez preparaty dziurawca jest indukcja izoformy CYP3A4 

cytochromu P-450, enzymu odpowiedzialnego za oksydatywny 

metabolizm ponad 50% leków. Dodając do tego 

wpływ składników tej rośliny na aktywność innych izoform 

tego układu enzymatycznego oraz glikoproteiny P można 

przypuszczać, że ten lek roślinny może wpływać na farma- 

22 

kokinetykę blisko 80% wszystkich leków [37]. Leki ziołowe 

w tym dziurawiec dostępne są w sprzedaży OTC i często 

stosowane są przez pacjentów bez konsultacji z lekarzem. 

W związku z tym, że producent specyfików ziołowych nie 

jest zobowiązany do prowadzenia badań dotyczących interakcji 

oraz zamieszczania stosownych informacji na opakowaniu 

lub ulotce swojego produktu, ciężar informowania 

o potencjalnych skutkach ubocznych czy możliwości wystąpienia 

interakcji z innymi lekami zażywanymi przez pacjenta 

spoczywa na farmaceutach. 


1. Eisenberg D i wsp. Trends in alternative medicine use 

in United States. 1990-1998. JAMA 1998; 280: 1569- 

1575. 

2. Ożarowski A, Jaroniewski W. Rośliny lecznicze 

i ich praktyczne zastosowanie. Instytut Wydawniczy 

Związków Zawodowych. Warszawa 1987. 

3. Gałuszko M, Cubała WJ. Rola dziurawca w leczeniu depresji. 

Psychiatria 2005; 2:93-96. 

4. Nahrstedt A, Butterweck V. Biologically active and other 

chemical constituents of the herb of Hypericum perforatum 

L. Pharmacopsychiatry. 1997;30:129-134. 

5. Greeson JM, Sanford B, Monti DA. St. John’s wort 

(Hypericum perforatum): a review of the current pharmacological, 

toxicological, and clinical literature. 

Psychopharmacology (Berl) 2001; 153: 402-414. 

6. Quiney C i wsp. Hyperforin, a new lead compound against 

the progression of cancer and leukemia? Leukemia 

2006; 20: 1519-1525. 

7. Brockmöller J i wsp. Hypericin and pseudohypericin: 

pharmacokinetics and effects on photosensitivity in humans. 

Pharmacopsychiatry. 1997; 30: 94-101. 

8. Ernst E i wsp. Adverse effects profile of the herbal antidepressant 

St. John’s wort (Hypericum perforatum L.). 

Eur J Clin Pharmacol 1998; 54: 589-594. 

9. Moore LB i wsp. St. John’s wort induces hepatic drug 

metabolism through activation of the pregnane X receptor. 

Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: 7500-7502. 

10. Nebel A i wsp. Potential metabolic interaction between 

St. John’s wort and theophylline. Ann Pharmacother 

1999; 33: 502-504. 

11. Kaminsky LS, Zhang ZY. Human P450 metabolism of 

warfarin. Pharmacol Ther 1997; 73: 67-74. 

12. Gordon JB. SSRIs and St.John’s Wort: possible toxicity? 

Am Fam Physician 1998; 57: 950-953. 

13. Barbenel DM i wsp. Mania in a patient receiving testosterone 

replacement postorchidectomy taking St John’s wort 

and sertraline. J Psychopharmacol 2000; 14: 84-86. 

14. Johne A i wsp. Decreased plasma levels of amitriptyline 

and its metabolites on comedication with an extract 

from St. John’s wort ( Hypericum perforatum ). J Clin 

Psychopharmacol 2002; 22: 46-54. 

15. Dresser GK i wsp. Coordinate induction of both cytochrome 

P4503A and MDR1 by St John’s wort in healthy 

subjects. Clin Pharmacol Ther 2003; 73: 41-50. 

16. Wang Z i wsp. The effects of St John’s wort (Hypericum 

perforatum) on human cytochrome P450 activity. Clin 

Pharmacol Ther 2001; 70: 317-326.


mgr Daniel Wolny 

Katedra i Zakład Biofarmacji 

Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej 

Śląski Uniwersytet Medyczny 

41-200 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1 

tel.: 032 364 1064 

e-mail: dwolny@sum.edu.pl 


17. Dannawi M. Possible serotonin syndrome after combina- 27. Barone GW i wsp. Drug interaction between St. John’s 

tion of buspirone and St John’s Wort. J Psychopharmacol wort and cyclosporine. Ann Pharmacother. 2000; 34: 

2002; 16: 401-406. 

1013-1016. 

18. Spinella M, Eaton LA. Hypomania induced by herbal and 28. Breidenbach T i wsp. Drug interaction of St John’s wort 

pharmaceutical psychotropic medicines following mild with cyclosporin. Lancet 2000; 355: 1912-1915. 

traumatic brain injury. Brain Inj 2002; 16: 359-367. 29. Karliova M i wsp. Interaction of Hypericum perforatum 

19. Johne A i wsp. Pharmacokinetic interaction of digoxin (St. John’s wort) with cyclosporin A metabolism in a patient 

with an herbal extract from St John’s wort (Hypericum after liver transplantation. J Hepatol 2000; 33: 853-855. 

perforatum). Clin Pharmacol Ther 1999; 66: 338-345. 30. Mai I i wsp. Impact of St John’s wort treatment on the 

20. Sugimoto K i wsp. Different effects of St John’s wort pharmacokinetics of tacrolimus and mycophenolic acid 

on the pharmacokinetics of simvastatin and pravastatin. in renal transplant patients. Nephrol Dial Transplant 

Clin Pharmacol Ther 2001; 70: 518-524. 

2003; 18: 819-822. 

21. Tannergreen C i wsp. St John’s wort decreases the bio- 31. Hebert MF i wsp. Effects of St. John’s wort (Hypericum 

availability of R- and S-verapamil through induction of perforatum) on tacrolimus pharmacokinetics in healthy 

the first-pass metabolism. Clin Pharmacol Ther 2004; volunteers. J Clin Pharmacol 2004; 44: 89-94. 

75: 298-309. 

32. Morimoto T i wsp. Effect of St. John’s wort on the phar- 

22. Jiang X i wsp. Effect of St John’s wort and ginseng on macokinetics of theophylline in healthy volunteers. J 

the pharmacokinetics and pharmacodynamics of warfa- Clin Pharmacol 2004; 44: 95-101. 

rin in healthy subjects. Br J Clin Pharmacol 2004; 57: 33. Wang Z i wsp. Effect of St John’s wort on the pharma- 

592-599. 

cokinetics of fexofenadine. Clin Pharmacol Ther 2002; 

23. Hall SD i wsp. The interaction between St John’s wort 71: 414-420. 

and an oral contraceptive. Clin Pharmacol Ther 2003; 34. Piscitelli SC i wsp. Indinavir concentrations and St 

74: 525-535. 

John’s wort. Lancet 2000; 355: 547-548. 

24. Pfrunder A i wsp. Interaction of St John’s wort with low- 35. de Maat MM i wsp. Drug interaction between St John’s 

dose oral contraceptive therapy: a randomized controlled wort and nevirapine. AIDS 2001; 15: 420-421. 

trial. Br J Clin Pharmacol 2003; 56: 683-690. 

36. Wang LS i wsp. St John’s wort induces both cytochrome 

25. Murphy PA. St. John’s wort and oral contraceptives: re- P450 3A4-catalyzed sulfoxidation and 2C19-dependent 

asons for concern? J Midwifery Womens Health 2002; hydroxylation of omeprazole. Clin Pharmacol Ther 

47: 447-450. 

2004; 75: 191-197. 

26. Ahmed SM, Banner NR, Dubrey SW. Low cyclosporin 37. Tirona RG, Bailey DG. Herbal product-drug interactions 

-A level due to Saint-John’s-wort in heart transplant pa- mediated by induction. Br J Clin Pharmacol 2006; 61: 

tients. J Heart Lung Transplant 2001; 20: 795-799. 677-681. 

23


1. Wstęp 

Piroksykam to przedstawiciel niesteroidowych leków przeciwzapalnych 

z grupy oksykamy. Wykazuje działanie przeciwzapalne, 

przeciwbólowe, przeciwgorączkowe. Jest stosowany w 

leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, osteoartrozie [1]. 

Współczesna technologia stałych doustnych postaci leku 

farmaceutycznych wymaga, aby substancja lecznicza po 

rozpadzie leku znajdowała się w stanie rozproszenia molekularnego. 

Piroksykam należy do II klasy BCS [2]. Praktycznie 

nie rozpuszcza się w wodzie, za to dobrze wchłania 

się z przewodu pokarmowego. Mała rozpuszczalność 

w płynach ustrojowych skutkuje drażniącym działaniem na 

śluzówkę żołądka oraz jelit [3]. Dlatego prowadzone są badania 

zmierzające do zwiększenia jego rozpuszczalności, bowiem 

biodostępność leku w fazie ciekłej jest większa a działanie 

szybsze [4-8]. 

Uzyskanie leku w stanie rozproszenia molekularnego 

można uzyskać różnymi metodami [9]. Jedną z metod 

zmierzającą do poprawy szybkości rozpuszczania substancji 

24 

Modyfikacja dostępności farmaceutycznej piroksykamu 

z tabletek z udziałem wybranych solubilizatorów 

Modification of the pharmaceutical availability of piroxicam 

from tablets with the use of selected solubilizators 

beata szulc-Musioł, lucyna bułaś 

śląski uniwersytet Medyczny w katowicach, 

katedra i zakład farmacji stosowanej wydziału farmaceutycznego 

z oddziałem Medycyny laboratoryjnej w sosnowcu 

kierownik katedry: dr hab. n. farm. Andrzej jankowski 

Streszczenie: 

Piroksykam to niesteroidowy lek przeciwzapalny 

z grupy oksykamy. Według klasyfikacji BCS należy do 

II klasy, charakteryzującej się małą rozpuszczalnością 

i dobrym wchłanianiem. Celem pracy było zbadanie 

wpływu wybranych surfaktantów na uwalnianie piroksykamu 

z tabletek. Tabletki sporządzono metodą granulacji 

na mokro. W sporządzonych granulatach zawierających 

tenzydy, zbadano parametry granulometryczne 

takie jak Indeks Carra i Współczynnik Hausnera. Parametry 

fizyczne tabletek oceniono zgodnie z FPVI. Rezultaty 

badań pozwoliły wykazać użyteczność badanych 

surfaktantów w poprawie dostępności farmaceutycznej 

piroksykamu z tabletek. 

Słowa kluczowe: piroksykam, surfaktanty, Tween 80, 

Laurylosiarczan sodu, Brij58, tabletki, dostępność farmaceutyczna 

Abstract: 

Piroxicam is a non-steroidal anti-inflammatory drug 

from oxicams group. It is classified in the Biopharmaceutic 

Drug Classification (BCS) system as 

a Class II drug with low solubility and high permeability. 

The aim of this study was to evaluate 

the effect of selected surfactants on the release 

of piroxicam from tablets. Tablets were made by wet 

granulation technique. In manufactured granulates containing 

tenzides, granulometric parametes such as Carr 

Index and Hausner Factor were investigated. Physical 

parameters of tablets were graded according to FPVI. 

Results of the study allowed determining the usefulness 

of investigated surfactants in the improvement of the 

pharmaceutical availability of piroxicam from tablets. 

Keywords: piroxicam, surfactants, Tween 80, sodium 

lauryl sulphate, Brij58, tablets, pharmaceutical availability 

leczniczych trudno rozpuszczalnych lub praktycznie nierozpuszczalnych 

w wodzie jest wykorzystanie solubilizacji 

micelarnej [10-12] 

Celem pracy było otrzymanie stałej doustnej postaci 

leku - tabletek z piroksykamem z formulacyjnym udziałem 

solubilizotora micelarnego. W pracy oceniono wpływ wybranych 

solubilizatorów na właściwości fizykochemiczne 

oraz szybkość uwalniania substancji biologicznie czynnej 

z wytworzonych tabletek. Z grupy niejonowych związków 

powierzchniowo czynnych zastosowano: Tween 80(T80) 

i Brij58 a z anionowo czynnych -laurylosiarczan sodu (LSS). 

2. Materiał i metody 

2.1Substancje 

Piroksykam (Jelfa S.A.), Tween80, Brij58, laurylosiarczan 

sodu, Avicel PH-101 i skrobia ziemniaczana (Sigma- 

Aldrich, Germany): stearynian magnezu (Merck, Germany), 

laktoza (Galfarm, Poland), kwas solny (POCH, Poland).

2.2 Sporządzanie tabletek z piroksykamem 

Opracowano siedem wariantów tabletek zawierających 

10mg piroksykamu. Tabletki sporządzono metodą granulacji 

na mokro. Zawartość procentowa substancji leczniczej 

i pomocniczych w przeliczeniu na tabletkę: 

piroksykam 5% 

skrobia ziemniaczana 45% 

laktoza 30% 

Avicel PH-101 19% 

stearynian magnezu 1% 

Składniki masy tabletkowej zarabiano w moździerzu 

wodnym roztworem zawierającym odpowiedni solubilizator 

i żelatynę (1% w/v). Wilgotną masę przecierano przez sito 

0.8 mm. Granulaty suszono w suszarce w temp. 30 0 C przez 

12 godz. Wysuszone granulaty ujednolicano stosując sito 

o wielkości oczek 0.8 mm. Substancję poślizgową (stearynian 

magnezu) dodawano bezpośrednio przed tabletkowaniem. 

Tabletki o masie ok. 200 mg tłoczono przy użyciu 

stempli o średnicy Ø=9mm na tabletkarce Erweka AR400. 

Solubilizatory zastosowano w ilości 0.4% (wariant 

I: F-T80-I; F-Brij58-I; F-LSS-I) i 4% (wariant II: 

F-T80-II; F-Brij58-II; F-LSS-II) całkowitej masy granulatu. 

Dodatkowo jako odnośnik sporządzono granulat bez dodatku 

surfaktantu (F-0). 

W otrzymanych granulatach oznaczono gęstość nasypową 

i gęstość po ubiciu (wolumetr typu Polfa W2). Dla 

każdej serii granulatu pomiary wykonano trzykrotnie. Uzyskane 

rezultaty pozwoliły obliczyć indeks Carra wg wzoru: 

IC=(TD-BD)*100/TD, gdzie: TD - gęstość po ubiciu (g/cm 3 ), 

BD – gęstość nasypowa (g/cm 3 ). 

Wartości gęstości nasypowej i gęstości po ubiciu posłużyły 

także do obliczenia współczynnika Hausnera. Wykonane 

tabletki przebadano zgodnie z FPVI [13], określając jednolitość 

masy pojedynczych tabletek, ścieralność i czas rozpadu. 

2.3 Oznaczenie dostępności farmaceutycznej 

Badanie dostępności farmaceutycznej przeprowadzono 

zgodnie z FPVI metodą łopatkową do 0.1 mol kwasu solnego 

przy prędkości obrotów 60obr/min. Ilość uwolnionej 

substancji leczniczej oznaczono spektrofotometrycznie, 

mierząc absorbancję przy 353nm. Stężenie piroksykamu 

obliczono z równania opisującego krzywą kalibracji. Wyniki 

pomiarów stężenia piroksykamu przedstawiono jako 

procent uwolnionej dawki (Q). Uzyskane wyniki poddano 

analizie statystycznej. Za poziom istotności przyjęto p


na skrócenie czasu rozpadu otrzymanych tabletek. Najkrótszy 

czas rozpadu wykazywały tabletki serii F-LSS- 

II zawierające w swoim składzie laurylosiarczan sodu 

w ilości 4%. 

Rezultaty badań dostępności farmaceutycznej (współczynnik 

Q) piroksykamu w modelowym płynie zbiorczym 

(0.1 mol kwas solny) z badanych formulacji przedstawiono 

w tabeli 2. Stanowiły one podstawę do prześledzenia zależności 

Q w funkcji czasu (t, min): Q=f (t, min), przedstawionego 

na rycinie 3. Najniższą dostępnością farmaceutyczną 

(ok. 80% po 45 minutach uwalniania) charakteryzowały się 

tabletki serii F0 (bez dodatku tenzydu) i serii F-T80-I zawierającej 

jako niejonowy surfaktant Tween80 w ilości 0.4%. 

Za wyjątkiem serii F-T80-I, we wszystkich pozostałych 

seriach tabletek ilość uwolnionego środka leczniczego 

w badanych punktach pomiarowych była istotnie wyższa 

dla tabletek zawierających w swoim składzie solubilizator 

micelarny w porównaniu do tabletek bez ich udziału 

(seria F-0). Najlepsze wyniki uzyskano dla tabletek zawierających 

jako solubilizator laurylosiarczan sodu i Brij 58 

w ilości 4% (po 15 minutach uwolniło się ponad 80% substancji). 

26 

Odchylenie od 

średniej masy 

tabletki (%) 

Ścieralność 

(%) 

Czas rozpadu 

(min) 

Wnioski 

Formulacje 

F-0 2.93 0.71 ± 0.03 

F-T80-I 2.56 0.78 ± 0.02 

F-Brij58-I 2.21 0.59 ± 0.02 

F-LSS-I 2.72 0.91 ± 0.01 

F-T80-II 2.19 0.61 ± 0.01 

F-Brij58-II 2.14 0.52 ± 0.02 

F-LSS-II 2.51 0.52 ± 0.03 

Tabela 1. Właściwości fizykochemiczne tabletek 

3.20 ± 0.15 

3.01 ± 0.11 

2.45 ± 0.13 

2.52 ± 0.10 

2.26 ± 0.09 

2.23 ± 0.15 

2.17 ± 0.15 

1. Obecność surfaktanta w masie formulacyjnej powoduje 

zmniejszenie wartość indeksu Carra, co sugeruje 

poprawę sypkości granulatów. 

2. Zastosowanie surfaktantów w masie tabletkowej 

wpłynęło na skrócenie czasu rozpadu otrzymanych 

tabletek. Najkrótszy czas rozpadu wykazywały tabletki 

serii F-LSS-II zawierające w swoim składzie 

laurylosiarczan sodu w ilości 4%. 

3. Wyniki badań szybkości uwalniania piroksykamu 

z tabletek wykazywały 

Formulacje → 

Czas [min]↓ 

Q5 

F-0 

44.73 ± 5.20 

F-T80-I 

49.30 ± 3.15 

F-Brij58-I 

50.17 ± 3.31 

F-LSS-I zasadność wprowadzenia surfaktanta 

do receptury tabletek. Dodatek 

substancji solubilizujących do 

masy tabletkowej istotnie wpływa 

na szybkość i ilość uwolnionej 

substancji leczniczej. Współczynnik 

Q uzyskał najwyższe wartości 

dla tabletek zawierających jako 

solubilizator laurylosiarczan sodu 

i Brij 58 w ilości 4%. 

a 55.32 ± 4.97 c 

Q10 57.38 ± 3.11 61.87 ± 4.87 63.63 ± 5.66 a 68.22 ± 4.73 c 

Q15 62.50 ± 2.05 67.85 ± 2.56 74.91 ± 4.92 c 78.12 ± 3.60 c 

Q20 66.27 ± 1.90 72.80 ± 3.68 79.99 ± 4.88 c 82.35 ± 4.30 c 

Q25 72.84 ± 2.29 77.87 ± 4.64 84.39 ± 5.30 c 84.58 ± 4.68 c 

Q30 76.54 ± 1.41 81.35 ± 3.49 85.17 ± 4.49 b 89.64 ± 3.54 c 

Q45 78.68 ± 0.99 83.79 ± 4.25 88.57 ± 3.75 b 93.72 ± 4.44 c 

K (min-1 )*10-2 3.09 ± 0.30 1.37 ± 0.12 a 1.45 ± 0.27 a 1.57 ± 0.19 a 

Formulacje → 

Czas [min]↓ 

F-T80-II F-Brij58-II F-LSS-II 

Q5 59.85 ± 4.37 c 69.78 ± 2.57 c 70.11 ± 5.12 c 

Q10 66.64 ± 3.20 b 75.34 ± 3.35 c 78.81 ± 5.12 c 

Q15 75.46 ± 2.68 b 82.56 ± 3.35 c 84.34 ± 3.55 c 

Q20 79.98 ± 2.65 a 85.86 ± 3.81 c 86.89 ± 2.79 c 

Q25 84.34 ± 3.46 a 87.27 ± 4.07 c 89.87 ± 2.91 c 

Q30 86.69 ± 3.95 a 89.07 ± 3.76 c 92.57 ± 4.11 c 

Q45 89.45 ± 3.36 a 92.12 ± 3.81 c 94.55 ± 2.73 c 

K (min-1)*10-2 1.86 ± 0.21 a 2.07 ± 0.37 a 2.18 ± 0.49 a 

statystycznie istotnie w porównaniu do tabletek bez solubilizatora: a p≤0.05; b p≤0.01; c p≤0.001 

Tabela 2. Wartości współczynnika Q (%) 

Piśmiennictwo: 

1. Zielska-Olczak M, Olczak S. Izoenzymy cyklooksygenazy 

i inhibitory cyklooksygenazy-2. Farm Pol 2000; 

18: 869-874. 

2. Nachajski M, Zgoda M M. Zastosowanie solubilizacji 

hydrotropowej i micelarnej w celu poprawy dostępności 

farmaceutycznej NLPZ- środków leczniczych z II klasy 

BCS. Farm Pol 2008; 64: 231-237. 

3. Gomułka S. Bezpieczniejsze niesteroidowe leki przeciwzapalne-niespełnione 

oczekiwania (na razie?). Terapia i 

Leki 2002; 5: 5-10. 

4. Jug M i wsp.: Hydroxypropyl methylcellulose microspheres 

with piroxicam and piroxicam-hydroxypropylbeta-cyclodextrin 

inclusion complex. Pharmazie 2004; 

59: 686-691. 

5. Ingkatawornwong S i wsp.: Studies on aging piroxicampolyvinylpyrrolidone 

solid dispersions. Pharmazie 2001; 

56: 227-230. 

6. Albertini B i wsp.: Evaluation of beta-lactose, PVP K12 

and PVP K90 as excipients to prepare piroxicam granules 

using two wet granulation techniques. Eur J Pharm 

Biopharm 2003; 56: 479-487.

7. Verma M M i wsp.: Dissolution, bioavailability and ulcerogenic 

studies on piroxicam-nicotinamide solid dispersion 

formulations. Boll Chim Farm 2003; 142: 119-124. 

8. Van Hees T i wsp.: Determination of the free/included 

9. 

piroxicam ratio in cyclodextrin complexes: comparison 

between UV spectrophotometry and differential 

scanning calorimetry.; Eur J Pharm Sci 2002; 15(4): 

347-53. 

Nachajski M, Zgoda M M. Zastosowanie solubilizacji 

hydrotropowej i micelarnej w celu poprawy dostępności 

farmaceutycznej NLPZ- środków leczniczych z II klasy 

BCS. Farmacja Polska 2008, 64 (5), 231-237. 


Beata Szulc-Musioł 


Katedra i Zakład Farmacji Stosowanej 

ul. Kasztanowa 3 

41-200 Sosnowiec 

Tel. 032 291-84-23 

e-mail: bszulc@sum.edu.pl 


10. Jankowski A, Gadomska-Nowak M. Wpływ metody 

sporządzania oraz dodatku substancji pomocniczych na 

dostępność farmaceutyczną piroksykamu z czopków. 

Farm Pol 2004; 20: 970-975. 

11. Zgoda M M. Solubilizacja hydrotropowa i micelarna 

trudno rozpuszczalnych w wodzie środków leczniczych. 

Farm Pol 2007; 4(53): 135-143. 

12. Szulc-Musioł B, Jankowski A. Influence of surfactants of 

Rofam type on properties of piroxicam tablets. Acta Pol 

Pharm Drug Research (w druku). 

13. Farmakopea Polska VI. Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne. 

Warszawa 2002. 

27


Depression of β 1 -integrin signalling and IGF-I receptor 

expression is responsible for oxidative stress 

– induced inhibition of collagen biosynthesis 

and cell growth in cultured fibroblasts. 

Osłabienie sygnału generowanego przez receptor β1 

integrynowy oraz ekspresji receptora IGF-I jest odpowiedzialne 

za indukowane przez stres oksydacyjny upośledzenie 

biosyntezy kolagenu i wzrostu fibroblastów. 

paweł sienkiewicz, wojciech Miltyk, jerzy pałka* 

department of Medicinal chemistry 

Medical university in bialystok 

head of the department: prof. jerzy pałka 

ABSTRACT 

The molecular mechanism of oxidative stress dependent 

inhibition of collagen biosynthesis and cell growth was 

studied in cultured human skin fibroblasts. Insulin-like 

growth factor-I (IGF-I) and prolidase play an important 

role in collagen biosynthesis and cell growth. IGF-I 

stimulates collagen and prolidase gene expression. 

Prolidase [EC 3.4.13.9] is involved in the recycling of 

proline for the protein biosynthesis and cell growth. 

Prolidase expression is under control of signaling by β 1 - 

integrin receptor. The endpoint of signal transduced by 

β 1 -integrin receptor, as well as IGF-IR, is activation of 

MAP-kinases (ERK 1 , ERK 2 ). The effects of oxidative 

stress on collagen and DNA biosynthesis, expression 

of prolidase, β 1 -integrin receptor, focal adhesion kinase 

pp125 FAK (FAK), IGF-IR and MAP- kinases (ERK 1 , 

ERK 2 ) were evaluated. Subconfluent cells were submitted 

to oxidative stresses with 30 µM t-butylhydroperoxide 

(t-BHP) for 1h per day for 3 days. It was found, that 

oxidative stres induced inhibition of collagen biosynthesis, 

prolidase expression and cell growth in human 

dermal fibroblasts. The mechanism of this phenomenon 

was found at the level of IGFR and β 1 -integrin signaling. 

It explains the inhibition of collagen and DNA biosynthesis 

in fibroblasts submitted to oxidative stress. 

Key words: collagen, cell growth, IGF-I receptor, β 1 - 

integrins, intracellular signaling, oxidative stress, prolidase 

28 

STRESZCZENIE 

Przedmiotem badań jest ocena molekularnego mechanizmu 

upośledzenia biosyntezy kolagenu i podziałów 

komórkowych w przebiegu doświadczalnego stresu 

oksydacyjnego w hodowli fibroblastów. Insulino-podobny 

czynnik wzrostowy I (IGF-I) i prolidaza pełnią 

ważną rolę w biosyntezie kolagenu i wzroście komórek. 

IGF-I pobudza ekspresję genów kolagenu i prolidazy. 

Prolidaza [EC 3.4.13.9] uczestniczy w recyklingu proliny 

do biosyntezy białek i wzrostu komórek. Ekspresja 

prolidazy jest pod kontrolą szlaku sygnałowego indukowanego 

przez receptor β1 integrynowy. Końcowym etapem 

szlaku sygnałowego indukowanego przez receptor 

β1 integrynowy i receptor IGF-I jest aktywacja MAP 

kinaz, ERK1 i ERK2. Zbadano wpływ doświadczalnego 

stresu oksydacyjnego na biosyntezę kolagenu i DNA, 

ekspresję prolidazy, receptorów β1 integrynowego i IG- 

F-I, białek FAK, ERK1 i ERK2. Fibroblasty przed osiągnięciem 

stanu inhibicji kontaktowej poddano stresowi 

oksydacyjnemu przez dodatek do podłoża hodowlanego 

30 μM t-butylo-nadtlenku wodoru (tBHP) na okres 

1 godziny/dzień powtarzając tą procedurę przez 3 dni. 

Wykazano, że stres oksydacyjny indukował obniżenie 

biosyntezy kolagenu, ekspresji prolidazy i wzrostu komórek 

w hodowli fibroblastów. Wykazano, że mechanizm 

tego zjawiska obejmuje upośledzenie aktywacji 

szlaków sygnałowych generowanych przez receptor β1 

integrynowy i receptor IGF-I. Wyjaśnia to mechanizm 

upośledzenia biosyntezy kolagenu i DNA w fibroblastach 

poddanych stresowi oksydacyjnemu. 

Słowa kluczowe: fibroblasty, kolagen, prolidaza, receptor 

IGF-I, receptor β1 integrynowy, szlaki sygnałowe, 

stres oksydacyjny

INTRODUCTION 

Oxidative stress plays important role in pathogenesis of 

many diseases. Oxygen radicals cause oxidation of nucleic 

acids [1], lipids [2] and proteins [3] contributing to disturbances 

in cellular metabolism. One of the proteins affected 

by oxidative stress is collagen [4-7]. 

Collagen is the most abundant extracellular protein in 

mammals, responsible for maintenance of architecture and 

integrity of connective tissue. It also plays an important role 

in interaction with integrin receptors, through which it participates 

in regulation of numerous physiological and pathological 

processes [8, 9]. 

Collagen biosynthesis in human dermal fibroblasts may 

depend on the activity of prolidase [10-12]. Prolidase [EC 

3.4.13.9] is a cytosolic enzyme which catalyses hydrolysis 

of imidodipeptides (mainly derived from collagen degradation) 

[13], releasing proline, which is used for collagen resynthesis 

[14] and cell growth [15]. 

Prolidase activity is known to be induced by β 1 -integrin 

receptor activation [16]. Stimulated β 1 -integrin receptor induces 

phosphorylation of non-receptor focal adhesion kinase 

pp125 FAK (FAK) [17], which is then capable of interacting 

with several proteins [18] and subsequently, two mitogen 

activated protein kinases (MAPK), extracellular-signal-regulated 

kinase 1 (ERK 1 ) and kinase 2 (ERK 2 ) [19]. The end 

point of the signaling is activation of transcription factors 

and gene expression of many proteins involved in regulation 

of cell growth and differentiation [20]. 

Another factor that stimulates collagen biosynthesis and 

cell growth is the insulin-like growth factor- I (IGF-I) [21], 

that exerts its effects through interaction with IGF-I receptor 

(IGF-IR) [22]. Stimulation of this receptor results in the 

activation of the Ras-Raf-mitogen activated protein kinase 

(MAPK) pathway, which involves the same signaling proteins 

and kinases as β 1 -integrin transduced pathway, except 

FAK [23]. The effects of IGF-I action is induction of collagen 

gene expression [24], up-regulation of prolidase activity 

[25], as well as stimulation of mitotic division and apoptosis 

prevention [26]. 

The current study was undertaken to investigate the effects 

of oxidative stress on collagen and DNA biosynthesis, 

expression of prolidase, β 1 -integrin receptor, FAK, MAP- 

kinases (ERK 1 , ERK 2 ) and IGF-I receptor (IGF-IR) in cultured 

fibroblasts. 

