Rast in kontrola rasti

Rast mikrobne populacije
• rast posamezne celice : rast populacije
• hranila
• fizikalno-kemijski faktorji rasti
• zaprt in odprt način namnoževanja
• merjenje rasti mikrobne populacije
• matematični opis rasti

Rast
Rast je definirana kot povečanje biomase.
Alternativno rast lahko definiramo kot povečanje števila mikrobnih
celic, oziroma povečanje CFU (colony forming units) ali MPN (most
probable number).

Metode za določanje biomase
• štetje (direktno štetje, gojitvene metode)
•optična gostota (OD)
• suha teža, mokra teža
•celični ogljik, celični dušik
• koncentracija proteinov, koncentracija DNA
• s substratom inducirana respiracija
• fumigacijsko- inkubacijska metoda
•določanje ATP

Potrebni in zadostni pogoji za rast
Potrebna je konstantna zaloga vseh virov in ustrezno fizikalno-kemijsko
okolje, ki omogoča biokemijske pretvorbe.
Potrebni mehanizmi:
- mehanizem za vnos snovi in energije
- mehanizem za sintezo in razgradnjo makromolekul
- mehanizem celične delitve
- mehanizem za signaliziranje in regulacijo
- mehanizem za odstranjevanje odpadnih produktov

Makrohranila
C gradnik celičnega materiala, vir elektronov
N sestavina aminokislin in proteinov, sestavina purinov, pirimidinov
in nukleinskih kislin, sestavina mureina in hitina, sestavina lipidov,
kot nitrat je alternativni akceptor elektronov
O sestavina vseh organskih spojin, akceptor elektronov
P sestavina nukleinskih kislin, fosfolipidov, tehoičnih
kislin, energijska rezerva, signalna molekula
S sestavina aminokislin (metionin, cistein, homocistein, cistationin),
vitaminov (tiamin, biotin), koencimov (CoA), rezervna snov,
energijski vir, alternativni akceptor elektronov

Makrohranila
K ozmoregulator, kofaktor
Na encimski aktivator, potreben za sprejem citrata,
transport pri halofilih
Mg sestavina ATP, klorofila, aktivator kinaz
Ca stabilizira celično steno, sestavina endospor, aktivator
kinaz
Fe citohromi, katalaza, peroksidaza, Fe-S proteini,
oksigenaza, nitrogenaza, vir energije, alternativni akceptor
elektronov

Mikrohranila
Co vitamin B12, transkarboksilaza
Cu citohromi, plastocijanin
Mn superoksid dismutaza fotosistem II
Mo nitrogenaza, nitrat reduktaza, sulfit oksidaza, format
dehidrogenaza, oksotransferaze
Ni hidrogenaze, koencim F430, CO dehidrogenaza, ureaza
Se format dehidrogenaza, nekatere hidrogenaze
W format dehidrogenaza, oksotransferaza
V nitrogenaza, peroksidaza
Zn anhidraze, alkohol dehidrogenaza, RNA in DNA polimeraza

Vrste mikrobioloških gojišč
Kemijsko definirana gojišča
vse komponente v gojišču poznamo in jih dodamo v znanih količinah
Kemijsko nedefinirana (kompleksna) gojišča
hranilni bujoni, krvni agar, kvasni ekstrakt, mesni peptoni
Selektivna gojišča
gojišče izberemo tako, da raste samo en mikroorganizmem, medtem ko drugi ne
morejo rasti (npr. manitol + visoka koncentracija soli za Staphylococce)
Diferencialna gojišča
na gojišču raste več različnih vrst organizmov, vendar se morfološko ali fiziološko
med seboj razlikikujejo (npr. MacConkey agar za diferenciacijo entrobakterij)

Viri dušika in žvepla v gojiščih
Razen dušik fiksirajočih bakterij in žveplo asimilirajočih bakterij ostali
mikrobi niso sposobni asimiliacije elementarnega dušika in žvepla.
Viri dušika za večino mikroorganizmov so: NH 4Cl, (NH 4)SO 4, NaNO 3 ali KNO 3.
Dodatno lahko zagotovimo vir dušika s peptonom ali drugimi proteinskimi
hidrolizati.
Vir žvepla za večino mikroorganizmov je sulfat. Za tiste, ki sulfata ne morejo
izrabiti so uporabni viri žvepla: H 2S, cistein, metionin ali pa peptoni.

Viri kisika, vodika in CO 2 v gojiščih
Vsi heterotrofi potrebujejo CO 2. Ker se veliko CO 2 reciklira v celici je potreba
po CO 2 majhna. Nekateri mikroorganizmi (npr. Neisseri ali Brucella)
potrebujejo povišane koncentracije CO 2 za svojo rast.
Vsi heterotrofi potrebujejo vir vodika. Vodik nastaja pri metabolizmu
aminokislin, ogljikovih hidratov in z disociacijo vode in se v celici reciklira.
Bakterije, ki rastejo na vodiku potrebujejo H 2 v večjih količinah.
Za biosintetske potrebe celice kisik običajno ni limiten nutrient. Če je kisik v
vlogi terminalnega akceptorja elektronov lahko limitira rast.

