Skripta - Departman za Biologiju i Ekologiju - Univerzitet u Novom ...
Skripta - Departman za Biologiju i Ekologiju - Univerzitet u Novom ...
Skripta - Departman za Biologiju i Ekologiju - Univerzitet u Novom ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Tatjana Kosti i Silvana Andri<br />
Molekularna i elijska<br />
imunologija<br />
<strong>Skripta</strong> <strong>za</strong> sve <strong>za</strong>interesovane studente<br />
WUS Austria – Daniel Print
Tatjana Kosti, PhD<br />
vanredni profesor na grupi predmeta iz Fiziologije životinja<br />
<strong>Departman</strong> <strong>za</strong> biologiju i ekologiju<br />
Prirodno-matematiki fakultet<br />
<strong>Univerzitet</strong> u <strong>Novom</strong> Sadu<br />
E-mail: tanjak@ib.ns.ac.yu<br />
Silvana Andri, PhD<br />
vanredni profesor na grupi predmeta iz Fiziologije životinja<br />
<strong>Departman</strong> <strong>za</strong> biologiju i ekologiju<br />
Prirodno-matematiki fakultet<br />
<strong>Univerzitet</strong> u <strong>Novom</strong> Sadu<br />
E-mail: silvana@ib.ns.ac.yu<br />
Naslovnu stranu osmislili:<br />
NINI i TEJ<br />
Grafiko oblikovanje korica:<br />
Predrag Nikoli<br />
The publishing of this script is part of the project CDP+ 118/2006 financed by Austrian<br />
Cooperation through WUS Austria<br />
This copy is not for sale<br />
Ova skripta je objavljena u okviru projekta WUS Austria CDP+ 118/2006 finansiranog od<br />
strane Austrian Cooperation<br />
Besplatan primerak
Predgovor<br />
Ova skripta je rezultat reali<strong>za</strong>cije projekta finansiranog od strane WUS-Austrija u okviru programa CDP+<br />
(Course Development Program), u smislu unapredjenja predmeta Molekularna i elijska imunologija<br />
namenjenog studentima osnovnih, Master i PhD studija na Prirodno-matematikom fakultetu, <strong>Univerzitet</strong>a u<br />
<strong>Novom</strong> Sadu.<br />
Namera autora je bila da studentima uine dostupnim informacije koje e im pomoi da savladaju osnovne<br />
principe molekularne i elijske imunologije, naglašavajui uticaj modernih tehnika i multidisciplinarni<br />
nauni pristup u razumevanju funkcije imunog sistema. <strong>Skripta</strong> je pisana sa željom da se informacije<br />
poredjaju u osnovni i jednostavan koncept koji bi pomogao studentima da razumeju kako radi imuni sistem.<br />
Tekst skripte je organizovan tako da prati porogram predavanja iz kursa Molekularna i elijska imunologija,<br />
ali ne sadrži opise specifine funkcije imunog sistema, u razliitim obolenjima. Studentima <strong>za</strong>interesovanim<br />
<strong>za</strong> ovu problematiku preporuujemo knjigu „Osnovna imunologija“ (Data Status; prevod knjige Basic<br />
Immunology, Abbas AK & Lichtman AH) u kojoj su opisani osnovni poremeaji funkcije imunog sistema, kao<br />
i kako imuni sistem funkcioniše u specifinim situacijama. Sve slike u skripti su preuzete iz knjige Cellular<br />
and Molecular Immunology (Abbas AK & Lichtman AH, 2005).<br />
S’ obzirom da je tekst skripte prvi pisani trag o sadržaju kursa, koji nema dugu tradiciju, sve kritike,<br />
sugestije i komentari su više nego dobrodošli.<br />
Veliko hvala Mariji Janji i Nataši Stojkov, saradnicama na grupi predmeta Fiziologija životinja, na pomoi<br />
oko korekture teksta, kao i Predragu Nikoliu <strong>za</strong> tehniko i grafiko oblikovanje korica.<br />
Na kraju, jedno jednostavno i ogromno hvala organi<strong>za</strong>ciji WUS Austrija, Pokrajinskom sekretarijatu <strong>za</strong><br />
obrazovanje i kulturu, kao i i gospodinu Gezi Danijelu (štamparija Danijel Print) na ogromnom razumevanju<br />
i finansijskoj podrsci u nameri da našim studentima obezbedimo skriptu koja e im, nadamo se, bar donekle<br />
olakšati savladavanje predvienog programa kursa.<br />
Autori
S A D R Ž A J<br />
01. UVOD U IMUNOLOGIJU 1<br />
02. FUNKCIONALNA ORGANIZACIJA IMUNOG SISTEMA 7<br />
2.1. OSNOVNE KARAKTERISTIKE ORGANIZACIJE I FUNKCIJE IMUNOG SISTEMA 7<br />
2.1.1. Uroeni i adaptivni imunitet 7<br />
2.1.2. Tipovi adaptivnog imunog odgovora 11<br />
2.1.3. Osnovne karakteristike / obeležja adaptivnog imunog odgovora 13<br />
2.1.4. elijske komponente adaptivnog imunog sistema 17<br />
2.1.5. Faze adaptivnog imunog odgovora 19<br />
2.1.5.1. Prepoznavanje antigena 20<br />
2.1.5.2. Aktivacija limfocita 21<br />
2.1.5.3. Efektorna fa<strong>za</strong> adaptivnog imunog odgovora: eliminacija antigena 21<br />
2.1.5.4. Homeosta<strong>za</strong>: Slabljenje / opadanje / nestajanje imunog odgovora 22<br />
2.2. ELIJE I TKIVA IMUNOG SISTEMA 23<br />
2.2.1. elije imunog sistema 24<br />
2.2.1.1. Limfociti 25<br />
2.2.1.2. Antigen-prezentujue elije (APCs) 29<br />
2.2.2. Anatomija i funkcija limfoidnih tkiva 31<br />
2.2.2.1. Kosna srž 31<br />
2.2.2.2. Timus 33<br />
2.2.2.3. Limfni vorovi i limfatini sistem 33<br />
2.2.2.4. Slezina 35<br />
2.2.2.5. Kožni imuni sistem 36<br />
2.2.2.6. Mukozni imuni sistem 37<br />
2.2.2.7. Putevi i mehanizmi recirkulacije limfocita 39<br />
03. PREPOZNAVANJE ANTIGENA 43<br />
3.1. KARAKTERISTIKE ANTIGENA 43<br />
3.2. ANTITELA 45<br />
3.2.1. Molekularna struktura antitela 45<br />
3.2.2. Sinte<strong>za</strong> i ekspresija Ig molekula 49<br />
3.2.3. Karakteristike antitela ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> prepoznavanje antigena 50<br />
3.2.4. Antigen-antitelo interakcija 51<br />
3.2.5. Karakteristike antitela ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> efektorne funkcije 52<br />
3.3. MOLEKULE GLAVNOG HISTOKOMPATIBILNOG KOMPLEKSA (MHC) 53<br />
3.3.1.Osobine MHC gena 53<br />
3.3.2. Osobine MHC molekula 54<br />
3.3.3. MHC molekuli klase I 55
3.3.4. MHC molekuli klase II 56<br />
3.3.5. Osobine peptid-MHC interakcija 56<br />
3.3.6. Ekspresija MHC molekula 57<br />
3.4. PROCESOVANJE I PREZENTACIJA ANTIGENA T LIMFOCITIMA 60<br />
3.4.1. Karakteristike antigena koje prepoznaju T limfociti 60<br />
3.4.2. Prezentacija proteinskih antigena CD4 + T limfocitima 62<br />
3.4.2.1. Tipovi elija koje prezentuju antigene CD4 + T elijama 62<br />
3.4.2.2. „Hvatanje“ i prezentacija proteinskih antigena 64<br />
3.4.3. Prezentacija proteinskih antigena CD8 + T limfocitima 64<br />
3.4.4. Procesovanje antigena 65<br />
3.4.4.1. Procesovanje internalizovanog antgena 65<br />
3.4.4.2. Procesovanje citosolnog antigena 68<br />
3.5. RECEPTOR ZA ANTIGENE NA T LIMFOCITIMA (TCR) I POMONE MOLEKULE 71<br />
3.5.1. Struktura TCR 72<br />
3.5.2. Uloga TCR-a u prepoznavanju peptida+MHC kompleksa 73<br />
3.5.3. CD3 i proteini 74<br />
3.5.3.1. Struktura CD3 i proteina 74<br />
3.5.3.2. Funkcija CD3 i proteina 75<br />
3.5.4. TCR 75<br />
3.5.5. Pomone molekule 76<br />
3.5.6. CD4 i CD8 koreceptori ukljueni u aktivaciju T limfocita 77<br />
3.5.6.1. Struktura CD4 i CD8 koreceptora 78<br />
3.5.6.2. Funkcija CD4 i CD8 koreceptora 78<br />
3.5.7. CD28 i CTLA-4: receptori koji regulišu aktivaciju T elija 79<br />
3.5.8. CD45 i CD2: molekuli koji uestvuju u signalnoj transdukciji 80<br />
3.5.9. Adhezione molekule T limfocita: integrini, selektini, CD44 80<br />
3.5.10. Efektorne molekule T limfocita 82<br />
04. AKTIVACIJA I REGULACIJA T I B LIMFOCITA 83<br />
4.1. AKTIVACIJA T LIMFOCITA 83<br />
4.1.1. Funkcionalni odgovor T limfocita 84<br />
4.1.2. Uloga kostimulatora u aktivaciji T limfocita 86<br />
4.1.3. Signalna transdukcija preko TCR receptora 88<br />
4.1.3.1. Rani dogaaji na membrani: formiranje imunološke sinapse i aktivacija protein kina<strong>za</strong> i adapternih 89<br />
proteina<br />
4.1.3.2. Signalni put Ras-MAP kinaze u T limfocitima 92<br />
4.1.3.3. Kalcijum- i protein kina<strong>za</strong> C-posredovan signalni put u T limfocitima 93<br />
4.1.3.4. Aktivacija transkripcionih faktora koji regulišu ekspresiju gena u T limfocitima 94<br />
4.2. AKTIVACIJA B LIMFOCITA 97
4.2.1. Generalne karakteristike humoralnog imunog odgovora 97<br />
4.2.2. Prepoznavanje antigena i antigenom-indukovana aktivacija B elija 98<br />
4.2.2.1. Signalna transdukcija od BCR kompleksa 98<br />
4.2.2.2. Receptori <strong>za</strong> komplement obezbeuju sekundarni signal 101<br />
4.2.2.3. Funkcionalni odgovor B elija na prepoznavanje antigena 102<br />
4.2.3. Humoralni odgovor na proteinske antigene <strong>za</strong>visi od T elija pomonica 102<br />
4.2.3.1. Rane faze humoralnog odgovora koji je <strong>za</strong>visan od T elija su: interakcija T-B elija, proliferacija B elija, 103<br />
sekrecija antitela i „isotype switching“<br />
4.2.3.2.Kasnije faze humoralnog odgovora <strong>za</strong>visnog od T elija pomonica: reakcije germinalnog centra 108<br />
4.2.4. Humoralni odgovor na T-ne<strong>za</strong>visne antigene 110<br />
4.2.5. Regulacija humoralnog imunog odgovora preko Fc receptora 111<br />
05. EFEKTORNI MEHANIZMI IMUNOG ODGOVORA 113<br />
5.1. CITOKINI 114<br />
5.1.1. Osnovne karakteristike citokina 115<br />
5.1.1.1. Funkcionalne kategorije citokina 117<br />
5.1.1.2. Citokinski receptori i signaling 118<br />
5.1.2. Citokini koji posreduju i regulišu uroeni imunitet 121<br />
5.1.2.1. Faktor nekroze tumora (TNF) 122<br />
5.1.2.2. Interleukin-1 (IL-1) 123<br />
5.1.2.3. Hemokini 124<br />
5.1.2.4. Interleukin-12 (IL-12) 125<br />
5.1.2.5. Tip I interferoni (IFNs) 127<br />
5.1.2.6. Interleukin-10 (IL-10) 129<br />
5.1.2.7. Drugi citokini uroenog imuniteta 129<br />
5.1.2.8. Uloga citokina u uroenom imunitetu i inflamaciji 130<br />
5.1.3. Citokini koji posreduju i regulišu adaptivni imunitet 131<br />
5.1.3.1. Interleukin-2 (IL-2) 132<br />
5.1.3.2. Interleukin-4 (IL-4) 133<br />
5.1.3.3. Interleukin-5 (IL-5) 134<br />
5.1.3.4. Interferon- (INF-) 134<br />
5.1.3.5. Faktor transformacije rasta (TGF-) 136<br />
5.1.3.6. Drugi citokini adaptivnog imuniteta 137<br />
5.1.3.7. Uloga citokina T elija u specijalizovanom adaptivnom imunom odgovoru 138<br />
5.1.4. Citokini koji regulišu hematopoezu („hematopoezni“ citokini) 138<br />
5.1.4.1. Faktor stem elija (c-kit ligand) 140<br />
5.1.4.2. Interleukin-3 (IL-3) 140<br />
5.1.4.3. Interleukin-7 (IL-7) 141<br />
5.1.4.4. Drugi hematopoezni citokini 141
5.2. EFEKTORNI MEHANIZMI UROENOG / NESPECIFINOG IMUNOG ODGOVORA 143<br />
5.2.1. Karakteristike uroenog imunog prepoznavanja 144<br />
