Skripta - Departman za Biologiju i Ekologiju - Univerzitet u Novom ...

Nakon ubacivanja vektora u embrionalne stem elije (ES) one rastu u prisustvu neomicina i
ganciklovira (supstance koja se dejstvom tiamidin kinaze transformiše u letalni produkt). elije u
kojima je došlo do sluajne integracije
vektora u genom rezistentne su na
neomicin, ali ih ubija prisustvo
ganciklovira; dok su elije u kojima je
došlo do homologih rekombinacija
rezistentne na obe supstance, jer se u
njima tk gen ne inkorporira u genom.
Ovakva pozitivno-negativna selekcija
omoguava odabir samo preživelih
elija koje nose homologe
rekombinacije, što se dodatno može
proveriti i PCR i Southern blot
metodama. Embrionalne stem elije
dalje se mogu ubaciti u blastociste
(Slika D-7B) i implantirati u uteruse
ženki miševa, koje se nalaze u stanju
»lažne trudnoe«. Nakon razvoja
embriona miševi ovako dobijene
generacije bie himerni za hete-
rozigotne prekide ili mutacije, pri
emu e neka tkiva biti poreklom od
ES elija, a druga od preostalih
normalnih elija blastociste. Germina-
tivne elije ovih miševa, takoe, su
naješe himerne, ali kako pripadaju
haploidnioj garnituri samo neke od
njih nosie izmenjene (mutirane ili
prekinute gene).
Slika D.7B. Formiranje »gene knockout« ciljnih gena
ES-Embrionalne stem elije; neo-gen rezistencije na neomicin; tkgen
za tiamidin
225