Viri mineralnih ionov v gojiščih
Večina mikroorganizmov zahteva dodatek:
Ca 2+ , K + , Na + , Mg 2+ , Mn 2+ , Fe 2+ , PO 4 3- v koncentracijah mg/L
Zn 2+ , Cu 2+ , Co 2+ , Mo 6+ vkoncentracijiµg/L
Bolj zahtevni mikroorganizmi zahtevajo dodatek elementov v
sledovih npr. Ni, Se, W, Al, B. Vir mineralnih ionov je lahko raztopina
soli po Winogradskem in raztopina mikroelementov.

Kelirajoče spojine v gojiščih
Večina divalentnih in trivalentnih metalov tvori netopne hidride, karbonate ali
fosfate. Precipitiranje metalov se poveča z avtoklaviranjem. Zaradi tega lahko
dodajamo gojiščem kelirajoče spojine. V mikrobiologiji uporabljamo:
-EDTA
- NTA (nitrilotriocetna kislina)
- aminokisline (glicin, histidin)
- karboksilne kisline (npr. acetat, citrat, sukcinat, tartrat)
-porfirini (hem)
-siderfori

Vitamini - rastni faktorji
p-aminobenzojska k. prekurzor za folno kislino
folna kislina metabolizem 1C spojin, prenos metilnih spojin
biotin sinteza maščobnih k., β-dekarboksilacija, fiksacija CO 2
kobalamin (B12) sinteza deoksiriboze, prenos 1C spojin
lipoična kislina prenos acilnih spojin
nikotinska kislina elektronski transport z NAD in NADP, dehidrogenacije
pantotejska kislina prekurzor za CoA
riboflavin elektronski transport z FMN, FAD, dehidrogenacije
tiamin (B1) α-dekarboksilacija, transketolaza
vitamin B6 amino in keto kislinske transformacije
vitamin K (quinon) eelektronski transport, sinteza sfingolipidov
hidroksamati vezava Fe 3+

Drugi organski rastni faktorji v gojiščih
Nekatere bakterije potrebujejo poleg vitaminov, aminokislin, purinov in
pirimidinov še dodatne rastne faktorje kot so:
•maščobne kisline (ocetna, propionska, butirat, valeriat, izovaleriat,
izobutirat)
•diaminopimelična kislina
• nepoznani rastni faktorji, ki jih dodamo s serumom, kvasnim ekstraktom,
posnetim mlekom, sadnimi sokovi, paradižnikovim sokom, talnim
ekstraktom in ruminalno tekočino

Mikroorganizmi, ki jih ne znamo gojiti
~ 99 % mikroorganizmov ne znamo gojiti. Mikrobe, ki so živi jih pa ne
znamo gojiti na standardnih laboratorijskih medijih pri običajnih
laboratorijskih pogojih zunaj njihovega naravnega habitata imenujemo
“viable but non-culturable”. Možni razlogi:
• inaktivacija celic z drugimi celicami
• neravnotežje uporabljenih substratov
• indukcija litičnega cikla
• previsoka koncentracija substrata

Fizikalno-kemijsko omejevanje hitrosti rasti
• vsak organizem lahko do neke mere tolerira neugodne pogoje v okolju,
neugodne pogoje lahko preživi tako, da zmanjša hitrost rasti, ustavi rast,
celično diferencira, če je tolerančni prag presežen propade
• poznavanje vpliva okoljskih faktorjev omogoča razumevanje ter razlago
prostorske in časovne biološke raznolikosti v okolju (npr. nastanek ekoloških
niš), obenem omogoča uspešnejšo kontrolo mikrobne aktivnosti

Vpliv redoks potenciala na rast
Redoks potencial je mera za tendenco oddajanja ali sprejemanja elektronov.
Eh
=
E
0
+
RT
nF
[ oksidant][
H
ln
[ reducent]
E h je redoks potencial, E o je redoks potencial pri standardnih pogojih (pH=0, 1M konc.
oksidanta in reducenta, 1bar, 25 o C), R je plinska konstanta, n je število prenešenih
elektronov, F ja Faradejeva konstanta, H + je koncentracija protonov.
Za organizme obstaja optimalni redoks potencial za uporabo elektronskih
akceptorjev:
kisik +400 mV
nitrat/nitrit -100 mV
sulfat -200 mV
CO 2
-300 mV
+
]

Kisik in redoks potencial
V raztopini imamo neto redoks potencial (E o), ki je odvisen od vseh molekul
in njihovih standardnih redoks potencialov. V večini primerov je dominantna
komponenta redoks potenciala kisik.
2.
30RT
RT
= E 0 + log p 2 + 2.
30 log[ H
4F
F
Eh O
p O2 je tenzija raztopljenega kisika
Npr. pri E h -140 mV je v raztopini raztopljenih ~ 10 8 molekul kisika na ml. V primeru,
da imamo ~ 10 8 celic/ml bo v povprečju na celico prišla ena molekula kisika.
+
]

Klasifikacija mikrobov glede na potrebo po O 2
Aerobi
potrebujejio kisik za rast
Fakultativni anaerobi
uporabljajo kisik če je na voljo,
lahko preživijo brez kisika
Mikroaerofili
uporabijo nižje koncentracije kisika
Obligatni anaerobi
kisik je zanje toksičen
aerob mikroaerofil
anaerob aerotoleranten
fakultativni aerob