5.2.2. Komponente uroenog imunog sistema 147<br />
5.2.2.1. Epitelijalne barijere 149<br />
5.2.2.2. Fagociti: neutrofili i makrofagi 151<br />
5.2.2.3. Uroeno-ubilake elije – elije prirodne ubice – NK elije 166<br />
5.2.2.4. Sistem komplementa 169<br />
5.2.2.5. Drugi cirkulišui proteini uroenog imuniteta 171<br />
5.2.2.6. Citokini 172<br />
5.2.3. Uloga uroenog imuniteta u stimulaciji adaptivnog imunog odgovora 174<br />
5.3. EFEKTORNI MEHANIZMI IMUNOG ODGOVORA POSREDOVANOG ELIJAMA 177<br />
5.3.1. Tipovi elijama-posredovanih imunih reakcija 177<br />
5.3.2. Razvoj efektornih elija 178<br />
5.3.2.1. Prepoznavanje antigena od strane T elija i kostimulacija 178<br />
5.3.2.2. Klonalna ekspanzija T elija 181<br />
5.3.2.3. Diferencijacija naivnih CD4 + T elija u efektorne elije 181<br />
5.3.2.4. Diferencijacija naivnih CD4 + T elija u citolitine T elije (CTLs) 186<br />
5.3.3. Migracija efektornih T elija i drugih leukocita na mesto gde je antigen 187<br />
5.3.4. Efektorni mehanizmi elijama-posredovanog imuniteta 188<br />
5.3.4.1. T-elijama posredovana aktivacija makrofaga i drugih leukocita 188<br />
5.3.4.2. Mehanizmi CTL-posredovanog uništavanja inficiranih elija 191<br />
5.4. EFEKTORNI MEHANIZMI HUMORALNOG IMUNOG ODGOVORA 195<br />
5.4.1. Pregled humoralnog imunog sistema 195<br />
5.4.2. Neutrali<strong>za</strong>cija mikroba i njihovih toksina 196<br />
5.4.3. Antitelima-posredovana opsoni<strong>za</strong>cija i fagocito<strong>za</strong> 198<br />
5.4.3.1. Fc receptor fagocita 199<br />
5.4.3.2. elijama-posredovana citotoksinost koja <strong>za</strong>visi od antitele 200<br />
5.4.4. Sistem komplementa 201<br />
5.4.4.1. Putevi aktivacije komplementa 202<br />
5.4.4.2. Receptori <strong>za</strong> proteine komplementa 209<br />
5.4.4.3. Regulacija aktivacije komplementa 210<br />
5.4.4.4. Funkcije komplementa 211<br />
5.4.5. Funkcija antitela na specijalnim anatomskim mestima u organizmu 212<br />
5.4.5.1. Mukozni imunitet 212<br />
5.4.5.2. Neonatalni imunitet 213<br />
D. DODATAK 215<br />
D.1. LABORATORIJSKE TEHNIKE KOJE SE KORISTE U IMUNOLOGIJI 215<br />
D.1.1. Laboratorijske metode koje koriste antitela 215
D.1.1.1. Kvantifikacija antigena imunoesejima 215<br />
D.1.1.2. Puifikacija i identifikacija proteina 216<br />
D.1.1.3. Markiranje i detekcija antigena u elijama i tkivima 219<br />
D.1.1.4. Odreivanje/merenje interakcije antigen-antitelo 221<br />
D.1.2. Anali<strong>za</strong> genske strukture i ekspresije 221<br />
D.1.2.1. „Southern Blot“ hibridi<strong>za</strong>cija 221<br />
D.1.2.2. „Northern Blot“ hibridi<strong>za</strong>cija 223<br />
D.1.2.3. Lanana reakcija polimeraze 223<br />
D.1.3. Transgeni miševi i „knock-out“ ciljnih gena 224<br />
L. LITERATURNI IZVORI 227
UVOD U IMUNOLOGIJU 01<br />
U ovom delu skripte je dat kratak uvod u imunologiju, kao i najosnovniji pojmovi o evoluciji<br />
imunog sistema.<br />
Imunologija je nauka koja prouava mehanizme koji su se razvili u toku evolucije, a u cilju<br />
odbrane organizma od štetnog uticaja stranih agenasa tj. svega onoga što organi<strong>za</strong>m ne<br />
prepoznaje kao svoje i što remeti ili preti da poremeti homeostazu. Re imunitet (imunost,<br />
otpornost) je izvedena od latinske rei immunitas koja se koristila da opiše <strong>za</strong>štitu Rimskih<br />
senatora od javnih tužilaca tokom njihovog rada u senatu. Istorijski, imunost oznaava <strong>za</strong>štitu od<br />
bolesti, ili preciznije <strong>za</strong>štitu od svega što može dovesti do poremeaja homeostaze, a potom<br />
eventualno i bolesti. elije i molekuli koji su odgovorni <strong>za</strong> <strong>za</strong>štitu organizma ine imuni sistem,<br />
a njihova <strong>za</strong>jednika i dobro koordinisana aktivnost, kao odgovor na strane agense, ini<br />
imuni odgovor. Fiziološka funkcija imunog sistema je odbrana. Dugo vremena se imunologija<br />
razvijala kao pove<strong>za</strong>na sa mikrobiologijom u nameri da proui neutralisanje i uklanjanje<br />
delovanja patogenih mirkoorgani<strong>za</strong>ma, pa su se i teorije o postanku i funkcionisanju imunog<br />
sistema svodile samo na prirodnu selekciju koja je, ini se, dopustila razvoj samo viših<br />
organi<strong>za</strong>ma iji se imunološki sistem mogao delotvornije odupreti napadu mikroorgani<strong>za</strong>ma.<br />
Poka<strong>za</strong>lo se da imunološka reakcija postoji i na nepatogene mikroorganizme, pa je uloga imunog<br />
sistema šira i mnogostrukija, te je vrlo teško jednostavno i precizno definisati fiziološku ulogu<br />
imunog sistema.<br />
Imunologija je eksperimentalna nauka bazirana na eksperimentalnim <strong>za</strong>pažanjima i <strong>za</strong>kljucima<br />
koji se iz njih izvode. Evolucija imunologije kao eksperimentalne discipline <strong>za</strong>visi od sposobnosti<br />
da se manipuliše funkcijom imunog sistema u kontrolisanim uslovima. Istorijski, prvi jasan<br />
primer ovakve manipulacije i jedan koji je ostao <strong>za</strong>beležen kao najdramatiniji je svakako uspešna<br />
vakcinacija Edvarda Dženera (engl. Edward Jenner) protiv malih boginja. Ovaj lekar je ustanovio<br />
1
da pacijenti koji su se oporavili od kravljih boginja nisu bii <strong>za</strong>raženi malim boginjama. Na osnovu<br />
ovih <strong>za</strong>pažanja on je ubrizgao sadržaj fistule kravljih boginja u rame osmogodišnjeg deaka.<br />
Kasnije je isti deak namerno inficiran malim boginjama, ali se bolest nije razvila. Dženerovo<br />
otkrie vakcine (lat. vaccinus kravlji, od krava) je prouzrokovalo znaajan napredak u imunologiji i<br />
ekspanziju primene vakcina, što se poka<strong>za</strong>lo kao najefikasniji metod <strong>za</strong> prevenciju infektivnih<br />
bolesti.<br />
U prošlom veku, posebno <strong>za</strong>dnjih 40 godina prošlog veka, novi eksperimentalni pristupi i<br />
sofisticirane naune metode doprineli su boljem razumevanju funkcije imunog sistema.<br />
Ekspanzivnim razvojem i napredkom metoda biotehnologije (produkcija monoklonalnih antitela;<br />
knock-out i transgene elijske linije; tehnologije rekombinantne DNK; proizvodnja rekombinantih<br />
proteina, posebno antigena i antitela i njihovih fragmenata, kao i himernih i humaniziranih<br />
antitela; proizvodnje citokina i drugih biološki aktivnih materija i dr.), poinje brži razvoj<br />
imunologije, te nova saznanja brzo nalaze i praktinu primenu u transplantacijskoj i tumorskoj<br />
medicini. Iskustvo da pri transplantaciji davalac (donor) i primalac (akceptor) moraju biti što<br />
sliniji, nametnulo je potrebu istraživanja njihovih slinosti i razlika i razvilo novu disciplinu –<br />
imunogenetiku, a tumorska imunologija je dobila mogunost klinike primene kroz<br />
imunodijagnostiku i imunoterapiju<br />
Stoga se danas, fiziološka uloga/funkcija imunog sistema ogleda u odbrani od infekcije,<br />
<strong>za</strong>štiti i odbrani od tumora, kao i u održanju antigenske i genske homeostaze organizma.<br />
Odbrana protiv štetnih agenasa je posredovana ranom reakcijom urodjenog imuniteta<br />
(prirodna otpornost organizma) i kasnom reakcijom steenog (adaptivna otpornost<br />
organizma) imuniteta.<br />
Prirodna i adaptivna otpornost su komponenete integrisanog odbrambenog odgovora organizma u<br />
kome brojne elije i molekuli funkcionišu kooperativno. Imuni sistem prepoznaje stranog agensa,<br />
a takodje, dovodi i do njegove destrukcije. Imuni sistem mora da prepozna štetni agens, a<br />
takodje, mora da razlikuje stranog napadaa od sastavnih konstituenata sopstvenog organizma.<br />
Ako se to ne desi, dolazi do pojave tzv. autoimunih bolesti kada imuni mehanizmi deluju protiv<br />
sopstvenih molekula (prvenstveno proteinskih). Pored toga, imuni sistem može da uništi<br />
kancerozne elije i/ili sprei razvoj odredjenih tumora. Takodje, imuni sistem je ukljuen u<br />
odbacivanje transplantata, sa izuzetkom transplantata od jednojajanog bli<strong>za</strong>nca.<br />
2
Osnovni pojmovi o evoluciji imunog sistema<br />
Iako i biljke i najprostiji životinjski oblici imaju odbrambene mehanizme, složenija evolucija<br />
višeelijskih organi<strong>za</strong>ma je nametnula i vitalnu potrebu razvoja internog odbrambenog sistema<br />
koji e ih štititi od razliitih stranih agenasa. Mehanizmi <strong>za</strong> odbranu organizma su prisutni u<br />
„nekoj formi“ kod svih višeelijskih organi<strong>za</strong>ma i oni ine/predstavljaju tzv. urodjeni (prirodni,<br />
nespecifini) imunitet. Mnogo specijalizovaniji odbrambeni mehanizmi se javljaju kod<br />
vertebrata i oni ine još jedan odmbrambeni sistem tzv. steeni (adaptivni, specifini) imunitet<br />
koji fukcioniše <strong>za</strong>jedno sa urodjenim inei moan odbrambeni sistem.<br />
Taksonomska<br />
grupa<br />
Tabela 1.1. Prisustvo odredjenih odbrambenih mehani<strong>za</strong>ma kod razliitih organi<strong>za</strong>ma<br />
Prirodni<br />
imunitet<br />
Steeni<br />
imunitet<br />
Fagocito<strong>za</strong> T i B<br />
limfociti<br />
Antitela Antimikrobni<br />
Više biljke + - - - - +<br />
Sundjeri + - + - - ?<br />
Gliste + - + - - ?<br />
Insekti, rakovi + - + - - +<br />
Ribe + + + + + +<br />
Žabe + + + + + +<br />
Reptili + + + + + +<br />
Ptice + + + + + +<br />
Sisari + + + + + +<br />
Razliite vrste elija kod beskimenjaka reaguju na mikroorganizme i/ili druge štetne agense tako<br />
što ih okružuju i uništavaju, ali nemaju antigen specifine limfocite i ne produkuju<br />
imunoglobuline (Ig), niti proteine sistema komplementa. Ovi organizmi sadrže brojne solubilne<br />
molekule kojima vezuju i liziraju mikroorganizme. Neki beskimenjaci poseduju specijalizovane<br />
elije (acelomata- fagocitni amebociti; Mollusca & Arthropoda – hemocite; Annelides – celomociti;<br />
tunicata – leukociti) koje su pretea elijama imunog sistema viših kimenjaka. Takodje,<br />
doka<strong>za</strong>no je da su beskimenjaci sposobni da ispolje reakciju odbacivanja stranog tkivnog<br />
transplantata. Smatra se da su se razliite komponenete imunog sistema sisara pojavile <strong>za</strong>jedno u<br />
filogeniji i da se tokom evolucije poveavala njihova specifinost i kompleksnost delovanja (Tabele<br />
1.1. i 1.2.).<br />
peptidi<br />
3