MATERIALS AND METHODS 

Materials. Anti–Goat IgG antibody, Anti–Mouse IgG 

antibody, bacterial collagenase, Dulbecco’s phosphate buffered 

saline (DPBS), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/ 

nitro blue tetrazolium liquid substrate reagent (BCIP/NBT), 

L-glycyl-proline, L-proline, monoclonal (rabbit) anti-focal 

adhesion kinase pp125 FAK antibody, monoclonal (goat) anti- 

IGF-IR antibody, monoclonal (mouse) anti-MAPK antibody, 

p-nitrophenol and p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside 

were provided by Sigma Corp., USA., as were most other 

chemicals and buffers used. t-Butylhydroperoxide (t- 

BHP) was the product of Fluka Chemie AG (Germany). 

Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) and fetal 


Fig. 1. β-galactosidase activity in control human dermal fibroblasts 

and the cells submitted to oxidative stress by treatment with 30 µM 

t-butylhydroperoxide (t-BHP) as described in the methods section. 

Mean values from three independent experiments done in duplicates 

are presented. P


Fig. 3. Western immunoblot analysis for prolidase in control human 

dermal fibroblasts (C) and the cells submitted to oxidative stress 

by treatment with 30 µM t-butylhydroperoxide (t-BHP) as described 

in method section. Samples used for electrophoresis consisted of 

20 µg of protein of pooled cell extracts (n = 6). Detection of β-actin 

was carried out in order to provide the loading control. The arrows 

indicate the molecular mass of standards. The intensity of the bands 

was quantified by densitometric analysis. 

Fig. 4. Western immunoblot analysis for β 1 -integrin receptor (A) and 

FAK (B) in control human dermal fibroblasts (C) and the cells submitted 

to oxidative stress by treatment with 30 µM t-butylhydroperoxide 

(t-BHP) as described in methods section. Samples used for electrophoresis 

consisted of 20 µg of protein of pooled cell extracts (n = 6). 

Detection of β-actin was carried out in order to provide the loading 

control. The arrows indicate the molecular mass of standards. The 

intensity of the bands was quantified by densitometric analysis. 

lasts were maintained in DMEM supplemented with 10% fetal 

bovine serum (FBS), 2 mM glutamine, 50 U/ml penicillin, 50 

µg/ml streptomycin at 37 0 C in a 5 % CO 2 incubator. Cells were 

counted in a hemocytometer and cultured at 1 x 10 5 cells per 

well in 2 ml of growth medium in 6 well plates (Costar). Cells 

reached about 80% of confluence at day 3 and such cells were 

used for assays. Cells were used in the 8th to 14th passages. 

Induction of oxidative stress in human dermal fibroblasts. 

Subconfluent cells were submitted to 2 repetitive oxidative 

stress by treatment for 2 days with 30 µM t-butylhydroperoxide 

(t-BHP) for 1 h per day according to the method 

described by Dumont et al. [27]. Induction of oxidative stress 

was performed in the following manner: 10 µl of 3 mM t- 

BHP in DPBS was added to each well, containing 1 ml of 

DMEM with 10% FBS and plates were incubated in 37 0 C 

for 1 hour. After this time, medium containing t-BHP was removed, 

cells were rinsed twice with DMEM and maintained 

in DMEM containing 10% FBS. The next 1hour treatment 

of the fibroblasts with t-BHP was performed after 24 hours, 

30 

Fig. 5. Western immunoblot analysis for IGF-I receptor in control 

human dermal fibroblasts (C) and the cells submitted to oxidative 

stress by treatment with 30 µM t-butylhydroperoxide (t-BHP) as described 

in methods section. Samples used for electrophoresis consisted 

of 20 µg of protein of pooled cell extracts (n = 6). Detection of 

β-actin was carried out in order to provide the loading control. The 

arrows indicate the molecular mass of standards. The intensity of the 

bands was quantified by densitometric analysis. 

Fig. 6. Time course experiment for DNA biosynthesis (measured 

by [ 3 H]thymidine incorporation assay) in control human dermal fibroblasts 

and the cells submitted to oxidative stress with 30 µM tbutylhydroperoxide 

(t-BHP) as described in methods section. Mean 

values from three independent experiments done in duplicates are 

presented. 

in order to let the cells recover from the previous one. Control 

cultures were incubated similarly but in the absence of t-BHP. 

In order to prepare the cell extracts for assays the fibroblasts 

were harvested 24h after the last scheduled stress. 

Determination of β- galactosidase activity. The activity 

of β- galactosidase was determined according to the method 

described by Chateriee et al. [28], modified by Zwierz et al. 

[29]. 150 µl of 20 mM solution of substrate (p-nitrophenylβ-D-galactopyranoside 

dissolved in Mc Ilvane’s phosphate- 

citrate buffer pH 4.7) was mixed with 200 µl of Mc Ilvane’s 

phosphate- citrate buffer pH 4.7 and 50 µl of cell extract. 

After 30 minutes of incubation in 37 0 C, the reaction was terminated 

by adding 1ml borate buffer pH 9.8. The amount of 

released p-nitrophenol was determined colorimetrically by 

absorbance at 410 nm and calculated from calibration curve 

for p-nitrophenol standards. Protein concentration was 

measured by the method of Lowry et al.[30]. Enzyme activity 

was reported as nanomoles of released p-nitrophenol 

during one minute per milligram of supernatant protein. 

DNA synthesis. Cells were counted in a hemocytometer 

and cultured at 1 x 10 5 cells per well in 1 ml of growth

Fig. 7. Western immunoblot analysis for MAP- kinases- ERK 1 , ERK 2 

in control human dermal fibroblasts (C) and the cells submitted to 

oxidative stress by treatment with 30 µM t-butylhydroperoxide (t- 

BHP) as described in methods section. Samples used for electrophoresis 

consisted of 20 µg of protein of pooled cell extracts (n = 6). 

Detection of β- actin was carried out in order to provide the loading 

control. The arrows indicate the molecular mass of standards. The 

intensity of the bands was quantified by densitometric analysis. 

medium until they reached about 80% of confluence. After 

the last 1h treatment of studied cells with t-BHP, 0.5 µCi 

[ 3 H]-thymidine (6.7 Ci/mmol) was added to each well and 

plates were incubated in 37 0 C with 5% CO 2 for 4 hours. After 

that time cell surface was rinsed 3 times with 1 ml of 0.05 

M Tris-HCl and 2 times with 1 ml of 5% TCA. Then, cells 

were lysed in 1ml of 0.1 M NaOH containing 1% SDS. After 

5 minutes the cell lysate was moved into scintillation vials 

containing 4 ml scintillation liquid and radioactivity of the 

samples was measured. 

Collagen synthesis. After the last scheduled 1h treatment 

of studied fibroblasts with t-BHP, the cells were labeled 

for 24 h with 5[ 3 H]proline (5 µCi/ml, 28 Ci/mmol) 

and incorporation of radioactive precursor into proteins was 

measured as described previously [30]. Incorporation of 

tracer into collagen was determined by digesting proteins 

with purified Clostridium histolyticum collagenase, according 

to the method of Peterkofsky [31]. Total protein synthesis 

was calculated from the sum of radioactivity of collagenaseresistant 

proteins and collagen digest. Results are shown as 

combined values for cell plus medium fractions. 

SDS-PAGE. Slab SDS/PAGE was used, according to 

the method of Laemmli [32]. 

Western Immunoblot Analysis. After SDS-PAGE, the 

gels were allowed to equilibrate for 5 min. in 25 mM Tris, 

0.2 M glycine in 20% (v/v) methanol. The proteins were 

transfered to 0.2 µm pore-sized nitrocellulose at 100 mA 

for 1 hour by using a LKB 2117 Multiphor II electrophoresis 

unit. The nitrocellulose was incubated with: polyclonal 

antibody against human prolidase at concentration 1:3,000; 

monoclonal anti-β 1 -integrin and polyclonal anti-FAK antibodies 

at concentration 1:1,000; monoclonal anti-IGF-IR 

antibody, monoclonal anti-MAPK antibody and polyclonal 

anti-β-actin antibody at concentration 1:5000 in 5% dried 

milk in Tris buffered saline with Tween 20 (TBS-T) (20 

mmol/l Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 150 mmol/l 

NaCl and 0.05% Tween 20) for 1 hour. In order to analyze 

prolidase and FAK, anti-Rabbit IgG (whole molecule) alkaline 

phosphatase conjugate was added at concentration 


1:5,000 in TBS-T, in order to analyze MAP-kinases second 

antibody-alkaline phosphatase conjugated, anti-Mouse 

IgG (whole molecule) was added at concentration 1:7,500 

in TBS-T and in order to analyze β 1 -integrin subunit, IGF- 

IR and β-actin second antibody- alkaline phosphatase 

conjugated, anti-Goat IgG (whole molecule) was added at 

concentration 1:5,000 in TBS-T and incubated for 30 min 

while slowly shaking. Then nitrocellulose was washed with 

TBS-T (5 x 5 min) and submitted to 5-bromo-4-chloro-3indolyl 

phosphate/nitro blue tetrazolium liquid substrate 

reagent (BCIP/NBT). The intensity of the bands was quantified 

by densitometric analysis. 

RESULTS 

Tert-butylhydroperoxide (t-BHP) that generates free 

oxygen radicals [33] is commonly used as an experimental 

model for induction of oxidative stress in cultured cells 

[34, 27]. The effectiveness of t-BHP in inducing oxidative 

stress in fibroblasts was measured by determination of β- galactosidase 

activity that represent a biomarker of oxidative 

stress [36, 27]. As can be seen in Fig. 1, β- galactosidase 

activity was increased by about 2 fold in fibroblasts treated with 

t-BHP compared to control cells. The results suggest high efficiency 

of t-BHP in inducing oxidative stress in studied cells. 

Collagen biosynthesis was evaluated by measurement of 

5[ 3 H]proline incorporation into proteins, susceptible to action 

of bacterial collagenase, as described in Materials and methods. 

Exposure of cells to oxidative stress contributed to a decrease 

in collagen biosynthesis to about 50 % of control (Fig. 2). 

The decrease in collagen biosynthesis in human dermal 

fibroblasts submitted to oxidative stress was accompanied 

by a decrease in the prolidase expression (Fig. 3). 

Although prolidase is stimulated through signal induced 

by β 1 -integrin [16, 36], we observed no differences in expression 

of this receptor between control and t-BHP treated 

fibroblasts (Fig. 4A). However, expression of FAK in the 

cells treated with t-BHP was distinctly decreased, compared 

to controls (Fig. 4B). It suggests, that β 1 -integrin signaling 

may play important role in oxidative stress-induced collagen 

biosynthesis disturbances. 

Considering the role of IGF-I in regulation of collagen 

biosynthesis, we evaluated the expression of IGF-IR receptor 

in studied cells. As can be seen in Fig. 5 in fibroblasts treated 

with t-BHP, IGF-I receptor expression was decreased. Both 

α and β subunits were affected. 

Inhibitory effect of oxidative stress on expression of 

IGF-I receptor suggests, that this phenomenon may attenuate 

DNA biosynthesis and subsequently mitotic divisions, 

since IGF-I exerts a strong stimulatory effect on these processes 

[26]. Therefore, [ 3 H]thymidine incorporation assay 

was performed, as described in Materials and methods. During 

the time course of the experiment, DNA biosynthesis 

significantly decreased in the cells treated with t-BHP compared 

to control (Fig. 6). 

Signal transmitted by stimulated IGF-I receptor leads 

to activation of two MAP-kinases (ERK 1 and ERK 2 ) [37]. 

As can be seen in Fig. 7 the expression of MAP- kinases 

was decreased in fibroblasts treated with t-BHP, compared 

to control cells. 

31


DISCUSSION 

Oxidative stress is known to affect tissue metabolism 

[38,39]. It participates in pathogenesis of inflammation 

[40,41] and diabetes [41,42], promotes carcinogenesis [1] 

and induces cellular senescence resulting from accumulation 

of oxidative damage in DNA, lipids and proteins [43]. 

Collagen, which accounts for about one third of total body 

proteins is essential not only for the maintenance of the connective 

tissue, but also for interaction with integrins. Activation 

of these receptors by extracellular matrix proteins, e.g. 

collagen, regulates cellular gene expression, differentiation, 

cell growth [44] and plays an important role in wound repair 

[45], tumorigenicity and invasiveness [46]. 

This study suggests, that oxidative stress exerts inhibitory 

effect on collagen biosynthesis in human dermal fibroblasts. 

Similar effect on collagen production was previously 

demonstrated in human cardiac fibroblasts exposed to varying 

concentrations of hydrogen peroxide or xanthine plus 

xanthine oxide [7]. In order to explain the mechanism of this 

process, we considered prolidase as a target enzyme. 

Prolidase activity has been demonstrated to play an important 

role in regulation of collagen biosynthesis in fibroblasts 

[10-12]. In fact, the enzyme expression was decreased 

in fibroblasts exposed to t-BHP. Decreased prolidase expression 

in these cells was accompanied by a decrease in the expression 

of phosphorylated FAK protein. The correlation is 

well known phenomenon. Activation of β 1 -integrin receptor 

that is known to increase in prolidase expression and activity 

[16, 36] leads to phosphorylation of FAK [17]. Therefore 

decrease in expression of FAK in t-BHP treated fibroblasts 

may explain decrease in prolidase expression. Similarly decreased 

expression of MAP- kinases (ERK 1 and ERK 2 ) was 

observed in t-BHP treated cells. 

Extracellular signal-regulated kinases pathway constitutes 

a major one, through which growth factor receptors 

transmit signals to the nucleus. It is known, that some growth 

factor receptors (EGFR, PDGFR or T-cell receptor) undergo 

phosphorylation in response to treatment with oxidants. 

Their phosphorylation leads to activation of p44/42 MAPK 

signaling pathway [47-52]. However, it has been recently 

shown, that oxidative stress can variously modulate ERKs 

activity in a time- and dose-dependent manner [53,54]. In 

addition, reactive carbonyl compounds, glyoxal and methylglyoxal 

formed extensively in conditions of oxidative stress 

have been demonstrated to be capable of dephosphorylation 

of intracellular phospho-ERKs, what results in their inactivation 

[55]. 

IGF-I receptor is a receptor-tyrosine kinase that plays a 

critical role in signaling that leads to cell survival and proliferation. 

It is also a strong stimulator of collagen and DNA 

biosynthesis [21, 26]. It has been proposed, that activation 

of this receptor may protect different cells from oxidative 

stress [56-58] and regulate their resistance to the action of 

oxidants [59]. 

We found that down-regulation of IGF-I receptor expression 

in fibroblasts submitted to oxidative stress was accompanied 

by parallel changes in expression of both MAP-kinases 

(ERK 1 and ERK 2 ). Simultaneously, DNA biosynthesis 

in fibroblasts treated with t-BHP decreased during the time 

32 

course of the experiment. In view of these data it seems that 

decrease in collagen biosynthesis and cell division caused 

by oxidative stress may be mostly a consequence of disturbances 

in β 1 -integrin and IGF-I receptor signaling. 

References 

1. Kawanishi S., Hiraku Y., Oikawa S. Mechanism of guanine-specific 

DNA damage by oxidative stress and its 

role in carcinogenesis and aging. Mutat. Res. 2001; 488: 

65-76. 

2. Mazhul V., Shcherbin D., Zavodnik I., Rękawiecka K., 

Bryszewska M. The effect of oxidative stress induced 

by t-butyl hydroperoxide on the structural dynamics of 

membrane proteins of chinese hamster fibroblasts. Cell 

Biol Intern. 1999; 23: 345-350. 

3. Stadtman E.R. Protein oxidation and aging. Science 1992; 

257: 1220-1224. 

4. Dean R.T., Thomas S.M., Vince G., Wolff S.P. Oxidation 

induced proteolysis and its possible restriction by some 

secondary protein modifications. Biomed Biochim Acta. 

1986; 11-12: 1563-1573. 

5. Monboisse J.C., Gardes-Albert M., Randaoux A., Borel 

J.P., Ferradini C. Collagen degradation by superoxide 

anion in pulse and gamma radiolysis. Biochim Biophys 

Acta. 1988; 965: 29-35. 

6. Kawaguchi Y., Tanaka H., Okada T., Konishi H., Takahashi 

M., Ito M., Asai J. The effects of ultraviolet A and 

reactive oxygen species on the mRNA expression of 

72-kDa type IV collagenase and its tissue inhibitor in 

cultured human dermal fibroblasts. Arch Dermatol Res. 

1996; 288: 39-44. 

7. Siwik D.A., Pagano P.J., Colucci W.S. Oxidative stress 

regulates collagen synthesis and matrix metalloproteinase 

activity in cardiac fibroblasts. Am J Physiol Cell 

Physiol. 2001; 280: 53-60. 

8. Gumbiner B.M., Yamada K.M. Cell-to-cell contact and 

extracellular matrix. Curr Opin Cell Biol. 1995; 7: 615- 

618. 

9. Plow E.F., Haas T.A., Zhang L., Loftus J., Smith J.W. Ligand 

binding to integrins. J Biol Chem. 2000; 275: 21785- 

21788. 

10. Pałka J., Miltyk W., Karna E., Wołczyński S. Modulation 

of prolidase activity during in vitro aging of human 

skin fibroblasts the role of extracellular matrix collagen. 

Tokai J Exp Clin Med. 1996; 21: 207-213. 

11. Miltyk W., Pałka J.A. Potential role of pyrroline 5-carboxylate 

in regulation of collagen biosynthesis in cultured 

human skin fibroblasts. Comp Biochem Physiol A. 

2000; 125: 265-271. 

12. Muszynska A., Pałka J., Gorodkiewicz E. The mechanism 

of daunorubicin-induced inhibition of prolidase 

activity in human skin fibroblasts and its implication 

to impaired collagen biosynthesis. Exp Toxicol Pathol. 

2000; 52: 149-55. 

13. Myara I., Charpentier C., Lemonnier A. Prolidase and 

prolidase deficiency, Life Sci. 1984; 34: 1985-1998. 

14. Yaron A., Naider F. Proline-dependent structural and 

biological properties of peptides and proteins. Crit Rev 

Biochem Mol Biol. 1993; 28: 31-81.

15. Emmerson K.S., Phang J.M. Hydrolysis of proline 

dipeptides completely fulfills the proline requirement in 

a proline-auxotropic Chinese hamster ovary cell line. J 

Nutr. 1993; 123: 909-914. 

16. Pałka J, Phang J. Prolidase activity in fibroblasts is regulated 

by interaction of extracellular matrix with cell 

surface integrin receptor. J. Cell. Biochem. 1997; 67 

166-175. 

17. Hanks S.K., Calalb M.B., Harper M.C., Patel S.K. Focal 

adhesion protein-tyrosine kinase phosphorylated in response 

to cell attachment to fibronectin. Proc Natl Acad 

Sci USA. 1992; 89: 8487-8491. 

18. Juliano R. Cooperation between soluble factors and 

integrin- mediated cell anchorage in the control of 

cell growth and differentiation. Bioessays 1996;18: 

911-917. 

19. Seger R., Krebs E.G. The MAPK signaling cascade. 

FASEB J. 1995; 9: 726-735. 

20. Labat-Robert J., Robert L. Interaction between cells 

and extracellular matrix: signaling by integrins and the 

elastin-laminin receptor. Prog. Mol. Subcell. Biol. 2000; 

25: 57-70. 

21. Goldstein R.H., Poliks C.F., Plich P.F., Smith B.D., Fine, 

A. Stimulation of collagen formation by insulin-like 

growth factor-I in cultures of human lung fibroblasts. 

Endocrinology 1989; 124: 964-970. 

22. Le Roith D., Werner H., Beitner-Johnson D., Roberts 

Jr. C.T. Molecular and cellular aspects of the insulinlike 

growth factor-I receptor. Endocr. Rev. 1995;16: 

143-64. 

23. Butler A.A., Yakar S., Gewolb I.H., Karas M., Okubo 

Y., LeRoith, D. Insulin-like growth factor-I receptor 

signal transduction: at the interface between physiology 

and cell biology. Comp Biochem Physiol B. 1998; 

121: 19-26. 

24. Tanaka H., Wakisaka A., Ogasa H., Kawai S., Liang C.T. 

Effect of IGF-I and PDGF administered in vivo on the 

expression of osteoblast- related genes in old rats. J Endocrinol. 

2002; 174: 63-70. 

25. Miltyk W., Karna E., Wołczyński S., Pałka J. Insulin-like 

growth factor I- dependent regulation of prolidase activity 

in cultured human skin fibroblasts. Mol Cell Biochem. 

1998; 189: 177-184. 

26. Baserga R., Hongo A., Rubini M., Prisco M., Valentinis 

B. The IGF-I receptor in cell growth, transformation 

and apoptosis. Biochem Biophys Acta. 1997; 1332: 

105-106. 

27. Dumont P., Burton M., Chen Q. M., Gonos E. S., Frippiat 

C., Mazarati J. B., Eliaers F., Remacle J., Touissant 

O. Induction of replicative senescence biomarkers by 

sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. 

Free Radic Biol Med. 2000; 28: 361-373. 

28. Chatteriee S., Velicer L.F., Sweeley C.C. Glycosphingolipid 

glycosyl hydrolases and glycosidases of synchronized 

human KB cells. J Biol Chem. 1975; 250: 

4972- 4979. 

29. Zwierz K., Gindzieński A., Głowacka D., Porowski T. 

The degradation of glycoconjugates in the human gastric 

mucous membrane. Acta Med Acad Sci Hung. 1981; 38: 

145-152. 


30. Oyamada I., Pałka J., Schalk E.M., Takeda K., Peterkofsky 

B. Scorbutic and fasted guinea pig sera contain an 

insulin-like growth factor I reversible inhibitor of proteoglycan 

and collagen synthesis in chick embryo chondrocytes 

and adult human skin fibroblasts. Arch Biochem 

Biophys. 1990; 276: 85-93. 

31. Peterkofsky B., Pałka J., Wilson S., Takeda K., Shah V. 

Elevated activity of low molecular weight insulin-like 

growth factor- binding proteins in sera of vitamin C- deficient 

and fasted guinea pigs. Endocrinology 1991; 128: 

1769-1779. 

32. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the 

assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 

227: 680-685. 

33. Ochi T., Miyaura S. Cytotoxicity of an organic hydroperoxide 

and cellular antioxidant defense system against 

hydroperoxides in cultured mammalian cells. Toxicology 

1989; 55: 69-82. 

34. Makino N., Bannai S., Sugita Y. Kinetic studies on the 

removal of extrecellular tert-butyl hydroperoxide by 

cultured fibroblasts. Biochim Biophys Acta 1995; 1243: 

503-508. 

35. Dimri G.P., Lee X., Basile G., Acosta M., Scott G., 

Roskeley C., Medrano E.E., Linskens M., Rubelj I., 

Pereira-Smith O., Peacocke M., Campisi, J. A biomarker 

that identifies senescent cells in culture and in aging 

skin in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92: 

9363-9367. 

36. Pałka J.A., Phang J.M. Prolidase activity is regulated by 

cell surface extracellular matrix interaction in normal fibroblast 

and MCF-7 cells. Proc Am Assoc Cancer Res. 

1994; 35: 531. 

37. Werner H., Le Roith D. New concepts in regulation and 

function of the insulin-like growth factors: implications 

for understanding normal growth and neoplasia. Cell 

Mol Life Sci. 2000; 57: 932-942. 

38. Mocali A., Caldini R., Chevanne M., Paoletti F. Induction, 

effects and quantification of sublethal oxidative 

stress by hydrogen peroxide on cultured human fibroblasts. 

Exp Cell Res. 1995; 216: 388-395. 

39. Allen R.G., Tresini M. Oxidative stress and gene regulation. 

Free Radic Biol Med. 2000; 28; 463-499. 

40. Salvemini D., Ischiropoulos, H., Cuzzocrea, S. Roles of 

nitric oxide and superoxide in inflammation. Methods 

Mol. Biol. 225 (2003) 291-303. 

41. Jialal I., Devaraj S., Venugopal S.K. Oxidative stress, 

inflammation, and diabetic vasculopathies: the role of alpha 

tocopherol therapy. Free Radic Res. 2002; 36: 1331- 

1336. 

42. Haskins K., Bradley B., Powers K., Fadok V., Flores S., 

Ling X., Pugazhenthi S., Reusch J., Kench J. Oxidative 

stress in type 1 diabetes. Ann N Y Acad Sci. 2003; 1005: 

43-54. 

43. Toussaint O., Medrano E.E., Von Zglinicki T. Cellular 

and molecular mechanisms of stress- induced premature 

senescence (SIPS) of human diploid fibroblasts and 

melanocytes. Exp Gerontol. 2000; 35: 927-945. 

44. Carey D.J. Control of growth and differentiation of vascular 

cells by extracellular matrix. Ann Rev Physiol. 

1991; 53: 161-177. 

33


45. Hart J., Silcock D., Gunnigle S., Cullen B., Light N.D., 

Watt P.W. The role of oxidised regenerated cellulose/collagen 

in wound repair: effects in vitro on fibroblast biology 

and in vivo in a model of compromised healing. Int 

J Biochem Cell Biol. 2002; 34; 1557-1570. 

46. Varner J.A., Cheresh D.A. Integrins and cancer. Curr 

Opin Cell Biol. 1996; 8: 724-730. 

47. Sachsenmaier C., Radler-Pohl A., Zinck R., Nordheim 

A., Herrlich P., Rahmsdorf H.J. Involvement of growth 

factor receptors in the mammalian UVC response. Cell. 

1994; 78: 963-972. 

48. Schieven G.L., Mittler R.S., Nadler S.G., Kirihara J.M., 

Bolen J.B., Kanner S.B., Ledbetter J.A., 1994. ZAP-70 

tyrosine kinase, CD45, and T cell receptor involvement 

in UV- and H2O2-induced T cell signal transduction. J 

Biol Chem. 1994; 269: 20718-20726. 

49. Huang R.P., Wu J.X., Fan Y., Adamson E.D. UV activates 

growth factor receptors via reactive oxygen intermediates. 

J Cell Biol. 1996; 133: 211-220. 

50. Knebel A., Rahmsdorf H.J., Ullrich A., Herrlich P. Dephosphorylation 

of receptor tyrosine kinases as target of 

regulation by radiation, oxidants or alkylating agents. 

EMBO J. 1996; 15: 5314-5325. 

51. Zanella C.L., Posada J., Tritton T.R., Mossman B.T. Asbestos 

causes stimulation of the extracellular-regulated 

kinase 1 mitogen-activated protein kinase cascade after 

phophorylation of the epidermal growth factor receptor. 

Cancer Res. 1996; 56: 5334-5338. 

52. Chen W., Martindale J.L., Holbrook N.J., Liu Y. Tumor 

promoter arsenite activates extracellular signal-regulated 

kinase through a signaling pathway mediated by epidermal 

growth factor receptor and Shc. Mol Cell Biol. 

1998; 18: 5178-5188. 

34 

Adres do korespondencji; 

Prof. Jerzy Pałka 

Department of Medicinal Chemistry 

Medical University of Białystok 

ul. Jana Kilinskiego 1 

15-089 Białystok 

Tel: (85)7485706 

e-mail: pal@umwb.edu.pl 

53. Li J., Holbrook N.J. Common mechanisms for declines 

in oxidative stress tolerance and proliferation with aging. 

Free Radic Biol Med. 2003; 35: 292-299. 

54. Bai X., Lu D., Bai J., Zheng H., Ke Z., Li X., Luo S. 

Oxidative stress inhibits osteoblastic differentiation of 

bone cells by ERK and NF-κB. Biochem Biophys Res 

Commun. 2004; 314: 197-207. 

55. Akhand A.A., Hossain K., Kato M., Miyata T., Du J., Suzuki 

H., Kurokawa K., Nakashima I. Glyoxal and methylglyoxal 

induce aggregation and inactivation of ERK 

in human endothelial cells. Free Radic Biol Med. 2001; 

31: 1228-1235. 

56. Kang B.P., Urbonas A., Baddoo A., Baskin S., Malhotra 

A., Meggs L.G. IGF-I inhibits the mitochondrial 

apoptosis program in mesangial cells exposed to 

high glucose. Am J Physiol Renal Physiol. 2003; 285: 

1013-1024. 

57.Hong F., Kwon S.J, Jhun B.S., Kim S.S., Ha J., Kim 

S.J., Sohn N.W., Kang C., Kang I., 2001. Insulinlike 

growth factor-1 protects H9c2 cardiac myoblasts 

from oxidative stress-induced apoptosis via 

phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular 

signal-regulated kinase pathways. Life Sci. 2001; 

68: 1095-1105. 

58. Galvan V., Logvinova A., Sperandio S., Ichijo H., 

Bredesen D.E. Type 1 insulin-like growth factor receptor 

(IGF-IR) signaling inhibits apoptosis signal-regulating 

kinase 1 (ASK1). J Biol Chem. 2003; 278: 13325- 

13332. 

59. Holzenberger M., Dupont J., Ducos B., Leneuve P., 

Geloen A., Even P.C., Cervera P., Le Bouc Y. IGF-I 

receptor regulates lifespan and resistance to oxidative 

stress in mice. Nature 2003; 421: 182-187.



Wpływ stopnia ufosforylowania bakteryjnych endotoksyn 

na ich aktywność biologiczną 

The influence of phosphorylation degree of bacterial endotoxins 

on their biological activity 

jolanta lodowska 1 , dorota jasek 1 , daniel wolny 2 , ludmiła węglarz 1 , zofia dzierżewicz 2 

1 katedra i zakład biochemii, 2 katedra i zakład biofarmacji, 

wydział farmaceutyczny, śląska Akademia Medyczna, 

41-200 sosnowiec, ul. narcyzów 1 

kierownik katedry i zakładu biochemii: prof. dr hab. ludmiła węglarz 

kierownik katedry i zakładu biofarmacji: prof. dr hab. zofia dzierżewicz 

Streszczenie 

Lipopolisacharyd (LPS), zwany endotoksyną bakteryjną, 

jest głównym czynnikiem wywołującym zakażenia 

bakteriami Gram-ujemnymi. Ten składnik zewnętrznej 

błony bakteryjnej posiada trzy regiony o odmiennych 

funkcjach biologicznych: część O-swoistą, rdzeń oligosacharydowy 

oraz lipid A. Za aktywność biologiczną 

odpowiedzialny jest komponent lipidowy, którego skład 

i budowa przestrzenna decyduje o aktywności biologicznej 

endotoksyny. Jednym z istotnych dla właściwości 

biologicznych LPS aspektów strukturalnych jest stopień 

ufosforylowana lipidu A, wpływa bowiem na rozpuszczalność 

endotoksyny w układach wodnych oraz przyłączenie 

jej do białka wiążącego LPS (LBP, ang. LPS 

binding potein) i transportującego ją do fosfolipidowej 

błony komórkowej zainfekowanego makroorganizmu. 

Mniejszy stopień podstawienia lipidu A grupami fosforanowymi 

warunkuje mniejszą aktywność endotoksyczną, 

przejawiającą się np. zahamowaniem indukcji cytokin 

oraz obniżeniem powinowactwa do receptorów LPS 

na komórkach ludzkich. Brak podstawników fosforanowych 

w lipidzie A zmniejsza również uporządkowanie 

reszt acylowych, co w efekcie modyfikuje właściwości 

biologiczne endotoksyny. 