Kisik in tvorba radikalov
Kisik običajno najdemo v triplet stanju, toksična oblika je singlet, ki
reagira s π vezjo. Nastanek singlet kisika je posledica fotokemijskih reakcij
Kisikove reaktivne zvrsti nastajajo pri dihanju.
O 2 + e - O 2 - · superoksid
O 2 - · + e - + 2H + H 2O 2 vodikov peroksid
H 2O 2 + e - + H + H 2O + OH · hidroksilni radikal
OH · + e - + H + H 20 voda

Pomembnejši kisikovi in dušikovi radikali
Reaktivne kisikove spojine:
superoksid O 2 -·
hidroksil, OH ·
peroksil, RO 2 ·
alkoksil, RO ·
hidroperoksil, HO 2 ·
Reaktivne dušikove spojine:
dušikov oksid, NO ·
dušikov dioksid, NO 2 ·

Poškodbe z radikali
• direktna poškodba peptidne vezi ali stranskih verig (cepitev, povezovanje
stranskih verig)
• posredna poškodba proteina z radikalno aktiviranimi lipidi in sladkorji
• sprememba sekundarne ali terciarne strukture (izguba katalitične
ali strukturne funkcije
• lipidne oksidacije (poškodba membrane)
• DNA poškodbe (cepitev vezi, mutacije)

Odstranjevanje radikalov
Pri dihanju poleg H 2O nastane tudi O 2 -· (~5 %). Aerobi, fakultativni aerobi
in mikroaerofilci morajo posedovati vsaj dva od znanih načinov aktivnega
odstranjevanja toksičnih oblik kisika:
2O 2 - · + 2H + H 2O 2 + O 2 superooksid dismutaza
H 2O 2 + H 2O 2 2H 2O + O 2 katalaza
H 2O 2 + NADH + H + 2H 2O + NAD + peroksidaza
V kolikor organizem nima enega od omenjenih encimov za odstranjevanje
kisika lahko preživi samo v anaerobnih razmerah.

Encimski obrambni mehanizmi pri kvasovki
encim funkcija
Cu/Zn superoksid dismutaza dismutacija superoksidnega aniona
(citoplazma)
Mn superoksid dismutaza dismutacija superoksidnega aniona
(mitohondrij)
katalaza A razgradnjavodikovega peroksida
(peroksisom)
katalaza T razgradnja vodikovega peroksida
citokrom C peroksidaza redukcija vodikovega peroksida
glutation reduktaza redukcija oksidiranega glutationa

Druge obrambne spojine pri kvasovki
spojina funkcija
glutation odstranjevanje prostih radikalov
metalotionini vezava Cu 2+ , odstranjevanje
superoksidnih in hidroksilnih radikalov
tioredoskin redukcija proteinskih disulfidov
poliamini zaščita lipidov

Topnost kisika v raztopini
temperatura cO2 H
( oC) ( mg/L) (mg/L/atm)
25 8.10 38.8
35 6.99 33.4
c O2 = H p g
c O2 = 14.16 - 0.3943T + 0.007714T 2 -
0.0000646T 3
Topnost kisika v tekočini je nizka
(nekaj mg/L). Potrebe po kisiku so
običajno precej večje. Zaradi tega je
potrebno pri aerobni inkubaciji stalno
dovajati kisik. Topnost kisika je
odvisna od parcialnega tlaka kisika
(p g), Henrijeve konstante (H),
temperature (T) in prisotnosti
topljencev v raztopini.

Gojenje anaerobov
• uporaba posod z majhnim razmerjem površina/volumen
• uporaba steklenic z navojem in zamaškom napolnjenih s tekočino
• uporaba poltekočih gojišč (dodatek 0.05 % agarja, manj konvekcije)
• uporaba parafinskega sloja na površini gojišča
• dodatek reducentov v medij
• uporaba večjih inokulumov ( do 10 %)
• inkubacija v anaerobnem okolju (dodatek indikatorja in reducirajočega
sredstva, npr. GasPak)

Gojenje anaerobov in redoks potencijal
Za gojenje anaerobov je potrebno znižati redoks potencial pod -100 mV, za
striktne anaerobe pa pod -300 mV. Za to uporabljamo reducirajoče spojine
(S 2 - , HS ali pa H2S kot aktivno komponento). V mikrobiologiji so uporabni:
• natrijev tioglikolat (E o ’ < -100 mV v koncentraciji 0.05 %)
• cistein HCl (E o ’ < -210 mV v koncentraciji 0.025 %)
•Na 2 S x 9H 2 O (E o ’ < -270 mV v koncentraciji 0.025%)
•FeS(E o ’ < -270 mV v koncentraciji 4 µg/ml)
• ditiotreitol (E o ’ < -330 mV v koncentraciji 0.02 %)
•H 2 (E o ’ < -420 mV)
• titanov citrat (E o ’ < -480 mV v koncentraciji 1-4 mM)

Namnoževanje anaerobnih mikroorganizmov

Vpliv vodne aktivnosti (a w ) na rast mikrobov
V bioloških celicah ima voda štiri osnovne funkcije:
• je kemijski reaktant (hidrolize, kondenzacije)
• je univerzalno topilo za metabolite
• ima mehansko vlogo pri ohranjanju celičnega turgorja
•omogoča strukturo proteinov, DNA, polisaharidom in membranam