Tabela 1.2. Evolucija imunog sistema - prisustvo odgovarajuih odbrambenih mehani<strong>za</strong>ma kod<br />
razliitih organi<strong>za</strong>ma<br />
I n v e r t e b r a t a<br />
Prirodna otpornost ( imunost) Adaptivna otpornost (imunost)<br />
Fagocite NK elije Antitela T i B limfociti Limfni<br />
vorovi<br />
Protozoa + - - - -<br />
Spongia + + - - -<br />
Annelides + - - - -<br />
Arthropodes + - - - -<br />
V e r t e b r a t a<br />
Elasmobranchia + + + (samo IgM) -<br />
Teleostea + + + (IgM, drugi?) -<br />
Amphibia + + + (2-3 klase) -<br />
Reptilia + + + (3 klase) -<br />
Aves + + + (3 klase) + (neke)<br />
Mamalia + + + (8 klasa) +<br />
NK elije (engl. natural killer cells) - urodjeno-ubilake elije ili elije prirodne ubice; + prisutan, - nije prisutan.<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
S porastom veliine i složenosti telesne gradje, kao i sa stepenom encefali<strong>za</strong>cije organi<strong>za</strong>ma, i<br />
odbrambeni sistem postajao je sve složeniji da bi odgovorio svim nametnutim <strong>za</strong>dacima. To je<br />
posebno izraženo kod kimenjaka jer je kod njih odbrana od mirkoorgani<strong>za</strong>ma bila preduslov<br />
njihovog opstanka, te se razvio sistem, tzv. adaptivni imuni sistem koji funkcioniše po principu<br />
prepoznavanja i uenja. Osnovne osobine adaptivnog imunog odgovora (prepoznavanje;<br />
uenje/memorisanje; razlikovanje sopstveno/strano) su prisutne i kod nižih kimenjaka, ali se<br />
tokom evolucije progresivno uveavala sposobnost razlikovanja razliitih antigena.<br />
Prvi susret sa bakterijskim, gljivinim, virusnim agensom obino rezultira infekcijom praenom<br />
razvojem bolesti. Imuni sistem pomaže da se organi<strong>za</strong>m oporavi od infekcije, a nakon toga<br />
organi<strong>za</strong>m razvija odgovarajue mehanizme koji ga ine otpornim na sledeu infekciju istim<br />
agensom. Pored toga, prilino velika sklonost kimenjakih elija ka zloudnim tumorskim<br />
promenama morala je usloviti razvoj vrlo osetljivog sistema koji bi mogao prepoznati veoma fine i<br />
4
tanane razlike izmedju zdrave i maligno-transformisane sopstvene elije. Kontinuirana borba<br />
kimenjaka sa mikroorganizmima rezultirala je razvojem odbrambenog sistema koji radi na<br />
principu prepoznavanja i neutralisanja (prirodni, urodjeni ili nespecifini mehanizmi<br />
odbrane) i/ili prepoznavanja, neutralisanja i uenja/pamenja (adaptivni, steeni ili<br />
specifini mehanizmi odbrane).<br />
5
FUNKCIONALNA ORGANIZACIJA<br />
IMUNOG SISTEMA 02<br />
U ovom delu skripte se definišu i opisuju osnovni pojmovi (tzv. “imunološku nomenklaturu”) i<br />
komponente imunog sistema u pogledu njihove funkcionalne organi<strong>za</strong>cije. U prvom poglavlju e<br />
biti definisani i opisani tipovi imunog odgovora i osnovne karakteristike i osnovni principi<br />
funkcionisanja komponenti imunog sistema. Drugo poglavlje je posveeno opisu elija i tkiva<br />
imunog sistema, sa posebnim osvrtom na odnos strukture i funkcije. Na ovaj nain se stvara<br />
osnova <strong>za</strong> razumevanje naina na koji imuni sistem prepoznaje štetene agense i razvija<br />
ogovarajuu odbrambenu reakciju.<br />
2.1. OSNOVNE KARAKTERISTIKE ORGANIZACIJE I FUNKCIJE IMUNOG SISTEMA<br />
2.1.1. Urodjeni i adaptivni imunitet<br />
Odbrana organizma od<br />
mikroorgani<strong>za</strong>ma i/ili drugih<br />
štetnih agenasa je posredovana<br />
mehanizmima i ranim reakci-<br />
jama urodjenog imuniteta i<br />
kasnijom reakcijom adaptivnog<br />
imuniteta (Slika 2.1. i Tabele<br />
2.1. i 2.2.).<br />
Slika 2.1. Osnovni mehanizmi urodjenog i<br />
steenog imuniteta<br />
7
Urodjeni i adaptivni imunitet su funkcionalno neodvojive komponente imunog sistema i rade na<br />
principu prepoznavanja i neutralisanja (prirodni, urodjeni ili nespecifini mehanizmi<br />
odbrane) i/ili prepo<strong>za</strong>vanja, neutralisanja i uenja/pamenja (adaptivni, steeni ili<br />
specifini mehanizmi odbrane).<br />
Tabela 2.1. Opšte karakteristike imunog odgovora<br />
I M U N I O D G O V O R<br />
URODJENI - PRIRODNI - NE SPECIFINI STEENI - ADAPTIVNI - SPECIFINI<br />
Evolutivno STARIJI MLADJI<br />
Antigen<br />
(specifina funkc. grupa)<br />
antigen ne <strong>za</strong>vistan<br />
i antigen ne specfian odgovor<br />
Maksimalni odgovor skoro trenutno<br />
izlaganje antigenu ne ostavlja nikakav<br />
Memorijski <strong>za</strong>pis<br />
<strong>za</strong>pamen trag o prethodnom susretu<br />
Osnovne komponente Fizike barijere<br />
Hemijski medijatori (sekretovane molekule)<br />
elije: fagocite (neutrofili, makrofagi), NK<br />
elije, K elije, LAAK elije<br />
antigen <strong>za</strong>vistan<br />
i antigen specifian odgovor<br />
postoji latentni period izmedju izlaganja antigenu i<br />
maksimalnog odgovora<br />
izlaganje antigenu rezultira <strong>za</strong>pamivanjem tj.<br />
imunološkom memorijom u vidu memorijskih elija –<br />
elija pamenja<br />
Antigen Prezentujue elije (APC)<br />
B limfociti i antitela (humoralni imuni odg.)<br />
citotoksini T limfociti (elijski imuni odg.)<br />
memorijski B i T limfociti<br />
Zajednike komponente bilo u pogledu<br />
Brojni hemijski medijatori (interleukini, komplement)<br />
aktivacije, efektornih<br />
Fagocitne i Antigen Prezentujue elije (APC)<br />
mehani<strong>za</strong>ma/reakcija ili pomoi<br />
Mastociti, Eozinofili, Bazofili<br />
…<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
Urodjeni imunitet (prirodna ili nespecifina otpornost organizma) je predstavljen skupom<br />
elijskih i biohemijskih odbrambenih mehani<strong>za</strong>ma koji se nalaze u stanju pripravnosti ak i pre<br />
infekcije i veoma brzo odgovaraju na infekciju. Ovi mehanizmi odgovaraju iskljuivo na infekcije<br />
mikroorganizmima i u osnovi razvijaju isti odgovor prilikom ponovljene infekcije. Osnovne<br />
komponenete urodjenog imuniteta su:<br />
(1) fizike i hemijske barijere, kao što su epitel i antimikrobijalne supstance produkovane na<br />
površini epitela;<br />
(2) fagocitne elije (neutrofili i makrofagi) i urodjeno-ubilake elije (engl. Natural Killer - NK<br />
cells) ili elije prirodne ubice;<br />
(3) proteini iz krvi, ukljuujui proteine lanove sistema komplementa, kao i druge medijatore<br />
inflamacije;<br />
8
(4) proteini koji se nazivaju citokini, a regulišu i koordinišu brojne aktivnosti elija nespecifinog<br />
imunog sistema.<br />
Mehanizmi urodjenog imunog sistema prepoznaju i specifini su <strong>za</strong> strukture koje su sline <strong>za</strong><br />
pojedine grupe mikroorgani<strong>za</strong>ma, ali ne mogu da definišu fine i male razlike izmedju stranih<br />
supstanci. Urodjeni imunitet obezbedjuje prvu, ranu, odbranu protiv invazije mikroorgani<strong>za</strong>ma.<br />
Suprotno urodjenom imunitetu, razvio se specifian sistem imunih mehani<strong>za</strong>ma koje stimulišu<br />
izlaganje infektivnom agensu i poveava im se veliina odbrambene sposobnosti pri svakom<br />
narednom izlaganju specifinom agensu. S obzirom da se ova forma imunog odgovora razvija kao<br />
odgovor na infekciju i adaptira se prema infekciji naziva se adaptivna imunost ili adaptivni<br />
imunitet. Osnovna obeležja adaptivnog imuniteta su veoma izražena specifinost <strong>za</strong> odredjene<br />
molekule, kao i sposobnost »pamenja« (memorisanja) i na osnovu toga izraženije i brže reakcije<br />
pri ponovljenom izlaganju istom stranom agensu. Adaptivni imuni odgovor je sposoban da<br />
prepozna i reaguje na veoma veliki broj tzv. »mikrobijalnih« , ali i »nemikrobijalnih« supstanci.<br />
Pored toga, poseduje neverovatno veliku sposobnost i kapacitet da razlikuje ak i veoma bliske<br />
mikroorganizme i/ili molekule i zbog toga se naziva i specifini imunitet. Komponente<br />
adaptivnog imuniteta su limfociti i njihovi produkti. Strane supstance koje indukuju specifian<br />
imuni odgovor i/ili interaguju sa produktima imunološke reakcije nazivaju se antigeni.<br />
Urodjeni (prirodni) mehanizmi odbrane su filogenetski stariji i u pripravnosti su <strong>za</strong> efikasno<br />
delovanje pre bilo kakve naznake o tome da e homeosta<strong>za</strong> biti poremeena stranim agensom. U<br />
sluaju susreta sa stranim agensom deluju brzo i svaki put sa jednakom efikasnošu aktiviraju<br />
raspoložive resurse elija i molekula iako se komponente ovog sistema nisu prethodno srele sa<br />
»napadaem«. Usmereni su relativno nespecifino protiv stranih agenasa (prepoznaju generalno<br />
motive makromolekula koji grade zid bakterijskih elija i sl., ali ne specifine funkcionalne grupe).<br />
Razlikuju strano od sopstvenog (prisutnog u homeostazi), ali nikako ne razlikuju vrstu stranog<br />
agensa i ne ostavljaju nikakav memorijski <strong>za</strong>pis o susretu sa stranim agensom. Na suprot tome,<br />
adaptivni (steeni) mehanizmi odbrane, iako filogenetski mladji, usmereni su protiv tano<br />
odredjene i specifine funkcionalne grupe koja igra ulogu specifinog »aktivatora« elija<br />
adaptivnog imunog sistema. Kao rezultat aktiviranja adaptivnih mehani<strong>za</strong>ma odbrane razvijaju se<br />
specifine efektorne reakcije elijske (citotoksini T limfociti) ili humoralne (antitela)<br />
komponente adaptivnog imunog sistema. Pored toga, adaptivni mehanizmi imunog odgovora<br />
ostavljaju memorijski <strong>za</strong>pis o susretu sa specifinim stranim agensom i nakon ponovljenog<br />
susreta reakcija usmerena ka uništavanju štetnog agensa je snažnija i brža, tj. efikasnija.<br />
9
Tabela 2.2. Poreenje urodjenog i adaptivnog (humoralnog i elijskog) imunog odgovora<br />
Karakteristike Urodjeni imuni odgovor Humoralni imuni odgovor elijski imuni odgovor<br />
Primarne elije Neutrofilni, eozinofilni i bazofilni<br />
granulociti, mastociti, monociti i<br />
makrofagi<br />
B elije T elije<br />
Poreklo elija Crvena koštana srž Crvena koštana srž Crvena koštana srž<br />
Mesto maturacije Crvena koštana srž (neutrofilni,<br />
Mesto gde se nalaze zrele<br />
elije<br />
Produkti primarne<br />
sekrecije<br />
eozinofilni i bazofilni granulociti i<br />
monociti) i tkiva (mastociti i makrofagi)<br />
Crvena koštana srž Timus<br />
Krv, vezivno tkivo, limfatino tkivo Krv i limfatino tkivo Krv i limfatino tkivo<br />