Grupy fosforanowe mogą także występować w regionie 

heptozowym i Kdo oligosacharydu rdzeniowego. Działają 

one jak sygnały indukujące lub inhibujące Kdo-transferazy 

i heptozylotransferazy. Ponadto z fosforanami 

mogą łączyć się kationy Mg 2+ i Ca 2+ warunkując strukturalną 

i funkcjonalną integralność błony zewnętrznej. 

Słowa kluczowe: lipopolisacharyd, lipid A, fosforany, 

aktywność biologiczna 

Abstract 

Lipopolysaccharide, also called endotoxin, is a major pathogenic 

factor of Gram-negative bacteria. This bacterial 

outer membrane component consists of three regions: 

antigen-O, oligosaccharide core and lipid A, which differ 

in chemical structure and biological activity. Lipid A is 

essential for the endotoxic effects of Gram-negative bacteria 

and its composition and structural features determine 

biological activities of LPS complexes. The degree 

of lipid A phosphorylation is one of the crucial features 

responsible for the bioactivity of this region, affecting 

on solubility of endotoxin in water and its attachment 

to LPS binding protein (LPB), which transport endotoxin 

to cell membrane of infected macroorganisms. The 

decrease of endotoxic activity, manifested by decreased 

secretion cytokines and reduced affinity to human cell 

LPS receptors, is correlated with the lower degree of 

phosphorylation. The lack of phosphate groups in lipid 

A also influences three-dimensional arrangement of acylic 

substituents which modifies biological properties of 

endotoxins. 

Phosphate groups may also be attached to heptoses and 

Kdo in the core region of LPS. They function as inhibiting 

or inducing signals for heptosyltransferases and 

Kdo-transferases. Moreover, Mg 2+ and Ca 2+ kations may 

join phosphate groups, thus affecting structural and functional 

integrity of the outer membrane. 

Key words: lipopolysaccharide, lipid A, phosphates, 

biological activity 

35


Wprowadzenie 

Lipopolisacharyd (LPS) jest jednym z najważniejszych 

składników strukturalnych zewnętrznej błony bakterii Gram 

-ujemnych. Uczestniczy bowiem w procesie komunikowania 

tych mikroorganizmów ze środowiskiem zewnętrznym [1]. 

Wpływa także na prawidłowe funkcjonowanie oraz przeżywalność 

komórek bakteryjnych chroniąc je przed działaniem 

kwasów żółciowych zainfekowanego makroorganizmu 

i hydrofobowych antybiotyków [2]. Ten heteropolimer, 

składający się z trzech połączonych kowalencyjnie komponentów 

strukturalnych: części O-swoistej, oligosacharydu 

rdzeniowego i lipidu A, odpowiedzialny jest za chorobotwórczość 

bakterii Gram-ujemnych. Stymuluje leukocyty 

i komórki śródbłonka, co powoduje uwolnienie licznych cytokin 

i mediatorów stanu zapalnego, m.in. interleukin (IL-1, 

IL-6, IL-8, IL-10), czynnika martwicy nowotworu (TNFα), 

produktów metabolizmu kwasu arachidonowego (prostaglandyny, 

leukotrieny), czynnika aktywującego płytki krwi, 

wolnych rodników tlenowych, nadtlenku wodoru i tlenku 

azotu [3-5]. Dla podkreślenia jego działań negatywnych nazwano 

go endotoksyną bakteryjną. Na aktywność biologiczną 

LPS wpływ ma przede wszystkim struktura chemiczna 

lipidu A, m. in. jego stopień ufosforylowania. Jednak grupy 

fosforanowe mogą też często występować w wewnętrznej 

części oligosacharydu rdzeniowego [6,7]. Nie można jednak 

wykluczyć podstawienia nimi reszt cukrowych w antygenie O 

[8]. Najczęstsze miejsca podstawienia fosforanami struktury 

LPS przedstawiono na ryc. 1. 

Zależność aktywności biologicznej 

lipopolisacharydu od jego struktury 

chemicznej 

Za wzorzec całkowitej aktywności biologicznej uznano 

lipid A wyizolowany z bakterii Escherichia coli. Jego 

szkielet cukrowy stanowi disacharyd d-glukozoaminylowy 

(GlcpN-β(1→6)-GlcpN) podstawiony dwiema grupami 

fosforanowymi. Jedna związana jest estrowo w pozycji 4’ 

Ryc. 1. Budowa chemiczna lipopolisacharydu [5] 

Fig. 1 Chemical structure of lipopolysaccharide [5] 

36 

(GlcNII) na końcu nieredukującym, a druga α-glikozydowo 

w pozycji 1 (GlcNI) końca redukującego. Do tego disacharydu 

przyłączone są cztery reszty acylowe w pozycjach 2, 

3, 2’, 3’ oraz dwie kolejne będące podstawnikami kwasów 

tłuszczowych znajdujących się w pozycjach 2’ i 3’ GlcNII 

[5,9]. Jest to więc difosforylowany heksaacyl lipid A o asymetrycznym 

rozmieszczeniu kwasów tłuszczowych (ryc. 2). 

Bardzo podobną strukturą charakteryzuje się lipid A rodzaju 

Pectinatus, który także wykazuje pełną aktywność endotoksyczną 

[10]. Badania mające na celu ustalenie struktury 

chemicznej LPS syntetyzowanego przez różne bakterie 

Gram-ujemne, dowiodły, że odstępstwa od tej „wzorcowej” 

budowy wpływają na obniżenie aktywności biologicznej 

[11-14]. Pełną aktywność toksyczną wykazuje lipid A zawierający 

disacharyd heksozoaminylowy podstawiony asymetrycznie 

sześcioma resztami acylowymi [15,16]. Jest on 

100-krotnie bardziej aktywny niż cząsteczka o pięciu lub 

siedmiu resztach acylowych (ryc. 2). LPS zawierający heksaacylowany 

lipid A jest łatwiej wiązany przez makrofagi 

niż endotoksyna o dwóch lub czterech resztach acylowych. 

Lipidowy komponent LPS podstawiony czterema kwasami 

tłuszczowymi jest prawie nieaktywny biologicznie, a deacylowany 

nie wykazuje żadnej aktywności w obronie przed 

leukocytami [3,5,17]. 

Na aktywność biologiczną lipidu A wpływ ma również 

asymetria podstawienia kwasami tłuszczowymi szkieletu 

cukrowego. Bakterie, których grupy acylowe w lipidzie A 

ułożone są symetrycznie, np. Chromobacterium violaceum, 

Neisseria meningitidis wykazują dużo mniejszą toksyczność 

niż struktury z niesymetrycznym rozmieszczeniem 

tych podstawników [2,17]. 

Wpływ stopnia ufosforylowania lipidu A 

na jego aktywność biologiczną 

O właściwościach biologicznych lipidu A stanowi nie 

tylko liczba, rodzaj oraz rozmieszczenie kwasów tłuszczowych, 

ale także ilość reszt fosforanowych. Holst i wsp. [11] 

twierdzą, że podstawniki fosforanowe szkieletu cukrowego


Ryc. 2. Wpływ modyfikacji strukturalnych hydrofobowej składowej lipidu A na aktywność biologiczną bakteryjnych endotoksyn na przykładzie 

zmian strukturalnych w lipidzie A E. coli wraz ze współczynnikami określającymi stopień zmniejszenia aktywności zmodyfikowanego lipidu 

A w odniesieniu do jego kompletnej struktury [5,20] 

Fig. 2 The influence of structural modifications of hydrophobic part of lipid A on biological activity of bacterial endotoxins, as exemplified 

by E. coli lipid A structural changes with coefficients reflecting degree of a decrease of modified lipid A activity with reference to its whole 

structure 

lipidu A mogą pośrednio wpływać na rozpuszczalność LPS 

w układach wodnych, zwiększając tym samym jego toksyczność. 

Również Cox i wsp. [18] stwierdzili korelację między 

stopniem ufosforylowania lipidu A a jego aktywnością biologiczną. 

Nie tylko LPS bakterii E. coli [15], który uznaje 

się za „wzorcowy”, lecz także jego mutant K12, który jest 

odporny na peptydowy antybiotyk polimyksynę B, wykazuje 

dużą aktywność. Prawdopodobnie wiąże się to z występowaniem 

w lipidzie A tych drobnoustrojów znacznych ilości 

fosfoetanoloaminy. W lipidzie A Campylobacter jejuni zidentyfikowano 

aż trzy różne disacharydy heksozoaminylowe 

o dość niepospolitych strukturach. Jednak w każdym z nich 

zostały zachowane dwa podstawniki fosforanowe. Mimo 

różnic strukturalnych aktywność lipidu A tego patogenu jest 

porównywalna z aktywnością „wzorcowego” LPS. Wykazuje 

on w organizmie gospodarza letalność, pirogenność 

i lokalną nekrozę skórną [19]. Potwierdza to wpływ stopnia 

ufosforylowania lipidu A na jego aktywność biologiczną. 

Za słusznością powyższej tezy przemawiają również 

wyniki badań Rietschel’a i wsp. [20], według których, im 

mniej reszt fosforanowych zawiera lipid A, tym mniejszą 

wykazuje aktywność. Lipid A z monofosforylowanym 

przy C1 lub C4’ disacharydem heksozoaminylowym 

jest 100 razy mniej aktywny niż zawierający dwa takie 

podstawniki (ryc. 3) [3]. Także Kumada i wsp. [21] zauważyli, 

że wysoka aktywność LPS jest uwarunkowana 

lipidem A o strukturze difosforylowanej w pozycji 1 i 4’ 

cukru. Prowadząc badania na niepodstawionym w pozycji 

4’ i monofosforylowanym przy C1 rdzenia heksozoaminylowego 

lipidzie A bakterii Porphyromonas gingivalis, 

stwierdzili jego niską endotoksyczność oraz pewną unikalną 

cechę biologiczną - indukcję mitozy w komórkach śledziony 

myszy niewrażliwych na endotoksynę. Niska chorobotwórczość 

cechuje też lipid A bakterii Marinomonas vaga lub 

Bacteroides fragilis, zawierający tylko glikozydowo związany 

fosforan w pozycji 1 [22,23]. Z tego względu LPS 

B. fragilis uznawany jest za antagonistę endotoksyny, co 

może mieć znaczenie przy opracowywaniu szczepionek. 

Według Krauss’a i wsp. [24] także brak grupy fosforanowej 

w pozycji 1, a jej obecność przy C4’ szkieletu disacharydowego 

lipidu A skutkuje obniżeniem toksyczności 

(Neisseria gonorrhoeae, Mesorhizobium huakuii). Nieufosforylowany 

i niewykazujący aktywności biologicznej 

lipid A syntetyzują m.in. bakterie Bacteroides intermedius, 

Rhizobium leguminosarum i Francisella tularensis 

[25-27]. 

Zależność aktywności biologicznej od stopnia ufosforylowania 

lipidu A została przedstawiona w tabeli I. 

Reszty fosforanowe, jako ujemnie naładowane podstawniki 

szkieletu cukrowego lipidu A, mogą mieć również 

wpływ na przyłączanie endotoksyny do białka wiążącego 

LPS (LBP, ang. LPS binding potein), które transportuje je 

do fosfolipidowej błony komórkowej zainfekowanego makroorganizmu 

[17]. Zastąpienie grup fosforanowych resztami 

α-d-mannopiranozowymi nie wpływa na właściwości 

fizykochemiczne, ale powoduje zmniejszenie aktywności 

endotoksycznej, przejawiającej się zahamowaniem indukcji 

cytokin oraz obniżeniem powinowactwa do receptorów LPS 

na komórkach ludzkich [17]. Schwudke i wsp. [28] twierdzą, 

że brak podstawników fosforanowych zmniejsza także 

37


Ryc. 3. Modyfikacje hydrofilowej komponenty lipidu A a aktywność biologiczna bakteryjnych endotoksyn, na przykładzie zmian strukturalnych 

w lipidzie A E. coli wraz ze współczynnikami określającymi stopień zmniejszenia aktywności zmodyfikowanego lipidu A w odniesieniu do jego 

kompletnej struktury [5,20] 

Fig. 3 The effect of modifications of hydrophylic part of lipid A on biological activity of bacterial endotoxins, as exemplified by E. coli lipid A 

structural changes with coefficients reflecting degree of a decrease of modified lipid A activity with reference to its whole structure 

uporządkowanie reszt acylowych w lipidzie A, co w efekcie 

modyfikuje właściwości biologiczne LPS. 

Bakterie Porphyromonas gingivalis, Rhodobacter sp. 

syntetyzują charakteryzujący się niewielką endotoksycznością 

lipid A o strukturze różniącej się od formy o „wzorcowej” 

aktywności jedynie podstawnikami fosforanowymi 

i acylowymi [29]. Jednak niektóre mikroorganizmy (Plesiomonas 

shigelloides, Rhodopseudomonas sphaeroides, Rhodobacter 

capsulatus) posiadają niewykazujący aktywności 

toksycznej lipid A o strukturze odpowiadającej temu komponentowi 

LPS u E. coli. Łukasiewicz i wsp. [30] sugerowali, 

że bakteria Plesiomonas shigelloides ma dużą zdolność 

indukcji cytokin, co może wynikać z difosforylowanej 

struktury lipidu A. Jednak przeczą temu wyniki ich późniejszych 

badań in vitro prowadzonych na zdefosforylowanej 

cząsteczce tego składnika LPS, bowiem nie potwierdziły 

wpływu ufosforylowania na powyższą formę aktywności 

biologicznej. Do nieaktywnych zaliczono również stosunkowo 

konserwatywną, difosforylowaną strukturę lipidu A 

bakterii Rhodopseudomonas sphaeroides [31] i Rhodobacter 

capsulatus [24]. Silipo i wsp. [32] wysunęli tezę o syntetyzowaniu 

przez bakterie nieufosforylowanego lipidu A 

o zmniejszonym stopniu zacylowania jako celowej strategii 

polegającej na łagodzeniu obrony makrooorganizmu. Bhat 

i wsp. [26] sugerują, że obecność podstawników fosforanowych 

w disacharydzie glukozoaminylowym jest dużo ważniejsza 

dla bakterii jelitowych niż innych, gdyż warunkuje 

ich żywotność, oraz wraz z resztami acylowymi determinuje 

właściwości toksyczne lipidu A oraz zdolność LPS do 

immunostymulacji w zainfekowanym makroorganizmie. 

Do grup fosforanowych lipidu A mogą być przyłączone 

dodatkowe podstawniki, np. etanoloamina (Etn), drugi fosforan 

(P), 4–aminoarabinoza (4-AraN), 4-amino-4-deoksy-l- 

38 

arabinopiranoza (l-Arap4N), d-arabinofuranoza (Araf), 

glukozoamina (GlcN) [33-35]. Prawdopodobnie mogą one 

wzmagać aktywność toksyczną LPS lub ją modyfikować. 

Vaara i wsp. [36] twierdzą, że kationowa 4-AraN wzmaga 

oporność przeciwko niektórym antybiotykom dzięki odpychaniu 

przez grupy fosforanowe czynników antymikrobiologicznych 

posiadających ładunek dodatni, np. polimyksynę 

B. Przy czym, oporność na ten antybiotyk jest proporcjonalna 

do liczby podstawionych 4-AraN grup fosforanowych 

w lipidzie A. Prowadząc badania nad LPS bakterii z rodzaju 

Pectinatus Helander i wsp. [37] początkowo sugerowali, 

że obecność niezestryfikowanego fosforanu w dystalnej 

GlcN jest istotna dla wiązania polimyksyny. Jednak ich teza, 

o oporności na ten antybiotyk mikroorganizmów (Bacteroides 

fragilis, Chromobacterium violaceum, Proteus mirabilis, 

Pseudomonas cepacia, mutanty pmr S. typhimurium) 

syntetyzujących lipid A pozbawiony tej grupy fosforanowej 

lub zawierający kationowe podstawniki, nie została potwierdzona 

w badaniach nad Pectinatus. Ich dalsze badania 

dowiodły jednak, że dodatnio naładowane podstawniki 

reszt fosforanowych w lipidzie A determinują reaktywność 

względem polimyksyny. Maskowanie grup fosforanowych 

skutkuje przesunięciem w kierunku kationowym ładunku 

pola elektrostatycznego w LPS, co nie sprzyja wiązaniu 

polimyksyny i w konsekwencji wpływa na wirulencję bakterii 

[37]. 

Lipid A Chromobacterium violaceum zawiera podstawione 

obie grupy fosforanowe - pierwszą glikozydowo 

GlcN, a drugą estrowo l-Arap4N [38]. Prawdopodobnie nadaje 

to specyficzność serologiczną lipidowi A. Pomimo, iż 

właściwości biologiczne tej cząsteczki nie zostały jeszcze 

w pełni zbadane, to sugeruje się jej znaczną aktywność, niższą 

jednak niż „aktywnych” form LPS. Krauss i wsp. [24]

Organizm 

stwierdzili, że podstawienie reszty fosforanowej etanoloaminą 

lub fosfoetanoloaminą zmniejsza toksyczność lipidu 

A. Przeczą temu jednak wyniki badań zawierającego te 

podstawniki LPS bakterii Rhodopseudomonas gelatinosa, 

które wykazały wysoką aktywność biologiczną tej endotoksyny 

[39]. 

Odzwierciedleniem przestrzennym struktury chemicznej 

lipidu A jest jej konformacja, która wpływa na właściwości 

biologiczne lipopolisacharydu. Struktura chemiczna 

o największej aktywności, czyli difosforylowany heksaacyl 


Rodzaj podstawnika 

disacharydu w pozycji Aktywność biologiczna Literatura 

C4’ C1 

Difosforylowane 

Agrobacterium tumefaciens -P -P wysoka [32] 

Bordetella pertussis -P -P średniowysoka [33] 

Bartonella henselae -P -P wysoka [47] 

Chlamydia trachomatis -P -P wysoka [48] 

Comamonas testosteroni -P -P wysoka [29] 

Escherichia coli -P -P wysoka [9] 

Erwinia carotovora -P -P wysoka [41] 

Haemophilus ducreyi -P -P wysoka [45] 

Haemophilus influenzae -P -P wysoka [46] 

Pseudomonas reactans -P -P brak danych [49] 

Yersinia pestis -P -P wysoka [35] 

Pectinatus frisingensis -P -P wysoka [10] 

Pectinatus cerevisiiphilus -P-l-Arap4N -P wysoka [10] 

Pseudomonas aeruginosa PA01 -P-l-Arap4N -P wysoka [51] 

Plesiomonas shigelloides -P-PEtn -P wysoka [30] 

Salmonella typhimurium -P-l-Arap4N -P wysoka [36] 

Moraxella catarrhalis -P -P-PEtn wysoka [52] 

Vibrio cholerae -P -P-PEtn brak danych [34] 

Campylobacter jejuni -P-PEtn -P-Etn wysoka [40] 

Chromobacterium violaceum -P-Arap4N -P-GlcpN średniowysoka [38] 

Klebsiella pneumoniae O3 -P-l-Arap4N -P-l-Arap4N wysoka [37] 

Rhodospirillum tenue 2761 -P-l-Arap4N -P-Araf wysoka [53] 

Rhodopseudomonas gelatinosa -P -P wysoka [39] 

Rhodobacter capsulatus -P-Etn -P-Etn niska [24] 

Porphyromonas gingivalis -P -P-Etn niska [21] 

Rhodopseudomonas sphaeroides -P -P niska [31] 

Monofosforylowane 

Neisseria gonorrhoeae -P - zredukowana [54] 

Shigella sonnei -P - brak danych [55] 

Mesorhizobium huakuii -P -GalA zredukowana [14] 

Bacteroides fragilis - -P zredukowana [22] 

Flavobacterium meningosepticum - -P niska [13] 

Leptospira interrogans - -PMe zredukowana [56] 

Marinomonas vaga - -P niska [23] 

Nieufosforylowane 

Aquifex pyrophilus -GalA - niska [12] 

Bacteroides intermedius - - niska [25] 

Bdellovibrio bacteriovorus -d-Manp -d-Manp niska [28] 

Francisella tularensis - - niska [27] 

Rhizobium etli -GalA - niska [57] 

Rhizobium leguminosarum -GalA - brak danych [26] 

Rhodomicrobium vannielii -d-Manp -d-GlcN niska [11] 

P – reszta fosforanowa, Etn – etanoloamina, PEtn – fosfoetanoloamina, d-GalpA – kwas d-galakturonowy, Arap4N–4-amino-4-deoksy-l-arabinopiranoza, Araf 

- arabinofuranoza, GlcpN – 2-amino-2-deoksy-d-glukopiranoza, d-Manp – d-mannopiranoza, Me – grupa metylowa, d-GlcN - d-glukozoamina, GalA - kwas 

galakturonowy 

Tabela I. Stopień ufosforylowania lipidu A i aktywność biologiczna bakterii Gram-ujemnych 

Table I. Phosphorylation degree of lipid A and biological activity of Gram-negative bacteria 

lipid A z asymetrycznie rozmieszczonymi podstawnikami 

acylowymi przybiera kształt stożkowaty, charakteryzujący 

się dużym kątem odchylenia szkieletu glukozoaminylowego 

od powierzchni tworzonej przez kwasy tłuszczowe (>45°). 

Taka konformacja lipidu A skutkuje silną indukcją IL-6 

[17]. W monofosforylowanym lipidzie A kąt odchylenia jest 

mniejszy i cząsteczka występuje w bardziej cylindrycznej 

konformacji. Jest to związane z obniżeniem jej aktywności 

toksycznej, przejawiającej się w hamowaniu sekrecji IL-6 

[5,17]. Łukasiewicz i Ługowski [2] twierdzą, że cylindrycz- 

39


ne lipidy A tetra- lub pentaacylowane o kącie nachylenia 

mniejszym niż 25° całkowicie tracą swoje właściwości toksyczne. 

Zależność funkcji biologicznych oligosacharydu 

rdzeniowego od stopnia jego 

ufosforylowania 

W strukturze LPS ufosforylowany może być nie tylko lipid 

A, lecz także oligosacharyd rdzeniowy. Niektóre bakterie 

Gram-ujemne posiadają region heptozowy oraz Kdo (kwas 

3-deoksy-d-mannooktulozonowy) podstawione w pozycji 

7 fosforanem lub jego pochodnymi, najczęściej fosfoetanoloaminą 

lub pirofosforanem. U meningokoków stwierdzono 

zróżnicowanie immunotypowe, bowiem niektóre z nich 

posiadają przy C3 lub C6 dystalnej heptozy (HepII) fosfoetanoloaminę 

(PEtn), a u innych brak tego podstawnika 

[18]. W pozycji C6, rzadziej C7, komponentu oligosacharydowego 

LPS bakterii Campylobacter jejuni Aspinall i wsp. 

[40] zidentyfikowali PEtn związaną z proksymalną resztą 

heptozową (HepI). Również u Erwinia carotovora występuje 

jednostka HepI monofosforylowana w pozycji C4 [41]. 

LPS Klebsiella pneumoniae serotypu C3 posiada ubogo 

ufosforylowany rdzeń oligosacharydowy, a w serotypie C1 

zamiast reszty fosforanowej występuje kwas galakturonowy 

[37]. Gatunki Pectinatus cerevisiiphilus i P. frisingensis 

syntetyzują wyjątkową strukturę sacharydową – ufosforylowaną 

glukozoaminę przyłączoną do C4 Kdo [10]. LPS 

z ufosforylowanym Kdo w pozycji C5 zidentyfikowano 

również u Vibrio cholerae, Bacteroides gingivalis i Bordetella 

pertussis [42-44]. W endotoksynach Haemophilus ducreyi 

obecny jest monofosforylowany Kdo [45]. 

Nie wyjaśniono jeszcze w pełni wpływu ufosforylowania 

komponenty oligosacharydowej LPS na aktywność biologiczną 

tych biomolekuł. Według Helander’a i wsp. [46] 

obecne w Kdo podstawniki fosforanowe mogą działać jak 

sygnały indukujące lub inhibujące Kdo-transferazy i heptozylotransferazy. 

Ponadto z fosforanami mogą łączyć się 

kationy Mg 2+ i Ca 2+ warunkując strukturalną i funkcjonalną 

integralność błony zewnętrznej. Ufosforylowana część 

rdzeniowa endotoksyny bakterii Helicobacter pylori ma 

natomiast znaczenie w wiązaniu lamininy, glikoproteiny 

występującej w błonach komórkowych makroorganizmów. 

Proces ten jest istotny w inicjowaniu kolonizacji śluzówki 

żołądka przez te bakterie i prawdopodobnie wiąże się 

z wpływem LPS na prawidłowe oddziaływanie białek błony 

podstawnej komórek, a tym samym słabszym wiązaniem lamininy 

z jej receptorem w nabłonku żołądka [3]. 

Łukasiewicz i wsp. [30] zasugerowali, że w warunkach 

in vivo rdzeń oligosacharydowy Plesiomonas shigelloides 

typu S zawierający, zamiast reszty fosforanowej, kwas galakturonowy, 

może wykazywać zdolność do dezagregacji 

i mniej efektywnej neutralizacji komórki bakteryjnej przez 

organizm gospodarza, co teoretycznie przekłada się na 

wyższą toksyczność tych mikroorganizmów. 

40 


1. Rietschel ETh, Wollenweber HW, Brade H, Zahringer U, 

Lindner B, Seydel U, Bradaczek H, Barnickel G, Labischinski 

H, Giesgrecht P, Structure and Conformation of 

the Lipid A Component of Lipopolisaccharides, Handbook 

of Endotoxin, Elsevier, Science Publishers 1984, 187-219. 

2. Łukasiewicz J, Ługowski C. Biologiczna aktywność lipopolisachrydu. 

Post Hig Med Dośw 2003; 57: 33-53. 

3. Różalski A. Lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych – 

struktura chemiczna, aktywność biologiczna i znaczenie w 

chorobotwórczości. (II) Budowa chemiczna a funkcja biologiczna 

LPS. Post Mikrobiol 1995; 3 (XXXIIV): 317-33. 

4. Saluk–Juszczak J, Wachowicz B. Aktywność prozapalna 

lipopolisacharydu. Post Biochem 2005; 51: 280-5. 

5. Lodowska J i wsp.: Heterogenność strukturalna lipidu A 

bakterii Gram-ujemnych. Post Hig Med Dośw 2007; 61: 

106-21. 

6. Olsthroon MMA i wsp.: Identification of a novel core 

type in Salmonella lipopolysaccharide. Complete structure 

analysis of the core region of the lipopolysaccharide 

from Salmonella enterica sv. arizonae O62. J Biol Chem 

1998; 273: 3817-29. 

7. Vinogradov EV i wsp.: The structures of the carbohydrate 

backbones of the lipopolysaccharides from Escherichia 

coli rough mutants F470 (R1 core type) and F576 

(R2 core type). Eur J Biochem 1999; 261: 629-39. 

8. Shashkov AS i wsp.: Structure of a 2-aminoethyl phosphate-containing 

O-specific polysaccharide of Proteus 

penneri 63 from a new serogroup O68. Eur J Biochem 

2000; 267: 601-5. 

9. Rosner MR i wsp.: Structure of the lipopolysaccharide 

from an Escherichia coli heptose-less mutant. I. Chemical 

degradations and identification of products. J Biol 

Chem 1979; 254: 5906-17. 

10. Helander IM i wsp.: Chemical structure of the lipid A 

component of lipopolysaccharides of the genus Pectinatus. 

Eur J Biochem 1994; 224: 63-70. 

11. Holst O i wsp.: structural studies on the phosphate-free 

lipid A of Rhodomicrobium vannielii ATCC 17100. Eur J 

Biochem 1983; 137: 325-32. 

12. Plötzt B i wsp.: Characterization of a novel lipid A containing 

d-galacturonic acid that replaces phosphate residues. 

The structure of the lipid A of the lipopolysacchride 

from the hyperthermophilic bacterium Aquifex pyrophilus. 

J Biol Chem 2000; 275: 11222-8. 

13. Tanamoto K i wsp.: Biological properties of lipid A isolated 

from Flavobacterium meningosepticum. Clin Diagn 

Lab Immun 2001; 8: 522-7. 

14. Choma A, Sowiński P. Characterization of Mesorhizobium 

huakuii lipid A containing both d-galacturonic acid and 

phosphate residues. Eur J Biochem 2004; 271: 1310-22. 

15. Rosner MR i wsp.: Structure of the lipopolysaccharide 

from an Escherichia coli heptose-less mutant. I. Chemical 

degradations and identification of products. J Biol 

Chem 1979; 254: 5906-17. 

16. Alexander C, Zähringer U. Chemical structure of lipid 

A – the primary immunomodulatory center of bacterial 

lipopolysaccharides. Trends Glycosci Glyc 2002; 14: 

69-86.

17. Schromm AB i wsp.: Biological activities of lipopolysaccharides 

are determined by the shape of their lipid A 

portion. Eur J Biochem 2000; 267: 2008-13. 

18. Cox AD i wsp.: Phosphorylation of the lipid A region 

of meningococcal lipopolysaccharide: Identification of a 

family of transferases that add phosphoetanoloamine to 

lipopolysaccharide. J Bacteriol 2003; 185: 3270-7. 

19. Moran AP i wsp.: Structural analysis of the lipid A component 

of Campylobacter jejuni CCUG 10936 (serotype 

O:2) lipopolysaccharide. Description of a lipid A containing 

a hybrid backbone of 2-amino-2-deoxy-d-glucose 

and 2,3-diamino-2,3-dideoxy-d-glucose. Eur J Biochem 

1991; 198: 459-69. 

20. Rietschel E i wsp.: Bacterial endotoxin: molecular relationships 

of structure to activity and function. FASEB J 

1994; 8: 217-25. 

21. Kumada H i wsp.: Structural study on the free lipid A 

isolated from lipopolysaccharide of Porphyromonas gingivalis. 

J Bacteriol 1995; 177: 2098-106. 

22. Weintraub A i wsp.: Structural characterization of the lipid 

A component of Bacteroides fragilis strain NCTC 9343 

lipopolysaccharide. Eur J Biochem. 1989; 183: 425-31. 

23. Krasikova IN i wsp.: Detailed structure of lipid A from lipopolysaccharide 

from the marine proteobacterium Marinomonas 

vaga ATCC 27119. Eur. J. Biochem. 2004; 

271: 2895-904. 

24. Krauss JH i wsp.: Structural analysis of the nontoxic lipid 

A of Rhodobacter capsulatus 37b4. Eur J Biochem 

1989; 180: 519-26. 

25. Johne B, Olson I, Bryn K. Fatty acids and sugars in lipopolysaccharides 

from Bacteroides intermedius, Bacteroides 

gingivalis and Bacteroides loescheii. Oral Microbiol 

Immunol 1988; 3: 22-7. 