Vpliv vodne aktivnosti (a w ) na rast mikrobov
a
w
=
π=
−
p
p
V
w
RT
=
n
p je parcialni tlak vode nad
raztopino s topljencem, p w je
parcialni tlak vode nad čisto
vodo, n w je število molov vode
v raztopini, n s je število molov
topljenca v raztopini.
lnaw
n
π je ozmotski tlak tekočine, R
je plinska konstanta, T je
temperatura, Vje volumen
raztopine, a w je vodna
aktivnost raztopine.
w
w
+ n
s
Voda je nujno potrebna za rast
mikroorganizmov. Vendar prisotnost vode še ne
pomeni, da je voda tudi dostopna. Dostopnost
vode je odvisna od vodne aktivnosti a w.
Npr. zmanjšanje a w iz 0.99 na 0.90 zaradi
spremenjene koncentracije NaCl pomeni zmanjšanje
koncentracije vode v celici za 50 %.

Vodna aktivnost, a w
vodna aktivnost snov mikroorganizem
1.000 destilirana voda Caulobacter, Spirilum
0.995 kri Streptococcus, Escherichia
0.980 morska voda Pseudomonas, Vibrio
0.950 kruh G+ paličke
0.900 sadni sirup G+ koki
0.850 salame Sacharomyces
0.800 marmelada Sacharomyces, Penicilium
0.750 slana jezera Halobacterium, Halococcus
0.700 žita Xeromyces

Adaptacija na nizko vodno aktivnost
Rast pri nizki vodni aktivnosti
omogočajo kompatiblni
topljenci, ki povečajo
koncentracijo snovi znotraj
celic tako, da voda lahko
prihaja v celico. Poznamo več
vrst kompatibilnih topljencev:
glicin, betain, prolin, glutamat,
saharoza, trehaloza, glicerol,
manitol.

Vpliv temperature na rast mikroorganizmov
k=
Ae
logk
−Ea/
RT
k je hitrostna konstanta reakcije, A
je predeksponentni faktor, ki poda
frekvenco trkov med molekulami,
Ea je aktivacijska energija, R je
plinska konstanta, T je
temperatura
= logA−
E
a
2.
30RT
µ je rastna konstanta
Temperaturno območje za rast bakterij je
~ 35 o C.
Temperatura vpliva na hitrost reakcij, vrsto
metabolizma, prehranske potrebe in sestavo
biomase. Hitrost kemijskih reakcij v odvisnosti
od temperature je podana z Arrheniusovo
enačbo.

Hitrost rasti pri različnih mikroorganizmih

Vpliv pH na rast
pH = − log H
pH a
= pK
⎡ +
⎢
⎣
⎤
⎥
⎦
⎛ [ kislina]
⎞
−log⎜
⎟
⎜ ⎟
⎝ [ baza]
⎠
pH vrednost gojišča vpliva na hitrost rasti.
Rast je možna v razponu 2-5 pH enot.
Metabolni produkti so lodvisni od pH.
Večina mikroorganizmov pri nizkem pH
producira nevtralne produkte, pri visokem
pH pa organske kisline. S pH se spreminja
sestava biomase, predvsem celične stene
in celične zunanjosti.

Zgodovinski razvoj gojenja mikroorganizmov
• prvi kompletno definiran medij za Aspergilus; (Raulin, 1869)
• uporaba čistih kultur (Koch, 1870)
• uporaba stresalnikov za gojenje (Kluyver & Perquin, 1930)
• uporaba prvih fermentorjev (v 40 letih 20.stoletja)
• matematični opis rastne kinetike v zaprtem sistemu (1942)
• matematični opis rastne kinetike v kemostatu (1950)
• kontrolirano namnoževanje mikroorganizmov (> 1960)

Načini gojenja mikroorganizmov
Zaprti sistemi gojenja:
Pri teh sistemih ne pride do izmenjave energije in snovi med sistemom in
okolico. Primer zaprtega sistema je šaržni ali “batch” sistem.
Odprti sistemi gojenja:
Pri teh sistemih gojenja prihaja do izmenjave energije in snovi med
sistemom in okolico. Primer odprtega sistema so:
- kemostat sistemi
- kontinuirani šaržni sistemi

Rastne faze
Rastne faze so definirane v zaprtem sistemu gojenja in se nanašajo
na populacijo celic. Posamezna celica lahko raste, ne raste ali
propada.
Ločimo več faz rasti mikrobne populacije:
-lag faza (1)
- faza pospešene rasti (2)
- eksponentna faza (3)
- faza pojemajoče rasti (4)
- stacionarna faza (5)
- faza propada (6)
CFU
1 2
3
4
5
6
čas

Lag faza
Čas od inokulacije do prve delitve celic imenujemo lag faza. V lag fazi
pride do povečanja mase celic. Lag faza je posledica:
• spremembe prehranskega statusa
• spremembe fizikalno kemijskega okolja
• okrevanja celic zaradi toksičnih produktov, ki so se nakopičili v mediju
(npr. kisline, baze, alkoholi, topila).
• sinteze novih encimov
• kalitve spor

Eksponentna faza rasti
Eksponentna faza rasti je faza hitre rasti, ko se biomasa pri vsaki delitvi
podvoji. Generacijski čas je čas, ki je potreben za podvojevanje
biomase.
Običajno vse parametre, ki vplivajo na rast mikroorganizma združimo v
eno konstatno (µ), ki je mera za trenutno hitrost rasti.