Histamin, kinini, komplement,<br />
prostaglandini, leukotrijeni, interferon<br />
Antitela Citokini<br />
Primarno dejstvo Inflamatorni odgovor i fagocito<strong>za</strong> Zaštita od ekstracelularnih<br />
Reakcije<br />
hipersenziti<strong>za</strong>cije<br />
(preosetljivosti)<br />
antigena (bakterije, toksini,<br />
paraziti, virusi)<br />
Nema Trenutna hipersenzitivnost<br />
(atopija, anafilaksija,<br />
citotoksine reakcije,<br />
kompleksni imuni poremeaji)<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
Zaštita od intracelularnih antigena (virusi,<br />
intracelularne bakterije i gljive) i tumora:<br />
regulacija antitelo-posredovanog i elijskog<br />
imunog odgovora (T elije pomonice i<br />
supresorske T elije)<br />
Odložena hipersenzitivnost (alergija ili infekcija i<br />
kontaktna hipersenzitivnost)<br />
Urodjena i adaptivna otpornost su komponenete integrisanog odbrambenog odgovora organizma u<br />
kome brojne elije i molekuli funkcionišu kooperativno. Iako je urodjena otpornost usmerena na<br />
eliminaciju mikroorgani<strong>za</strong>ma, veliki broj patogenih vrsta je tokom evolucije stekao sposobnost<br />
rezistencije na mehanizme urodjenog imuniteta, te njihova eliminacija <strong>za</strong>heva mone mehanizme<br />
adaptivnog imunog odgovora. Dve najznaajnije veze ova dva sistema su u tome što: (1) urodjeni<br />
mehanizmi imunog odgovora stimulišu adaptivni imuni odgovor i utiu na prirodu adaptivnog<br />
imunog odgovora, dok (2) adaptivni imuni mehanizmi koriste veliki broj efektornih mehani<strong>za</strong>ma<br />
urodjenog imuniteta u eliminaciji mikroorgani<strong>za</strong>ma, esto uveavajui odbrambene aktivnosti<br />
urodjenih odbrambenih mehani<strong>za</strong>ma.<br />
Prema konvenciji/dogovoru termin imuni odgovor i imuni sistem se odnosi na adaptivni<br />
imunitet, dok se <strong>za</strong> urodjeni imunitet više koristi termin urodjena (prirodna) otpornost organizma,<br />
ukoliko nije drugaije naznaeno.<br />
10
2.1.2. Tipovi adaptivnog imunog odgovora<br />
U pogledu korišenja razliitih komponenti i posrednika imunog sistema, kao i u pogledu razliite<br />
funkcije u eliminisanju razliitih antigena, razlikuju se dva tipa adaptivnog imunog odgovora:<br />
humoralni imunitet i elijama-posredovani imunitet (Slika 2.2.). Humoralni imunitet je<br />
posredovan molekulama u krvi i mukoznim sekretima, koje se nazivaju antitela, a produkuju ih<br />
elije koje se nazivaju B limfociti (ili B elije). Antitela prepoznaju antigene mikroorgani<strong>za</strong>ma,<br />
neutrališu infektivnost mikroorgani<strong>za</strong>ma i<br />
»oznaavaju« mikroorganizme <strong>za</strong> eliminaciju<br />
preko razliitih drugih efektornih mehani-<br />
<strong>za</strong>ma imunog sistema. Humoralni imunitet je<br />
osnovni odbrambeni mehani<strong>za</strong>m uperen<br />
protiv vanelijskih (ekstracelularnih) anti-<br />
gena i mikroorgani<strong>za</strong>ma i njihovih toksina<br />
zbog toga što sekretovana antitela imaju<br />
sposobnost vezivanja <strong>za</strong> ove mikroorganizme<br />
i/ili njihove toksine i na taj nain asistiraju u<br />
njihovoj eliminaciji. Antitela su veoma<br />
specijalizovana, te razliita antitela mogu<br />
aktivirati razliite efektorne mehanizme (npr.<br />
neka stimulišu fagocitozu, druga aktiviraju<br />
oslobadjanje inflamatornih medijatora iz<br />
mastocita, i dr.).<br />
Slika 2.2. Tipovi adaptivnog imuniteta<br />
elijama-posredovani imunitet koji se još naziva elijski imunitet je posredovan specifinim<br />
elijama koje se nazivaju T limfociti (ili T elije). elijski imunitet je odgovoran <strong>za</strong> imune<br />
mehanizme kojima se uništavaju unutarelijski (intracelularni) antigeni i mikroorganizmi.<br />
Ovaj tip imunog odgovora se razvio kao odgovor na unutarelijske mikroorganizme, kao što su<br />
virusi i neke bakterije koji preživljavaju i proliferišu i unutar fagocita ili drugih elija organizma<br />
domaina, a njihovi antigeni su nedostupni cirkulišuim antitelima. Odbrana organizma od<br />
ovakvih tipova infekcije je funkcija elijama-posredovanog imuniteta, a time se poboljšava<br />
destrukcija mikoorgani<strong>za</strong>ma »nastanjenih« u fagocitima ili se uništava inficirana elija, kako bi se<br />
eliminisao izvor/rezervoar infekcije.<br />
11
Zaštitna uloga imunosti uperena protiv razliitih vrsta mikroorgani<strong>za</strong>ma i njihovih antigena<br />
može biti indukovana odgovorom organizma domaina na strani antigen ili prenošenjem<br />
antitela ili limofocita koji su specifini <strong>za</strong> antigen/mikroorgani<strong>za</strong>m. Forma imuniteta koja se<br />
indukuje prilikom prvog izlaganja stranom antigenu naziva se aktivni imunitet, <strong>za</strong>to što<br />
organi<strong>za</strong>m ima aktivnu ulogu u odgovoru na antigen (Slika 2.3.). Individue i limfociti koji nisu bili<br />
izloženi specifinom antigenu nazivaju se naivni (intaktni, virgini). Suprotno, individue koje su<br />
odgovorile specifinom reakcijom na antigen <strong>za</strong>štiene su prilikom narednog izlaganja istom<br />
antigenu i kaže se da su imune (otporne) na taj specifini antigen. U <strong>za</strong>visnosti od naina<br />
kontakta sa stranim agensom, i u odnosu na to da li organi<strong>za</strong>m aktivno uestvuje u formiranju<br />
odgovora, razlikuju se aktivan prirodni imunitet (sluajan kontakt sa antigenom i<strong>za</strong>ziva<br />
primarni odgovor; pri prvom kontaktu mogu da se razviju simptomi bolesti, ali ne moraju, a<br />
razvija se otpornost na dati antigen) i aktivan veštaki imunitet - vakcinacija (vakcina sadrži na<br />
neki nain promenjen<br />
antigen tj. on nema<br />
sposobnost virulentnosti ne-<br />
go samo imunogeninosti,<br />
tako da ne i<strong>za</strong>ziva simptome<br />
bolesti; prva vakcinacija<br />
i<strong>za</strong>ziva primarni odgovor, a<br />
sledea odgovor memorijskih<br />
elija, visok titar antitela i<br />
dugotrajnu protekciju).<br />
Slika 2.3. Aktivni i pasivni imunitet<br />
Pasivni imunitet se može ostvariti prenošenjem seruma koji sadrži antitela i/ili limfocita od<br />
specifino imunizovane individue (u procesu koji se naziva adaptivni transfer u eksperimentalnim<br />
situacijama), pri emu primalac seruma/limfocita postaje imun na specifian antigen iako nikada<br />
nije došao u kontakt sa njim, niti je razvio imuni odgovor (Slika 2.3.). Pasivna imuni<strong>za</strong>cija je<br />
koristan metod <strong>za</strong> poboljšanje rezistentnosti u veoma kratkom vremenu, bez potrebe <strong>za</strong> ekanjem<br />
da se razvije adaptivni imuni odgovor. Pasivan prirodni imunitet stie fetus preko placente<br />
majke, kao i odoje preko majinog mleka. Pasivan veštaki imunitet formira se aplikacijom<br />
gotovih antitela, što prouzrokuje momentalnu, ali kratkotrajnu <strong>za</strong>štitu i koristi se kao tretman<br />
koji spašava život kod potencijalno letalnih infekcija kakav je npr. tetanus (ubrizgavanje antitela<br />
12
koja su izolovana iz životinje koja je imunizovana bakterijskim toksinima). U klinikim uslovima<br />
se stepen imuniteta na prethodno izlaganje antigenu/mikoorganizmu meri indiretno, ili analizom<br />
prisustva produkata imunog odgovora (serumska antitela specifina <strong>za</strong> antigene) ili<br />
administracijom supstanci izolovanih i purifikovanih od mikroorgani<strong>za</strong>ma i praenjem/merenjem<br />
reakcije na ove supstance. Reakcija na antigene je vidljiva/merljiva jedino kod individua koje su<br />
ranije bile izlagane istom antigenu i <strong>za</strong> ovakve osobe se kaže da su “senzibilisane” na dati<br />
specifian antigen, a reakcija njihovog organizma je indikator “senzibilisanosti”. Iako reakcija na<br />
izolovani i preišeni antigen nema znaajnu <strong>za</strong>štitnu funkciju, poka<strong>za</strong>no je da su senzibilisane<br />
individue sposobne da ispolje <strong>za</strong>štitni imuni odgovor protiv mikroba.<br />
2.1.3. Osnovne karakteristike/obeležja adaptivnog imunog odgovora<br />
Svi humoralni i elijama-posredovani imuni odgovori prema stranim antigenima ispoljavaju<br />
nekoliko fundamentalnih karakteristika koje su posledica osobina limfocita koji <strong>za</strong>pravo i<br />
posreduju u ovim odgovorima.<br />
Specifinost (engl. specificity) – sigurnost da e veliki broj razliitih antigena i<strong>za</strong>zvati specifian<br />
odgovor.<br />
Diverzitet (engl. diversity)– raznolikost omoguava imunom sistemu da odgovori na veliki broj<br />
razliitih antigena.<br />
Memorija (engl. memory) – dovodi do poveanja odgovora prilikom ponovljenog izlaganja istom<br />
antigenu.<br />
Specijali<strong>za</strong>cija (engl. speciali<strong>za</strong>tion) – generiše odgovore koji su optimalni <strong>za</strong> odbranu protiv<br />
razliitih tipova mikroorgani<strong>za</strong>ma i njihovih antigena.<br />
Ograniavanje sopstvenog (limitacija) tzv. »samoograniavajui« odgovor (engl. self-limitation)<br />
– dozvoljava/omoguava imunom sistemu da se »vrati« u stanje homeostaze.<br />
Ne reaktivnost (tolerantnost) prema sopstvenom (engl. nonreactivity/tolerance to self)–<br />
spreava ošteenje organizma domaina prilikom odgovora na strane antigene.<br />
Specifinost i diverzitet se ispoljavaju kao sposobnost adaptivnog imunog sistema da razvija<br />
specifian mehani<strong>za</strong>m imunog odgovora na veoma razliite antigene, ak i na razliite delove<br />
jednog kompleksa proteina, polisaharida ili drugih makromolekula (Slika 2.4.). Delovi ovakvih<br />
antigena koji se specifino prepoznaju od strane pojedinanih limfocita nazivaju se determinante<br />
(antigene determinante) ili epitope. Ova visoka specifinost postoji zbog toga što pojedini<br />
limfociti ekpresuju membranske receptore koji su sposobni da razlikuju suptilne razlike u<br />
13
strukturi izmedju odredjenih antigena. Klonovi limfocita sa razliitim specifinim receptorima su<br />
prisutni kod neimunizovane (naivne) individue i sposobni su da prepoznaju i reaguju na<br />
specifian antigen, na emu se <strong>za</strong>sniva osnovna postavka hipoteze klonske selekcije koja e<br />
kasnije u tekstu (deo 2.1.5.1. Prepoznavanje antigena) biti malo detaljnije objašnjena. Ukupan<br />