26. Bhat UR, Forsberg LS, Carlson RW. Structure of lipid 

A component of Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli 

lipopolysaccharide. Unique nonphosphorylated lipid 

A containing 2-amino-2-deoxygluconate, galacturonate, 

and glucosamine. J Biol Chem 1994; 269: 14402-10. 

27. Vinogradov E, Perry MB, Conlan JW. Structural analysis 

of Francisella tularensis lipopolysaccharide. Eur J Biochem 

2002; 269: 6112-8. 

28. Schwudke D i wsp.: The obligate predatory Bdellovibrio 

bacteriovorus possesses a neutral lipid A containing α-dmannoses 

that replace phosphate residues. Similarities 

and differences between the lipid A and the lipopolysaccharides 

of the wild type strain B. bacteriovorus HD100 

and its host-independent derivative HI100. J Biol Chem 

2003; 278: 27502-12. 

29. Iida T i wsp.: Chemical structure of lipid A isolated from 

Comamonas testosteroni lipopolysaccharide. Eur J Biochem 

1996; 237: 468-75. 

30. Łukasiewicz T i wsp.: Structure of the lipid A – inner 

core region and biological activity of Plesiomonas shigelloides 

O54 (strain CNCTC 113/92) lipopolysaccharide. 

Glycobiology 2006; 16: 538-50. 

31. Quereshi N i wsp.: Chemical reduction of 3-oxo and 

unsaturated groups in fatty acids of diphosphoryl lipid 

A from the lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas 

sphaeroides. Comparison of biological properties before 

and after reduction. J Biol Chem 1991; 266: 6532-8. 


32. Silipo A i wsp.: Full structural characterization of the lipid 

A components from the Agrobacterium tumefaciens 

strain C58 lipopolysaccharide fraction. Glycobiology 

2004; 14: 805-15. 

33. Caroff M i wsp.: Structural characterization of the lipid 

A of Bordetella pertussis 1414 endotoxin. J Bacteriol 

1994; 176: 5156-9. 

34. Broady KW, Rietschel ET, Lüderitz O. The chemical 

structure of the lipid A component of lipopolysaccharides 

from Vibrio cholerae. Eur J Biochem 1981; 115: 

463-8. 

35. Venezia ND i wsp.: Lipopolysaccharides from Yersinia 

pestis. Studies on lipid A of lipopolysacccharides I and 

II. Eur J Biochem 1985; 151: 399-404. 

36. Vaara M, Viljanen P. Binding of polymyxin B nonapeptide 

to gram-negative bacteria. Antimicrob. Agents Chemother 

1985; 27: 548-54. 

37. Helander IM i wsp.: Characterization of lipopolysaccharides 

of polymyxin-resistant and polymyxin-sensitive 

Klebsiella pneumoniae O3. Eur J Biochem 1996; 237: 

272-8. 

38. Hase S, Rietschel ET. The chemical structure of the lipid 

A component of lipopolysaccharides from Chromobacterium 

violaceum NCTC 9694. Eur J Biochem 1977; 75: 

23-34. 

39. Tharanathan RN i wsp.: The structure of lipid A from the 

lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas gelatinosa 

29/1. Arch Microbiol 1985; 141: 279-83. 

40. Aspinall GO i wsp.: Chemical structure of the 

core region of Campylobacter jejuni serotype O:2 

lipopolysaccharide. Eur J Biochem 1993; 213: 

1029-37 

41. Fukuoka S i wsp.: Elucidation of the structure of the core 

region and the complete structure of the R-type lipopolysaccharide 

of Erwinia carotovora FERM P-7576. Eur J 

Biochem 1997; 250: 55-62. 

42. Brade H. Occurrence of 2-keto-deoxyoctonic acid 5-phosphate 

in lipopolysaccharides of Vibrio cholerae ogawa 

and inaba. J Bacteriol 1985; 161: 795-8. 

43. Kumada H i wsp.: Occurrence of O-phosphorylated 

2-keto-3-deoxyoctonate in the lipopolysaccharide of 

Bacteroides gingivalis. FEMS Microbiol Lett 1988; 51: 

77-80. 

44. Chaby R, Szabó L. 3-deoxy-2-octulosonic acid 5-phosphate: 

a component of the endotoxin of Bordetella 

pertussis. Eur J Biochem 1975; 59: 277-80. 

45. Melaugh W i wsp.: Partial characterization of the major 

lipooligosaccharide from a strain of Haemophilus ducreyi, 

the causative agent of chancroid, a genital ulcer 

disease. J Biol Chem 1992; 267: 13434-9. 

46. Helander IM i wsp.: Chemical structure of the lipopolysaccharide 

of Haemophilus influenzae strain I-69 Rd - /b + . 

Eur J Biochem 1988; 177: 483-92. 

47. Zähringer U i wsp.: Structure and biological activity 

of the short-chain lipopolysaccharide from Bartonella 

henselae ATCC 49882. J Biol Chem 2004; 279: 

21046-54. 

48. Rund S i wsp.: Structural analysis of the lipopolysaccharide 

from Chlamydia trachomatis serotype L2. J Biol 

Chem 1999; 274: 16819-20. 

41


49. Silipo A i wsp.: Structural determination of lipid A of the 

lipopolysaccharide from Pseudomonas reactans. Eur J 

Biochem 2002; 269: 2498-505. 

50. Venezia ND i wsp.: Lipopolysaccharides from Yersinia 

pestis. Studies on lipid A of lipopolysacccharides I and 

II. Eur J Biochem 1985; 151: 399-404. 

51. Bhat UR i wsp.: Structural studies of lipid A from Pseudomonas 

aeruginosa PA01: occurrence of 4-amino-4deoxyarabinose. 

J Bacteriol 1990; 172: 6631-6. 

52. Masoud H, Perry MB, Richards JC. Characterization of 

the lipopolysaccharide of Moraxella catarrhalis. Structural 

analysis of the lipid A from M. catrarrhalis serotype A 

lipopolysaccharide. Eur J Biochem 1994; 220: 209-16. 

53. Tharanathan RN, Weckesser J, Mayer H. Structural studies 

on the d-arabinose-containing lipid A from Rhodospirillum 

tenue 2761. Eur J Biochem 1978; 84: 385-94. 

42 


dr Jolanta Lodowska 

Katedra i Zakład Biochemii, 

Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej 


ul. Narcyzów 1 

41-200 Sosnowiec 

tel.: 032 364 1064 

e-mail: jlodowska@sum.edu.pl 

54. Post DMB i wsp.: Intracellular survival of Neisseria gonorrhoeae 

in male urethral epithelial cells: importance 

of a hexaacyl lipid A. Infect Immun 2002; 70: 909-20. 

55. Ługowski C, Romanowska E. Chemical studies on 

Shigella sonnei lipid A. Eur J Biochem 1974; 48: 

319-23. 

56. Que-Gewirth NLS i wsp.: A methylated phosphate group 

and four amide-linked acyl chains in Leptospira interrogans 

lipid A. The membrane anchor of an unusual lipopolysaccharide 

that activates TLR2. J Biol Chem 2004; 

279: 25420-9. 

57. Que NLS i wsp.: Purification and mass spectrometry 

of six lipid A species from the bacterial endosymbiont 

Rhizobium etli. Demonstration of a conserved distal unit 

and variable proximal portion. J Biol Chem 2000; 275: 

28006-16.


Profil ekspresji genów kodujących białka 

związane z aktywnościa biologiczną leptyny 

w raku endometrium 

Wstęp 

Leptyna (LEP) początkowo zidentyfikowana jako hormon 

związany z regulacją przyjmowania pokarmu, jest adipokiną 

o wielokierunkowym działaniu. Plejotropowa natura 

leptyny związana jest z występowaniem w organizmie 

receptora leptyny Ob-R. Znanych jest kilka izoform receptora 

leptyny będących wynikiem alternatywnego składania 

eksonów i proteolitycznego rozszczepienia białek 

już istniejących izoform receptora (ryc. 1). Wewnątrzko- 


Expression profile of genes connected with biological activity of leptin 

in endometrial cancer 

Małgorzata stachowicz 1 , joanna orchel 1 , jacek olender 1 , 

izabela woźniczko 1 Andrzej witek 2 

1 katedra i zakład biologii Molekularnej w sosnowcu 

2 katedra i klinika położnictwa i ginekologii w katowicach 

3 katedra i zakład genetyki Medycznej w sosnowcu 

katedra i zakład biologii Molekularnej w sosnowcu 

kierownik: dr hab. urszula Mazurek 

Streszczenie 

Leptyna indukuje wzrost komórek nowotworowych 

poprzez aktywację różnych ścieżek sygnałowych w komórce. 

Celem pracy było porównanie transkryptomów 

tkanek endometrium wyznaczonych techniką mikromacierzy 

oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix) 

oraz wyselekcjonowanie z puli transkryptów genów 

kodujących białka związane z aktywnością biologiczną 

leptyny, które na poziomie mRNA różnicują tkanki 

endometrium. W badaniu analizowano wycinki endometrium 

prawidłowego w fazie proliferacyjnej oraz 

gruczolakoraka endometrium G1-G4, Na podstawie 

bazy Affymetrix, bazy NCBi i danych literaturowych 

wyselekcjonowano 91 transkryptów genów kodujących 

białka związane z aktywnością biologiczną leptyny. 

Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono 

po normalizacji wyników w programie RMA Expres 

wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.6,0, 

Excel oraz SAM (significance analysis of microarrays) 

Wśród tych genów w gruczolakoraku endometrium 

obserwowano nadekspresję MMP2, MMP9 i VEGFA. 

w porównaniu do endometrium prawidłowego w fazie 

proliferacyjnej. 

Słowa kluczowe; leptyna, mikromacierz oligonukleotydowa, 

rak enometrium 

Summary 

Intracellular signalling pathways are activated by leptin 

and are involved in cancerogenesis. 

The aim of the study was to analyze of endometrial 

tissues transcriptome by using oligonucleotide microarray 

technique (HGU133A Affymetrix). Next, among 

from 91 transcripts connecting with biological activity 

of leptin there were choose genes which differentiated 

investigated tissues of endometrium. There were analyzed: 

endometrium histopatological estimated as healthy 

in proliferative phase and endometrial adenocarcinoma 

(G1-G4). The obtained values of fluorescence for 

each probe on microarray chips were normalized with 

the RMAExpress.. Differences in mRNA levels were 

evaluated with SAM program (Significance Analysis of 

Microarrays), Statistica v.6,0 and Excel. Among from 

91 transcripts connecting with biological activity of leptin 

including transcripts involved in leptin– induced intracellular 

signaling pathway; MMP2, MMP9 i VEGFA 

occurred overexpression in cancer tisssues. 

Key words; leptin, oligonucleotide microarray, endometrial 

cancer 

mórkowa domena receptora leptyny Ob-Rb zawiera region 

box1 złożony z 29 aminokwasów, który przyłącza domenę 

kinazy tyrozynowej Janusa JAK2, region box2 również odpowiedzialny 

za przyłączenie kinazy JAK oraz region box3, 

miejsce wiązania białek STAT (ang. signal transducer and 

activator of transcription), które po ufosforylowaniu i utworzeniu 

dimerów pełnią funkcje czynników transkrypcyjnych 

w regulacji ekspresji genów [1,] (ryc. 1). Badania Myers’a 

dowodzą, że w przypadku długiej izoformy receptora leptyny 

Ob-Rb do aktywacji kinaz JAK oprócz regionu box1 

43


Ryc. 1. Izoformy receptora leptyny; Ob-Ra – krótka izoforma receptora leptyny, Ob- 

Rb – długa izoforma receptora leptyny, Ob-Re – rozpuszczalna forma receptora 

leptyny, Lep – leptyna, regiony – box-1, box-2, box-3; JAK2 – kinaza tyrozynowa 

Janusa 2 (ang. Janus Kinase 2), Tyr 985 , Tyr 1077 , Tyr 1138 – reszty tyrozynowe w obrębie 

wewnątrz komórkowej domeny długiej izoformy receptora leptyny, p – fosforylacja, 

białka STAT (ang. the Signal Transducers and Activators of Transcription), MAP – kinazy 

aktywowane mitogenami (ang. mitogen-activated protein kinases) 

wymagana jest także obecność odcinka złożonego z 31-36 

reszt aminokwasowych [2]. 

Długa izoforma receptora leptyny OB-Rb, ze względu 

na podobieństwo strukturalne do podjednostki gp 130, aktywuje 

po połączeniu się z ligandem ścieżki przekazu sygnału 

w komórce. Białko gp 130 oddziałuje z kinazami tyrozynowymi 

z rodziny JAK (Janus Kinase) i jest łącznikiem przenoszącym 

pobudzenie z aktywowanego receptora na kinazę 

tyrozynową 

Jak pokazano na rycinie 1, Ob-Rb posiada w obrębie 

wewnątrzkomórkowej domeny trzy konserwatywne reszty 

tyrozynowe; Tyr 985, Tyr 1077 i Tyr 1138, które wykazują 

różną zdolność aktywowania przekazu sygnału w komórce 

i określają plejotropową naturę receptora leptyny. Leptyna 

łącząc się na powierzchni komórki z receptorem OB-Rb powoduje 

jego dimeryzację i aktywuje poprzez transfosforylację 

kinazę tyrozynową Janusa JAK2, co w dalszej kolejności 

prowadzi do fosforylacji reszt tyrozynowych w obrębie wewnątrzkomórkowej 

domeny OB-Rb. 

Tyr 985 uczestniczy w aktywacji w komórce szlaku 

ERK1/2 – szlaku kinaz regulowanych przez sygnały zewnątrzkomórkowe 

(ang. extra cellular signal-regulated 

kinases). Kinaza tyrozynowa JAK 2 asocjuje z Ob-Rb za 

pośrednictwem domeny box1 oraz fragmentu złożonego 

z 31-36 aminokwasów. Ufosforylowane reszty tyrozynowe 

na powierzchni Ob-Rb stanowią miejsca przyłączania białek 

sygnałowych z domenami SH2 (ang. Src homology). Ufosforylowana 

reszta Tyr 985 przyłącza fosfatazę tyrozynową 

SHP-2, która następnie ulega fosforylacji i przyłącza białko 

adaptorowe Grb2. W konsekwencji w komórce zostaje uruchomiony 

przekaz sygnału za pośrednictwem kaskady kinaz 

MAP-2 białkowych kinaz aktywowanych przez czynniki 

mitogenne (ang. mitogen activated protein kinases), w który 

ostatecznie zaangażowane są kinazy ERK (ERK1; MAPK3 

ang. extracelluarly regulated protein kinases1; mitogenactivated 

protein kinase 3 i ERK2; MAPK1 – extracelluarly 

regulated protein kinases2; mitogen-activated protein 

44 

kinase1) oraz kinazy MEK1/MAP2K1 

i MEK2/MAP2K2 (ang. mitogen-activated 

protein kinase kinase 1; mitogenactivated 

protein kinase kinase 2) i kinaza 

Raf [2]. Kinazy MAP przemieszczają się 

do jądra komórkowego, gdzie dochodzi 

do fosforylacji i aktywacji czynników 

transkrypcyjnych, takich jak c-jun, c-fos, 

c-myc, erg-1 i w konse kwencji prowadzi 

do indukcji ekspresji genów związanych 

z procesami proliferacji i różnicowania]. 

Ufosforylowana Tyr 985 jest miejscem 

przyłączania się zarówno fosfatazy tyrozynowej 

SHP-2 jak i białka hamującego 

przekaz sygnału, białka SOCS3 (ang. 

suppressor of cytokine signaling 3). Przyłączenie 

białka SOCS3 do reszty Tyr 985 

znosi sygnał przekazywany za pośrednictwem 

Ob-Rb z powodu uniemożliwienia 

przyłączenia się JAK2 do receptora. Białko 

SOCS3 oddziałuje poprzez domeny SH2 

z ufosofrylowaną resztą Tyr 985 receptora 

leptyny blokując jego aktywność [2]. 

Badania ostatnich lat wykazały obecność 

jej receptorów (LEPR) w wielu komórkach i narządach, 

a co za tym idzie zaangażowanie leptyny w: angiogenezę, 

dojrzewanie układu rozrodczego, tworzenie kości, 

gojenie ran, a także funkcjonowanie układu immunologicznego 

[3,4,5,]. Badania ostatnich lat dowodzą, że leptyna indukuje 

wzrost komórek nowotworowych poprzez aktywację 

różnych ścieżek sygnałowych w komórce [6,7,8,9,10,]. 

Poznanie plejotropowej aktywności leptyny w komórkach 

zmienionych nowotworowo może w przyszłości być wykorzystane 

do projektowania strategii terapeutycznych 

w walce z rakiem. Chociaż ilość prac dotyczących funkcji 

leptyny i jej receptora w różnych typach nowotworów stale 

wzrasta, to jednak nadal jest to temat nie do końca poznany. 

Do dzisiaj nie została w pełni poznana funkcja leptyny i jej 

receptora w progresji różnych typów nowotworów, w tym 

w raku endometrium, który jest piątym pod względem częstości 

występowania nowotworem złośliwym kobiet [11]. 

Nowotwory zaliczane na podstawie badania klinicznego 

i patomorfologicznego do tego samego stadium zaawansowania, 

leczone w ten sam sposób, w różnym stopniu poddają 

się terapii. Różnice te przypisywane są cechom molekularnym, 

które odpowiedzialne są za różny przebieg kliniczny 

nowotworów o podobnym obrazie histologicznym. Analiza 

molekularna nowotworów umożliwia poszukiwanie genów, 

które są zaangażowane w proces nowotworzenia. Duże nadzieje 

w leczeniu nowotworów wiąże się z terapią celowaną, 

której głównym przesłaniem jest poszukiwanie leków 

z grupy związków oddziałujących na receptory substancji 

będących czynnikami wzrostu. Szlaki przekazywania sygnału 

w komórce odgrywające rolę w regulacji proliferacji, 

apoptozie i transformacji nowotworowej stanowią podstawę 

badań mających na celu poszukiwanie potencjalnych 

markerów mających znaczenie w procesie nowotworzenia. 

Ponieważ zasadniczym założeniem terapii celowanej jest 

poszukiwanie leków, które byłyby w stanie hamować receptory 

komórkowe, za pośrednictwem których dochodzi w ko-

mórce do pobudzenia szlaków związanych 

z procesami nowotworzenia, coraz większe 

znaczenie mają badania prowadzone na poziomie 

całego, genomu, transkryptomu lub 

proteromu 

Celem przedstawionej pracy było porównanie 

transkryptomów związanych 

z aktywnością biologiczną leptyny w endometrium 

prawidłowym w fazie proliferacyjnej 

oraz gruczolakoraku endometrium, wyznaczonych 

techniką mikromacierzy oligonukleotydowych 

HG-U133A (Affymetrix). 

Materiał i metody 

Materiał do badań stanowiły wycinki 

endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej 

oraz gruczolakoraka endometrium 

G1-G4, pobieranych od chorych leczonych 

w Katedrze i Klinice Położnictwa i Ginekologii 

w Katowicach. 

Ekstrakcja całkowitego RNA: Po homogenizacji 

50-100 mg wycinków endometrium 

przy użyciu homogenizatora Pozytron 

(Kinematyka AG, Szwajcaria), ekstrahowano RNA z użyciem 

odczynnika TRIZOL (Gibco BRL) (Invitrogen Life 

Technologies, Kalifornia, USA), zgodnie z protokołem producenta 

Ekstrakty całkowitego RNA oczyszczono z wykorzystaniem 

zestawu RNeasy Mini Kit, Qiagen w celu 

usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń DNA. Ekstrakty 

RNA oceniano ilościowo przy użyciu spektrofotometru GeneQuant 

II (Pharmacia) Wartość absorbancji przy długości 

fali 260 nm była podstawą do obliczenia stężenia RNA, 

przy założeniu, że wynik pomiaru w kuwecie o drodze 

optycznej 1 cm równy 1 OD 260 odpowiada stężeniu 40 µg 

RNA w 1 cm 3 ekstraktu, oraz jakościowo techniką elektroforezy 

w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. 

Wyznaczanie transkryptomu metodą mikromacierzy 

oligonukleotydowych z zastosowaniem płytek HG- 

U133A (Affymetrix). Około 8 µg całkowitego RNA zostało 

wykorzystane do syntezy dwuniciowego cDNA (Gibco BRL 

SuperScript Choice system). W następnym etapie otrzymany 

cRNA wyznakowano biotyną (reakcja transkrypcji in 

vitro, Enzo kit). Po fragmentacji biotynylowanego cRNA 

przeprowadzono hybrydyzację z mikromacierzą Test3 

oraz HG-U133A (Affymetrix) Znakowanie produktów hybrydyzacji 

przeprowadzono kilkustopniowo kompleksem 

streptawidyna–fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami 

przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi 

streptawidyna–fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGE- 

WS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej 

HG–U133A w przewodniku Gene Expression Analysis 

Technical Manual (Affymetrix, Kalifornia, USA). W następnym 

etapie płytki mikromacierzy poddano skanowaniu 

skanerem Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent 

Technologies, Kalifornia, USA). Otrzymane wyniki intensywności 

fluoroscencji zostały zapisane i zarchiwizowane 

w programie Microarray Suite. Analizę porównawczą 

transkryptomów przeprowadzono po normalizacji wynikow 


Ryc 2. Geny związane z aktywnością biologiczną leptyny charakteryzujące się nadekspresją 

aktywności transkrypcyjnej w raku endometrium w porównaniu do aktywności 

transkrypcyjnej genów w endometrium prawidłowego w fazie proliferacyjnej 

w programie RMA Expres wykorzystując programy komputerowe: 

Statistica v.6,0, Excel oraz SAM (significance analysis 

of microarrays). 

Wyniki 

Analizę profilu ekspresji genów kodujących białka kaskad 

sygnałowych aktywowanych przez leptynę w wycinkach 

endometrium, rozpoczęto od porównania raportów 

wygenerowanych w programie Microarray Suite Affymetrix 

bezpośrednio po odczycie sygnałów fluorescencji na 

mikromacierzy. Rozkład sygnałów fluorescencji na płytce, 

zgodny z zaleceniami producenta mikromacierzy (Affymetrix 

„Technical Manual GeneChip Expression Analysis”) 

był podstawą do akceptacji kolejnych transkryptomów do 

analizy porównawczej, którą rozpoczęto od normalizacji 

wyników w programie RMA Express, w celu wyrównania 

zróżnicowanych wartości tła oraz szumu, zmniejszającego 

prawdopodobieństwo błędnej interpretacji wyników. 

Analizę porównawczą transkryptomów, rozpoczęto od 

grupowania transkryptomów wykonując aglomeracyjną 

analizę skupień. Jako miarę odległości między mikromacierzami 

wykorzystano odległość Czebyszewa, a zastosowaną 

metodą aglomeracji była metoda średnich połączeń 

ważonych. Oceniono w ten sposób zgodność grupowania 

wycinków na podstawie charakterystyki klinicznej, histopatologicznej 

i molekularnej. Do analizy porównawczej typowano 

te transkryptomy, które były kwalifikowane do tej samej 

grupy, niezależnie od zastosowanego kryterium podziału 

(klinicznego, histopatologicznego czy molekularnego). 

W dalszym etapie analizy porównawczej z grupy 22283 

mRNA, które można analizować na mikromacierzy HG- 

U133A, na podstawie danych literaturowych oraz bazy 

NCBI i Affymetrix wyselekcjonowano 91 transkryptów, 

których geny kodują białka uczestniczące w ścieżkach przekazu 

sygnału w komórce, aktywowanych przez leptynę. 

Następnie wykorzystując technikę Blanda i Altmana wy- 

45


selekcjonowano geny, które różnicują wycinki endometrium 

prawidłowego w fazie proliferacyjnej i gruczolakoraka endometrium 

G1-G4 (tab. 1, ryc 2). 

Dyskusja 

Technika mikromacierzy oligonukleotydowych została 

wykorzystana w celu analizy transkryptów wchodzących 

w skład ścieżek sygnałowych aktywowanych w komórce 

po połączeniu się leptyny z jej receptorem. Spośród 91 

transkryptów genów związanych z aktywnością biologiczną 

leptyny, Wyznaczenie dla wszystkich transkryptów parametru 

SLR wskazującego wielokrotność różnicy sygnału 

fluorescencji charakterystycznych dla transkryptomów endometrium 

kontrolnego i gruczolakoraka, stanowilo jedno 

z kryteriów typowania genów różnicujących endometrium. 

Otrzymane wyniki wskazują, że obserwowane różnice aktywności 

transkrypcyjnej genów tj. MMP2, MMP9 i VEG- 

FA mogą mieć związek z procesem angiogenezy, W danych 

literaturowych wciąż poszerzana jest lista czynników i cząsteczek 

stymulujących ten proces. Istnieją doniesienia literaturowe, 

w których podkreśla się udział leptyny jako czynnika 

proangiogennego stymulującego proces angiogenezy 

in vivo i in vitro. Badania Somasundar i wsp. [13] na przykład 

dowodzą, że in vitro leptyna ma zdolność wzmagania 

proliferacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych 

z siłą działania podobną do tej, jaką posiada VEGF (vascular 

endothelial growth factor). Badania prowadzone na 

modelach zwierzęcych potwierdziły, że leptyna ma zdolność 

stymulowania procesu angiogenezy synergistycznie 

z dwoma innymi kluczowymi czynnikami proangiogennymi, 

tj. z FGF-2 (fibroblast growth factor) i VEGF. Ponadto 

leptyna zwiększa ekspresję genów zaangażowanych 

w proces angiogenezy, tj.: MMP-2 (matrix metalloproteinases 

2) i MMP-9 (matrix metalloproteinases 9) [14]. 

W świetle otrzymanych wyników wydaje się jednak, że 

proces angiogenezy w raku endometrium stymulowany 

jest raczej poprzez aktywację VEGF a nie leptynę, o czym 

świadczy brak tej ostatniej wśród genów różnicujących 

badane tkanki nowotworowe i histopatologicznie ocenione 

jako zdrowe. 

46 

ID mRNA SLR 2 SLR 

201069_at 

MMP2 Metaloproteinaza 2 (gelatinase A), 

1,41 4,09 

201693_s_at 

203936_s_at 

EGR1 

białko odpowiedzi wczesnego wzrostu (early growth 

response 1) 


2,24 9,4 ↑ 

MMP9 metallopeptidase 9 (gelatinase B), 1,81 6,11 ↑ 

211527_x_at 

czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (vascular 

VEGFA 

1,58 4,85 ↑ 

endothelial growth factor A 

Tabela 1 

Transkrypty różnicujące raka endometrium wybrane z 91 mRNA związanych z aktywnością biologiczną leptyny. SLR – ang. signal log ratio 

– stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych grupach, 2SLR – wartość opisująca wielokrotność 

różnicy sygnału fluorescencji pomiędzy porównywanymi transkryptomami, strzałka ↑ - oznacza, nadekspresję genu w wycinkach 

gruczolakoraka endometrium 

1. Frühbeck G. Intracellular signalling pathways activated 

by leptin. Biochem J 2006; 1(393): 7-20. 

2. Myers MG, Jr. Leptin receptor signaling and the regulation 

of mammalian physiology. The Endocrine Society 

2004; 59: 287-304. 

3. Trentz O.A , Handschin A.E., Hemmi S., Zund G, Wanner 

G.A., Trentz O. Leptin regulates human osteoblast 

proliferation and phenotype marker expression in vitro. 

European Cells and Materials. 2004; 7(1), 89 

4. Frank S., Stallmeyer B., Kampfer H., Kolb N., Pfeilschifter 

J. Leptin enhances wound re-epithelialization and 

constitutes a direct function of leptin in skin repair. J- 

Clin-Invest. 2000; 106(4), 501-9 

5. Matarese G. Leptin and the immune system: how nutritional 

status influences the immune response. Eur Cytokine 

Netw. 2000; 11(1), 7-14 

6. Pai R, Lin C, Tran T, Tarnawski A. Leptin activates 

STAT and ERK2 pathways and induces gastric cancer 

cell proliferation. Biochem Biophys Res Commun. 2005 

Jun 17;331(4):984-92 

7. Frankenberry KA, Skinner H, Somasundar P, McFadden 

DW, Vona-Davis LC. Leptin receptor expression 

and cell signaling in breast cancer. Int J Oncol. 2006 

Apr;28(4):985-93 

8. Somasundar P, Frankenberry KA, Skinner H, Vedula G, 

McFadden DW, Riggs D, Jackson B, Vangilder R, Hileman 

SM, Vona-Davis LC. Prostate cancer cell proliferation 

is influenced by leptin. J Surg Res. 2004 May 

1;118(1):71-82] 

9. Attoub S., Noe V., Pirola L., Bruyneel E., Chastre E., 

Mareel M., Wymann M.P., Gespach Ch. Leptin promotes 

invasiveness of kidney and colonic epithelial cells via phosphoinositide 

3-kinase-, Rho-, and Rac-dependent signaling 

pathways. The FASEB Journal. 2000;14, 2329-2338 

10. Koda M., Sulkowska M., Wincewicz A., Kanczuga-Koda 

L., Musiatowicz B., Szymanska M, Sulkowska S. 

Expression of leptin, leptin receptor, and hypoxia inducible 

factor 1α in human endometrial cancer. Annals of the 

New York Academy of Sciences. 2007; 1095(1), 90-98 

11. Kaźmierczak W. Rak endometrium – aspekty hormonalne. 

Ginek Prakt. 2004; 12( 2), 13-16 

12. Somasundar P, Yu AK, Vona-Davis L, McFadden DW. 

Differential effects of leptin on cancer in vitro. J Surg 

Res 2003; 113: 50-55. 