Hitrost rasti
dX
= µ X
dt
X je količina biomase, µ je
rastna konstanta, t je čas
rasti biomase
X =
X oe
µ t
X o je količina biomase
(inokuluma) na začetku rasti
mikroorganizma
To je osnovna enačba za rast mikrobne
populacije. V kolikor so vsi pogoji za rast
zadovoljeni potem se v časovnem intervalu dt
število celic poveča proporcionalno s številom
celic X.
Povečanje celic je konstantno. Omenjena
predpostavka drži samo v primeru
eksponentne rasti.

Generacijski čas (t d )
td
=
ln2
µ
X X
t td
o /
= 2
t je čas rasti
mikroorganizma, t d pa je
podvojevalni čas biomase
Generacijski čas je čas, ko je X = 2X o in t = t d.
Število podvojitev biomase v času t je t/t d.
Generacijski čas je pri različnih mikoorganizmih
različen in je v rangu od 20 min do 5000 min.

Logistična enačba rasti
dX ⎛ X
= µ X⎜1−
dt ⎝ K
⎞
⎟
⎠
X je biomasa, µ je
hitrost rasti, K je
nosilnost okolja.
Logistična enačba odpravlja predpostavko, da je
hitrosti rasti konstantna. Pri povišani gostoti celic
se hitrost rasti zaustavlja in gre proti nosilnosti, ki
jo omogoča okolje. Večino rastnih krivulij
mikroorganizmov lahko z logistično enačbo
zadovoljivo popišemo.

Stacionarna faza
V fazi zaustavljanja rasti se velikost celic zmanjšuje. V tej fazi rast in
delitev celic nista sklopljena procesa. Celice se delijo tudi potem, ko je
prenehala rast, zaradi česar dobimo več manjših celic.
Razlogi zakaj pride do prehoda v stacionarno fazo:
• poraba hranil
• zniževanje koncentracije kisika
• pomankanje prostora
• akumulacija toksičnih produktov

Metabolne spremembe stradajočih celic
• znižan pretok snovi skozi metabolne poti
•večina energije se porabi za vzdrževalni metabolizem
• celica vzdržuje adenilatni naboj celice
• celica vzdržuje protonski gradient
• spremeni se razmerje med ∆pH in ∆ψ
• zmanjša se stabilnost RNA molekul
• del ribosomov dimerizira in postane neaktiven
•poveča se število mutacij

Faza propada
Če v stresni situaciji odpovedo vsi obrambni mehanizmi potem nastopi
celična smrt, do tega pride zaradi:
• dramatičnega znižanja energijskega naboja celice
•dramatičnega znižanja protonskega gradienta
• kompletne razgradnje kromosomov
Zakaj, kljub stresnim razmeram velikokrat propade samo del populacije?
• asinhronizacija celičnih ciklov v populaciji celic (npr. faza stradanja
nastopi v različnih fazah celičnega cikla, ki so različno dovzetne za stres)
• proces odmiranja celic je stohastičen

Kemostat
medij
X=0; S=Sr; F
mikrobna kultura
X; S; F
V kemostatu imamo stalno mešanja
biomase in substrata. Substrat
kontinuirano dodajamo kulturi. Po
drugi strani pa kulturo in gojišče
kontinuirano z istim pretokom
odvajamo iz kemostata. Zaradi tega
se volumen tekočine v kemostatu ne
spreminja.

Kontrola mikrobne rasti
Rast je limitirana s pomankanjem hranil ali neugodnimi fizikalno-
kemijskimimi pogoji. Velikokrat je potrebno rast prekiniti predno hranila
zmanjkajo ali so razmere za rast neugodne. Kontrolo lahko izvajamo z:
-dekontaminacijo
- dezinfekcijo
- sterilizacijo

Dekontaminacija
Dekontaminacijski postopki zmanjšujejo obremenjenost okolja z
mikroorganizmi. Pri dekontaminaciji ne uničimo vseh mikroorganizmov.
Dekontaminacijski postpoki so v veliki meri socialno in kulturno pogojeni.
Med te postopke spadajo:
-umivanje
- čiščenje
- odstranjevanje ostankov hrane in zemlje

Dezinfekcija - razkuževanje
Dezinfekcija je postopek uničenja večine patogenih mikroorganizmov. Z
dezinfekcijo ne uničimo vseh mikroorganizmov. Dezinfekcijska sredstva
delimo na:
-antiseptike(lahko uporabljamo na živalih, rastlinah in človeku)
-dezinfektante(uporabljamo na neživih objektih)

Antiseptična sredstva
antiseptik način delovanja
detergenti topijo membrane
fenoli topijo membrane, denaturirajo proteine
alkoholi topijo membrane, denaturirajo proteine
gvanidini topijo membrane
peroksid oksidant
klor oksidant
jod oksidant, jodira tirozin
perocetna k. oksidant
glutaraldehid alkilirajoče sredstvo

Dezinfekcijska sredstva v industriji
industrija spojina uporaba
papirna živo srebro, fenol med proizvodnjo
usnjarska težke kovine, fenol v produktu
plastika detergenti v vodni raztopini plastike
tekstilna težke kovine, fenoli razpad tekstila
lesna fenoli propad lesa
metalurška detergenti v emulzijah
petrokemična živo srebro, fenoli med pridobivanjem in hranjenjem
elektro klor v hladilnih stolpih
jedrska klor v reaktorjih

Pasterizacija
Pastrizacija zmanjša število mikroorganizmov v hrani, ki je občutljiva na
obdelavo z visokimi temperaturami. Pasterizacija ni sterilizacija.
Npr. mleko pasteriziramo zato, da ubijemo patogene organizme kot so
bakterije, ki povzročajo tuberkulozo, brucelozo, Q mrzlico, tifoidno mrzlico in
enterobakterije. Pasteriziramo tako, da mleko segrejemo na 71 o C za 15 sek ali
pa na 63 o C za 30 min.