broj antigenih specifinosti limfocita jedne individue se naziva limfocitni repertoar i on je veoma<br />
veliki. Procenjeno je da jedan organi<strong>za</strong>m može razlikovati/odvojiti izmedju 10 7 i 10 9 razliitih<br />
antigenih determinanti. Ovo svojstvo limocita se naziva diverzitet i rezultat je varijabilnosti u<br />
strukturi antigen-vezjueg mesta na limfocitnom receptoru koji vezuje antigene. Drugim reima,<br />
postoji veoma veliki broj klonova limfocita koji se razlikuju po strukturama njihovih antigenih<br />
receptora, te se na taj nain kreira ukupan »repertoar« koji je ekstremno raznolik. Limfociti svakog<br />
klona, nakon aktiviranja specifinim antigenom imaju sposobnost brze proliferacije, stvarajui<br />
potomstvo iste specifinosti koje broji više hiljada elija. To je tzv. klonska ekspanzija koja<br />
osigurava da se adaptivni imunitet suprotstavi brzoj proliferaciju mikoorgani<strong>za</strong>ma. Molekularni<br />
mehanizmi koji omoguavaju i generišu veliki diverzitet u populaciji antigenih receptora bie<br />
pomenuti u Odeljku 4. Maturacija, aktivacija i regulacija limfocita.<br />
Tabela 2.3. Osnovne osobine adaptivnog imunog odgovora<br />
OSOBINA FUNKCIONALNI ZNACAJ<br />
Specifinost Razliiti Ag i<strong>za</strong>zivaju specifine odgovore. Osnova <strong>za</strong> specifine odgovore leži u tome što limfociti ekspresuju membranske<br />
receptore koji razlikuju fine razlike u strukturi koje postoje izmedju razliitih antigena.<br />
Diverzitet<br />
Memorija<br />
Imuni sistem specifino odgovara na širok spektar razliitih Ag (repertoar limfocita - izuzetno veliki; izraunato je da imuni sistem<br />
može da razlikuje, i odgovori specifino, na 10 7-10 9 razliitih imunih determinanti). Drugim reima, postoje mnogi, razliiti klonovi<br />
limfocita koji se razlikuju u strukturi svojih receptora <strong>za</strong> antigene i u specifinosti <strong>za</strong> antigene<br />
Ponovljeno izlaganje istom Ag i<strong>za</strong>ziva vei i brzi imuni odgovor. Stimulacija naivnih limfocita sa Ag stimuliše ekspanziju klonova I<br />
njihovu diferencijaciju na efektorne i dugo živee memorijske elije. Memorijski limfociti imaju specijalne karakteristike koje ih ine<br />
efikasnijim od naivnih limfocita (koji nisu bili u kontaktu sa Ag) u eliminaciji Ag.<br />
Specijali<strong>za</strong>cija Odgovori su specifini i optimalni <strong>za</strong> razliite tipove Ag<br />
Limitacija Imuni odgovor je vremenski ogranien - imuni sistem se vraa na nivo ba<strong>za</strong>lne aktivnosti kada se eliminiše Ag<br />
Tolerancija <strong>za</strong><br />
sopstveno tkivo<br />
Mehanizmi odbrane na strani patogen ne oštecuju sopstvene elije<br />
14
Memorija se ispoljava kao sposobnost elija adaptivnog imunog sistema da na odredjeni nain<br />
»memorišu« (<strong>za</strong>pamte) prethodni kontakt sa<br />
antigenom i da se na taj nain povea<br />
sposobnost reakcije/odgovora prilikom<br />
ponovljenog susreta sa istim antigenom.<br />
Reakcija/odgovor na drugo i svako naredno<br />
izlaganje istom antigenu naziva se<br />
sekundarni imuni odgovor i on je obino<br />
mnogo brži, vei, a esto i kvalitativno razliit<br />
od prvog tzv. primarnog imunog odgovora<br />
na isti antigen (Slika 2.4.).<br />
Slika 2.4. Specifinost, memorija i tolerantnost na sopstveno<br />
ad<br />
aptivnog imunog odgovora<br />
Primarni imuni odgovor se aktivira nakon prvog prodora antigena u organi<strong>za</strong>m tj. kada<br />
predhodno nestimulisani «naivni» limfociti prepoznaju antigen. Svaki naredni kontakt sa istim<br />
antigenom, uglavnom, dovodi do razvijanja sekundarnog imunog odgovora. Sekundarni imuni<br />
odgovor <strong>za</strong>poinje kada memorizujue elije (odredjenog primarnim kontaktom aktiviranog i<br />
proliferisanog klona) prepoznaju iste antigene. Nakon prepoznavanja, one proliferišu i<br />
diferenciraju se u efektorne elije, koje neutrališu antigen. Dakle, sekundarni imuni odgovor se<br />
razvija brže od primarnog i ima veu amplitudu odgovora (npr. vei je titar antitela u serumu).<br />
Smatra se da se <strong>za</strong>jedno sa sekundarnim, ponovo razvija i primarni imuni ogovor, koji e nakon<br />
proliferacije i diferencijacije limfocita, ostaviti odredjeni broj memorizujuih elija u limfatinom<br />
tkivu, cirkulaciji ili kosnoj srži. Imunološka memorija se javlja delimino zbog toga što svako<br />
izlaganje specifinom antigenu dovodi do ekspanzije klona koji poseduje receptore <strong>za</strong> dati antigen.<br />
Pored toga, stimulacija naivnih limfocita antigenima generiše tzv. dugo-živee memorijske elije<br />
(ovaj fenomen e biti opisan u Poglavlju 2.2. elije i tkiva imunog sistema). Ove memorijske elije<br />
imaju specijalne karakteristike koje im omoguavaju da budu mnogo efikasnije u eliminaciji<br />
antigena nego naivni limfociti koji nisu bili u kontaktu sa antigenom (npr. memorijski B limfociti<br />
produkuju antitela, koja vezuju antigene sa veim afinitetom, nego antitela produkovana prilikom<br />
primarnog imunog odgovora; memorijske T elije imaju veu sposobnost »dolaska« na mesto<br />
infekcije nego naivne T elije). Imunološka memorija na neki nain vrši optimi<strong>za</strong>ciju mehani<strong>za</strong>ma<br />
imunog odgovora u borbi sa infekcijama, jer svaki novi susret sa mikroorganizmom i/ili<br />
antigenom generiše sve više memorijskih elija, a aktiviraju se i one koje su prethodno nastale.<br />
15
Sposobnost memorisanja je jedan od razloga zbog kojeg vakcine obezbedjuju dugotrajnu <strong>za</strong>štitu<br />
protiv infekcija.<br />
Specijali<strong>za</strong>cija se ogleda u sposobnosti imunog sistema da, na razliite mikroorganizme, odgovori<br />
na veoma razliite, tano definisane i specijalne naine, maksimalno pojaavajui odbrambene<br />
mehanizme usmerene protiv mikroorgani<strong>za</strong>ma. Prema tome, humoralni imunitet i elijama-<br />
posredovani imunitet mogu biti aktivirani razliitim klasama mikroorgani<strong>za</strong>ma ili istim<br />
mikroorganizmom u razliitim stadijumima infekcije (vanelijske i unutarelijske) i svaki tip<br />
imunog odgovora štiti organi<strong>za</strong>m domaina od date klase mikroorgani<strong>za</strong>ma. ak i u okviru<br />
humoralnog i elijama-posredovanog imunog odgovora, priroda antitela ili T limfocita koji se<br />
generišu može da varira od jedne do druge klase antigena (o specijali<strong>za</strong>ciji e biti diskutovano u<br />
Odeljku 3. Prepoznavanje antigena i Odeljku 4. Maturacija, aktivacija i regulacija limfocita).<br />
Ograniavanje sopstvenog (limitacija) ili tzv. »samoograniavajui« odgovor se ogleda u<br />
sposobnosti imunog sistema da se vrati u stanje »homeostaze« odnosno mirovanja, u kome je bio<br />
»<strong>za</strong>teen« prilikom invazije štetnog agensa, spreman da odgovori na naredni napad antigena.<br />
Naime, svaki normalan imuni odgovor slabi tokom vremena nakon stimulacije sa antigenom, a<br />
imuni sistem se »vraa« u svoje ba<strong>za</strong>lno stanje mirovanja do uspostavljanja homeostaze.<br />
Homeosta<strong>za</strong> se održava u najveoj meri zbog toga što su imuni odgovori uzrokovani antigenima i<br />
funkcionišu u cilju eliminacije antigena, te je stoga neophodna eliminacija osnovnih stimulusa <strong>za</strong><br />
preživljavanje i aktivaciju limfocita. Pored toga, antigeni i imuni odgovori na date antigene<br />
inhibišu sam imuni odgovor.<br />
Nereaktivnost (tolerantnost) prema sopstvenom se ogleda u sposobnosti adaptivnog imunog<br />
sistema da se bori protiv velikog broja razliitih mikroorgani<strong>za</strong>ma, kao i drugih stranih antigena,<br />
ali da u normalnim, fiziološkim uslovima, ne reaguje protiv sopstvenih antigena i/ili potencijalno<br />
antigenih molekula. Jedna od najmarkantnijih karakterijstika svakog normalnog imunog sistema<br />
je njegova sposobnost da prepoznaje, reaguje/odgovara i eliminiše veliki broj stranih (onih koji<br />
organizmu ne pripadaju) antigena, a da istovremeno ne reaguje i stvara ošteenja protiv<br />
sopstvenih (onih koji organizmu pripadaju) antigenih molekula. Tolerancija prema sopstvenim<br />
antigenima ili tolerancija prema sopstvenom se održava na raun nekoliko medjusobno-<br />
koordinisanih mehani<strong>za</strong>ma. Jedan od njih je eliminacija limfocita koji ekspresuju receptore<br />
specifine <strong>za</strong> neke od sopstvenih antigena. Drugi mehani<strong>za</strong>m je dozvoljavanje limfocitima da se<br />
»sretnu« sa drugim sopstvenim antigenima u situaciji kada je onemoguena stimulacija limfocita<br />
16
koji reaguju na sopstveno (engl. self-reactive lymphocytes) ili postoji funkcionalna inaktivacija<br />
ove grupe limfocita. Ovi mehanizmi tolerancije prema sopstvenom i diskriminacije izmedju<br />
sopstvenih i stranih antigena bie detaljnije opisani u Odeljku 4. Maturacija, aktivacija i regulacija<br />
limfocita. Abnormalnosti u indukciji ili održavanju tolerancije prema sopstvenom dovode do<br />
imunog odgovora upravljenog prema sopstvenim tzv. autolognim antigenima i esto rezultira<br />
poremeajima koji se nazivaju autoimune bolesti.<br />
Sve nabrojane karakteristike imunog sistema su neophodne, ukoliko se želi ostvariti odbrambena<br />
funkcija imunog sistema. Specifinost i memorija omoguavaju imunom sistemu da veoma<br />
efikasno eliminiše perzistentne i ponovljenje stimulacije sa istim antigenom, te da sanira infekcije<br />
koje su prolongirane ili uestale. Diverzitet/raznolikost je neophodna da bi imuni sistem odbranio<br />
organi<strong>za</strong>m od mnogih i raznovrsnih potencijalnih patogena iz okruženja. Specijali<strong>za</strong>cija<br />
omoguava imunom sistemu da formira »sopstveni di<strong>za</strong>jn« odgovora kako bi najbolje i<br />
najefikasnije eliminisao razliite vrste antigena. Ograniavanje sopstvenog imunog odgovora<br />
omoguava imunom sistemu da se »vrati« u prvobitno stanje mirovanja nakon eliminacije svakog<br />
stranog antigena i da bude u pripravnosti i sposoban da odgovori pri narednom susretu sa<br />
antigenom. Tolerancija prema sopstvenom je vitalna <strong>za</strong> prevenciju ošteenja sopstvenih elija i<br />