↑

13. Park HY, Kwon HM, Lim HJ, Hong BK, Lee JY, Park 

BE, Jang Y, Cho SY, Kim HS. Potential role of leptin 

in angiogenesis: leptin induces endothelial cell proliferation 

and expression of matrix metalloproteinases in vivo 

and in vitro. Exp Mol Med. 2001; 33(2): 95-102. 



mgr Małgorzata Stachowicz 

Katedra i Zakład Biologii Molekularnej Wydziału Farmaceutycznego i Oddziału Medycyny Laboratoryjnej, 

Śląski Uniwersytet Medyczny, 

41-200 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1, 

tel.: 00 48 032 364 10 20, fax: 00 48 032 364 10 20, 

e-mail: g_stach@o2.pl 

47


Rekombinowane wektory wirusowe rAAV 

w terapii genowej nowotworów 

Recombinant adeno-associated virus vector (rAAV) preparations 

for cancer gene therapy 

Maciej Małecki 1,2 , karolina hajdukiewicz 2 , jan pachecka 2 

1 zakład biologii komórki, centrum onkologii-instytut im. Marii skłodowskiej-curie, warszawa 

2 katedra i zakład biochemii i chemii klinicznej, wydział farmaceutyczny, warszawski uniwersytet Medyczny, 

warszawa 

p.o. kierownika zakładu biologii komórki: doc. dr hab. Maciej Małecki 

kierownik katedry i zakładu biochemii i chemii klinicznej: prof. dr hab. jan pachecka 

Streszczenie 

W terapii genowej wykorzystuje się, zawierające kodujące 

sekwencje kwasów nukleinowych, preparaty genowe 

wprowadzane do komórek za pomocą nośników 

genów, czyli wektorów. Prawidłowy układ nośnik/gen 

decyduje o wydajnym procesie transfekcji oraz ekspresji 

genów, która warunkuje efekt terapeutyczny, odpowiedź 

biologiczną komórek, narządów. Prowadzone są 

intensywne badania nad uzyskiwaniem bezpiecznych 

dla pacjentów preparatów genowych. Wektory konstruowane 

w oparciu o genom wirusów związanych 

z adenowirusami (rAAV) efektywnie wnoszą geny do 

komórek, są nietoksyczne i niepatogenne. rAAV wykorzystywane 

są w badaniach podstawowych oraz w leczeniu 

chorych na nowotwory. Próby kliniczne terapii 

genowej z rAAV zostały przeprowadzone u chorych na 

nowotwory skóry oraz prostaty. Obecność rAAV w klinice 

odzwierciedla postęp w terapii genowej, a tym samym 

ujawnia kierunki rozwoju współczesnej farmacji. 

Słowa kluczowe: terapia genowa, wirusy związane 

z adenowirusami, nowotwory 

Wprowadzenie 

Terapia genowa, terapia fotodynamiczna czy wykorzystanie 

komórek macierzystych do celów terapeutycznych 

odzwierciedlają postęp w naukach farmaceutycznych, a ich 

obecność w klinice czyni możliwym leczenie pacjentów, dla 

których klasyczne środki i metody leczenia nie są do końca 

skuteczne. Terapia genowa, znana w klinice od lat 90. 

ubiegłego stulecia [1] wykorzystuje geny kodujące białka 

o funkcji terapeutycznej. W chwili obecnej w badaniach klinicznych 

terapii genowej wykorzystuje się nośniki genów 

konstruowane głównie w oparciu o genom adenowirusów, 

lentiwirusów oraz wirusów związanych z adenowirusami 

48 

Abstract 

Gene therapy methods are based on coding nucleic acid 

sequences that are administered directly to cells via 

carriers commonly recognized as DNA vectors. The 

correctly prepared cDNA/vector formula determines 

efficient transfection of cells, transgen expression, and 

therefore biological responses. The studies concerning 

the development of safe and efficient vectors are still 

conducted. Recombinant adeno-associated virus vectors 

(rAAV) are a most promising candidates for cancer gene 

therapy protocols. They are nonpathogenic and seem to 

be safer than other viral vectors. rAAV effectively infect 

cancer cells of broad range and permit stable and 

efficient transgene expression. In vivo studies show a 

promising observations and therapeutic implications. 

So far, recombinant adeno-associated based vectors are 

successfully used in the clinic for gene therapy of melanoma 

and prostate patients. 

Key words: gene therapy, adeno-associated viruses, 

cancers 

(AAV). Wiele opracowań wskazuje, iż preparaty genowe wirusowe, 

mimo iż efektywnie wnoszą geny do komórek, nie 

są bezpieczne dla pacjentów . Najczęściej opisywane niepożądane 

działania rekombinowanych wirusów to wysoka immunogenność 

oraz mutageneza insercyjna. W chwili obecnej 

wektory konstruowane w oparciu o genom AAV należą 

do najbezpieczniejszych. rAAV bardzo wydajnie infekują 

komórki gospodarza, a czas ekspresji transgenu jest długi. 

W próbach terapii genowej wykorzystuje się rAAV z uwagi 

na brak ich patogenności, toksyczności, wydajną infekcję 

komórek oraz długą i wysoką ekspresję wprowadzanych 

genów. Atrakcyjność kliniczną rAAV zwiększa również występowanie 

w przyrodzie serotypów AAV (AAV1-AAV12).

Możliwość konstruowania in vitro serotypów rAAV pozwala 

na przygotowywanie preparatów genowych wnoszących 

geny do określonych narządów człowieka. Dalsze badania 

przedkiniczne i kliniczne wskażą czy i kiedy rAAV staną się 

uniwersalnymi nośnikami genów w terapii genowej i rozszerzą 

tym samym spektrum środków leczniczych współczesnej 

farmakoterapii. 

Wirusy związane z adenowirusami (AAV) 

Wirusy AAV należą do rodziny Parvoviridae, rodzaju 

Dependovirus. AAV mają średnicę około 25 nm, symetrię 

ikozahedralną i zawierają pojedynczą nić DNA, składającą 

się z 4680 par zasad (AAV2). Genom wirusa AAV zbudowany 

jest z dwóch otwartych ramek odczytu lewej rep 

i prawej cap, oskrzydlonych sekwencjami ITR (ang. inverted 

terminal repeats) złożonymi ze 145 par zasad. Sekwencje 

ITR są niezbędne do replikacji, pakowania i integracji 

DNA AAV do genomu gospodarza. W wirusowym genomie 

można wyróżnić trzy promotory: p5, p19 i p40. Dwa pierwsze 

odpowiedzialne są za ekspresję genów białek Rep, natomiast 

promotor p40 reguluje ekspresją białek kapsydowych 

Cap. Zmienność składu aminokwasowego białek kapsydowych 

determinuje występowanie w przyrodzie serotypów 

AAV wykazujących tropizm narządowy. AAV nie posiadają 

zdolności do samodzielnego namnażania się w komórce 

gospodarza, a do replikacji genomu wymagają obecności 

wirusa wspomagającego. Wśród najczęściej opisywanych 

wirusów ko-infekujących opisuje się adenowirusy oraz herpeswirusy. 

Unikalną cechą AAV jest również zdolność do 

miejscowo-specyficznej integracji własnego DNA do chromosomu 

19 człowieka (19q13.4, AAVS1) [2]. Wnikanie 

AAV (transdukcja, infekcja) do komórek jest procesem wieloetapowym, 

w którym można wyróżnić przyłączenie wirusa 

do powierzchni komórki, transport wewnątrzkomórkowy, 

zdarzenia jądrowe. Rozpoznanie i związanie AAV z błona 

komórkową wiąże się z oddziaływaniem białek kapsydu wirusów 

z receptorami komórkowymi. W przypadku wirusa 

AAV serotyp 2 (AAV2) najczęściej opisywanymi receptorami 

są proteoglikany bogate w siarczan heparanu (HSPG). 

W wiązaniu błonowym AAV biorą także udział receptory 

pomocnicze - ko-receptory, np. dla AAV2 ko-receptorami są 

np. integryny oraz receptor dla czynnika wzrostu fibroblastów 

1 (FGFR1) [3]. 

Rekombinowane wektory AAV 

jako potencjalne środki lecznicze 

Środki lecznicze współczesnej farmakoterapii mają 

zdefiniowaną strukturę, postać, cechuje je ściśle określony 

skład ilościowy i jakość, uzyskiwane są dzięki powtarzalnym 

procedurom syntezy. Znana jest ich aktywność biologiczna, 

działania niepożądane, a znaczenie kliniczne jest 

już najczęściej dobrze udokumentowane. Preparaty genowe, 

których podstawą są kwasy nukleinowe, są w chwili 

obecnej wykorzystywane głównie w pracach eksperymentalnych 

na liniach komórkowych i zwierzętach oraz stanowią 

przedmiot wstępnych prób klinicznych terapii genowej 

na pacjentach. Biochemiczna formuła preparatu genowego 

sprowadza się do sekwencji DNA kodujących wybrane 


białka o funkcji terapeutycznej, zaś postać farmaceutyczna 

– determinowana bezpośrednio przez rozwój technologii 

farmacji stosowanej – sprowadza się do formy wektora 

– wirusowego lub niewirusowego nośnika genów. Zainteresowanie 

wirusowymi wektorami AAV wynika bezpośrednio z 

ich charakterystyki molekularno-biochemicznej. Uzyskiwane 

in vitro - rekombinowane AAV- efektywnie wnoszą geny 

do komórek oraz pozwalają na długą ekspresję transgenów, 

są nieimmunogenne i niepatogenne dla gospodarza. Obecność 

serotypów AAV zwiększa ich atrakcyjność kliniczną. 

W chwili obecnej, dzięki metodom inżynierii genetycznej, 

możliwym jest w warunkach laboratorium konstruowanie 

i namnażanie wirusów AAV niosących wybrane geny terapeutyczne. 

Formuła uzyskiwania rAAV przewiduje także 

przygotowanie preparatów genowych rAAV do stosowania 

w klinice, czyli spełniających farmakopealne wymagania jakości 

[4]. Uzyskiwanie rekombinowanych wektorów AAV 

wiąże się z potrzebą klonowania molekularnego genów 

AAV w formie plazmidów. Istniejąca w chwili obecnej procedura 

przewiduje wykorzystanie plazmidów AAV (pAAV) 

niosących geny rep, cap, transgen oskrzydlony sekwencjami 

ITR oraz genów wirusów wspomagających np. adenowirusowe 

geny E1, E2A, E4, VA. Plazmidy wprowadza się 

do komórek pakujących hodowanych w warunkach in vitro 

w formie hodowli adhezyjnych lub zawiesinowych. Najczęściej 

wykorzystuje się komórki pakujące ustalonych linii 

komórkowych HEK293, HEK293T, HeLa, A549. Z komórek 

pakujących, transfekowanych pAAV izoluje się cząstki 

rekombinowanych wektorów AAV niosących wybrane geny 

terapeutyczne. Ilość cząstek wirusowych (miano) w uzyskanym 

preparacie ocenia się głównie poprzez określenie np. 

metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (ang. real 

time PCR) liczby kopii genomu rAAV w preparacie (gc/ml). 

Wyniki badań oceniających natomiast jakość uzyskanego 

preparatu – czystość biochemiczną, mikrobiologiczną, toksykologiczną 

warunkują wykorzystanie preparatu w warunkach 

klinicznych. 

Preparaty rAAV w terapii genowej 

nowotworów 

W terapii genowej chorych na nowotwory wykorzystywane 

są geny kodujące białka o zdefiniowanej aktywności 

antynowotworowej. Badania prowadzone są z rekombinowanymi 

wektorami AAV jako nośnikami genów kodujących 

białka proapoptotyczne, antyangiogenne, immunotropowe. 

Większość badań prowadzonych jest w warunkach eksperymentalnych 

– na komórkach linii komórkowych oraz na 

zwierzętach laboratoryjnych. Pierwsze próby kliniczne terapii 

genowej z rAAV zostały przeprowadzone u chorych na 

raka prostaty i czerniaka [1]. 

Geny samobójcze W terapii genowej nowotworów nierzadko 

wykorzystuje się rAAV niosące geny samobójcze. 

Do komórek nowotworowych wprowadza się rAAV kodujące 

białko enzymatyczne przekształcające nieaktywną formę 

leku (prolek) w postać toksyczną dla komórek. W pracach 

wskazuje się również, iż zasięg oddziaływania toksycznego 

metabolitu jest szerszy niż wynikający z wydajności infekcji 

komórek, z uwagi na efekt oddziaływania międzykomórko- 

49


wego (ang. bystander effect) [5]. Najczęściej stosowanym 

genem samobójczym jest gen kodujący enzym kinazę tymidynową 

wirusa opryszczki pospolitej (HSVtk). Jej działanie 

w intensywnie dzielących się komórkach nowotworu polega 

na fosforylacji nukleozydowych analogów tymidyny, (np. 

gancyklowir; acyklowir). Ufosforylowane postaci leków są 

inhibitorami polimerazy DNA. Giną komórki, do których 

wprowadzony został transgen i zaszła jego ekspresja, jak 

oraz komórki, do których toksyczny metabolit dostał się połączeniami 

międzykomórkowymi. Badania z użyciem AAV- 

HSVtk, w połączeniu z gancyklowirem przeprowadzono np. 

na komórkach nowotworów głowy i szyi [6], piersi [7], skóry 

[8]. W doświadczeniach Su i wsp. [9] mysie komórki raka 

wątroby transdukowano wektorem rAAV/HSVtk, pod kontrolą 

wątrobowo-specyficznego promotora (dla albuminy) 

oraz specyficznego dla nowotworu elementu wzmacniającego 

(dla α-fetoproteiny) [9]. Po podaniu gancykloviru wykazano, 

że tylko komórki raka wątroby, które wykazywały odczyn 

dodatni względem obecności albumin i α-fetoproteiny, 

uległy zniszczeniu. Podobne badania, jednak na komórkach 

raka jajnika, przeprowadzili również Bao i wsp. [10]. 

Geny proapoptotyczne W terapii genowej nowotworów 

wykorzystuje się również geny kodujące białka apoptozy. 

W pracy Rohr i wsp. [11] konstrukt rAAV/p53 wprowadzano 

do komórek niedrobnokomórkowego raka płuca Wraz 

ze zwiększającą się dawką preparatu rAAV, obserwowano 

zahamowanie wzrostu nowotworu w porównaniu z komórkami 

transdukowanymi wektorem kontrolnym rAAV/ 

GFP. Redukcję masy nowotworu wiązano ze zwiększonym 

poziomem apoptozy, a jednoczesne podawanie cisplatyny, 

wykazało synergistyczny efekt. W innych badaniach wykazano 

natomiast wydłużenie czasu przeżycia myszy z rakiem 

jelita grubego po podaniu „koktajlu terapeutycznego” niosącego 

jednocześnie gen p53 (Ad- p53) oraz gen kodujący 

domenę kringle 1 ludzkiego wątrobowego czynnika wzrostu 

(HGFK1) [12]. Zhang i wsp. [13] skonstruowali natomiast 

wektor niosący gen TRAIL, będący pod kontrolą promotora 

dla ludzkiej telomerazy, który wydajnie transdukował 

komórki raka wątroby, indukując w nich proces apoptozy. 

Przeciwnowotworowy efekt wzmocniony był równoległą 

ekspozycją komórek nowotworowych na działanie 

5-fluorouracylu. Podobne doświadczenia z użyciem rAAV- 

TRAIL wykonał Wang i wsp. [14]. 

Geny antyangiogenne Jedną ze strategii terapii genowej 

nowotworów jest antyangiogeneza, czyli próby ograniczania 

wzrostu i funkcji naczyń krwionośnych nowotworów. Ma 

i wsp. [15] prowadzili badania na komórkach glejaka zaszczepionych 

szczurom. Doguzowo podawano preparat rAAV 

kodujący angiostatynę. Wykazano zahamowanie wzrostu 

nowotworu i wydłużenie czasu przeżycia 40% szczurów, 

w porównaniu z grupą kontrolną, która otrzymywała preparat 

rAAV bez genu terapeutycznego. Shi i wsp. [16] zaproponowali 

użycie rAAV niosące gen endostatyny w badaniach 

nad rakiem jelita grubego. Doswidczenia wykonano in vitro, 

jak i in vivo. rAAV-endostatyna podawano zwierzętom domięśniowo. 

Obserwowano wysoki poziom rekombinowanej 

endostatyny w surowicy i zahamowanie indukowanej przez 

nowotwór angiogenezy, a w konsekwencji ograniczenie 

50 

wzrostu guza jelita grubego. Interesujące wyniki opublikowali 

również Ponnazhagan i wsp. [17]. Autorzy obserwowali 

ograniczenie wzrostu nowotworu jajnika u myszy, którym 

domięśniowo podano preparat bicistronowy rAAV niosący 

geny angiostatyny oraz endostatyny jednocześnie. 

Geny immunotropowe Wiadomym jest, iż nowotwory 

posiadają niezwykłą właściwość ucieczki spod nadzoru 

układu immunologicznego organizmu. Podejmowanych jest 

wiele badań mających na celu stymulację układu odpornościowego 

do walki z nowotworem np. poprzez dostarczanie 

do komórek guza za pomocą wektorów rAAV genów cytokin, 

które ulegając ekspresji pobudzają komórki prezentujące 

antygeny oraz limfocyty T cytotoksyczne [18]. Do grupy 

wykorzystywanych cytokin należą również interferony. 

W pracy Zhang i wsp. [19] komórki różnych linii nowotworowych 

transdukowano konstruktem rAAV niosącym gen 

syntetycznego interferonu oraz bakteryjny gen oporności na 

neomycynę (rAAV-IFN-conI-Neo). Obserwowano brak różnic 

we wzroście w porównaniu z komórkami niestransdukowanymi. 

Pomimo odporności tych komórek na działanie 

IFN in vitro, po przeniesieniu stransdukowanych komórek 

do zwierząt, guzy wzrastały wolniej niż u zwierząt z komórkami 

nietransdukowanymi W pracy Hammer i wsp. [20] 

natomiast do transdukcji komórek raka mózgu zastosowano 

rAAV z genem dla interferonu β (rAAV-IFN β) oraz trichostatynę 

(inhibitor deacetylazy histonów o działaniu przeciwnowotworowym). 

Autorzy opisali, iż w wyniku zastosowania 

rAAV/INF i trichostatyny wzrost guzów mózbu był 

ograniczony. W pracy zaś Devchand i wsp. [21] do transdukcji 

komórek guzów nowotworowych wykorzystano wektor 

rAAV kodujący interleukinę 12 (IL12). Wykazano, zależny 

od ekspresji IL12 wzrost syntezy interferonu γ i wzmożoną 

proliferację limfocytów, [21]. W badaniach poświęconych 

terapii genowej nowotworów i genom immunotropowym 

wykorzystywane sa również komórki dendrytyczne transdukowanie 

za pomocą wektorów rAAV. W pracy Liu i wsp. 

[22] do komórek dendrytycznych, w przebiegu raka piersi, 

wprowadzane były wektory rAAV kodujące błonową glikoproteinę 

- laktadherynę (BA46). Wprowadzenie do komórek 

dendrytycznych AAV/BA46/Neo zaowocowało ekspresją 

laktadheryny, szybką odpowiedzią limfocytów cytotoksycznych 

na MHC kl.I prezentujące BA46, pobudzeniem limfocytów T do 

produkcji IFN-γ oraz ekspresją dodatkowych antygenów na powierzchni 

komórek dendrytycznych (CD80, CD86). 

Podsumowanie 

Preparaty genowe konstruowane w oparciu o genom 

niepatogennych wirusów związanych z adenowirusami 

(AAV) wykorzystywane są obecnie w badaniach eksperymentalnych, 

zaś pierwsze próby kliniczne przeprowadzono 

u chorych na nowotwory skóry i prostaty. Obecność rAAV 

w laboratoriach i klinikach wynika bezpośrednio z faktów, iż 

naukowcy potrafią konstruować i namnażać rAAV in vitro, 

a uzyskane preparaty zawierają aktywne biologicznie cząstki 

wirusowe, które są dla pacjentów bezpieczne i wprowadzają 

wybrane geny terapeutyczne do komórek nowotworowych. 

Obecność rekombinowanych wektorów wirusowych 

AAV w badaniach odzwierciedla postęp w terapii chorych 

na nowotwory.


doc. dr hab. n. med. Maciej Małecki 

Zakład Biologii Komórki 

Centrum Onkologii-Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie 

ul. Roentgena 5, 02-781 Warszawa 

tel. 022 546 26 20 

mahan@poczta.wp.pl 



13. Zhang Y i wsp.: AAV-mediated TRAIL gene expression 

driven by hTERT promoter suppressed human 

1. www.wiley.co.uk/genmed 

hepatocellular carcinoma growth in mice. Life Science 

2. Małecki M, Woźniak A, Janik P. Wirusy związane z ade- 2008;82: 1154-61. 

nowirusami (AAV). Postępy Biochem 2008; 54: 57-63. 14. Samulski RJ i wsp.: Targeted integration of adeno-asso- 

3. Małecki M. Wirusowe strategie w terapii genowej ze ciated virus (AAV) into human chromosome 19. EMBO 

szczególnym uwzględnieniem wektorów konstruowa- 1991; 10: 3941-50. 

nych z wirusów związanych z adenowirusami (AAV). 15. Ma HI i wsp.: Intratumoral gene therapy of malignant 

Postępy Biol. Kom 2004; 31: 47-57. 

brain tumor in a rat model with angiostatin delivered by 

4. Farmakopea Europejska 2006. 

adeno-associated viral (AAV) vector. Gene Ther 2002; 

5. Stribbling SM i wsp.: Regressions of established breast 9: 2-11. 

cancer xenografts by carboxypeptidase G2 suicide gene 16. Shi W i wsp.: Adeno-associated virus-mediated gene 

therapy and the prodrug CMDA are due to a bystander transfer of endostatin inhibits angiogenesis and tumor 

effect. Hum. Gene Ther 2000; 11: 285-92. 

growth in vivo. Cancer Gene Ther 2002; 9: 513-21. 

6. Kanazawa T i wsp.: Suicide gene therapy using AAV- 17. Ponnazhagan S i wsp.: Adeno-Associated Virus 

HSVtk/ganciclovir in combination with irradiation re- 2-Mediated Antiangiogenic Cancer Gene Therapy: 

sults in regression of human head and neck cancer xeno- Long-Term Efficacy of a Vector Encoding Angiostatin 

rafts in nude mice. Gene Ther 2003; 10: 51-58. 

and Endostatin over Vectors Encoding a Single Factor. 

7. Li ZB i wsp.: Recombinant AAV-mediated HSVtk gene Cancer Res 2004; 64: 1781-7. 

transfer with direct intratumoral injections and Tet-On 18. Anderson R i wsp.: Construction and biological charegulation 

for implanted human breast cancer. BMC racterization of an interleukin-12 fusion protein (Fle- 

Cancer 2006; 6: 66. 

xi-12): delivery to acute myeloid leukemic blasts 

8. Schoensiegel F i wsp.: MIA (melanoma inhibitory acti- using adeno-associated virus. Hum. Gene Ther 1997; 

vity) promoter mediated tissue-specific suicide gene the- 8: 1125-35. 

rapy of malignant melanoma. Cancer Gene Ther 2004; 19. Zhang JF i wsp.: Gene therapy with an adeno-associated 

11: 408-18. 

virus carrying an interferon gene results in tumor growth 

9. Su H i wsp.: Selective-killing of AFP-positive hepatocel- suppression and regression. Cancer Gene Ther 1996; 3: 

lular carcinoma cells by adeno-associated virus transfer 31-8. 

of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Hum. 20. Hmner JB i wsp.: The efficacy of combination therapy 

Gene Ther 1996; 7: 463-70. 

using adeno-associated virus-interferon beta and tricho- 

10. Bao R, Selvakumaran M, Hamilton TC. Targeted Gene statin A in vitro and in a murine model of neuroblastoma. 

Therapy of Ovarian Cancer Using an Ovarian-specific J Ped. Sur 2008; 43: 177-83. 

Promoter. Gyn. Oncol 2002; 84: 228-34. 

21. Paul D i wsp.: Construction of a recombinant adeno-as- 

11. Rohr UP i wsp.: Non-small lung cancer are prime tar- sociated virus (rAAV) vector expressing murine inter- 

gets for p53 gene transfer mediated by a recombinant leukin-12 (IL-12) Ther. 2000. 7, s. 308-315. 

adeno-associated virus type-2 vector Cancer Gene Ther 22. Liu Y i wsp.: Use and specificity of breast cancer anti- 

2003;10: 898-906. 

gen/milk protein BA46 for generating anti-self-cytotoxic 

12. Nie B i wsp.: AAV-HGFK1 and Ad-p53 cocktail therapy T lymphocytes by recombinant adeno-associated virus- 

prolongs survival of mice with colon cancer. Mol. Canbased gene loading of dendritic cells. Cancer Gene Ther 

cer Ther 2008;7: 2855-65. 

2005; 12: 304-12. 

51


Badanie zależności pomiędzy strukturą 

i działaniem pochodnych benzodiazepiny. 

Część I. Nie-nukleozydowe inhibitory 

odwrotnej transkryptazy wirusa HIV-1 

Structure-activity relationship of benzodiazepine derivatives. 

Part I. Non-nucleoside reverse transcriptase HIV-1 inhibitors 

piotr włodno, elżbieta brzezińska 

zakład chemii Analitycznej, katedra chemii Medycznej, wydział farmaceutyczny 

uniwersytetu Medycznego w łodzi 

kierownik: elżbieta brzezińska 

Streszczenie 

Przeprowadzono analizę ilościowej zależności pomiędzy 

strukturą i działaniem (QSAR) 52 pochodnych 4,5,6,7-tetrahydro-imidazolo[4,5,1-jk][1,4]benzodiazepin-2(1H)onu 

o działaniu hamującym na RT HIV-1. W analizie zastosowano 

parametry fizykochemiczne badanych związków 

obliczone z zastosowaniem metody pół-empirycznej 

PM3. Zastosowano analizę regresji wielokrotnej (MR), 

analizę skupień (CA) i analizę funkcji dyskryminacyjnej 

(DFA) w celu wyłonienia grupy zmiennych klasyfikujących 

pochodne benzodiazepiny zgodnie z poziomem ich 

aktywności anty-HIV-1 RT. Dzięki zastosowaniu analizy 

MR ustalono istotną rolę parametrów hydrofobowych 

i elektronowych badanych związków dla ich aktywności 

biologicznej. Istotne równanie regresji wieloczynnikowej 

uzyskane w MR może być użyte do przewidywania 

poziomu aktywności różnych pochodnych benzodiazepiny. 

Zależność ta zawiera parametry użyte w metodach 

CA i DFA. Analiz DFA i CA wykazały, że parametry: 

log P (współczynnik podziału), N-N (odległość pomiędzy 

atomami azotu BDZ), Q1 (ładunek elektryczny zgromadzony 

na atomie azotu N1 BDZ), %PSA (powierzchnia 

polarna cząsteczki), HD (liczba wiązań wodorowych) 

i V (objętość cząsteczki) są odpowiedzialne za klasyfikację 

związków jako silnie i słabo działające. Zdolność 

przekraczania bariery krew-mózg odgrywa ważną rolę 

w tej klasyfikacji. Zastosowane analizy pozwoliły zaproponować 

zasadę klasyfikacji BDZ wykazujących działanie 

anty-HIV-1 RT. 

Słowa kluczowe: ilościowa zależność pomiędzy struktura 

i aktywnością; analiza regresji; analiza funkcji dyskryminacyjnej; 

analiza skupień; pochodne benzodiazepiny 

52 

Abstract 

A quantitative structure-activity relationship (QSAR) 

analysis of 52 4,5,6,7-tetrahydro-imidazo[4,5,1-jk][1,4] 

benzodiazepin-2(1H)-one derivatives as RT HIV-1 inhibitors 

was carried out. The semi-empirical method 

PM3 was employed to calculate a set of physicochemical 

parameters for investigated compounds. The Multiple 

Regression analysis (MR), Cluster Analysis (CA), and 

Discriminant Function Analysis (DFA) were employed 

to reduce dimensionality and investigate which subset of 

variables is effective for classifying the benzodiazepine 

derivatives according to their degree of anti- HIV-1 RT 

activity. By using the MR we have found the important 

role of the hydrophobic and electronic parameters of 

investigated benzodiazepines H1-H52 for their activity. 

The good multivariate relationship obtained by the use 

of MR method can be used for predicting the quantitative 

effect of anty-HIV-1 RT activity of different benzodiazepine 

derivatives. These relationships involved the parameters 

used in CA and DFA methods. The DFA and CA 

methods showed that the parameters log P (partition coefficient), 

N-N (distance between BDZ nitrogen atoms), 

Q1 (electric charge focused on BDZ N1 atom), %PSA 

(polar surface area), HD (number of hydrogen bounds) 

and V (molecular volume) are responsible for separation 

between compounds with higher and lower activity. The 

blood-brain barrier permeability plays very important 

role in this classification. From used analysis we present a 

prediction rule of classifying benzodiazepine derivatives 

with anty-HIV-1 RT activity. 

Keywords: quantitative structure-activity relationship; 

regression, discriminant and cluster analysis, benzodiazepine 

derivatives

Wstęp 

W badaniach nad poszukiwaniem nowych substancji 

biologicznie czynnych wykorzystywane są tzw. układy wyjściowe 

– centroidy. Niektóre centroidy, częściej występują 

w chemii medycznej i określane są mianem uprzywilejowanych, 

a ich pochodne wykazują różne kierunki działania. Do 

tego typu układów wyjściowych zaliczyć można centroid 

benzodiazepinowy. Jest to struktura, na bazie której otrzymano 

wiele substancji czynnych o bardzo różnorodnym kierunku 

i zakresie działania. Pochodne benzodiazepiny (BDZ) 

zostały odkryte w 1954 roku przez Leo Sternbacha. Pierwsza 

pochodna tego układu została opatentowana w 1959 roku, 

a wprowadzona do lecznictwa już w roku 1960 pod nazwą 

Librium (chlordiazepoksyd) [1]. Zainteresowanie tym lekiem 

zaowocowało wieloma badaniami. Obecnie zsyntetyzowano 

już tysiące BDZ, z czego na rynku dostępne są leki 

zawierające kilkanaście substancji czynnych o tej budowie. 

Są one szeroko stosowane w lecznictwie, jako ligandy receptora 

benzodiazepinowego w układzie GABA-ergicznym. 

Ich działanie przeciwlękowe, miorelaksujące i uspokajające 

uważane jest za klasyczne i nazywane diazepamo-podobnym. 

Badano również inne zastosowania farmakologiczne 

pochodnych benzodiazepiny. Wymienić można wiele stwierdzonych 

efektów biologicznego działania BDZ. Wśród wymienianych 

znajdują się: związki działające przeciwarytmicznie 

[2-5]; antagoniści receptora cholecystokininowego 

[6-8]: inhibitory odwrotnej transkkryptazy wirusa HIV-1 

(NNRTI) [9-12]; antagoniści receptorów α-adrenergicznych 

[13,14]; działające na receptory κ-opioidowe [15-18]; muskarynowe 

[19]; wpływające na ośrodek głodu [20-24]; 

przeciwlipemiczne [25]. Obecnie znana jest możliwość 

zastosowania BDZ w wielu schorzeniach, a prace nad ich 

dalszym wykorzystaniem wciąż trwają. Związki te działają 

w obrębie centralnego układu nerwowego lub na obwodzie. 

Ich zróżnicowane działanie może być spowodowane zarówno 

uwarunkowaniami farmakodynamicznymi, jak i farmakokinetycznymi. 