UV- razkuževanje
•UV povzroči nastanek pirimidinskih dimerov (mutacije)
• ne prodira globoko, uporabno za razkuževanje delovnih površin,
operacijskih dvoran, prostorov za hranjenje sterilnega materiala
•UV luči so lahko prižgane samo takrat, ko v prostoru ni ljudi

Sterilizacija
Sterilzacija pomeni uničenje živosti in je absoluten pojem. Enkrat
sterilno vedno sterilno seveda, če ne pride do kontaminacije. Poznamo
več vrst sterilizacije:
•toplotna
•kemijska
• radiacijska
• filtracija

Toplotna sterilizacija

Autoklaviranje sterlizacija z vlažno toploto
Standardno avtoklaviranje:
• tlak 1.2 atm
• temperatura 121 o C
• čas 15 min
Kontrola uspešnosti:
- Bacillus subtilis
- B. stearothermophilus

Sterilizacija s suho toploto
S suho toploto povečamo oksidacijo (skrajna oblika je sežig). Pri 180 o C
je potrebno sterilizirati vsaj 30 min. Uporabna za sterilizacijo, kovinskih
instrumentov, olj, praškov in steklovine.
Posebna oblika sterilizacije s toploto je žarjenje cepilnih zank, konic
pincet in igel.

Sterilizacija z elektromagnetnim valovanjem
Za strerilizacijo uporabljamo: mikrovalove, X-žarke, γ-žarke in vir
elektronov. Mehanizem delovanja je različen.
Največkrat za sterilizacijske namene uporabljamo radioizotope 60 Co in
137 Cs. Radiacijsko sterilizacijo uporabljamo za sterilizacijo toplotno
občutljivih snovi kot so medicinska oprema, zdravila, tkiva in hrana,
predvsem meso in mesni izdelki.

Filtracija
Za sterilizacijske namene so uporabni filtri s premerom por 0.2 µm. Ločimo
več vrst filtrov:
• globinski filtri (azbest, papir, steklena vlakna)
• membranski filtri (polimeri acetat celuloze ali nitrat celuloze)
• nukeoporni filtri (polikarbonatni filtri)
Filtriramo lahko s pomočjo siringe ali vakumske črpalke.

Plinska sterilizacija
Uporabljamo predvsem:
- etilenoksid (alkiliranje sulfhidridnih, amino, karboksi in hidroksi skupin)
- formaldehid (podoben učinek kot etilenoksid)
Uporabljamo za sterilizacijo plastičnih snovi.

Kemijska kontrola rasti
bakteriostatik
bakteriolitik
bakteriocid

Sintetična kemoterapevtska sredstava
Sintetična kemoterapevtska sredstva so predvsem analogi rastnih
faktorjev, ki inhibirajo rast. Pomembni analogi:
- sulfa spojine
- analogi purinov in primidinov
- analogi aminokislin
- analogi vitaminov
- quinuloni (preprečitev supernavitja DNA)
folna kislina

Analogi rastnih faktorjev
V večini primerov so rastni faktorji
bromirani ali fluorirani. Struktura
rastnega faktorja se zaradi dodatka
ne spremeni znatno, tako da
spojino encim še vedno prepozna,
spremeni pa se encimska
aktivnost.

Določanje protimikrobne aktivnosti
Najbolj običajni metodi biološkega
testiranja protimikrobnih aktivnosti
sta:
•določanje minimalne
inhibitorne koncentracije, MIC
• difuzijska metoda z diski na
predhodno inokuliranem
agariziranem gojišču

Alexander Fleming (1881 - 1955)
Nadaljuje Erlichovo delo na kemoterapevtikih. Prvi
uspešno aplicira kemoterapevtik. Okrije lizocim.
1929 po srečnem naključju okrije, da plesen
Penicillium notatum zaustavi rast stafilokokov.
Po začetnem navdušenju, zaradi težav z izolacijo
penicilina, delo na antibiotikih zastane do II. svetovne
vojne. Za svoje delo 1945 dobi Nobelovo nagrado.

