Skripta - Departman za Biologiju i Ekologiju - Univerzitet u Novom ...

specifina, što znai da e se proba vezati samo za onu ciljnu sekvencu molekula DNK koja ima
komplementaran raspored baza. Proba može da nae odgovarajuu sekvencu DNK izmeu milion
drugih slinih, ali nekomplementarnih molekula. Koraci u hibridizaciji su sledei:
Razdvajanje smeše molekula DNK
Imobilizacija molekula na matriksu
Dodavanje probe u cilju vezivanja za odgovarajuu sekvencu DNK
Uklanjanje nevezane probe ispiranjem
Mesto vezivanja probe odgovara mestu na kome se nalazi sekvenca
Nakon toga sledi DNK preišavanje i fragmentacija DNK pomou enzima restrikcionih
endonukleaza (seku molekul DNK na tano odreenom, specifinom mestu) i elektroforetsko
razdvajanje fragmenata prema veliini na agaroznom gelu. DNK se, zatim, denaturiše inkubacijom
agaroznog gela u puferu za denaturaciju. Kako je poznato da je agaroza nepogodna za
manipulaciju, neophodno je preneti DNK fragmente sa gela na nosa pogodniji za manipulaciju
Slika D.5. »Southern Blot« hibridizacija.
(celulozna ili najlon
membrana), elektrofore-
zom ili kapilarnom
difuzijom. Mambrana se
izlaže visokoj temperaturi
ili UV zracima da bi se
DNK fiksirala. Nakon
hibridizacije sa radioakti-
vno obeleženom probom,
membrana se ispere i
detekcija se vrši autora-
diografijom.
222