Graz˙yna Budryn, Ewa Nebesny FENOLOKWASY – ICH WŁAS ...

198 L. Rodzewicz, I. Zawadzka
Nr 2
Dyrektywa Unii Europejskiej 2003/181/WE obowia˛zuja˛ca od 13 marca 2003 r. wprowadziła MRPL
dla CAP na poziomie 0,3 μg/kg dla mie˛sa, jaj, mleka, owoców morza (krewetki, kraby) i miodu (1).
Ws´ród metod instrumentalnych układy GC-ECD, LC-UV, LC-DAD do oznaczania pozostałos´ci CAP
w produktach pochodzenia zwierze˛cego nie spełniaja˛ powyz˙szego warunku, gdyz˙ granice wykrywalnos´ci
podawane przez róz˙nych autorów sa˛ wyz˙sze niz˙ wymagany MRPL (2, 3, 4). Warunek ten spełniaja˛
metody, w których sa˛ stosowane układy GC-MS lub LC-MS. Oprócz tego metody potwierdzaja˛ce
stosowane dla grupy A, do której nalez˙y CAP musza˛ przekazywać informacje na temat struktury
chemicznej analitu.
Porównuja˛c obie techniki oznaczania CAP wykazano, z˙e metody oparte na stosowaniu układu LC-MS
sa˛ prostsze niz˙ GC-MS. W przypadku układu LC-MS moz˙na analizować CAP bez uprzedniego
przeprowadzenia go w jego pochodna˛. Równiez˙ kolumny stosowane w LC znacznie lepiej toleruja˛
zanieczyszczenia niz˙ kolumny kapilarne w GC, których efektywnos´ć gwałtownie spada pod wpływem
zanieczyszczeń. Ponadto metody jonizacji stosowane w LC-MS przy oznaczaniu CAP dla mas powyz˙ej
m/z = 100 nie powoduja˛ interferencji z tła. Dlatego tez˙ metody w których znalazły zastosowanie układy
LC-MS okazały sie˛ najbardziej efektywne do identyfikacji i oznaczania ilos´ciowego CAP w produktach
pochodzenia zwierze˛cego (2, 5, 6, 7).
Dyrektywa 2002/657/WE z dnia 14 sierpnia 2002 r. wprowadza parametry wykonawcze jakie musi
spełniać metoda potwierdzaja˛ca ilos´ciowa. Oprócz takich parametrów jak: specyficznos´ć, selektywnos´ć,
liniowos´ć, powtarzalnos´ć, odtwarzalnos´ć wewna˛trzlaboratoryjna, opornos´ć (na niewielkie zmiany metody),
wprowadza dwa nowe parametry: limit decyzyjny wartos´ci granicznej (CCα) oraz zdolnos´ci
wykrywania (CCβ) (8).
CCα jest to ste˛z˙enie analitu w próbce przy i powyz˙ej którego wynik analizy uznawany jest za
niezgodny z prawdopodobieństwem 1 – α. Bła˛d α jest to prawdopodobieństwo uznania próbki za
fałszywie dodatnia˛ i wynosi on dla CAP (grupa A) 1%. CCβ jest to najniz˙sze ste˛z˙enie analitu, które
moz˙e być wykryte, zidentyfikowane i oznaczone w próbce z prawdopodobieństwem 1 – β. Bła˛d β jest to
prawdopodobieństwo uznania próbki za fałszywie ujemna˛ i wynosi on dla CAP 5%. Oba te parametry
słuz˙a˛ do jednoznacznej interpretacji wyników analiz pozostałos´ci chemicznych w z˙ywnos´ci pochodzenia
zwierze˛cego. Parametry te wyznacza sie˛ na podstawie krzywej kalibracji zgodnie z PN-ISO 11843-2 (9).
Wartos´ci CCα iCCβ rozstrzygaja˛ ze znanym prawdopodobieństwem czy w próbce znajduje sie˛
oznaczany CAP, czy nie lub czy jego wartos´ć przekracza wartos´ć graniczna˛. Dla potwierdzaja˛cej metody
ilos´ciowej oznaczania CAP wyniki sa˛ zgodne jez˙eli sa˛ poniz˙ej wartos´ci CCα wyznaczonej dla
poszczególnych matryc. Przy metodzie przesiewowej potwierdzaja˛cej wyniki sa˛ zgodne jes´li zawarte sa˛
poniz˙ej wartos´ci CCβ. Wyniki powyz˙ej CCβ wymagaja˛ potwierdzenia.
Przygotowanie prób e k d o a n a l i z y. Procedura przygotowania próbek do MS jest
podobna jak do LC. Klasyczna metoda polega na ekstrakcji wste˛pnej, czyli izolacji CAP z badanego
materiału, usunie˛ciu lipidów, oczyszczaniu i zate˛z˙aniu otrzymanego ekstraktu. Najcze˛s´ciej stosowana˛
metoda˛ ekstrakcji wste˛pnej CAP z tkanki mie˛s´niowej zwierza˛t jest homogenizacja próbki w obecnos´ci
rozpuszczalników lub buforów po czym naste˛puje oddzielenie cze˛s´ci stałych od roztworu w procesie
wirowania. Do ekstrakcji CAP z próbek stosowano najcze˛s´ciej octan etylu, acetonitryl, metanol oraz
bufory fosforanowy i octanowy. Mało jest prac, w których porównywano odzyski CAP w zalez˙nos´ci od
stosowanych do ekstrakcji rozpuszczalników. Przy zastosowaniu octanu etylu, acetonitrylu, metanolu do
ekstrakcji z tkanki mie˛s´niowej ryb otrzymano odzysk odpowiednio ok. 90, 80 i 75% ze wzgle˛dnym
odchyleniem standardowym wynosza˛cym mniej niz˙ 10%. W celu usunie˛cie lipidów stosowano heksan.
Oczyszczanie prowadzono przewaz˙nie technika˛ SPE przy zastosowaniu kolumienek wypełnionych faza˛
chemicznie zwia˛zana˛ odwrócona˛ oktadecyl C-18 oraz faza˛ adsorpcyjna˛ z˙el krzemionkowy, tlenek glinu.
Przy zastosowaniu kolumienek wypełnionych C-18 do analizy CAP w tkance ryb otrzymano odzysk ok.
90%, z˙elem krzemionkowym oraz tlenkiem glinu ok. 80% ze wzgle˛dnym odchyleniem standardowym
wynosza˛cym mniej niz˙ 5% (10). W niektórych przypadkach autorzy metod pomijali etap oczyszczania
próbki z zastosowaniem kolumienek zaste˛puja˛c ja˛ ekstrakcja˛ ciecz-ciecz (11, 12, 13). Analize˛ próbek
CAP prowadzono w obecnos´ci standardu wewne˛trznego dodanego bezpos´rednio do próbki przed
homogenizacja˛. Jako standard wewne˛trzny stosowano (IS) wzorzec deuterowy d5-CAP lub meta-CAP.
Do analizy w LC-MS stosowano krótkie kolumny chromatograficzne, które spełniały role˛ wste˛pnego
rozdziału próbki. Stosowano przy tym kolumny standardowe o s´rednicy 3 – 5 mm oraz kolumny
mikroborowe o s´rednicy 1 – 2 mm. Kolumny były wypełnione przewaz˙nie faza˛ chemicznie odwrócona˛
C-8 i C-18. Jako faze˛ ruchoma˛ stosowano wode˛, wodne roztwory kwasu mrówkowego oraz buforowy
roztwór octanu amonowego w poła˛czeniu z polarnymi rozpuszczalnikami acetonitrylem lub metanolem.