Delovanje protibakterijskih terapevtskih
sredstev na celičnem nivoju

Lastnosti klinično uporabnih antibiotikov
• ne smejo biti toksični in imeti stranskih učinkov
• ne smejo povzročati alergijskih reakcij
• ne smejo uničiti nativne flore (selektivnost)
• priti morajo do meste infekcije
• biti morajo kemijsko stabilni (dolga razpolovna doba)
• ne sme priti do hitre rezistence

Antibiotiki, ki delujejo na sintezo celične stene
Inhibirajo sintezo bakterijskega peptidoglikana in so zato
visokospecifični za bakterijske celice. Predvsem uporabni pri G+
bakterijah. Ločimo:
- β laktamske antibiotike
- polipeptidne antibiotike
- aminokislinski analogi
- glikolipidnu antibiotiki

β-laktamski antibiotiki
Imajo beta laktamske obroče in se vežejo ter blokirajo transpeptidazo. So
baktericidni in delujejo le na rastoče celice. Izzovejo preobčutljivostne
reakcije. Beta laktamaza jim uniči delovanje.
Predstavniki: penicilin G, penicilin V, meticilin, oksacilin, nafcilin, amoksicilin, bakampicilin,
karboksipenicilin, tikarcilin, temocilin, mezlocilin, azlocilin, piperacilin, amoksiciklin, ampicilin,
cefalosporin, karbapenam, monobaktram, imipenem, cefaklor, aztreonam.

β-laktamski antibiotiki

Generacije penicilinov
Prva generacija (naravni, penicilin G, penicilin V)
Delovanje: streptokoki, večina anaerobov v usni votlini; Treponema pallidum,
Clostridium, nepenicilazni stafilokoki, večina Neisseria and Bacteroides sp. razen B. fragilis),
Listeria in Pasteurella multocida.
Druga generacija (semi-naravni, ampicilin, amoksicilin)
Delovanje: širši spekter proti G- bakterijam E. coli, P. mirabilis in H. Influenzae
glavni antibiotik za Listeria. Neučinkoviti proti penicilazam
Tretja generacija (semi-naravni, karbenicilin, tikarcilin)
Delovanje:povečano delovanje proti P. aeruginosa, Enterobacter sp., Morganella
morgagni and Proteus sp. Neučinkoviti proti penicilazam, manj učinkoviti proti enterokokom
kot druga generacija.
Četrta generacija (semi-sintetični, azlocilin, mezlocilin)
Delovanje: širši spekter kot 3. Generacija, bolj učinkoviti proti enterokokom, bolj

Polipeptidni antibiotiki
Preprečijo sproščanje osnovne peptidoglikanske enote iz lipidnega
prenašalca baktoprenola in sintezo tehoične kisline. Uporabni za lokalno
zdravljenje, zelo toksični.
Predstavnik: bacitracin.

Aminokislinski analogi
• cikloserin je podoben D-alaninu in prepreči racemazno reakcijo, ki
konvertira L-alanin v D-alanin, cCikloserin se ~ 100 močneje veže na
encim kot D-alanin
• podoben je dipeptidu D-alanil-D-alanin in prepreči transpeptidacijo, v
celico pride z aktivnim prenosom za glicin, je zelo toksičen.

Glikopeptidi
Inhibirajo tako transglikozilacijo (nastanek glikanske verige) kot
transpeptidacijo (zamreženje). Vežejo se na osnovno peptidoglikansko
enoto, ko le ta zapušča citoplazmo in tako preprečijo vezavo v aktivno
mesto encima. Niso učinkoviti za G- , ker ne morejo
prečkati zunanje membrane.
Predstavniki: vankomicin, teikoplanin

Antibiotiki, ki inhibirajo sintezo proteinov
Ti antibiotiki blokirajo sintezo proteinov na ribosomu in imajo visoko
specifičnost za 30S ali 50S podenoto ribosoma. Predvsem uporabni pri G-
bakterijah. Ločimo:
- aminoglikozide
- tetraciklini
- derivati benzena
- makrolidi
- piranozidi
- fucidinska kislina
tetraciklini

Mesto inhibicije proteinske sinteze
inicijacija, vezava prve t-RNA na P mesto
vezava druge t-RNA na A mesto
nastanek prve peptidne vezi
prenos peptida na P mesto 50S
vezava nove t-RNA na A mesto
nastanek peptidne vezi
terminacija
aminoglikozidi
tetraciklinii
kloramfenikoli
piranozidii
makrolidi
fucidinska kislina

Antibiotiki, ki inhibirajo sintezo nukleinskih kislin
Antibiotiki delujejo tako, da preprečijo sintezo nukleinskih kislin oziroma
njihov prepis. Delujejo na:
• sintezo folne kisline (npr. sulfonamidi, trimoetoprim, kortimoksazol)
• DNA-girazo (npr. norfloksacin, enoksacin, pefloksacin, ciprofloksacin, ofloksacin)
• RNA-polimerazo vezava na beta podenoto RNA polimeraze, kar
onemogoča vezavo nukleotidov in s tem sintezo RNA (npr. rimfampicin)

Antibiotiki, ki blokirajo delovanje membrane
Ti antibiotiki razrušijo membransko strukturo. Hitro in učinkovito uničijo
celico. Zaradi podobne sestave sestave prokariontskih in evkariontskih
membran niso visoko specifični.
Klinično uporaben je polimiksin, ki se
veže na fosfolipide.