Efekt obserwowany może więc być zależny 

od właściwości fizykochemicznych determinujących 

specyficzną biodostępność (np. umożliwiających pokonanie 

bariery krew-mózg). Z powodu wielu kierunków działania 

i podobieństwa strukturalnego BDZ stanowią ciekawy 

materiał badawczy w analizach (Q)SAR. Wnioski płynące 

z analizy strukturalnej poszczególnych grup działania BDZ 

w wielu przypadkach można uznać za wyczerpujące. Trudno 

jednak odnaleźć przykłady dociekania podstaw zróżnicowania 

działania pochodnych benzodiazepiny pomiędzy tymi 

grupami. Podobieństwo cech fizykochemicznych związków 

w grupach wykazujących określony efekt biologiczny i ich 

odrębność pomiędzy grupami może definiować obserwowaną 

różnorodność działania pochodnych układu benzodiazepiny. 

Założono, że zróżnicowanie odpowiedzi biologicznej 

ma podłoże farmakodynamiczne, ale również farmakokinetyczne. 

Rozpatrywano więc zarówno siłę działania BDZ 

w grupach działania, jak również wpływ na jego ukierunkowanie. 

Celem pracy było odnalezienie prawidłowości 

w ukierunkowaniu działania farmakologicznego pochodnych 

o podobnej budowie i obserwacja centroidu benzodiazepinowego, 

jako niespecyficznego nośnika specyficznej odpowiedzi 

biologicznej. Niniejsza praca dotyczy badania grupy 


52 pochodnych 4,5,6,7-tetrahydro-metylimidazolo[4,5,1-jk] 

[1,4]benzo-diazepin-2(1H)-onu dla ustalenia charakterystyki 

strukturalnej wymagań BDZ o działaniu hamującym na 

RT HIV-1. Dane strukturalne i o aktywności biologicznej 

związków zgromadzono na podstawie prac źródłowych [9, 

26-28]. 

Materiały i metody 

Analizowane w pracy BDZ należą do znanej wśród nienukleozydowych 

inhibitorów HIV-1 RT (NNRTI) grupy 

TIBO. Do badań przyjęto 52 związki (H1-H52) pochodzące 

z bibliografii [9,26-28]. Strukturę pochodnych i aktywność 

podano w Tabeli 1. 

Dane o właściwościach fizykochemicznych związków 

H1-H52 ustalono metodami obliczeniowymi z zastosowaniem 

metod pół-empirycznych. Podstawą badania właściwości 

były struktury związków w minimum energetycznym 

(po optymalizacji geometrycznej metodą PM3 bez przeglądu 

konformacji). Związki opisano zbiorem zmiennych zgromadzonych 

za pomocą programów HyperChem 7.1, ACD- 

Labs 8.0 (logD i pK): log P - lipofilowość, %PSA – odsetek 

powierzchni o charakterze polarnym, N-N – odległość pomiędzy 

atomami azotu BDZ, HD i HA – liczba donorów 

i akceptorów wiązań wodorowych, Q1 i Q2 – ładunek elektryczny 

na N1 i N4 BDZ, V – objętość cząsteczki, Cl, Br, 

F, I – liczba atomów chlorowca, P – polaryzowalność objętościowa, 

S – pole powierzchni, M – masa cząsteczkowa, 

Md – moment dipolowy, eH i eL – energia orbitali HOMO 

i LUMO, B1 i B2 – wskażnik przenikania BBB, log D 

– współczynnik dystrybucji (dane surowe przedstawiono 

w Tabeli 2.). 

Analizę statystyczną przeprowadzono z zastosowaniem 

programu STATISTICA 7.0, metodami: regresji wielorakiej 

(MR); analizy skupień (CA) metodą grupowania k-średnich; 

analizy funkcji dyskryminacyjnej (DFA). 

Wyniki badań 

Analiza regresji wielokrotnej (MR – Multiple Regression) 

Przeprowadzono pełną analizę regresji z zastosowaniem 

parametrów fizykochemicznych obliczonych metodami 

pół-empirycznymi dla związków H1–H52. Wyznaczono 

macierz korelacji w poszukiwaniu ścisłych zależności pomiędzy 

zmiennymi niezależnymi, w celu odrzucenie modeli 

regresji wielokrotnej, powstałych z równoczesnym udziałem 

skorelowanych zmiennych. Następnie prowadzono systematyczną 

analizę krokową dla zmiennej zależnej – aktywności 

biologicznej pIC 50 z użyciem wszystkich zgromadzonych 

danych fizykochemicznych – zmiennych niezależnych. 

Przeprowadzenie pełnej analizy krokowej wprowadziło do 

modelu regresji 14 zmiennych niezależnych. Model ten opisuje 

88% (r = 0,94; n = 52) zmienności całkowitej w badanej 

grupie przypadków aktywnych. Liczba przypadków (52) 

nie upoważnia jednak do wprowadzenia 14 zmiennych do 

modelu. Ponadto niektóre zmienne wykazywały korelacje 

wewnętrzne. Ostatecznie najlepsze równanie po korekcie, 

53


niezawierające skorelowanych danych tłumaczy 83% wariancji 

całkowitej w grupie przypadków, co nadal wskazuje 

na bardzo dobre dopasowanie modelu (r = 0,91) i może mieć 

wartość predykcyjną w zakresie aktywności anty-HIV-1 pochodnych 

benzodiazepiny. Powstały model wyrażony jest 

równaniem: 

pIC 50 = 17,91(±5,90) + 0,23(±0,24)log P 

+ 0,16(±0,03)%PSA – 5,74(±1,92)N-N – 0,58(±0,26) 

HD – 0,02(±0,01)Q1 – 0,98(±0,31)HA + 2,24(±0,87)V 

+ 0,43(±0,26)Cl 

r = 0,91; R 2 = 0,83; F = 26,611; p

ilościowy. Sposób wyznaczenia zmiennej grupującej oparty 

został na wynikach analizy skupień. Badane pochodne H1- 

H52 opisano kodami grupowymi: 1 – średnio działające; 

2 – słabo działające i 3 – silnie działające hamująco na RT 

HIV-1. Do analizy wprowadzono tylko zmienne niezależne 

(standaryzowane) uzyskane z analizy MR i użyte następnie 

w analizie grupowania metodą k-średnich CA do wyznaczenia 

skupień 1-3 (log P, %PSA, N-N, HD, Q1, HA, V, Cl, P 

i S). Analizę prowadzono przy użyciu krokowej metody postępującej 

wyznaczającej zmienne dyskryminujące spośród 

wprowadzonych do analizy. Po pięciu kolejnych krokach 

analizy i wprowadzeniu 5 zmiennych dyskryminujących do 

modelu uzyskano dwie funkcje dyskryminacyjne. Obliczone 

funkcje dyskryminacyjne pozwoliły na stworzenie wykresu 

rozrzutu przypadków (Ryc. 2). 

Ryc. 2. Wykres rozrzutu przypadków H1-H52 na podstawie 

średnich zmiennych kanonicznych funkcji dyskryminacyjnej 

1 (pierwiastek 1) w stosunku do funkcji dyskryminacyjnej 2 

(pierwiastek 2) 

Jak widać grupy 1-3 są wyraźnie rozdzielone i stanowią 

skupiska przypadków o pewnym rozproszeniu. Mimo obserwowanego 

rozproszenia kontrola prawdopodobieństwa 

a posteriori klasyfikacji związków nie wykazuje błędów 

w przyporządkowaniu przypadków (tabeli prawdopodobieństwa 

nie zamieszczono). Poszczególne przypadki zostały 

zakwalifikowane do odpowiednich grup z prawdopodobieństwem 

w granicach r = 0,98-1,00; związki H19 

(r = 0,92); H43 (r = 0,91); H32 (r = 0,71). Badanie macierzy 

klasyfikacji wykazało, że prawdopodobieństwo a priori 

jest całkowite. Procent przypadków, które zostały poprawnie 

sklasyfikowane w każdej grupie przez aktualne funkcje 

klasyfikacyjne równe są 100% (Tabela 5). 

Na podstawie satysfakcjonujących wyników analizy zaproponowano 

trzy funkcje klasyfikacyjne charakteryzujące: 

Grupę 1 BDZ o umiarkowanym działaniu hamującym 

na RT HIV-1 

G_1 = 2,8 V + 4,3 HD – 3,2 PSA% – 1,9 N-N – 0,1 Cl 

– 1,2 Q1 – 5,9 

Grupę 2 BDZ o słabym działaniu hamującym na RT 

HIV-1 

G_2 = – 5,1 V + 1,8 HD – 0,9 PSA% + 0,8 N-N – 1,2 

Cl + 0,4 Q1 – 4,4 


Grupę 3 BDZ o silnym działaniu hamującym na RT 

HIV-1 

G_3 = 3,4 V – 3,6 HD + 2,3 PSA% + 0,1 N-N + 1,2 Cl 

+ 0,2 Q1 – 4,1 

Przedstawione funkcje klasyfikacyjne mogą być wykorzystane 

jako praktyczne narzędzie klasyfikacji nowych przypadków. 

Wnioski 

Na podstawie przeprowadzonej analizy zaproponowano 

charakterystykę strukturalną pochodnych BDZ o działaniu 

hamującym na RT HIV-1. Analiza MR pozwala na ustalenie, 

że wyższa aktywność pIC 50 pochodnych H1-H52 zależna 

jest od następujących czynników: lipofilowości logP 

powyżej 2,55; %PSA powyżej 15,73%; odległość atomów 

azotu N-N poniżej 2,90 Å; liczby donorów wiązań wodorowych 

HD poniżej 1,13; niskiego ładunku dodatniego na 

atomie azotu N1 Q1; liczby akceptorów wiązań wodorowych 

HA poniżej 3,94; V powyżej 275 Å 3 ; obecności podstawników 

halogenowych Cl (podane wartości graniczne 

stanowią średnią arytmetyczną danych surowych w badanej 

grupie). Większość tych parametrów wpływa na możliwość 

przenikania związków przez barierę krew-mózg. Badane 

związki nie wykazywały działania diazepamo-podobnego. 

Przeprowadzona analiza MR wskazuje na brak preferencji 

dla czynników sprzyjających pokonywaniu BBB przez 

benzodiazepinowe NNRTI. Analiza skupień pokazuje, że 

zmienność niektórych parametrów nie zachowuje trendu 

zgodnego z wynikiem analizy regresji, szczególnie w przypadku 

pochodnych o słabym i średnim działaniu (skupienia 

2 i 1). W opisanym przypadku najbardziej widoczne jest to 

w odniesieniu do korzystnej wartości ładunku dodatniego 

na atomie N1 układu benzodiazepiny. Różnice te dają możliwość 

obserwacji struktury zmienności kolejnych parametrów 

w mniejszych zakresach przypadków. W badaniach licznych 

grupa przypadków obserwowane w MR korelacje poszczególnych 

zmiennych są jedynie trendem wypadkowym zjawiska 

w całej grupie. Węższe zakresy obserwacji w CA mogą ujawniać 

zmienność tego trendu dla kolejnych skupień przypadków 

o bardziej sprecyzowanych właściwościach (np. biologicznych). 

Skupienia te, które podobne są pod względem strukturalnym, 

mogą charakteryzować się nawet trendem przeciwnym, 

co nie ujawnia się w badaniu łącznie całej grupy. Jest to 

najczęściej spowodowane zbyt małym wpływem średniej wartości 

zmiennej dla danego skupienia. Tak ujawniona struktura 

zmienności całkowitej pomaga uniknąć formułowania zbyt 

uogólnionych wniosków i zastosować właściwe wskazówki 

do dalszych badań. Wyłonione w przebiegu CA skupienia 

1-3 – grupy działania średniego, słabego i silnego są podstawą 

analizy dyskryminacyjnej. Satysfakcjonujące wynik analizy 

dyskryminacyjnej pozwoliły na sformułowanie równań matematycznych, 

jako praktycznego narzędzia kwalifikowania nowych 

pochodnych do badań biologicznych. Analizy CA i DFA 

całkowicie potwierdzają, że zróżnicowanie odpowiedzi biologicznej 

w grupie BDZ NNRTI ma podłoże farmakodynamiczne, 

ale również farmakokinetyczne i zależy w dużej mierze od 

zahamowania zdolności przenikania BBB. 

Badania wykonano w ramach tematu badawczego 

finansowanego przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi 

Nr 502-13-626 

55


Tabela 1. 

Pochodne H1-H52 o działaniu hamującym 

odwrotną transkryptazę wirusa 

HIV-1 

4,5,6,7-tetrahydroimidazolo[4,5,1-jk] 

[1,4]benzodiazepin-2(1H)-on 

56 

związek R1 R2 R3 R4 pIC 50 

H1 H O CH 2 CO 2 CH 3 5-CH 3 3,04 

H2 8-NH 2 O CPM 5-CH 3 3,07 

H3 9-NHCOCH 3 O CPM 5-CH 3 3,80 

H4 H O CH 2 CH=CHC 6 H 5 5-CH 3 3,91 

H5 H O CH 2 -2-furanyl 5-CH 3 3,97 

H6 H O CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 5-CH 3 4,00 

H7 H O CH 2 CH 2 CH 3 5-CH 3 4,05 

H8 H O CH 2 CHCH 2 5-CH 3 4,15 

H9 H O CH 2 C(CH=CH 2 )=CH 2 5-CH 3 4,15 

H10 H O CH 2 C(Br)CH 2 5-CH 3 4,21 

H11 9-NH 2 O CPM 5-CH 3 4,22 

H12 H O CH 2 CHCHCH 3 5-CH 3 4,24 

H13 H O CH 2 CH 2 CHCH 2 5-CH 3 4,30 

H14 H O 2-MA 5-CH 3 4,33 

H15 H O CPM 5-CH 3 4,36 

H16 H O CH 2 C(C 2 H 5 )=CH 2 5-CH 3 4,43 

H17 H O CH 2 CHCHCH 3 5-CH 3 4,46 

H18 H O CH 2 C(CH 3 )=CHCH 3 5-CH 3 4,54 

H19 H O DMA 5-CH 3 4,90 

H20 8-NCH 3 O CPM 5-CH 3 5,18 

H21 9-N(CH 3 ) 2 O CPM 5-CH 3 5,18 

H22 10-OCH 3 O DMA 5-CH 3 5,18 

H23 8-CONH 2 O DMA 5-CH 3 5,20 

H24 9-CF 3 O DMA 5-CH 3 5,23 

H25 10-OCH 3 S DMA 5-CH 3 5,33 

H26 H O DMA 5-CH 3 5,48 

H27 9-NO 2 S CPM 5-CH 3 5,61 

H28 10-Br S DMA 5-CH 3 5,97 

H29 8-CH 3 O DMA 5-CH 3 6,00 

H30 9-CF 3 S DMA 5-CH 3 6,31 

H31 8-CONH 2 S DMA 5-CH 3 6,73 

H32 9-Cl O DMA 5-CH 3 6,74 

H33 9-Cl S DMA H 6,80 

H34 8-OC 2 H 5 S DMA 5-CH 3 7,02 

H35 8-I O DMA 5-CH 3 7,06 

H36 H S CPM 5-CH 3 7,22 

H37 8-CN S DMA 5-CH 3 7,25 

H38 8-I S DMA 5-CH 3 7,32 

H39 8-Br O DMA 5-CH 3 7,33 

H40 8-Cl S DMA H 7,34 

H41 H S DMA 5-CH 3 7,36 

H42 9-Cl S DMA 5-CH 3 7,47


H43 8-OCH 3 S DMA 5-CH 3 7,47 

H44 9-Cl S CPM 5-CH 3 7,47 

H45 8-CCH S DMA 5-CH 3 7,53 

H46 9-F S DMA 5-CH 3 7,60 

H47 9,10-di-Cl S DMA 5-CH 3 7,60 

H48 8-CH 3 S DMA 5-CH 3 7,87 

H49 8-F S DMA 5-CH 3 8,24 

H50 8-SCH 3 S DMA 5-CH 3 8,30 

H51 8-Cl S DMA 5-CH 3 8,37 

H52 8-Br S DMA 5-CH 3 8,52 

Tabela 2. 

Wartości parametrów fizykochemicznych dla inhibitorów odwrotnej transkryptazy pochodnych 4,5,6,7-tetrahydroimidazolo[4,5,1jk][1,4] 

benzodiazepin-2(1H)-onu 

Zw. pIC50 S [Å 2 ] V [Å 3 ] logP R [Å 3 ] P [Å 3 ] M HD HA Q1 [C] Q2 [C] 

H1 3,04 288,39 245,87 0,45 73,18 28,43 275,31 1,00 6,00 0,08 -0,06 2,50 

H2 3,07 273,19 241,07 0,49 74,23 28,28 258,32 3,00 5,00 0,08 -0,02 4,14 

H3 3,80 315,25 276,53 0,12 82,61 32,04 300,36 2,00 6,00 0,09 -0,02 2,90 

H4 3,91 345,85 306,20 3,18 97,25 37,17 319,41 1,00 4,00 0,08 -0,07 3,90 

H5 3,97 289,02 258,18 0,16 81,93 30,85 283,33 1,00 5,00 0,08 -0,07 3,82 

H6 4,00 292,37 253,94 2,08 76,20 29,54 259,35 1,00 4,00 0,06 -0,07 2,85 

H7 4,05 274,05 237,30 1,69 71,59 27,70 245,32 1,00 4,00 0,08 -0,08 3,96 

H8 4,15 268,03 232,71 1,02 71,48 27,51 243,31 1,00 4,00 0,08 -0,07 3,89 

H9 4,15 293,24 260,11 1,95 80,41 30,99 269,35 1,00 4,00 0,08 -0,08 3,79 

H10 4,21 274,39 245,10 1,67 79,02 30,14 322,20 1,00 4,00 0,08 -0,07 5,86 

H11 4,22 276,61 241,59 0,49 74,23 28,28 258,32 3,00 5,00 0,09 -0,02 4,09 

H12 4,24 267,59 238,85 1,38 77,51 29,35 257,34 1,00 4,00 0,07 0,03 3,43 

H13 4,30 268,98 239,57 1,87 76,24 29,35 257,34 1,00 4,00 0,08 -0,08 3,89 

H14 4,33 293,39 251,13 1,77 75,77 29,35 257,34 1,00 4,00 0,09 0,01 4,14 

H15 4,36 263,39 230,60 1,27 69,53 26,93 243,31 1,00 4,00 0,09 0,03 3,97 

H16 4,43 298,26 264,79 2,16 80,37 31,18 271,36 1,00 4,00 0,08 -0,08 3,83 

H17 4,46 276,16 243,12 1,38 77,51 29,35 257,34 1,00 4,00 0,06 0,01 3,52 

H18 4,54 267,70 246,64 2,35 81,23 31,28 272,37 1,00 4,00 0,06 -0,06 2,96 

H19 4,90 296,72 264,60 2,11 80,54 31,18 271,36 1,00 4,00 0,09 -0,07 3,89 

H20 5,18 309,36 275,43 1,54 83,96 31,95 286,38 1,00 5,00 0,09 -0,02 4,40 

H21 5,18 314,05 275,88 1,54 83,96 31,95 286,38 1,00 5,00 0,09 -0,02 4,34 

H22 5,18 325,98 289,07 1,85 87,00 33,65 301,39 1,00 5,00 0,08 -0,07 4,75 

H23 5,20 325,92 292,41 0,94 89,12 34,45 314,93 3,00 6,00 0,09 -0,06 3,19 

H24 5,23 327,92 288,92 2,99 86,51 32,74 339,36 1,00 4,00 0,09 -0,07 3,88 

H25 5,33 337,12 300,41 3,45 95,59 36,82 317,45 1,00 4,00 0,24 -0,08 7,31 

H26 5,48 280,33 248,13 1,69 76,12 29,35 257,34 1,00 4,00 0,08 -0,06 3,97 

H27 5,61 299,03 261,08 -1,05 84,43 31,93 304,37 1,00 6,00 0,23 -0,03 4,70 

H28 5,97 331,06 297,31 4,49 96,75 36,97 366,32 1,00 3,00 0,24 -0,08 6,36 

H29 6,00 314,62 280,91 2,57 85,58 33,02 285,39 1,00 4,00 0,08 -0,07 4,14 

H30 6,31 343,19 305,35 3,09 91,10 34,75 357,44 1,00 3,00 0,98 -0,11 11,79 

H31 6,73 325,06 293,13 3,38 95,71 36,26 315,43 1,00 4,00 0,25 -0,07 4,83 

H32 6,74 315,00 278,83 2,62 85,35 33,11 305,81 1,00 4,00 0,08 -0,06 3,41 

H33 6,80 301,86 270,23 3,80 89,51 34,44 307,84 1,00 3,00 0,24 -0,07 5,67 

H34 7,02 353,63 316,68 3,79 100,33 38,65 331,48 1,00 4,00 0,23 -0,08 7,19 

H35 7,06 322,51 292,59 3,36 92,25 36,21 397,26 1,00 4,00 0,09 -0,07 3,17 

H36 7,22 276,06 241,70 2,86 78,11 30,09 259,37 1,00 3,00 0,24 -0,04 6,25 

H37 7,25 326,61 293,58 3,74 94,86 36,20 312,43 1,00 4,00 0,24 -0,08 2,38 

H38 7,32 333,26 303,72 4,96 101,53 39,37 413,32 1,00 3,00 0,24 -0,08 5,59 

Md 

[D] 

57


H39 7,33 321,58 293,50 4,42 91,23 34,78 348,28 1,00 4,00 0,05 -0,08 1,99 

H40 7,34 307,21 273,37 3,80 89,51 34,44 307,84 1,00 3,00 0,24 -0,07 5,39 

H41 7,36 305,26 271,82 3,23 87,54 33,43 285,41 1,00 3,00 0,24 -0,08 6,25 

H42 7,47 318,87 285,70 3,75 92,34 35,36 319,85 1,00 3,00 0,24 -0,07 5,70 

H43 7,47 330,65 295,69 2,98 94,00 35,90 315,43 1,00 4,00 0,23 -0,07 7,00 

H44 7,47 293,20 255,88 3,38 82,92 32,02 293,81 1,00 3,00 0,24 -0,04 5,53 

H45 7,53 336,46 303,57 4,35 98,81 37,82 313,46 1,00 3,00 0,24 -0,07 6,43 

H46 7,60 312,71 278,42 3,84 89,34 34,25 305,41 1,00 3,00 0,24 -0,08 5,18 

H47 7,60 339,19 303,78 4,74 98,73 38,20 356,31 1,00 3,00 0,24 0,07 5,82 

H48 7,87 325,75 292,09 4,17 94,16 36,18 301,45 1,00 3,00 0,24 -0,08 6,65 

H49 8,24 305,21 274,18 3,37 87,76 33,34 303,40 1,00 3,00 -0,01 -0,03 4,70 

H50 8,30 340,09 306,56 3,32 100,45 38,27 331,49 1,00 3,00 0,24 -0,67 6,49 

H51 8,37 316,25 285,51 3,75 92,34 35,36 319,85 1,00 3,00 0,24 -0,07 5,44 

H52 8,52 327,93 296,76 4,49 96,75 36,97 366,32 1,00 3,00 -0,05 -0,01 5,09 

związki N-N [Å] 

58 

eH 

[ kcal/mol] 

eL 

[ kcal/mol] 

B1 B2 logD Cl F Br I %PSA 

H1 2,91 -8,74 -0,01 -0,71 -0,44 1,28 0,00 0,00 0,00 0,00 21,46 

H2 2,80 -8,34 0,06 -0,70 -0,44 -0,78 0,00 0,00 0,00 0,00 22,55 

H3 2,81 -8,57 -0,24 -0,80 -0,49 -0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 20,52 

H4 2,90 -8,75 -0,31 0,10 -0,02 2,81 0,00 0,00 0,00 0,00 10,29 

H5 2,95 -8,79 0,04 -0,56 -0,23 1,46 0,00 0,00 0,00 0,00 16,86 

H6 2,94 -8,90 -0,14 -0,07 -0,02 1,67 0,00 0,00 0,00 0,00 12,17 

H7 2,88 -8,75 0,03 -0,13 -0,02 1,14 0,00 0,00 0,00 0,00 12,98 

H8 2,89 -8,74 0,02 -0,23 -0,02 1,47 0,00 0,00 0,00 0,00 13,27 

H9 2,96 -8,76 0,00 -0,09 -0,02 2,61 0,00 0,00 0,00 0,00 12,13 

H10 2,95 -8,90 -0,16 -0,13 -0,02 2,73 0,00 0,00 1,00 0,00 12,97 

H11 2,81 -8,31 0,07 -0,70 -0,44 -0,66 0,00 0,00 0,00 0,00 22,27 

H12 2,87 -8,24 -0,15 -0,18 -0,02 1,92 0,00 0,00 0,00 0,00 13,30 

H13 2,81 -8,74 0,02 -0,10 -0,02 2,04 0,00 0,00 0,00 0,00 13,23 

H14 2,85 -8,74 -0,01 -0,12 -0,02 1,79 0,00 0,00 0,00 0,00 12,13 

H15 2,86 -8,75 0,03 -0,19 -0,02 0,38 0,00 0,00 0,00 0,00 13,51 

H16 2,97 -8,76 0,01 -0,06 -0,02 2,33 0,00 0,00 0,00 0,00 11,93 

H17 2,87 -8,23 -0,16 -0,18 -0,02 1,92 0,00 0,00 0,00 0,00 12,88 

H18 2,88 -6,20 -1,19 -0,03 -0,02 2,26 0,00 0,00 0,00 0,00 13,29 

H19 2,88 -8,90 -0,14 -0,07 -0,02 3,10 0,00 0,00 0,00 0,00 11,99 

H20 2,74 -8,32 0,05 -0,20 -0,07 0,59 0,00 0,00 0,00 0,00 12,55 

H21 2,79 -8,24 0,11 -0,20 -0,07 0,92 0,00 0,00 0,00 0,00 12,36 

H22 2,88 -8,68 0,09 -0,24 -0,17 2,09 0,00 0,00 0,00 0,00 13,75 

H23 2,86 -8,92 0,60 -0,88 -0,71 0,83 0,00 0,00 0,00 0,00 24,14 

H24 2,88 -9,17 -0,62 0,07 -0,02 3,65 0,00 3,00 0,00 0,00 10,85 

H25 2,91 -8,19 -0,69 -0,22 -0,41 2,80 0,00 0,00 0,00 0,00 17,75 

H26 2,89 -8,71 0,04 -0,13 -0,02 1,64 0,00 0,00 0,00 0,00 12,69 

H27 2,84 -8,79 -1,56 -1,45 -1,00 2,17 0,00 0,00 0,00 0,00 32,24 

H28 2,91 -8,36 -0,94 0,07 -0,26 3,63 0,00 0,00 1,00 0,00 15,28 

H29 2,86 -8,65 0,06 0,00 -0,02 2,53 0,00 0,00 0,00 0,00 11,31 

H30 2,74 -5,88 -2,04 -0,14 -0,26 4,30 0,00 3,00 0,00 0,00 14,74 

H31 2,90 -8,65 -0,94 -0,35 -0,54 2,50 0,00 0,00 0,00 0,00 20,82 

H32 2,96 -8,68 -0,17 0,01 -0,02 3,17 1,00 0,00 0,00 0,00 11,30 

H33 2,81 -8,33 -0,91 -0,03 -0,26 3,50 1,00 0,00 0,00 0,00 16,76 

H34 2,89 -8,16 -0,71 -0,17 -0,41 3,50 0,00 0,00 0,00 0,00 16,92 

H35 2,85 -8,74 -0,58 0,12 -0,02 3,43 0,00 0,00 0,00 1,00 11,03 

H36 2,89 -8,26 -0,77 -0,18 -0,26 1,22 0,00 0,00 0,00 0,00 18,33 

H37 2,90 -8,63 -1,33 -0,39 -0,64 3,76 0,00 0,00 0,00 0,00 22,78 

H38 2,88 -8,31 -0,90 0,14 -0,26 4,09 0,00 0,00 0,00 1,00 15,18 

H39 2,76 -8,37 -0,09 0,28 -0,02 3,18 0,00 0,00 1,00 0,00 11,06 

H40 2,92 -8,32 -0,91 -0,03 -0,26 3,69 1,00 0,00 0,00 0,00 16,47


H41 2,89 -8,26 -0,76 -0,12 -0,26 3,82 0,00 0,00 0,00 0,00 16,58 

H42 2,81 -8,32 -0,90 -0,04 -0,26 3,99 1,00 0,00 0,00 0,00 15,87 

H43 2,79 -8,17 -0,85 -0,29 -0,41 2,97 0,00 0,00 0,00 0,00 18,09 

H44 2,89 -8,34 -0,92 -0,10 -0,26 2,69 1,00 0,00 0,00 0,00 17,26 

H45 2,88 -8,19 -0,84 0,05 -0,26 3,35 0,00 0,00 0,00 0,00 15,04 

H46 2,91 -8,37 -0,96 -0,03 -0,26 3,44 0,00 1,00 0,00 0,00 16,18 

H47 2,90 -8,38 -1,03 0,11 -0,26 4,40 2,00 0,00 0,00 0,00 14,92 

H48 2,89 -8,19 -0,72 0,02 -0,26 3,29 0,00 0,00 0,00 0,00 15,53 

H49 2,81 -8,38 -0,94 -0,10 -0,26 3,13 0,00 1,00 0,00 0,00 16,58 

H50 2,78 -8,21 -0,84 -0,48 -0,67 3,50 0,00 0,00 0,00 0,00 22,32 

H51 2,81 -8,31 -0,90 -0,04 -0,26 3,69 1,00 0,00 0,00 0,00 16,00 

H52 2,90 -8,37 -0,94 0,07 -0,26 3,84 0,00 0,00 1,00 0,00 15,43 

Tabela 3. 

Wyniki analizy wariancji dla zmiennych w modelu i wartości średnich dla każdego skupienia 

zmienna F p 

Średnia 1 

skupienia 

Średnia 2 

skupienia 

Średnia 3 

skupienia 

pIC50 54,35542 0,000000 -0,270097 -0,88282 0,925338 

S 63,76588 0,000000 0,620892 -1,06432 0,685341 

V 69,51182 0,000000 0,586988 -1,07565 0,711052 

logP 38,37724 0,000000 -0,218937 -0,84214 0,865097 

P 68,65278 0,000000 0,231819 -1,03855 0,838763 

HA 1,64278 0,203915 0,340133 0,13447 -0,276852 

HD 21,53544 0,000000 0,868383 0,40995 -0,767399 

Q1 9,25522 0,000389 -0,492178 -0,41918 0,604788 

N-N 3,12496 0,052805 -0,617155 0,31305 -0,004066 

Cl 5,79882 0,005491 -0,371015 -0,37101 0,505929 

PSA% 1,68609 0,195811 -0,455939 -0,02781 0,232531 

Tabela 4. 