tkiva tokom održavanja funkcije raznolikog repertoara limfocita specifinog <strong>za</strong> strane antigene.<br />
2.1.4. elijske komponente adaptivnog imunog sistema<br />
Osnovne elije imunog sistema su limfociti, antigen prezentujue elije i efektorne elije.<br />
Limofociti su elije koje specifino prepoznaju i odgovaraju na antigen i zbog toga su one<br />
medijatori humoralnog i elijskog imuniteta. Postoje razliite populacije limfocita specifine po<br />
nainu prepoznavanja antigena i funkcijama (Slika 2.5). B limfociti su jedine elije sposobne da<br />
produkuju antitela. Oni prepoznaju ekstracelularne antigene ukljuujui i one na površini elije, a<br />
potom se diferenciraju u elije koje sekretuju antitela, te na taj nain predstavljaju medijatore<br />
humoralnog imuniteta. T limfociti ne produkuju antitela. Ovi limfociti prepoznaju antigene<br />
intracelularnih mikroorgani<strong>za</strong>ma i funkcionišu u smislu uništavanja ovih mikroorgani<strong>za</strong>ma ili<br />
inficiranih elija, te predstavljaju medijatore elijama-posredovanog imuniteta. Antigeni receptori<br />
T limfocita su membranski molekuli razliiti od antitela, ali strukturno pove<strong>za</strong>ni sa njima. T<br />
limfociti imaju ogranienu specifinost <strong>za</strong> antigene, te oni prepoznaju iskljuivo peptidne antigene<br />
koji su <strong>za</strong>kaeni <strong>za</strong> proteine ekspresovane na površini elija domaina, kodirane genima velikog<br />
17
histokompatibilnog kompleksa (engl.<br />
Major Histocompatibility Complex –<br />
MHC). Stoga T elije prepoznaju i<br />
odgovaraju iskljuivo na antigene<br />
ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> površinu elije (engl. cell<br />
surface antigens), dok na solubilne<br />
antigene ne reaguju. T limfociti<br />
podrazumevaju razliite subpopulaci-<br />
je, a najbolje definisne su pomone T<br />
elije (pomonice) i citolitini ili<br />
citotoksini T limfociti (engl.<br />
Cytolytic T Lymphocites - CTLs). Kao<br />
markeri <strong>za</strong> fenotipsko razlikovanje<br />
subpopulacija limfocita mogu se<br />
koristiti membranski proteini.<br />
Slika 2.5. Klase limfocita<br />
Na primer, elije pomonice ekspresuju membranski protein CD4, dok citotoksini T limfociti<br />
ekspesuju CD8 protein. T i B limfociti imaju klonalno distribuirane receptore <strong>za</strong> antigen tj. postoji<br />
veliki broj klonova <strong>za</strong> razliite antigene, a pripadnici istog klona imaju iste receptore <strong>za</strong> antigene<br />
na svojim membranama. Geni koji kodiraju receptore <strong>za</strong> antigene, se formiraju rekombinacijom<br />
DNA segmenata, tokom razvoja ovih elija. Somatske rekombinacije generišu milione razliitih<br />
gena <strong>za</strong> receptore, formirajui vrlo širok repertoar razliitih limfocita. Kao odgovor na stimulaciju<br />
antigenom, pomone T elije sekretuju proteine koji se nazivaju citokini, a njihova funkcija je da<br />
stimulšu proliferaciju i diferencijaciju kako samih T elija, tako i drugih elija ukljuujui B elije,<br />
makrofage i druge leukocite. Citotoksine T elije uništavaju elije koje produkuju strane<br />
antigene, kao što su elije inficirane virusim ili drugim intracelularnim mikroorganizmima.<br />
Specifini T limfociti ija je funkcija da uestvuju uglavnom u inhibiciji imunog odgovora nazivaju<br />
se regulatorni T limfociti. Njihovo stvaranje i precizna fiziološka uloga još uvek nije precizno<br />
definisana. Pored B i T limfocita, trea klasa limfocita su tzv. urodjeno-ubilake elije (engl.<br />
Natural Killer - NK cells) ili elije prirodne ubice ukljuene u urodjenoj otpornosti na viruse i<br />
druge intracelularne mikroorganizme. Inicijacija i razvoj adaptivnog imunog odgovora <strong>za</strong>hteva<br />
da antigeni budu »uhvaeni« i »izloženi« specifinim limfocitima. elije koje ispunjavaju ova dva<br />
<strong>za</strong>datka i koje su u službi »serviranja« antigena limfocitima nazivaju se antigen prezentujue<br />
18
elije (engl. Antigen Presenting Cells - APC). Najspecijalizovanije APC su dendritske elije kože<br />
osposobljene da hvataju antigene koji dospevaju iz spoljašnjeg okruženja, da ih transportuju do<br />
limfoidnih organa i na kraju da prezentuju ove antigene naivnim T limfocitima kako bi se aktivirao<br />
imuni odgovor. Drugi elijski tipovi funkcionišu kao APC u razliitim stadijumima humoralnog i<br />
elijama-posredovanog imuniteta. Aktivacija limfocita antigenima vodi ka generisanju velikog<br />
broja razliitih medjusobno koordinisanih mehani<strong>za</strong>ma koji imaju <strong>za</strong> cilj eliminaciju antigena i<br />
veoma esto <strong>za</strong>htevaju prisustvo specifinih elija koje se nazivaju efektorne elije. U razliitim<br />
tipovima imunog odgovora efektorne elije mogu biti npr. aktivirani T limfociti, mononuklearni<br />
fagociti i druge elije imunog sistema. Limfociti i »dodatne« elije koje su u funkciji imunog<br />
sistema su koncentrisani u anatomski diskretnim limfoidnim organima gde one medjusobno<br />
interaguju i iniciraju imuni odgovor. Limfociti su takodje prisutni i u krvi i odatle mogu da<br />
recirkulišu u limfoidna tkiva, a potom na periferiju koja je izložena antigenu i da ga tamo<br />
eliminišu. Detaljnije informacije o elijskoj komponeneti imunog sistema bie predoene u<br />
Poglavlju 2.2. elije i tkiva imunog sistema.<br />
2.1.5. Faze adaptivnog imunog odgovora<br />
Adaptivni imuni odgovor se odvija kroz nekoliko fa<strong>za</strong> – prepoznavanje antigena, aktivacija<br />
limfocita i efektorna fa<strong>za</strong> eliminacije antigena – praena »povratkom« u stanje homeostaze i<br />
održavanja memorije (Slika 2.6.).<br />
Svi imuni odgovori <strong>za</strong>poinju<br />
prepoznavanjem specifinog atigena.<br />
Ovo prepoznavanje prouzrokuje i<br />
vodi ka aktivaciji limfocita koji su<br />
prepoznali antigen, a kulminira u<br />
razvoju efektornih mehani<strong>za</strong>ma koji<br />
posreduju fiziološku funkciju<br />
imunog odgovora, odnosno,<br />
eliminaciju antigena. Nakon<br />
eliminacije anitigena, imuni odgovor<br />
slabi i obnavlja se homeosta<strong>za</strong>.<br />
Slika 2.6. Faze adaptivnog imunog odgovora<br />
19
U narednim delovima teksta je dat sažet prikaz pojedinih fa<strong>za</strong> adaptivnog imunog odgovora, a<br />
detaljnije informacije bie predoene u posebnom poglavlju.<br />
2.1.5.1. Prepoznavanje antigena<br />
Svaka individua poseduje veliki broj limfocita klonskog porekla, pri emu je svaki klon nastao od<br />
jednog jedinog prekursora i sposoban je da prepozna i reaguje na odredjenu antigenu<br />
determinantu, te se nakon ulaska antigena »selektuje« specifian postojei klon i aktivira<br />
antigenom (Slika 2.7.). Ovaj fundamentalni princip imunog sistema se naziva hipote<strong>za</strong> klonske<br />
selekcije, a predložena je kao hipote<strong>za</strong> koja objašnjava kako imuni sistem može da ogovori na<br />
veliki broj razliitih antigena. Prema ovoj hipotezi, antigen-specifini klonovi limfocita se razvjaju<br />
ranije i ne<strong>za</strong>visno od izlaganja<br />
antigenu. elije unutar jednog<br />
klona poseduju identine antigene<br />
receptore koji se razlikuju od<br />
antigenih receptora na elijama<br />
lanicama drugih klonova. Iako je<br />
veoma teško postaviti gornju gra-<br />
nicu broja antigenih determinanti<br />
koje prepoznaje imuni sistem<br />
sisara, naješe se koriste<br />
vrednosti izmedju 10 7 i 10 9. Ovo je<br />
razumljiva aproksimacija broja<br />
razliitih antigenskih receptornih<br />
proteina koji se produkuju te<br />
reflektuje broj pojedinih klonova<br />
limfocita prisutnih u svakom<br />
organizmu.<br />
Slika 2.7. Hipote<strong>za</strong> klonske selekcije<br />
Ovo je razumljiva aproksimacija broja razliitih antigenskih receptornih proteina koji se<br />
produkuju, te reflektuje broj pojedinih klonova limfocita prisutnih u svakom organizmu. Strani<br />
antigeni interaguju i aktiviraju postojee klonove antigen-specifinih limfocita tj. onih koji imaju<br />
20
eceptore <strong>za</strong> datu antigenu determinantu, u specijalizovanom limfoidnom tkivu gde imuni odgovor<br />
<strong>za</strong>poinje.<br />
2.1.5.2. Aktivacija limfocita<br />
Aktivacija limfocita <strong>za</strong>hteva prepoznavanje dva razliita signala: prvi je antigen a drugi je<br />
komponenta urodjenog imunog odgovora na mikroorganizme koji su oštetili eliju (Slika 2.8.).<br />
Ovaj fenomen je definisan kao hipote<strong>za</strong> dva signala <strong>za</strong> aktivaciju<br />
limfocita. Potreba <strong>za</strong> antigenom (tzv. signalom 1 ili prvim<br />
signalom) garantuje specifinost imunog odgovora (registrovae ga<br />
samo klon koji ima specifini receptor <strong>za</strong> taj antigen). Potreba <strong>za</strong><br />
dodatnim stimulusom iniciranim od strane mirkoorgani<strong>za</strong>ma ili<br />
reakcije urodjenog imuniteta na mikroorganizme (tzv. signal 2<br />
ili drugi signal) garantuje da e imuni odgovor biti indukovan<br />
onda kada bude potreban (protiv mikroorgani<strong>za</strong>ma ili drugih<br />
štetnih agenasa) a ne protiv bezopasnih molekula ukljuujui i<br />
sopstvene antigene.<br />
Slika 2.8. Dva signala su neophodna <strong>za</strong> aktivaciju limfocita<br />
Odgovor limfocita na antigene i drugi signal ukljuuje sintezu novih proteina, proliferaciju<br />
elija i diferencijaciju u efektorne i memorijske elije. To podrazumeva aktivaciju transkripcije<br />
gena koji ranije nisu bili aktivni tj. sintezu novih proteina, i proliferaciju elija odredjenog klona.<br />
U sluaju nekih akutnih virusnih infekcija, veliina klona aktivranog antigenom može biti 50 000<br />
puta vea od ba<strong>za</strong>lne. Antigenom-aktivirani limfociti se diferenciraju u efektorne elije,<br />
(citotoksini T limfociti, elije pomonice i plazma elije), ija je funkcija da eliminišu antigene, i<br />
memorijske elije, koje su dugoživee i pokazuju uvean odgovor prilikom ponovnog susreta sa<br />
istim antigenom. Periferni limfatini vorovi su mesto gde B i T limfociti odgovaraju na antigene<br />
(koji pristižu iz perifernog tkiva putem limfe). U slezini limfociti odgovaraju na antigene poreklom<br />
iz krvi.<br />