Mikroorganizmi, ki producirajo antibiotike
Organizmi, ki producirajo antibiotike živijo predvsem v tleh, delajo spore in
so neobčutljivi na delovanje lastnega antibiotika. Fiziološka vloga
antibiotikov ni popolnoma poznana. Pomembnejši producenti:
• Penicillium in Cephalosporium producirata β-laktame
• Streptomyces producira tetracikline, aminoglikozide, makrolide,
klarmfenikol, rifamicin in večino ostalih klinično uporabnih antibiotikov
• Bacillus producira polipeptidne antibiotike

Mehanizmi rezistence na antibiotike
Mehanizmi rezistence na antibiotike so vezani na mutacijo kromosomske
DNA oziroma na prisotnost plazmidne DNA. Rezistenčni mehanizmi:
• zmanjšana permeabilnost za antibiotik
• inaktivacija antibiotika (penicilinaze)
• modifikacija antibiotika (metilaze, acetilaze, fosforilaze)
• sprememba tarčne molekule (RNA polimeraze, ribosomov ali DNA giraze)
• sprememba metabolnih poti (npr. namesto sinteze folne kisline, njen vnos)
• aktiven iznos antibiotika
• odsotnost strukture (npr. mikoplazme nimajo celične stene)

Rezistenca na antibiotike
Ali bomo zapravili to luksuzno dobrino, ki nam je skupaj z vakcinacijo
podaljšla življenje v povprečju za 20 let???

Bakterocini
Bakterocini so molekule, ki inhibirajo oziroma ubijejo sorodne vrste ali
sorodne seve. Zaradi specifičnega delovanja na sorodne vrste se ločijo od
antibiotikov, ki so neselektivni.
Bakterocine poimenujemo glede na bakterije, ki jih proizvajajo, npr. Escherichia
coli proizvaja kolicin, Bacillus subtilis proizvaja subtilizin, Staphylococcus
gallinarum proizvaja galidermin, Lactobacilus johnsonii proizvaja laktacin,
Pediococcus acidilactici proizvaja pediocin, Lactobacilus sake proizvaja sakacin,
možne pa so tudi izjeme.

Delovanje bakterocinov
Kolicini in mikrocini lahko:
• formirajo pore v membrani (npr. kolicin V)
• cepijo nukleinsko kislino (npr. kolicin E9)
• inhibirajo lipidne prenašalce (npr. kolicin M),
• inhibirajo DNA girazo (npr. mikrocin B17)
• inhibirajo celično delitev (npr. mikrocin 25)
• inhibirajo proteinsko sintezo (npr. mikrocin C7)
Kolicini se običajno vežejo na receptorje, ki jih celica potrebuje za
normalno funkcioniranje, npr. transport nutrientov.

Posttranslacijske modifikacije bakteriocinov
procesiranje
30 a.k.
I A S
I A
K F I
dehidracija,
dekarboksilacija,
procesiranje
C T C A K T G S F N S Y C C
P G
EpiB, EpiC, EpiD,
EpiP
pre-epidermin
K
dA dA
dA U dA dA dA
F S
S
I
B A K G F N Y
P G
S
S NH
Bakterocini so običajno postranslacijsko modificirani.
epidermin

Kontrola glivičnih okužb
• inhibicija ergosterolne sinteze: inhibirana citokromska P450 zmanjša
koverzijo iz 14-α-metilsterola v ergosterol, kar povzroči spremembo v fluidnosti
in funkcioniranju membrane, vpliv na sintezo sterolov gostitelja (npr.
spremenjena sinteza testosterona), inhibicija transformacije blastospor Candide
albicans v invazivno micelarno obliko
• spremenjeno delovanje membrane: predvsem sredstva z z visoko afiniteto za
membrane z ergosterolom, povečana prepustnost za K + in Mg 2+ , smrt celice,
rezistenca redka

Kontrola glivičnih okužb
• delovanje na niti delitvenega vretena: vezava na mikrotubule mitotičnega
delitvenega vretena, kar vodi do zaustavljanja delitve, zato ne pride do invazije in
gliva odpade skupaj z odmrlo kožo, dolge terapije od 3 tednov (koža) do 4
mesecev (nohti)
• inhibicija sinteze celične stene: inhibicija sinteze hitina, inhibicija sinteze 1,3-β-
D-gluikana
• inhibicija sinteze nukleinskih kislin: nukleinski analogi, preprečijo sintezo
timina

Antivirusna kemoterapija
Nukleozidni analogi: aciklovir, ganciklovir in trifluridin blokirajo virusno polimerazo;
didanosin, lamivudin in zidovudin blokirajo reverzno transkripcijo; ribaravin blokira
sintezo virusne RNA
Sintetični amini: amantadin, blokira razstavljanje virusnega plašča
Pirofosfatni analogi: fosfonoformična kislina, blokira virusno polimerazo
RNA polimerazni inhibitorji: rifamicin, blokira RNA polimerazo
Retrovirusni proteazni inhibitorji: indinavir, blokira cepitev polipeptidov
Interferoni: inducirajo proteine, ki inhibirajo virusno replikacijo

Antiprionska kemoterapija
Še v povojih!
Material, ki je prišel v stik s prioni je potrebno dekontaminirati z:
- 1-urnim avtoklaviranjem pri 134 o C
- 1 urnim namakanjem v 1N NaOH
- 2 urnim namakanjem v 0.5 % natrijevem hipokloritu

Razvoj novih protimikrobnih sredstev
Razvoj novega antimikrobnega sredstva za medicinske potrebe traja od
10-15 let. Stroški razvoja novega sredstva od izuma do postavitve na trg
so astronomski (~ 800.000.000 USD).
Ker so stroški postavitve novega zdravila prohibitivno visoki je na tržišču
čedalje manj novih antiinfekcijskih sredstev. Leta 1992 je FDA agencija
odobrila 20 novih sredstev leta 2002 pa le enega.