Elementy każdego skupienia i ich odległość od środka skupienia 

Elementy skupienia 

1 o działaniu średnim 

odległość 


2 o działaniu 

słabym 

odległość 


3 o działaniu silnym 

odległość 

H3 0,996428 H1 0,826443 H25 0,622601 

H4 0,800506 H2 1,374987 H28 0,508992 

H20 0,636572 H5 0,572766 H30 1,767258 

H21 0,440089 H6 0,484278 H31 0,519840 

H22 0,349281 H7 0,349789 H32 0,973703 

H23 1,401729 H8 0,395729 H33 0,691904 

H24 0,491963 H9 0,579017 H34 0,679353 

H29 0,427278 H10 0,447480 H37 0,593641 

H35 0,591008 H11 1,323457 H38 0,556812 

H39 0,813233 H12 0,320487 H40 0,637294 

H13 0,511137 H41 0,508636 

H14 0,395197 H42 0,575944 

H15 0,462283 H43 0,598260 

H16 0,670163 H44 0,831838 

H17 0,283501 H45 0,448987 

H18 0,390788 H46 0,444526 

H19 0,481683 H47 1,277764 

H26 0,338070 H48 0,351001 

H27 1,531500 H49 0,799258 

H36 0,861703 H50 0,795917 

H51 0,613459 

H52 0,767912 

59


Tabela 5. 

Macierz obserwowanych i przewidywanych klasyfikacji przypadków w grupach z zastosowaniem modelu 

60 

Macierz klasyfikacji Wiersze: obserwowana klasyfikacja Kolumny: Przewidywana klasyfikacja 

Procent poprawnie G_1 G_2 G_3 

G_1 100,0000 10 0 0 

G_2 100,0000 0 20 0 

G_3 100,0000 0 0 22 

Razem 100,0000 10 20 22 


Elżbieta Brzezińska 

Zakład Chemii Analitycznej UM w Łodzi, 

ul. Muszyńskiego 1, 90-151 Łódź, tel. 042-677-92-11; 

ebrzezinska@pharm.am.lodz.pl 


1. Sternbach, L.H. The Benzodiazepines Story. J Med Chem 

1979; 22: 1-7. 

2. Johnson RE. i wsp.: 4,5-Dihydro-3-(methanesulfonamidophenyl)-1-phenyl-1H-2,4-benzodiazepines: 

a novel class III 

antiarrhythmic agents. J Med Chem 1993; 36:3361-70. 

3. Butcher JW. i wsp.: Novel 5-cyclopropyl-1,4-benzodiazepin-2ones 

as potent and selective I(Ks)-blocking class III antiarrhythmic 

agents. Bioorg Med Chem Lett 2003; 13(6): 1165-68. 

4. Seebohm G. i wsp.: Molecular Determinants of KCNQ1 

Channel Block by a Benzodiazepine. Mol Pharmacol 2003; 

64: 70–77. 

5. Shvetsa N. i wsp.: Study of the electronic and structural 

features characteristic of 4,5-dihydro-1-phenyl-1H-2,4- 

6. 

benzodiazepines demonstrating antiarrhythmic activity. J 

Mol Structure (Theochem) 1993; 463: 105–110. 

Gupta S.P. Quantitative Structure-Activity Relationship Studies 

on Cholecystokinin Antagonists. Current Pharm Design, 

2002; 8: 111-124 

7. Ursini A. i wsp.: Synthesis and SAR of new 5-phenyl-3ureido-1,5-benzodiazepines 

as cholecystokinin-B receptor 

antagonists. J Med Chem 2000; 43: 3596-3613 

8. Evans B.E. i wsp.: Design of potent, orally effective non 

peptidal antagonists of the peptide hormone cholecystokinin. 

Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 4918-22. 

9. Kukla MJ. i wsp.: Synthesis and anti-HIV-1 activity of 4,5,6,7tetrahydro-5-methyloimidazo[4,5,1-jk][1,4]benzodiazepin-2- 

(1H)-one (TIBO) derivatives. J Med Chem 1991; 34: 746-751. 

10. Ren J. i wsp.: The structure of HIV-1 reverse transcriptase 

complexed with 9-chloro-TIBO: lessons for inhibitor design. 

Structure 1995; 3: 915-26. 

11. Zhou Z., Madura JD. CoMFA 3D-QSAR Analysis of HIV-1 

RT Nonnucleoside Inhibitors, TIBO Derivatives Based on 

Docking Conformation and Alignment Chem. Inf Comput Sci 

2004; 44: 2167 -2178. 

12. Viroj W. Analysis of binding energy activity of TIBO and HIV 

-RT based on simple consideration for conformational change 

African J Biotech 2007; 6: 188-189. 

13. Gower AJ. i wsp.: Pharmacological evaluation of in vivo tests 

for alpha 2-adrenoceptor blockade in the central nervous system 

and the effects of the enantiomers of mianserin and its aza-analog 

ORG 3770 Arch Int Pharmacodyn Ther 1988; 291: 185-201. 

14. Liebman JM. i wsp.: CGS 7525A, a new, centrally active alpha 

2-adrenoceptor antagonist. Life Sci 1983; 32: 355-63. 

15. Cappelli A. i wsp.: Synthesis, biological evaluation, and quantitative 

receptor docking simulations of 2-[(acylamino)ethyl]-1,4-benzodiazepines 

as novel tifluadom-like ligands with 

high affinity and selectivity for k-opioid receptors. J Med 

Chem 1996; 39: 860–872. 

16. Anzini M. i wsp.: Synthesis, Biological Evaluation, and Receptor 

Docking Simulations of 2-[(Acylamino)ethyl]-1,4benzodiazepines 

as k-Opioid Receptor Agonists Endowed 

with Antinociceptive and Antiamnesic Activity. J Med Chem 

2003; 46: 3853-3864. 

17. Burkard WP. [H3] Tifluadom binding in guinea-pig brain 

membranes. Eur J Pharmacol, 1984; 97: 337–338. 

18. Romer D. i wsp.: Unexpected opioid activity in a known class 

of drug. Life Sciences 1982; 31: 1217-20 

19. Dor A., Krasnowska M. Wpływ pirenzepiny – wybiórczego 

antagonisty receptorów M1, podanej po inhalacji ipratropium, 

na wentylację płuc u chorych na przewleklą obturacujną chorobę 

płuc Alergia Astma Immunologia 2000; 5: 193-196. 

20. Baile CA. i wsp.: Endotoxin-elicited fever and anorexia and 

elfazepam-stimulated feeding in sheep. Physiology and Behaviour 

1981; 27: 271-277. 

21. Van Den Broek GW. i wsp.: Feeding and depression of abomasal 

secretion in sheep elicited by elfazepam and 9-azacannabinol 

Pharmacol Biochem Behav 1979; 11: 51-6 

22. Squires, RF., Saederup E. Clozapine and several other antipsychotic/antidepressant 

drugs preferentially block the same 

core fraction of GABAA receptors. Neurochem Res 1998; 23: 

1283-1290. 

23. Chebib M., Graham A., Johnston A. GABA-Activated Ligand 

Gated Ion Channels: Medicinal Chemistry and Molecular 

Biology. J Med Chem 2000; 43: 8. 

24. Brea J. i wsp.: QF2004B, a potential antipsychotic butyrophenone 

derivative with similar pharmacological properties to 

clozapine Neuropharmacol 2006; 34: 1-12. 

25. Kesäniemi YA., Miettinen TA. Inhibition of cholesterol absorption 

by neomycin, benzodiazepine derivatives and ketoconazole 

Eur J Clin Pharmacol 1991; 40 Suppl1: 65-7. 

26. Breslin HJ. i wsp.: Synthesis and Anti-HIV-1 Activity of 

4,5,6,7-Tetrahydro-5-methyloimidazo[4,5,1-jk][1,4]benzodiazepin-2(1H)-one 

(TIBO) Derivatives. J Med Chem 1995; 

38: 771-793. 

27. Ho W. i wsp.: Synthesis and Anti-HIV-1 Activity of 4,5,6,7- 

Tetrahydro-5-methyloimidazo[4,5,1-jk][1,4]benzodiazepin-2(1H)-one 

(TIBO) Derivatives. J Med Chem 1995; 38: 

794-802. 

28. Breslin HJ. i wsp.: Synthesis and anti-HIV activity of 1,3,4,5tetrahydro-2H-1,4-benzodiazepin-2-one 

(TBO) derivatives. 

Truncated 4,5,6,7-tetrahydro-5-methyloimidazo[4,5,1-jk] 

[1,4]benzodiazepin-2(1H)-one (TIBO) analogues. Bioorg 

Med Chem 1999; 7: 2427-2436. 

29. Brzezińska E. The QSAR analysis of tricyclic non-nucleoside 

inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase. Acta Polon Pharm 

2003; 60: 3-13. 

30. Brzezińska E., Glinka R. Serach for New non-nucleoside inhibitors 

of HIV-1 reverse transcriptase (HIV-1 RT). Acta Polon 

Pharm 2002; 59: 379-392. 

31. Adams D. i wsp.: Preparation and Anti-HIV Activity of N-3 

-Substituted Thymidine Nucleoside Analogs. J Med Chem 

1997; 40: 1550-1558. 

32. Schafer W. i wsp.: Non-nucleoside inhibitors of HIV-1 reverse 

transcriptase: Molecular modeling and X-ray structure investigations. 

J Med Chem 1993; 36: 726-733.


Wstęp 

Badania nad mechanizmem toksycznego działania glikolu 

etylenowego (GE) były dotąd głównie skoncentrowane 

na utlenianiu tego związku przez dehydrogenazy: alkoholową 

(ADH) i aldehydową (ALDH) do aldehydu i kwasu 

glikolowego. Ostatnie doniesienia wskazują, że mechanizm 

toksycznego działania GE może polegać również na tworzeniu 

wolnych rodników i ich łączeniu się z makromoleku- 


Wątrobowy i nerkowy układ monooksygenaz zależnych 

od cytochromu P450: wpływ glikolu etylenowego 

i 4-metylopirazolu 

Andrzej plewka, danuta plewka 1 , grażyna nowaczyk 2 , joanna kowalówka-zawieja 3 , 

barbara zielińska-psuja 3 , tomasz szczepanik 

zakład proteomiki, śląski uniwersytet Medyczny w sosnowcu, 

1 katedra Morfologii, śląski uniwersytet Medyczny w katowicach, 

2 ośrodek badania efektów edukacyjnych, śląski uniwersytet Medyczny w katowicach, 

3 katedra i zakład toksykologii uniwersytetu Medycznego im. k. Marcinkowskiego w poznaniu 

Streszczenie 

Badania nad mechanizmem toksycznego działania glikolu 

etylenowego były dotąd głównie skoncentrowane 

na utlenianiu tego związku przez dehydrogenazę alkoholową 

i aldehydową. Przemiany glikolu etylenowego 

do formaldehydu przebiegają przy współudziale cytochromu 

P450. Początkowo zakładano, że bierze w nich 

udział jedynie izoforma CYP 2E1. W chwili obecnej 

istnieją przesłanki, że w przemiany te są zaangażowane 

inne izoenzymy. W świetle powyższych danych celem 

niniejszego projektu badawczego jest kompleksowa 

ocena przydatności 4-metylopirazolu (4-MP) w postępowaniu 

leczniczym w zatruciach pojedynczych glikolem 

etylenowym. 

Badania zostały przeprowadzone na dojrzałych szczurach 

samcach szczepu Wistar. Glikol etylenowy w dawce 

3830 mg/kg m.c. (1/2 DL 50 ) był podawany per os sondą 

dożołądkową, natomiast 4-MP w dawce 10 mg/kg m.c. 

dootrzewnowo. Materiał do badań (nerki, wątroba) był 

pobierany od zwierząt po 8; 12; 18; 24; 36 i 48 godzin od 

podania ksenobiotyku. W uzyskanych mikrosomach wykonano 

oznaczenia aktywności układu monooksygenaz 

zależnych od cytochromu P450 oraz określono poziom 

izoform 2E1, 1A2 i 2B1/2. 

Uzyskane wyniki wskazują, że 4-MP indukuje poziom 

cytochromu P450, praktycznie nie wpływając na pozostałe 

składniki układu monooksygenazowego zarówno 

w wątrobie jak i w nerce. Co więcej 4-MP indukował 

wszystkie badane izoformy P450. 

słowa kluczowe: CYPP450, szczur, wątroba, nerka, glikol 

etylenowy, 4-metylopirazol 

Abstract 

Until now the researches on the mechanism of the toxic 

influence of the ethylene glycol were mainly concentrated 

on the oxidation of this compound by the alcohol 

and aldehyde dehydrogenases. The changes of the 

ethylene glycol into formaldehyde proceed with the 

participation of the cytochrome P450. At first it was 

assumed that only the CYP2E1 isoform participates in 

them. At present there are premises that other isoenzymes 

are in these changes involved. Considering the 

above-mentioned data, the aim of this research project 

is comprehensive evaluation of the usefulness 4-methylpyrazole 

(4-MP) during treatment in the isolated ethylene 

glycol poisonings. 

The researches were done on mature breed of Wistar 

male rats. Ethylene glycol in dose 3830 mg/kg body 

weight (1/2 DL 50 ) was given per os with a stomach 

probe, whereas 4-MP in dose 10 mg/kg body weight into 

peritoneum. The research material (kidneys, liver) was 

taken from animals 8; 12; 18; 24; 36 and 48 hours after 

giving the xenobiotic. In resulted microsomes there were 

done the markings of the activity of the monooxygenase 

system depending on the cytochrome P450 and there 

was also determined the level of the isoforms 2E1, 1A2 

and 2B1/2. 

The received results indicate that 4-MP induces the level 

of the cytochrome P450, practically not having influence 

on the other ingredients of the monooxygenase system, 

both in the liver and in the kidney. Additionally, 4-MP 

induced all the researched isoforms P450. 

keywords: CYPP450, rat, liver, kidney, ethylene glycol, 

4-methylpyrazole 

łami komórkowymi, a także bezpośrednim cytotoksycznym 

działaniu metabolitów. Tym samym stosowanie w terapii 

zatruć glikolem etylenowym jedynie odtrutek spowalniających 

przemiany GE za pośrednictwem ADH może być niewystarczające. 

Przemiany GE do formaldehydu przebiegają 

również przy współudziale cytochromu P450. Początkowo 

zakładano, że bierze w nich udział jedynie izoforma CY- 

P2E1. W chwili obecnej istnieją przesłanki, że w przemiany 

te są zaangażowane inne izoenzymy jak np. CYP1A2 

61


czy CYP2B1/2. Obecnie w leczeniu zatruć GE stosuje się 

specyficzne odtrutki, jak etanol czy 4-metylopirazol [1]. 

W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych porównawczych 

dotyczących oceny skuteczności i ryzyka stosowania 

obu tych terapii. Ponadto często zatruciu glikolem etylenowym 

towarzyszy spożycie alkoholu etylowego. W takich 

przypadkach zastosowanie 4-metylopirazolu może doprowadzić 

do wystąpienia interakcji pomiędzy ksenobiotykami. 

Wykazano bowiem, że równoczesne podanie etanolu 

i 4-metylopirazolu zdrowym ochotnikom powoduje 

o około 40% obniżenie szybkości eliminacji etanolu i 50% 

obniżenie wydalania 4-metylopirazolu utrzymujące się do 

8 godzin od podania ksenobiotyków [2, 3]. Te wzajemne 

modyfikacje mogą mieć kliniczne implikacje u wielu pacjentów, 

którzy równocześnie spożyli etanol i glikol etylenowy. 

W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych czy 

podobne interakcje mogą zachodzić również po łącznym 

podaniu glikolu etylenowego, etanolu i 4-metylopirazolu. 

Badania ostatnich lat wykazały, że glikol etylenowy może 

być również utleniony do formaldehydu z uwolnieniem nadtlenku 

wodoru. Istotny udział w tej reakcji odgrywa cytochrom 

P450, a zwłaszcza jego izoforma CYP2E1 oraz izoenzymy 

indukowane fenobarbitalem i 3-metylocholantrenem. 

Utlenianie glikolu etylenowego do formaldehydu za pośrednictwem 

cytochromu P450 prowadzi do wytworzenia nadtlenku 

wodoru. Powstające w obecności Fe(II) rodniki ponadtlenkowe 

odpowiedzialne są za wywoływanie stresu oksydacyjnego związanego 

z naruszeniem równowagi pomiędzy procesami generacji 

aktywnych form tlenu i procesami antyoksydacyjnymi. 

W latach 70-tych w doświadczalnym zatruciu glikolem 

etylenowym u zwierząt wykazano skuteczność 

4-metylopirazolu. W 1998 roku 4-metylopirazol został dopuszczony 

w USA do stosowania klinicznego jako specyficzna 

odtrutka w leczeniu zatruć glikolem etylenowym u osób 

powyżej 12. roku życia [4]. 4-Metylopirazol skuteczniej niż 

etanol ogranicza przemiany glikolu etylenowego zachodzące 

za pośrednictwem dehydrogenazy alkoholowej, zarówno 

u zwierząt jak i u ludzi [5, 6]. Ponadto jego działanie inhibicyjne 

utrzymuje się znacznie dłużej stąd też 4-metylopirazol 

zalecany jest w przypadkach ostrych i ciężkich zatruć [6, 7]. 

Glikol etylenowy jest inhibitorem cytochromu P450. 

W biotransformacji glikolu bierze udział wiele izoenzymów 

cytochromu P450. Izoformy CYP2E1 i CYP2B1/2 biorą 

udział w tym metabolizmie w stopniu istotnym. Dane literaturowe 

wskazują, że CYP2E1 efektywnie bierze udział 

w metabolizmie glikolu i sugerują, że glikol ten jest induktorem 

CYP2E1. Wydaje się, że delikatny wpływ stymulujący 

glikol ma także na CYP2B1/2, ale w stosunku do innych 

izoform ma on raczej charakter inhibitorowy. 

W świetle powyższych danych celem niniejszej pracy 

była ocena przydatności 4-metylopirazolu w postępowaniu 

leczniczym w zatruciach pojedynczych glikolem etylenowym. 

Dokonano oceny aktywności enzymów biorących 

udział w metabolizmie glikolu etylenowego. 

Materiały i metody 

Zwierzęta 

Badania przeprowadzono na dojrzałych szczurach samcach 

szczepu Wistar. Każde zwierzę przebywało osobno 

62 

w klatkach plastikowych a hodowla była prowadzona 

w tym samym pomieszczeniu. Grupy liczyły po 5 zwierząt 

dla każdego z punktów czasowych w poszczególnych grupach 

badawczych. W czasie trwania eksperymentu szczury 

były hodowane w standardowych warunkach (21 O C, wilgotność 

55-60%, dzień-noc 12:12 godz.). 

Szczury karmiono paszą standardową (Labofeed), którą 

usuwano na 12 godzin przed zabiciem, pozostawiając wolny 

dostęp do wody. Szczury usypiano za pomocą ketaminy 

podanej domięśniowo w dawce 10 mg/kg m.c. Natychmiast 

pobierano wątroby oraz nerki i umieszczano je w lodowatym 

roztworze soli fizjologicznej. 

Materiał do badań (nerki, wątroba) pobierano od zwierząt 

po 8; 12; 18; 24; 36 i 48 godzin od podania ksenobiotyku. 

Traktowanie 

Glikol etylenowy w dawce 3830 mg/kg m.c. (1/2 

DL 50 ) był podawany per os sondą dożołądkowo, natomiast 

4-metylopirazol w dawce 10 mg/kg m.c. dootrzewnowo 

(jest to standardowa dawka stosowana w terapii). 

Ksenobiotyki były podawane wg następującego schematu: 

- grupa kontrolna 

- zwierzęta otrzymujące glikol etylenowy 

- zwierzęta otrzymujące 4-metylopirazol 

- zwierzęta otrzymujące oba oceniane ksenobiotyki 

Izolacja frakcji mikrosomalnej 

Wątrobową i nerkową frakcję mikrosomalną izolowano 

według metody Dallnera [8]. Po kilkukrotnym przepłukaniu 

w roztworze soli fizjologicznej, wątroby cięto na niewielkie 

skrawki i rozdrabniano w homogenizatorze Pottera-Elvehjema 

z tłokiem teflonowym, przy 400 obrotach na minutę i czterech 

pełnych ruchach tłoka. Środowiskiem homogenizacyjnym był 

0,25 molowy roztwór sacharozy w 10 milimolowym buforze 

Tris-HCl o pH=7,4. Na 1 gram tkanki dodawano 5 cm 3 tego 

roztworu. Ten i kolejne etapy obróbki wątroby prowadzano 

w temperaturze 2-4 0 C. Uzyskany homogenat poddano procesowi 

wirowania różnicowego, w którym kolejno osadzano 

frakcję jądrową (10 min., 900g), mitochondrialną (20 min., 

20000g) i wreszcie mikrosomalną (90 min., 105000g). 

Czyste frakcje mikrosomalne zawieszano w zbuforowanym 

20% o/o roztworze glicerolu tak, aby stężenie białka 

było nie mniejsze niż 5 mg/cm 3 . Próby te natychmiast zamrażano 

w temperaturze -20 0 C. 

Metody oznaczania składników układu cytochromu P450 

W uzyskanych mikrosomach wykonano oznaczenia: 

- stężenia białka metodą Lowry’ego i wsp. [9]. 

- zawartości cytochromów P450 i b 5 - spektrofotometrycznie 

wykonując tzw. widmo różnicowe, metodą Estabrooka 

i Werringloera [10]. 

- aktywności reduktazy NADPH-cytochrom P450 i reduktazy 

NADH-cytochrom b 5 - spektrofotometrycznie metodą 

Hodgesa i Leonarda [11]. 

- analiza ekspresji białek P450 w komórkach wątroby 

i nerek przeprowadzono techniką elekroforetyczną i 

Western blottingu. Analiza ilościowa izoform 2E1, 1A2

Ryc. 1. 

[nM/mg białka] 

1,2 

1 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0 

i 2B1/2 została przeprowadzona na podstawie pomiarów 

densytometrycznych blotów. 

Analiza statystyczna 

Wyniki oznaczeń biochemicznych, które przedstawiono 

w tym opracowaniu są średnią z pięciu niezależnych pomiarów. 

Istotność różnic w poszczególnych seriach, a także 

pomiędzy grupami czasowymi oceniano na podstawie testu 

ANOVA na poziomie p=0.05. 

Wyniki 

Układ monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 

Wątroba 

* 

* 

Cytochrom P450 

8h 12h 18h 24h 36h 48h 

Kontrola Glikol 4-Metylopirazol Glikol+4-Metylopirazol 

Traktowanie glikolem nie zmieniało zawartości cytochromu 

P450 do 18 godziny obserwacji. Począwszy od 

* 

* 


* * * 

Ryc. 1. Stężenie cytochromu P450 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol 

(4-MP) oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G) 

(*) – oznacza zmianę znamiennie statystyczną dla p=0.05 w stosunku do własnej grupy kontrolnej. 

Ryc. 2. 

[ [μM/min/mg 

białka] 

0,14 

0,12 

0,1 

0,08 

0,06 

0,04 

0,02 

0 

Reduktaza NADPH-cytochrom P450 

8h 12h 18h 24h 36h 48h 


* 

* 

* * * 

* 

Ryc. 2. Aktywność reduktazy NADPH-cytochrom P450 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy 

(G), 4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP 

+ G) 


* 

[Czas] 

24 godziny, w której stwierdzono hamowanie do 82% 

kontroli, w kolejnych przedziałach czasu inhibicja pogłębiała 

się, osiągając 66% wartości grupy kontrolnej 

w 48 godzinie (Ryc. 1). Reduktaza współpracująca z cytochromem 

P450 w tym doświadczeniu w pierwszej dobie 

obserwacji wykazywała tendencję do wzrostu swojej 

aktywności, która zmieniała się w utrwaloną stymulację 

sięgająca 125% kontroli w 48 godzinie od zakończenia 

obserwacji (Ryc. 2). 

Od 18 godziny po podaniu glikolu zaczęła spadać zawartość 

cytochromu b 5 . Od 90% wartości grupy kontrolnej do 

około 65% po 48 godzinach obserwacji (Ryc. 3). Glikol nie 

miał natomiast żadnego wpływu na aktywność reduktazy 

współpracującej z cytochromem b 5 (Ryc. 4). 

Traktowanie 4-metylopirazolem doprowadziło po 8 godzinie 

obserwacji do 115% wzrostu zawartości cytochromu 

P450, który rósł do 24 godziny, gdzie osiągał około 125% 

wartości kontroli. Do końca obserwacji wartość ta nie uległa 

zmianie (Ryc. 1). W tych warunkach narażenia, aktywność 

* 

* 

[Czas] 

63


Ryc. 3. 


0,8 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

64 

0 

* 

Cytochrom b5 

8h 12h 18h 24h 36h 48h 


* 

* 

* 

* 

* 

* 

Ryc. 3. Stężenie cytochromu b5 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP) 

oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G) 


Ryc. 4. 

[ [μM/min/mg 

białka] 

0,9 

0,8 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

* 

Reduktaza NADH-cytochrom b5 

8h 12h 18h 24h 36h 48h 


* 

Ryc. 4. Aktywność reduktazy NADH-cytochrom b5 w wątrobie szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 

4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych łącznie, tj. 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G) 


Ryc. 5. 


0,25 

0,2 

0,15 

0,1 

0,05 

0 

* 

* * 

Cytochrom P450 

8h 12h 18h 24h 36h 48h 


* 

* * 

Ryc. 5. Stężenie cytochromu P450 w nerce szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP) 



* 

* 

* * 

* 

* * 

* 

* 

[Czas] 

* 

[Czas] 

* * 

[Czas]

Ryc. 6. 

[ [μM/min/mg 

białka] 

Ryc. 7. 


[ [μM/min/mg 

białka] 

0,06 

0,05 

0,04 

0,03 

0,02 

0,01 

0 

0,16 

0,14 

0,12 

0,1 

0,08 

0,06 

0,04 

0,02 

0 

Ryc. 8. 

0,16 

0,14 

0,12 

0,1 

0,08 

0,06 

0,04 

0,02 

0 

Cytochrom b5 

* * * 

8h 12h 18h 24h 36h 48h 



* * * * * * 

Reduktaza NADH-cytochrom b5 

8h 12h 18h 24h 36h 48h 


Reduktaza NADPH-cytochrom P450 

8h 12h 18h 24h 36h 48h 


* * 

Ryc. 6. Aktywność reduktazy NADPH-cytochrom P450 w nerce szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 



Ryc. 7. Stężenie cytochromu b5 w nerce szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP) 



* 

* 

* * 

* 

* 

* 

* 

* 

* 

* 

* 

* 

* * 

[Czas] 

* 

* 

[Czas] 

* * 

Ryc. 8. Aktywność reduktazy NADH-cytochrom b5 w nerce szczurów narażanych na glikol etylenowy (G), 



[Czas] 

65


reduktazy NADPH-cytochrom P450 przez cały okres obserwacji 

była podobna do wartości grup kontrolnych (Ryc. 2). 

W tej grupie doświadczalnej poziom wątrobowego cytochromu 

b 5 wykazywał tendencję do słabo zaznaczonego 

spadku poniżej wartości kontrolnych (Ryc. 3). Podanie 

4-metylopirazolu miało delikatnie stymulujący wpływ na 

aktywność reduktazy NADH-cytochrom b 5 . Praktycznie 

przez cały czas obserwacji aktywność tej reduktazy oscylowała 

w granicach 120% wartości kontroli (Ryc. 4). 

Równoczesne podanie obu badanych ksenobiotyków 

wykazywało tendencję do ujemnego wpływu na poziom 

wątrobowego cytochromu P450 w całym okresie obserwacji. 

Ujawniono inhibicję na poziomie 90% kontroli (Ryc. 1). 

Reduktaza współpracująca z tym cytochromem przez pierwszą 

dobę od zakończenia eksperymentu nie zmieniała swojej 

aktywności. Po tym czasie aktywność tego enzymu rosła, 

od 120% w 36 godzinie do 135% kontroli po 48 godzinach 

obserwacji (Ryc. 2). 

W warunkach łącznego narażenia obserwowano praktycznie 

brak wpływu badanych ksenobiotyków na oba składniki 

II mikrosomalnego łańcucha transportu elektronów 

(Ryc. 3). Dopiero po pierwszej dobie obserwacji pojawiał 

się subtelny inhibitorowy wpływ ksenobiotyków na poziom 

cytochromu b 5 , który w 36 i 48 godzinie obserwacji wynosił 

około 90% kontroli. Reduktaza NADH-cytochrom b 5 zareagowała 

tendencją do delikatnej stymulacji swojej aktywności, 

sięgającej w pierwszej dobie poziom 110% kontroli. 

W pozostałych fazach obserwacji stwierdzono aktywność 

porównywalna do grup kontrolnych (Ryc. 4). 

66 

Nerka 

Traktowanie glikolem miało negatywny wpływ na zawartość 

cytochromu P450 w całym przedziale obserwacji 

(Ryc. 5). Począwszy od 8 godziny, gdzie stwierdzono hamowanie 

sięgające 88% kontroli, w kolejnych przedziałach 

czasu inhibicja pogłębiała się, osiągając 62% wartości grupy 

kontrolnej w 48 godzinie. Reduktaza współpracująca z cytochromem 

P450 w tej grupie doświadczalnej w pierwszych 

kilkunastu godzinach obserwacji wykazywała tendencję do 

hamowania swojej aktywności (Ryc. 6). Począwszy od 18 

godziny zmieniała się ona w utrwaloną inhibicję sięgającą 

nawet 60% kontroli w 24 godzinie od zakończenia obserwacji. 

W kolejnych przedziałach była ona nieco słabsza. 

Od 24 godziny po podaniu glikolu ujawniono spadek 

zawartość cytochromu b 5 . Wynosił on około 80% wartości 

grupy kontrolnej aż do 48 godziny obserwacji (Ryc. 7). Glikol 

miał podobny wpływ na aktywność reduktazy współpracującej 

z cytochromem b 5 , z tą różnicą, że hamowanie 

aktywności reduktazy miało już miejsce w 18 godzinie. 

Szczurzy narażone na 4-metylopirazol nie zareagowały 

zmianą poziomu białka mikrosomalnego w żadnym z okresów 

obserwacyjnych (Ryc. 8). 

Traktowanie 4-metylopirazolem prowadziło do wzrostu 

zawartości cytochromu P450 do 36 godziny, w której osiągnął 

poziom 140% kontroli (Ryc. 5), utrzymujący się do 48 

godziny obserwacji. W tych warunkach aktywność reduktazy 

NADPH-cytochrom P450 rosła do 24 godziny obserwacji, 

osiągając 140% poziomu grupy kontrolnej. W kolejnej 

grupie czasowej stymulacja ta lekko obniżyła się do 130% 

i utrzymywała się do 48 godziny obserwacji na tym poziomie 

(Ryc. 6). 