2.1.5.3. Efektorna fa<strong>za</strong> adaptivnog imunog odgovora: eliminacija antigena<br />
Tokom efektorne faze imunog odgovora limfocti koji su bili specifino aktivirani antigenima<br />
ostvaruju efektorne funkcije koje vode do eliminacije antigena. Efektorne i neke memorijske elije,<br />
napuštaju limfne vorove, odlaze u periferno tkivo na mesto infekcije gde su neophodne <strong>za</strong><br />
21
eliminaciju mikroba. Eliminacija ekstracelularnih i intracelularnih antigena posredstvom antitela<br />
i T limfocita veoma esto <strong>za</strong>hteva ueše kako drugih, tzv. nelimfatinih elija, tako i ueše<br />
odbrambenih mehani<strong>za</strong>ma koji su operativni u urodjenom imunom odgovoru. Prema tome, isti<br />
mehanizmi urodjenog imunog odgovora, koji obezbedjuju prvu liniju odbrane protiv infektivnih<br />
agenasa, mogu biti korišeni prilikom odredjenih adaptivnih odgovora u eliminaciji<br />
mikroorgani<strong>za</strong>ma. Pored toga, kao što je napomenuto ranije, veoma važna generalna funkcija<br />
adaptivnog imunog odgovora je da pojaava efektorne mehanizme urodjenog imuniteta i da ih<br />
fokusira na ona tkiva i elije koji su napadnuti stranim antigenom.<br />
2.1.5.4. Homeosta<strong>za</strong>: Slabljenje/opadanje/nestajanje imunog odgovora<br />
Na kraju imunog odgovora, imuni sistem se vraa u svoje ba<strong>za</strong>lno stanje mirovanja, najveim<br />
delom zbog toga što veina antigen-stimulisanih limfocita umire apoptozom. Apopto<strong>za</strong> je forma<br />
regulisane, fiziološke elijske smrti u kojoj nukleus prolazi konden<strong>za</strong>ciju i fragmentaciju, plazma<br />
membrana postaje »mehurasta« i ispunjena vezikulama, interna struktura i poredak<br />
membranskih lipida se gubi, te mrtva elija biva veoma brzo fagocitirana i pre izlivanja njenog<br />
sadržaja. Apopto<strong>za</strong> je proces suprotan nekrozi, obliku elijske smrti, u toku koga nuklearana i<br />
elijska membrana pucaju i sadržaj se izliva što aktivira mehanizme lokalne inflamatorne reakcije.<br />
Velika frakcija antigenima-aktiviranih limfocita ulazi u proces apoptoze verovatno zbog toga što<br />
preživljavanje limfocita <strong>za</strong>visi od antigena i antignenom-indukovanih faktora rasta, te kada imuni<br />
odgovor eliminiše antigen kojim je bio iniciran, limfociti ostaju bez stimulusa esencijalnih <strong>za</strong><br />
preživljavanje i umiru. Za preživljavanje memorizujuih elija nije potrebna stimulacija sa<br />
antigenom. Izvestan broj memorizujuih elija migriraja u limfne noduse (gde obezbedjuje pul<br />
antigen specifinih limfocita, koji mogu biti brzo aktivirani i diferencirani u efektorne elije,<br />
prilikom ponovnog izlaganja istom antigenu), dok druge ostaju u mukoznom tkivu ili cirkulišu u<br />
krvi (odakle mogu biti regrutovane <strong>za</strong> brzi odgovor u bilo kom delu tela).<br />
Osnovni pojmovi i principi uvedeni u ovom poglavlju detaljnije e biti objašnjeni u tekstu poglavlja<br />
koja slede.<br />
22
2.2. ELIJE I TKIVA IMUNOG SISTEMA<br />
elije koje ine imuni sistem (IS) i koje su odgovorne <strong>za</strong> funkciju IS, se nalaze rasute po svim<br />
tkivima u organizmu, prisutne su u cirkulaciji (cirkulišu krvotokom i limfotokom), ili su<br />
organizovane u anatomski definisane grupacije elija tzv. limfne organe. Anatomska organi<strong>za</strong>cija<br />
ovih elija i njihova sposobnost da cirkulišu po organizmu tj. da se stalno kreu i rasporedjuju<br />
izmedju krvi, limfe i tkiva, je od suštinskog znaaja <strong>za</strong> nastajanje imunog odgovora (IO).<br />
Da bi IS bio efikasan u borbi protiv razliitih patogena mora da <strong>za</strong>dvolji sledee <strong>za</strong>hteve:<br />
1. treba da odgovori na mali broj razliitih mikroba koji mogu da prodru na bilo kom<br />
mestu u organi<strong>za</strong>m;<br />
2. mali broj elija IS (tzv. naivnih limfocita), treba da specifino prepozna i odgovori na<br />
strane antigene;<br />
3. efektorni mehanizmi imunog sistema (Ab i efektorni T limfociti) treba da unište strane<br />
mikrobe na mestima njihovog prodora u organi<strong>za</strong>m, kao i na mestima koja su udaljena od<br />
mesta prodora mikroba.<br />
Sposobnost IS da se suoi sa ovim <strong>za</strong>htevima i da efikasno <strong>za</strong>stiti organi<strong>za</strong>m od stranih Ag, <strong>za</strong>visi<br />
od organi<strong>za</strong>cije i karakteristika elija i tkiva IS.<br />
Specijalizovana tkiva (periferni limfatini organi) vezuju (koncentrišu) antigene koji prodiru<br />
kroz glavne ulaze u organi<strong>za</strong>m (koža, GIT, RS). Vezivanje antigena i njihov transport do<br />
limfatinih organa je prvi korak u adaptivnom IO.<br />
Naivni limfociti (limfociti koji nisu bili u kontaktu sa antigenom) migriraju kroz periferne<br />
limfatine organe i tu se susreu sa antigenom, prepoznaju ga i iniciraju IO. (Memorijski i<br />
efektorni limfociti nastaju od antigen-stimulisanih naivnih limfocita).<br />
Efektorni i memorijski limfociti cirkulišu krvotokom i dospevaju i do mesta prodora<br />
antigena i tu se <strong>za</strong>državaju. Time je omogueno sistemsko delovanje imuniteta tj. da imuni<br />
mehanizmi funkcionišu bilo gde u organizmu.<br />
23
2.2.1. elije imunog sistema<br />
elije koje su ukljuene u adaptivni IO su:<br />
antigen-specifini limfociti,<br />
specijalizovane elije koje iskazuju antigene i time aktiviraju limfocite (engl. antigen-<br />
presenting cells, APCs),<br />
efektorne elije koje eliminišu antigene.<br />
Tabela 2.4. elije imunog sistema i njihova primarna funkcija<br />
TIP ELIJE PRIMARNA FUNKCIJA TIP ELIJE PRIMARNA FUNKCIJA<br />
P R I R O D N I IM U N I T E T S T E E N I I M U N I T E T<br />
Neutrofilni<br />
Fagocito<strong>za</strong> i inflamatorni procesi; naješe prvi<br />
granulociti<br />
napuštaju cirkulaciju i dolaze do inficiranog tkiva<br />
Monociti Napuštaju cirkulaciju i u tkivima se razvijaju u<br />
makrofage<br />
Makrofagi Najmoniji fagociti; znaajni u kasnim<br />
stadijumima infekcije i reparacije tkiva,<br />
rasporeeni su u celom organizmu u cilju<br />
pravovremenog »hvatanja« stranih agenasa;<br />
produkuju antigene; uestvuju u aktivaciji T i B<br />
limfocita<br />
Bazofilni granulociti Pokretljive elije, napuštaju cirkulaciju, dospevaju<br />
do tkiva gde pospešuju oslobaanje jedinjenja<br />
koja uestvuju u inflamatornim procesima<br />
Mastociti Nepokretne elije u vezivnom tkivu; pospešuju<br />
Eozinofilni<br />
granulociti<br />
inflamatorne procese<br />
B elije Nakon aktivacije, diferenciraju se u<br />
plazma elije ili memorijske B elije<br />
Plazma elije Produkuju antitela koja su direktno ili<br />
indirektno odgovorna <strong>za</strong> destrukciju<br />
antigena<br />
Memorijske B elije<br />
Brzo i efikasno odgovaraju na antigen<br />
na koji je imuni sistem prethodno ve<br />
reagovao; odgovorne <strong>za</strong> imunitet<br />
Citotoksine C elije Odgovorne <strong>za</strong> destrukciju elija<br />
liziranjem ili produkcijom citokina<br />
T elije odgovorne <strong>za</strong><br />
odgodjenu hipersenzitivnost<br />
Produkuju citokine koji pospešuju<br />
inflamatorne procese<br />
Iz krvi prelaze u razliita tkiva i oslobaaju<br />
jedinjenja koja inhibišu inflamatorne procese T elije pomonice Aktiviraju B elije i efektorne T elije<br />
Prirodne elije ubice Liziraju tumorske elije i elije inficirane virusima Supresorske T elije Inhibiraju B elije i efektorne T elije<br />
Memorijske T elije Brzo i efikasno odgovaraju na antigen<br />
na koji je imuni sistem prethodno ve<br />
reagovao; odgovorne <strong>za</strong> steeni<br />
imunitet<br />
Dendritske elije Procesuju antigene i uestvuju u<br />
aktivaciji B i T elija<br />
24
položeno jedro i tanak sloj citoplazme u kojoj se nalaze<br />
oskudno <strong>za</strong>stupljene organele (nekoliko mitohondrija,<br />
ribozoma, lizozoma bez specijalizovanih organela). Pre<br />
stimulacije sa antigenom, naivni limfociti se nalaze u stanju<br />
mirovanja, u G0 fazi elijskog ciklusa. Nakon susreta sa<br />
antigenom, naivni limfociti, ulaze u G1 fazu, postaju vei<br />
(10-12 µm u dijametru), imaju više citoplazme i organela, i<br />
povišen nivo citiplazmatine RNA, i dobijaju naziv veliki<br />
limfociti ili limfoblasti.<br />
Slika 2.9. Kretanje elija imunog sistema tokom<br />
imunog odgovora<br />
Dendritske elije “love” antigene na mestu njihovog<br />
prodora u organi<strong>za</strong>m i transportuju/koncentrišu ih do<br />
limfnih vorova, gde aktiviraju naivne limfocite koji<br />
su putem krvi dospeli u limfne vorove. Efektorne i<br />
memorijske elije, koje su nastale u limfnom voru,<br />
ulaze u cirkulaciju i putem krvi dospevaju do bilo kog<br />
tkiva. Antitela, takodje, dospevaju u krvotok i tako<br />
mogu da lociraju antigene bilo gde u organizmu.<br />
Memorijske elije, mogu da ostanu u perifernom<br />
limfatinom tkivu ili mogu da udju u krvotok.<br />
2.2.1.1. Limfociti<br />
Limfociti su jedine elije u organi-<br />
zmu sposobne da specifino pre-<br />
poznaju antigene. Oni su odgo-<br />
vorni <strong>za</strong> dve osnovne karakteristi-<br />
ke adaptivnog IO, <strong>za</strong> specifinost i<br />
postojanje imunološke memorije.<br />
Morfologija limfocita<br />
Naivni limfociti su elije koje nisu<br />
bile u kontaktu sa antigenom.<br />
Zbog njihove veliine i izgleda<br />
morfolozi ih nazivaju mali limfociti.<br />
To su elije dijametra 8-10 µm,<br />
koje imaju veliko, centralno<br />
Slika 2.10. Faze elijskog ciklusa limfocita<br />
25
Klase limfocita<br />
Iako su morfološki posmatrano isti, limfociti se razlikuju po svojoj funkciji kao i po proteinskim<br />
produktima. B limfociti (nosioci humoralnog imuniteta), su dobili naziv <strong>za</strong>to što kod ptica ove<br />
elije sazrevaju u Bursi Fabricii. Sisari ne poseduju anatomski ekvivalent Burse Fabricii, te oni<br />
sazrevaju u kosnoj srži. T limfociti (medijatori elijske imunosti), nastaju u kosnoj srži, a <strong>za</strong>tim<br />
migriraju i sazrevaju u timusu. T limfocite ine dve grupe limfocita, T elije pomonice i citolitiki<br />
(citotoksini) T limfociti (CTLs). T i B limfociti poseduju klonalno distribuirane receptore <strong>za</strong><br />