W tej grupie doświadczalnej poziom nerkowego cytochromu 

b 5 nie zmienił się w 8 i 12 godzinie obserwacji 

(Ryc. 7). W dwóch kolejnych przedziałach czasowych ujawniono 

słabą stymulację zawartości tego białka, sięgającą 

120% kontroli. Od tego momentu ujawniono brak wpływu 

4-metylopirazolu na poziom omawianej hemoproteiny. Podanie 

4-metylopirazolu stymulowało aktywność reduktazy 

NADH-cytochrom b 5 (Ryc. 8). Od około 110% po 8 godzinach 

po podaniu ksenobiotyku, do ponad 140% kontroli po 

36 godzinach obserwacji. 

Narażenie na równoczesne podanie glikolu etylenowego 

i 4-metylopirazolu miało pozytywny wpływ na poziom 

cytochromu P450 praktycznie w całym okresie obserwacji 

(Ryc. 5). Począwszy od 12 godziny ujawniono stymulację, 

począwszy od 110%, która po 36 godzinach wynosiła 160% 

kontroli. W 48 godzinie obserwacji stymulacja była słabsza 

i wynosiła 140% kontroli. Reduktaza współpracująca z tym 

cytochromem przez pierwszych 18 godzin od zakończenia 

eksperymentu nie zmieniała swojej aktywności (Ryc. 6). Po 

tym czasie aktywność tego enzymu rosła od 115% kontroli 

do 145% w 48 godzinie obserwacji. 

W tej grupie doświadczalnej poziom nerkowegocytochromu 

b 5 nie zmienił się w 8 godzinie obserwacji 

(Ryc. 7). Od tego momentu ujawniono hamowanie sięgające 

nawet 70% kontroli, które nie zanikało do końca obserwacji. 

Podanie 4-metylopirazolu hamowało aktywność reduktazy 

NADH-cytochrom b 5 . Od 90% po 8 godzinach po podaniu 

4-metylopirazolu, do 70% kontroli po 24 i 36 godzinach obserwacji 

(Ryc. 8). 

Izoformy cytochromu P450 

Wątroba 

Stymulujący wpływ glikolu etylenowego na CYP2E1 

obserwowano we wszystkich badanych przedziałach czasowych, 

jednak jego maksimum ujawniono w 24 godzinie, 

gdzie stanowiło ono 245% kontroli (Tab. I). Izoforma 

CYP2B1/2 po 8 godzinach od zakończenia eksperymentu 

miała poziom grupy kontrolnej, ale wartość ta narastała 

w kolejnych przedziałach czasu (Tab. II). W 36 godzinie 

osiągnęła 175% poziomu grupy kontrolnej, po czym poziom 

ten zaczął opadać. Poziom CYP1A2 do 24 godziny 

po zakończeniu eksperymentu był taki jak w grupie kontrolnej, 

ale w dwóch ostatnich przedziałach obserwacji wynosił 

130% kontroli (Tab. III). 

W wątrobie 4-metylopirazol stymulująco wpływał na 

CYP2E1. Po 8 godzinach od zakończenia eksperymentu był 

on znacząco wyższy niż w kontroli, i wynosił 180% wartości 

grupy kontrolnej (Tab. I). Indukcja tej izoformy narastała w 

kolejnych przedziałach czasu, osiągając wartość maksymalną 

w 36 godzinie, gdzie stwierdzono 340% wzrost poziomu 

tego białka w stosunku do kontroli. Dopiero po dwóch dobach 

ujawniono lekki spadek zawartości tej izoformy, jednak 

wynosił on nadal jeszcze 305% kontroli. 

W przypadku izoformy CYP2B1/2 obserwowano podobny 

przebieg zmian stężenia, jednak stymulacja tego białka 

przez 4-metylopirazol była słabsza (Tab. II). Tym razem

wzrost zawartości izoformy narastał do 24 godziny gdzie 

pojawiała się 150% indukcja CYP2B1/2, a która utrzymywała 

się na nieco niższym poziomie w kolejnych godzinach 

obserwacji. W 48 godzinie stymulacja wynosiła jeszcze 

205% kontroli. 

4-Metylopirazol nieznacznie podwyższał poziom izoformy 

CYP1A2 (Tab. III). Zmiana ta była obserwowana 

dopiero w 12 godzinie od zakończenia doświadczenia, kiedy 

obserwowano wówczas indukcję wynoszącą 125% kontroli. 

Tylko po upływie pierwszej doby obserwowano nieco 

wyższy jej poziom, kiedy stymulacja tej izoformy osiągnęła 

140% kontroli. 

Łączne narażenie szczurów na 4-metylopirazol i glikol 

etylenowy miało stymulujący wpływ na CYP2E1 po zakończeniu 

eksperymentu. Już po 8 godzinach poziom tej 

izoformy był już wyższy niż w kontroli, bowiem osiągał 

wartość 115% (Tab. I). W kolejnych godzinach obserwacji 

stymulacja narastała, osiągając poziom 185% kontroli po 36 

godzinach, po czym stężenie tej izoformy lekko obniżało 

swój poziom. W ostatniej fazie obserwacji stężenie CYP2E1 

osiągało jeszcze 155% kontroli. 


Tabela. I. Poziomy CYP2E1 w wątrobie i nerce szczura narażanych na glikol etylenowy (G), 4-metylopirazol (4-MP) oraz traktowanych 

łącznie 4-metylopirazolem i glikolem etylenowym (4-MP + G) 

Czas od 

Wątroba Nerka 

zakończenia 

narażania 

G 4-MP 4-MP + G G 4-MP 4-MP + G 

8 105 180* 115 100 115 100 

12 165* 210* 130 95 130* 120 

18 220* 270* 165* 115 130 125 

24 245* 310* 170* 135* 135* 135* 

36 230* 340* 185* 125 115 135* 

48 225* 305* 155* 125 110 125* 

Przedstawione dane oznaczają procentową zmianę stężenia izoformy cytochromu P450 odniesionej do własnej grupy kontrolnej. 

* - Zmiana znamienna statystycznie dla p


12 godzinach od zakończeniu eksperymentu miała poziom 

grupy kontrolnej (Tab. II). Narastał on powoli w kolejnych 

przedziałach czasu. W 36 godzinie przekroczył 130% poziomu 

grupy kontrolnej i pozostał na tym poziomie do końca 

obserwacji. Poziom CYP1A2 do 48 godziny od zakończenia 

eksperymentu był nieco niższy niż w grupie kontrolnej (Tab. 

III). 

4-Metylopirazol stymulował CYP2E1 w nerce. Jednak 

wyraźnie wyższy poziom tej izoformy obserwowano 

dopiero po 12 godzinach od zakończenia eksperymentu 

był on wyższy niż w grupie kontrolnej i wynosił 130% 

(Tab. I). Poziom tej izoformy utrzymywał się w kolejnych 

okresach czasowych, i dopiero w 36 godzinie stwierdzono 

spadek poziomu tego białka do poziomu około 115% kontroli. 

Utrzymywał się on na tym samym poziomie, aż do 

końca obserwacji. 

Nieco podobny przebieg zmian obserwowano w przypadku 

CYP2B1/2, jednak w tym przypadku stymulacja tej 

izoformy była silniejsza (Tab. II). Ujawniono ją już w 8 godzinie, 

gdzie wynosiła 130% kontroli. Narastała następnie 

systematycznie aż do końca obserwacji, gdzie ujawniono 

poziom tego CYP-u przekraczający 250% kontroli w 48 godzinie. 

4-Metylopirazol praktycznie nie zmieniał poziomu izoformy 

CYP1A2 w 8 godzinie obserwacji (Tab. III). Po tym 

czasie nastąpiła skokowa zmiana stężenia tej izoformy, 

która utrzymywała stabilny poziom aż do zakończenia doświadczenia. 

Obserwowano wówczas indukcję wynoszącą 

około 150% kontroli. 

Łączne narażenie na oba ksenobiotyki nie indukowało 

CYP2E1 po 8 godzinach od zakończenia eksperymentu 

(Tab. I). Jednak w pozostałych okresach obserwacji stwierdzono 

około 130% wzrost stężenia tej izoformy. 

Analogicznie zachowywała się izoforma CYP2B1/2 

w pierwszej dobie obserwacji (Tab. II). W dwóch kolejnych 

przedziałach czasowych obserwowano stosunkowo wyraźną 

stymulację. Wynosiła ona nieco ponad 150% kontroli. 

CYP1A2 nie zareagował na łączne podanie badanych 

ksenobiotyków przez dwie pierwsze fazy obserwacji (Tab. 

III). Począwszy od 18 godziny ujawniono 135% stymulację 

CYP1A2, która utrzymywała się aż do końca obserwacji. 

Dyskusja 

4-Metylopirazol, znany inhibitor ADH, został wdrożony 

do badań nad wpływem alkoholu etylowego u ludzi we 

wczesnych latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku. Od 

tamtej pory pokaźna ilość badań in vitro oraz eksperymentalnych 

badań na zwierzętach wykazała, że 4-metylopirazol 

jest wartościowym narzędziem w wyjaśnianiu roli ADH 

i metabolicznych konsekwencji eliminacji etanolu. 

Jednak tylko kilka badań in vivo było prowadzonych 

na ludziach. 4-Metylopirazol ostatnio został zaaprobowany 

przez Ministerstwo Żywności i Leków USA i jest w chwili 

obecnej w użyciu klinicznym jako antidotum na zatrucie 

glikolem [12]. Może jednak być z powodzeniem stosowany 

do leczeniu zatruć metanolem. 

Glikol etylenowy jest rozpuszczalnikiem organicznym 

używanym w przemyśle, oraz składnikiem wielu płynów 

użytkowych. Metabolizm tego alkoholu gra kluczową rolę 

68 

w hepatotoksycznym wpływie tej substancji. Izoenzymy 

cytochromu P450 są kluczowymi enzymami w pierwszym 

etapie metabolizmu glikolu etylenowego, co ma znaczenie 

w hepatotoksyczności tego związku. Glikol etylenowy jest 

inhibitorem ogólnego poziomu cytochromu P450. Nasze 

badania nie potwierdziły wyników uzyskanych przez Imazu 

i wsp. [4, 7], którzy obserwowali zwiększoną zawartość 

cytochromu P450 o około 15% bez wpływu na aktywność 

reduktazy współpracującej z tym cytochromem. W przypadku 

II mikrosomalnego łańcucha transportu elektronów ich 

wyniki były zbieżne z naszymi. Wykazano, że zwiększona 

biotransformacja glikolu koreluje ze wzrostem poziomu wątrobowego 

cytochromu P450. 

Dane literaturowe sugerują, że glikol etylenowy jest induktorem 

CYP2E1, ale nie do końca wiemy, jaki jest ostateczny 

wpływ tego alkoholu na inne izoenzymy cytochromu 

P450. Wydaje się, że glikol etylenowy ma także słabo wyrażony 

wpływ stymulujący na CYP2B1/2, ale w stosunku 

do innych izoform ma on raczej charakter inhibitorowy. 

W naszych badaniach wykazaliśmy, że CYP2E1 istotnie 

zwiększał swój poziom po traktowaniu z glikolem etylenowym. 

Indukcja CYP2E1 przez glikol wydaje się być istotną, 

ponieważ ta izoforma odgrywa znaczącą rolę w utlenianiu 

glikolu do formaldehydu. Zwiększa również produkcję nadtlenku 

wodoru oraz syntezę ponadtlenków, w której uczestniczy 

NADH i NADPH. 

Co więcej, stwierdziliśmy, że CYP1A2 nie obniżał swojego 

poziomu. Obie te informacje należy powiązać ze wzrostem 

ogólnego stężenia cytochromu P450, co stawia wyniki 

naszej pracy w grupie doniesień rzucających nowe spojrzenie 

na opisywany problem. Wynika to między innymi z tego, że 

ujawniliśmy również indukcję izoformy 2B1/2, oraz że jak 

wynika z danych literaturowych inna izoforma konstytucyjna, 

tj. CYP2C11 też ulega indukcji w tych warunkach. Na 

podstawie innych danych literaturowych wiadomo, że inne 

izoformy P450 nie są zaangażowane w metabolizm glikolu 

etylenowego, lub ich udział jest znikomy [13]. Możemy 

więc wnosić, że zastosowana dawka glikolu etylenowego 

wydaje się być pozbawiona efektu hepatotoksycznego. Ta 

toksyczność pojawia się tylko po podaniu dawki, która nie 

może ulec detoksykacji [13, 14, 15]. Stabilny poziom cytochromu 

P450 i aktywność reduktazy NADPH-cytochrom 

P450 przez co najmniej 48 godzin od podania ksenobiotyku 

pośrednio świadczą o braku zmian degeneracyjnych w zraziku 

wątrobowym. 

Indukowany przez glikol etylenowy wzrost aktywności 

reduktazy NADPH-cytochrom P450 obserwowany przez 

nas nie był dotychczas odnotowany. Np. Schenkman i wsp. 

[16] obserwowali hamowanie wielu aktywności monooksygenazowych 

oraz wspomnianej reduktazy u królików 

traktowanych glikolem. Wyższe dawki glikolu używane 

w naszych badaniach mogą zwiększać metabolizm glikolu 

do formaldehydu. Ten proces wymaga NADPH. Jest prawdopodobne, 

że hamowanie reduktazy NADPH-cytochrom 

P450 wynikało stąd, że NADPH był wykorzystywany 

w biotransformacji glikolu. 

Badania niniejsze skupiły się na udziale układu monooksygenaz 

zależnych od cytochromu P450 u szczurów traktowanych 

między innymi glikolem. Należy pamiętać, ze 

ksenobiotyki te również wpływają na nerkowy układ mono-

oksygenaz zależnych od cytochromu P450 (MFO). Metabolity 

pośrednie wytwarzane przez nerkowy cytochrom P450 

mogą modyfikować aktywność wątrobowego układu MFO, 

komplikując w ten sposób badania procesów intoksykacji 

i detoksykacji przebiegających w organizmach traktowanych 

ksenobiotykami. 

Znamiennym według nas jest wzrost poziomu nerkowego 

cytochromu P450 w grupie zwierząt narażonej równocześnie 

na 4-metylopirazol, podczas gdy w tym samym czasie 

aktywność reduktazy NADPH-cytochrom P450 również 

rosła. Prawdopodobnie jest to niezbędne dla zachowania 

optymalnej aktywności wątrobowego układu monooksygenaz 

zależnych od cytochromu P450 w sytuacji krytycznej. 

4-MP, inhibitor dehydrogenazy alkoholowej, jest nowym 

antidotum stosowanym w przypadkach zatrucia glikolem 

etylenowym. Zatrucie glikolem leczy się wykonując 

płukanie żołądka zaraz po jego spożyciu, alkalizację, oraz 

podając etanol. W leczeniu etanolem największą trudność 

sprawia utrzymanie jego stężenia we krwi w zakresie od 

1 do 2 g/dm 3 przez częste modyfikowanie dawki oraz fakt, 

że etanol może prowadzić do zahamowania czynności 

ośrodkowego układu nerwowego, zwłaszcza u dzieci. 

Terapią alternatywną jest podanie 4-metylpyrazolu, który 

jest konkurencyjnym inhibitorem dehydrogenazy alkoholowej. 

W krajach Europy zachodniej zatrucia glikolem są 

rzadkością. Np. we Francji w ostatnich latach odnotowano 

pięć przypadków zastosowania 4-MP u osób dorosłych zatrutych 

glikolem etylenowym. Pacjenci byli przyjęci wcześnie, 

zanim rozwinęła się niewydolność nerek, co pozwoliło 

na wydalenie przez nerki niezmienionego glikolu etylenowego 

[17]. Odnotowano niewielkie działania uboczne 4-MP 

oraz fakt, iż terapia 4-MP była łatwiejsza w dawkowaniu. 

Skuteczność leczenia 4MP była potwierdzona poprzez szybkie 

wyrównanie kwasicy metabolicznej bez alkalizacji i wydłużenia 

czasu półtrwania glikolu etylenowego. Nie zaobserwowano 

skutków ubocznych działania 4-MP. 

W wątrobie pomimo podwyższonego poziomu cytochromu 

P450 w grupie z 4-metylopirazolem ujawniliśmy praktycznie 

kontrolne poziomy aktywności reduktazy NADPHcytochrom 

P450. Mechanizm, poprzez który 4-metylopirazol 

podwyższa stężenie cytochromu P450, może być tylko spekulowany. 

Być może wynika to ze zwiększenia płynności 

błon cytoplazmatycznych. 4-metylopirazol wzmaga procesy 

β-oksydacji nasyconych kwasów tłuszczowych w mitochondriach. 

Rosnąca aktywność obu badanych reduktaz może 

być tego pośrednim dowodem. 

W podjętych przez nas badaniach istotne było stwierdzenie, 

że podanie 4-MP szczurom obciążonych glikolem 

etylenowym podwyższa poziom CYP2E1 - głównego izoenzymu 

indukowanego przez alkohole. Obserwacja ta częściowo 

obejmuje także izoformę CYP1A2 i CYP2B1/2. Ten 

pozytywny wpływ 4-MP ujawniono także przy ocenie ogólnej 

poziomu cytochromu P450. Efektu takiego nie uzyskano 

w przypadku drugiego badanego cytochromu. 

Możemy sądzić, że 4-MP może łagodzić uszkodzenie wątroby 

wywołane glikolem. Nie jest to raczej wpływ poprzez 

modyfikowanie istotnych CYP-ów, tj. CYP2E1, CYP2B1/2 

i CYP1A1/2. Gra tu zapewne rolę skomplikowany mechanizm 

oparty na ochronie komórkowego GSH [18]. 

Pomimo utrzymującego się podwyższonego poziomu 


cytochromu P450 w grupie z 4-MP ujawniliśmy stabilne 

poziomy aktywności reduktazy NADPH-cytochrom P450. 

Równocześnie oba składniki II mikrosomalnego łańcucha 

transportu elektronów były lekko stymulowane przez 

4-MP. Sugerujemy, że przy tej dawce 4-MP nie pojawia 

się zaawansowana peroksydacja lipidów, powiązana z mechanizmem 

indukowanego glikolem uszkodzenia wątroby. 

Ochronny wpływ GSH w tym przypadku jest według nas 

wystarczający. 

Wydaje się zatem, że w przypadku potwierdzenia zatrucia 

glikolem etylenowym przy zachowanej funkcji nerek, 

podanie 4-MP wydaje się być lekiem z wyboru. 

Wnioski 

1. Główny składnik układu monooksygenazowego, 

tj. cytochrom P450 wykazywał stały poziom stężenia 

przez cały okres badania (bez narażenia). Etanol 

wywoływał wzrost zawartości cytochromu P450 

we wszystkich badanych przedziałach czasowych, 

podczas glikol etylenowy zmniejszał stężenie tego 

białka. Jednocześnie podany etanol i glikol etylenowy 

również powodowały zmniejszenie stężenia cytochromu 

P450, lecz w mniejszym stopniu niż sam 

glikol etylenowy. Podanie 4-metylopirazolu niweluje 

inhibicyjne działanie badanego glikolu. Łączne podanie 

trzech badanych ksenobiotyków prowadzi do 

wyraźnej indukcji tej hemoproteiny. 

2. Aktywność enzymu współpracującego z cytochromem 

P450 tj. reduktazy NADPH-cytochrom P450 

nie korelowała z rytmem zmian zawartości powyższej 

hemoproteiny. Aktywność tej reduktazy zwiększała 

się po podaniu etanolu, ale była hamowana 

przez glikol etylenowy i w większym stopniu przez 

połączenie etanolu i glikolu etylenowego. Aktywność 

tej reduktazy zwiększyła się przy jednoczesnym 

podaniu glikolu etylenowego i 4-metylopirazolu, ale 

w obecności podanego jeszcze etanolu wzrost aktywności 

enzymu był tłumiony. 

3. Składniki II mikrosomalnego łańcucha transportu 

elektronów tj. cytochrom b 5 i reduktaza NADH-cytochrom 

b 5 zmieniały swoje parametry po podaniu 

glikolu podobnie jak w przypadku składników 

I mikrosomalnego łańcucha. Stosowane ksenobiotyki 

obniżały zawartość cytochromu b 5 oraz aktywność 

reduktazy współpracującej z tym białkiem 

we wszystkich przedziałach czasowych. Największy 

wpływ inhibicyjny miał sam glikol etylenowy, 

a w połączeniu z etanolem słabszy. Traktowanie samym 

4-metylopirazolem nie wykazało w tym przypadku 

jego indukcyjnego wpływu na cytochrom b 5 . 

Suplementacja obu ksenobiotyków wykazała ponownie, 

że 4-metylopirazol zmniejsza inhibicyjne 

działanie glikolu etylenowego. 

4. Badania poziomu wybranych izoform cytochromu 

P450 wykazały, indukcję izoformy 2E1 oraz 2B1/2 

zarówno po podaniu samego 4-metylopirazolu oraz 

łącznie z glikolem, co może być przyczyną wystąpienia 

działań niepożądanych podczas stosowania 

4-metylopirazolu w terapii zatruć glikolem etyleno- 

69


70 

wym. Izoforma CYP2B1/2 przy narażeniu na glikol 

etylenowy nieznacznie narastała do 48 godziny, 

a w połączeniu z etanolem przyrost tej izoformy był 

już znaczny. W przypadku CYP2E1 glikol etylenowy 

powodował podobny wzrost jak dla powyższej 

izoformy. Poziom izoenzymu 1A2 uległ nieznacznemu 

wzrostowi. Narażenie na trzy badane ksenobiotyki 

było w swoim oddziaływaniu na badane 

izoformy nieco słabsze niż w grupie z glikolem 

i 4-metylopirazolem. 


1. Sarkola T., Eriksson C.J.P.: Effect of 4-methylpyrazole 

on endogenous plasma ethanol and methanol levels in 

humans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 2001; 25: 513-516. 

2. Bradley K.: Fomepizole - a new antidote for the treatment 

of ethylene glycol poisoning. J. Pharm. Soc. Winconsin 

1998; 9/10: 39-45. 

3. Jacobsen D., McMartin K.E.: 4-Methylpyrazole – present 

status. J. Toxicol. Clin. Toxicol. 1996; 34: 379-381. 

4. Boyer E.W. i wsp.: Severe ethylene glycol ingestion 

treated without hemodialysis. Pediatrics 2001; 107: 

172-173. 

5. Barceloux D.G. i wsp.: American Academy of Clinical 

Toxicology Practice Guidelines on the Treatment 

of Ethylene Glycol Poisoning. Clin. Toxicol. 1999; 37: 

537-560. 

6. Baud F.J. i wsp.: Treatment of ethylene glycol poisoning 

with intravenous 4-methylpyrazole. N. Engl. J. Med. 

1988; 319: 97-100. 

7. Sarkola T. i wsp.: Ethanol, acetaldehyde, acetate, and 

lactate levels after alcohol intake in white men and women: 

Effect of 4-methylpyrazole. Alcohol. Clin. Exp. 

Res. 2002; 26: 239–245. 

Adres do korespondencji 

Dr hab. Andrzej Plewka 

adres: Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny, 

41-200 Sosnowiec, ul. Ostrogórska 30 

telefon: 32-364-14-30 

e-mail: aplewka@sum.edu.pl 

8. Dallner G.: Isolation of rough and smooth microsomes - 

general. Methods Enzymol. 1974; 32: 191-215. 

9. Lowry O.H. i wsp.: Protein measurement with the Folin 

phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275. 

10. Estabrook R.W., Werringloer J.: The measurement of 

difference spectra: application to the cytochromes of microsomes. 

Methods Enzymol. 1978; 52: 212-220. 

11. Hodges T.K., Leonard R.T.: Purification of a plasma 

membrane-bound adenosine triphosphatase from plant 

roots. Methods Enzymol. 1974; 32: 392-406. 

12. Brent J. i wsp.: Fomepizole for the treatment of ethylene 

glycol poisoning. New Engl. J. Med. 1999; 340: 

832-838. 

13. Cai H., Guengerich F.P.: Reaction of trichloroethylene 

and trichloroethylene oxide with cytochrome P450 enzymes: 

Inactivation and sites of modification. Chem. Res. 

Toxicol. 2001; 14: 451-458. 

14. Nakahama T. i wsp.: Comparative study on the mode of 

action of chlorinated ethylenes on the expression of rat 

CYP forms. J. Health Sci. 2001; 47: 278-287. 

15. Nakahama T., Saturani S., Inouye Y.: Effects of chlorinated 

ethylenes on expression of rat CYP forms: Comparative 

study on correlation between biological activities 

and chemical structures. J. Health Sci. 2000; 46: 

251-258. 

16. Voznesensky A.I., Schenkman J.B.: Inhibition of cytochrome-P450 

reductase by polyols has an electrostatic 

nature. Eur. J. Biochem. 1992; 210: 741-746. 

17. Harry P. i wsp.: Ethylene glycol poisoning in a child 

treated with 4-methylpyrazole. Pediatrics 1998; 102: 

E31-E33. 

18. Vendemiale G. i wsp.: Effect of acetaminophen administration 

on hepatic glutathione compartmentation and 

mitochondrial energy metabolism in the rat. Biochem. 

Pharmacol. 1996; 52: 1147-1154.

Regulamin redagowania prac 

w „Farmaceutycznym Przeglądzie Naukowym” 

1. FPN zamieszcza prace oryginalne doświadczalne , kliniczne 

i poglądowe, z zakresu nauk farmaceutycznych, 

medycznych i nauk pokrewnych. 

2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy 

przesyłać w formie elektronicznej na adres: fpn@ 

kwiecinski.pl (w wyjątkowych przypadkach na dyskietce 

3,5” lub dysku CD-ROM) oraz – w jednym egzemplarzu 

wydruku komputerowego (z tabelami, wykresami 

i rycinami) na adres Redakcji. 

Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko pierwszego 

autora i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny 

tworzyć osobne zbiory. Nie należy umieszczać rycin i 

fotografii w plikach tekstowych. Redakcja zaleca użycie 

edytorów tekstów: Star Office, Word, Word Perfect. 

Preferowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor: CMYK, 

rozdzielczość 300 dpi. 

3. Prace podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych 

każdorazowo przez Redaktora Naczelnego. 

Zachęca się autorów do proponowania nazwisk recenzentów. 

Redakcja zastrzega sobie prawo dokonywania 

poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu 

z autorem). 

4. Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie 

była uprzednio publikowana ani nie została wysłana 

do redakcji innego czasopisma oraz – zgodę Kierownika 

Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie 

publikacji w czasopiśmie. 

5. Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach, 

które są przedmiotem pracy naukowej, opisanej 

w manuskrypcie, muszą mieć akceptację, odpowiednio, 

Komisji Bioetycznej lub Etycznej. 

6. Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji 

redakcji. 

7. Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw 

autorskich do wydrukowanych prac (w tym prawo do 

wydania drukiem, na nośnikach elektronicznych CD 

i innych oraz w Internecie). Dopuszcza się natomiast 

drukowanie streszczeń bez zgody Wydawcy. 

8. Instrukcja dla autorów 

8.1. Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie 

na białym papierze formatu A4, z zachowaniem 

podwójnego odstępu między wierszami oraz 

marginesem 2,5 cm. 

8.2. Strona tytułowa powinna zawierać: tytuł lub stopień 

naukowy, imię i nazwisko (imiona i nazwiska) 

autorów w pełnym brzmieniu, tytuł pracy w języku 

polskim i angielskim, nazwę placówki naukowej, 

oraz tytuł lub stopień naukowy, imię i nazwisko 

kierownika placówki naukowej, skąd pochodzi praca. 

U dołu strony należy podać imię i nazwisko oraz 

adres, telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za 

korespondencję, dotyczącą manuskryptu. 

8.3. Druga strona manuskryptu powinna zawierać 

streszczenie (150-250 słów w języku polskim 

i angielskim), w którym należy podać krótkie 

wprowadzenie, cel badania, podstawowe procedury 

(wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych, 

metody badań), główne wyniki oraz 

wnioski. Pod streszczeniem należy umieścić słowa 

kluczowe w języku polskim i angielskim, zgodnie 

z Medical Subject Headings Index Medicus. 

8.4. Oryginalne prace powinny być podzielone na rozdziały, 

według schematu: wstęp, materiał i metody, 

wyniki badań, dyskusja oraz wnioski. 

8.5. Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności 

cytowania w tekście pracy. Skróty tytułów czasopism 

powinny być zgodne z Index Medicus. Każda 

pozycja – pisana od nowego wiersza, powinna być 

opatrzona numerem oraz zredagowana zgodnie 

z niżej podanym przykładem: 

· czasopismo naukowe: 

Varga J, Abraham D. Systemic sclerosis: a prototypic 

multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117: 

557-67. 

Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać 

nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”. 

Komosińska-Vassev K i wsp.: Graves’ disease-associated 

changes in the serum lysosomal glycosidases activity and 

the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 

331: 97-102. 

· wydawnictwo zbiorowe: 

Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia 

Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie 

PZWL. Warszawa 1994, 59-69. 

· monografia: 

Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław 

2004. 

Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych, 

powinny być oznaczone cyframi arabskimi. 

Liczbę pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach 

oryginalnych do 20 pozycji, w poglądowych do 30 

i w pozostałych do 10. 

8.6. Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe 

i kolorowe) powinny być umieszczone w osobnej 

kopercie, ponumerowane, opatrzone nazwiskiem 

autora i tytułem pracy, z zaznaczeniem „góra”, 

„dół”. Opisy rycin należy podać na oddzielnej 

stronie z numerami ilustracji podanymi cyframi 

arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane, 

należy zaopatrzyć w pisemną zgodę 

Wydawcy na ponowną publikację. 

8.7. Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, 

należy ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć 

tytułami umieszczonymi nad tabelą. Opisy 

tabel należy podać na oddzielnej stronie z numerami 

tabel, podanymi cyframi rzymskimi. 

8.8. Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej 

wynosi 10, pozostałych – 5 stron. 

Adres Redakcji: 

Farmaceutyczny Przegląd Naukowy 

43-300 Bielsko-Biała 

ul. Wiśniowa 25/2 

tel: 033/816 28 99 

e-mail: fpn@kwiecinski.pl


PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH 

Miesięcznik 

WYDAWCA 

ODBIORCA: 

Przegląd NaukowyIndex 

Copernicus 2,51 


Nr rachunku odbiorcy: 

74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 



kwota:....................................................................................... 

wpłacający:.............................................................................. 

................................................................................................. 

................................................................................................. 

ODBIORCA: 

Zamawiam 

FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY 

Nr ............ 

Nr rachunku odbiorcy: 

74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 



kwota:....................................................................................... 

wpłacający:.............................................................................. 

................................................................................................. 

................................................................................................. 

Zamawiam 

FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY 

Nr ............ 

PRENUMERATA 

Prosimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literami 

o dokonanie wpłat na poczcie lub w banku. 

Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu. 

Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeraty 

otrzymająPaństwo po około 2 tygodniach 

od dokonania wpłaty. 

Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeraty 

i Kolportażu: 

Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiego 


TEL. 033 817 38 99 


43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2 

74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 

PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY 


43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2 

74 1050 1070 1000 0090 6083 4158 

PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY

Pokaż cały numer - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?