antigene. Drugim reima, postoji mnogo klonova ovih elija koji se medjusobno razlikuju po<br />
specifinosti njihovih receptora <strong>za</strong> odredjene antigene (pripadnici istog klona ekspresuju iste<br />
receptore <strong>za</strong> antigen, koji se razlikuje od receptora pripadnika drugog klona). Geni koji kodiraju<br />
receptore <strong>za</strong> antigene se formiraju rekombinacijom segmentata DNA u toku razvoja ovih elija.<br />
Zahvaljujui ovim somatskim rekombinacijama nastaju geni <strong>za</strong> milione razliitih receptora i tako<br />
nastaje vrlo velik i raznolik repertoar limfocita. Urodjeno-ubilake elije (engl. natural killer cells;<br />
NK) su trea populacija limfocita koja poseduje razliite receptore od T i B limfocita i ija je<br />
funkcija ve<strong>za</strong>na <strong>za</strong> nespecifinu imunost (prirodnu otpornost).<br />
Tabela 2.5. Klase limfocita<br />
KLASA FUNKCIJA RECEPTOR ZA ANTIGEN FENOTIPSKI MARKER<br />
T limfociti - pomonice Stimulišu rast i diferencijaciju B<br />
Citolitiki T limfociti<br />
(citotoksini)<br />
limfocita.<br />
Aktiviraju makrofage sekrecijom<br />
citokina.<br />
Uništavaju virusom inficirane elije,<br />
tumorske elije; odbacivanje alografta.<br />
heterodimer CD3 +, CD4 +, CD8 -<br />
heterodimer CD3 +, CD4 -, CD8 +<br />
B limfociti Produkcija antitela Antitelo ve<strong>za</strong>no <strong>za</strong> membranu<br />
Urodjeno-ubilake<br />
elije<br />
Uništavaju virusom inficirane elije,<br />
tumorske elije;<br />
limfocita (imunoglobulin)<br />
Imunoglobulinu-slian receptor na<br />
ubilakim elijama<br />
Fc receptori; klasa II MHC;<br />
CD19; CD21<br />
Fc receptor <strong>za</strong> IgG<br />
Membranski proteini se mogu koristiti kao fenotipski markeri <strong>za</strong> razlikovanje funkcionalno<br />
razliitih populacija limfocita. Na primer, veina T elija pomonica ekspresuje površinske<br />
proteine tzv CD4, dok veina CTLs ekspresuje površinske proteine CD8. Antitela specifina <strong>za</strong> te<br />
markere, obeležena odgovarajuim probama, mogu se koristiti <strong>za</strong> identifikaciju i izolaciju razliitih<br />
populacija limfocita. *Prihvaena nomenklatura <strong>za</strong> markere limfocita je CD nomenklatura. CD<br />
(CD16)<br />
26
(cluster of differentiation) je istorijski termin koji oznaava kolekciju monoklonalnih antitela, koja<br />
su specifina <strong>za</strong> razliite markere diferencijacije limfocita. CD sistem obezbedjuje uniforman<br />
pristup u identifikaciji površinskih molekula na limfocitima, APCs i mnogim drugim elijskim<br />
tipovima imunog sistema. Mnogi od ovih proteina/markera imaju znaajnu ulogu u funkciji<br />
Diferencijacija limfocita<br />
limfocita.<br />
Slika 2.11. Morfologija limfocita. A- limfocit u perifernoj krvi (svetlosna mikroskopija);<br />
B- mali limfocit (elektronska mikroskopija); C- veliki limfocit (elektronska mikroskopija).<br />
Kao i ostale elije krvi, i limfociti nastaju u kosnoj srži. U toku kompleksnog procesa sazrevanja<br />
(maturacije) oni ekspresuju receptore <strong>za</strong> antigene i dobijaju funkcionalne i fenotipske<br />
karakteristike zrele elije. B limfociti sazrevaju u kosnoj srži, dok T limfociti napuštaju kosnu srž,<br />
nastanjuju timus, i tu maturiraju u zrelu formu. Zrele forme limfocita napuštaju kosnu srž i<br />
timus, ulaze u cirkulaciju i<br />
nasta-njuju periferne limfne<br />
organe. Zrele forme limfocita,<br />
koje se nalaze u limfnim voro-<br />
vima, a nisu bile u kontaktu sa<br />
antigenom, nazivaju se naivni<br />
limfociti.<br />
Slika 2.12. Sazrevanje limfocita<br />
Funkcija naivnih limfocita je da prepoznaju antigene i iniciraju adaptivni IO. Ukoliko se ne sretnu<br />
sa antigenom, naivni limfociti posle nekog vremena bivaju izloženi apoptozi i umiru, a populacija<br />
se održava na odredjenom nivou <strong>za</strong>hvaljujui nastajanju novih naivnih limfocita od progenitornih<br />
elija kosne srži. Procenjeno je da poluživot naivnih limfocita miša iznosi oko 3-6 meseci, dok<br />
humani limfociti žive nekoliko godina. Veruje se da je <strong>za</strong> preživljavanje naivnih limfocita<br />
neophodno “slabo” prepoznavanje sopstvenih antigena, tako da elije primaju signale koji ih<br />
održavaju u životu, a nedovoljni su da aktiviraju diferencijaciju u efektorne elije. Priroda ovih<br />
auto-antigena znaajnih <strong>za</strong> preživljavanje naivnih limfocita, <strong>za</strong> sada nije poznata. Drugim reima,<br />
receptor <strong>za</strong> antigen na naivnim limfocitima je neophodan ne samo <strong>za</strong> prepoznavanje stranog<br />
antigena i iniciranje diferencijacije u efektorne elije, nego i <strong>za</strong> preživljavanje naivnih elija.<br />
Takodje, smatra se da su i citokini znaajni <strong>za</strong> preživljavanje naivnih limfocita.<br />
27
Aktivacija limfocita<br />
Antigeni i drugi stimuluisi aktiviraju naivne limfocite da se diferencijraju u efektorne i memorijske<br />
elije. Ova aktivacija se odvija u nekoliko fa<strong>za</strong>.<br />
Sinte<strong>za</strong> novih (de novo) proteina. Odmah nakon stimulacije <strong>za</strong>poinje transkripcija gena,<br />
koji su predhodno bili u mirovanju, i sinte<strong>za</strong> novih proteina. Sintetišu se citokini (u T elijama),<br />
koji stimulišu rast i diferencijaciju limfocita i drugih efektornih elija; citokinski receptori, koji<br />
ine limfocite senzitivnim na stimulaciju<br />
citokinima; i mnogi drugi proteini<br />
ukljueni u transkripciju gena i deobu<br />
elija.<br />
Proliferacija elija. Kao odgovor<br />
na antigen i faktore rasta produkovane iz<br />
elija, antigen-specifini limfociti bivaju<br />
<strong>za</strong>hvaeni mitotikim deobama. Ovo vodi<br />
ka proliferaciji i poveanju antigen-<br />
specifinog klona tj. ekspanziji klona.<br />
Kod nekih akutnih infekcija virusima,<br />
broj virus-specifinih T limfocita može da<br />
poraste pedeset hiljada puta u odnosu na<br />
ba<strong>za</strong>lni (nestimulisani) broj.<br />
Slika 2.13. Faze aktivacije limfocita<br />
Diferencijacija u efektorne elije. Neki od antigen-stimulisanih limfocita se diferenciraju<br />
u efektorne elije, ija je funkcija eliminacija antigena. Efektorni limfociti su: pomone T elije,<br />
CTLs i B limfociti koji produkuju antitela. Diferencirane T elije pomonice, na membrani<br />
ekspresuju proteine, koji mogu da reaguju sa ligandima drugih elija (kao sto su makrofage i B<br />
limfociti), a takodje sekretuju citokine koji aktiviraju druge elije. Diferencirani CTLs imaju<br />
granule koje sadrže proteine ukljuene u uništavanje virusom-inficiranih elija kao i tumorskih<br />
elija. B limfociti se diferenciraju u elije koje sintetišu i sekretuju antitela (plazma elije). One<br />
imaju širi sloj citoplazme sa dobro razvijenim granuliranim endoplazmatskim retikulumom (gde se<br />
sintetišu antitela i drugi proteini, koji se sekretuju ili ulaze u sastav membrane limfocita), kao i<br />
perinuklearni Golgi kompleks (gde molekule antitela dobijaju konanu formu i gde se pakuju u<br />
sekretorne vezikule). Smatra se da više od 1/2 ukupne mRNA plazma elija kodira proteine<br />
antitela. Plazma elije se razvijaju u limfoidnim organima na mestu IO, i mogu da migriraju na<strong>za</strong>d<br />
28
u kosnu srž, gde neke od njih žive duži period nakon <strong>za</strong>vršetka IO. Ipak veina plazma elija ne<br />
živi dugo nakon eliminacije antigena.<br />
Diferencijacija u memorijske elije. Neki od antigen-stimulisanih B i T limfocita se<br />
diferenciraju u memorijske elije, koje su odgovorne <strong>za</strong> brzi i masovan IO, nakon ponovnog<br />
susreta sa istim antigenom (sekundarni IO). Memorijske elije preživljavaju u stanju<br />
funkcionalnog mirovanja i nekoliko godina nakon eliminacije antigena. Od naivnih i efektornih<br />
limfocita se razlikuju po proteinima koje ekspresuju na svojoj membrani. Memorijski B limfociti<br />
na membrani ekspresuju Ig kao što su IgG, IgE i IgA dok naivni B limfociti imaju IgM i IgD.<br />
Takodje, memorijski T limfociti u odnosu na naivne T elije na membrani imaju više adhezivnih<br />
molekula, kao što su integrini i CD44. Ovi proteini promovišu migraciju memorijskih elija na<br />
mesto infekcije. Neke memorijske elije migriraju u limfne vorove gde obezbedjuju pul antigen-<br />
specifinih limfocita, koji mogu brzo da odgovore na ponovni prodor antigena (mogu brzo da<br />
proliferišu u efektorne elije). Druge memorijske elije, nastanjuju mukozna tkiva ili cirkulišu<br />
krvotokom, odakle brzo mogu da budu regrutovane u efektorni odgovor, i usmerene na mesto<br />
prodora antigena.<br />
2.2.1.2. Antigen-prezentujue elije (APCs)<br />
Antigen-prezentujue elije (APCs) su populacije elija koje su specijalizovane da “hvataju”<br />
antigene i iskazuju ih na svojim membranama, T limfocitima. One, obezbedjuju signal koji<br />
stimuliše proliferaciju i diferencijaciju T limfocita. Najbrojnija populacija APCs, ukljuena u<br />
aktivaciju T limfocita su dendritske elije. Makrofage, kao i B limfociti, takodje, mogu da<br />
funkcionišu kao APCs (B limfociti mogu da iskažu antigene, na svojoj membrani, T elijama<br />
pomonicama). Specijalizovane elije tzv. folikularne dendritske elije, iskazuju antigene B<br />
limfocitima, tokom odredjenih fa<strong>za</strong> humoralnog imunog odgovora.<br />
Dendritske elije. Dendritske elije imaju znaajnu ulogu u “hvatanju” proteinskih<br />
antigena i indukciji elijskog imunog odgovora (stimulaciji T limfocita). Ove elije se nalaze ispod<br />
epitela u veini organa, gde “hvataju” antigene, a <strong>za</strong>tim ih transportuju do perifernih limfoidnih<br />
organa. Tu se dendritske elije sreu sa T limfocitima. Veina potie od monocitne loze i otuda<br />
naziv mijeloidne dendritske elije.<br />
Mononuklearni fagociti. Sistem mononuklearnih fagocita se sastoji od elija ija je<br />
primarna funkcija fagocito<strong>za</strong>. elije ovog sistema potiu od elija kosne srži, koje ulaze u<br />
cirkulaciju a potom sazrevaju i bivaju aktivirane u razliitim tkivima.<br />
Monociti su nepotpuno diferencirane elije koje napuštaju kosnu srž, i ulaze u<br />
cirkulaciju. Monociti su dijametra 10-15 µm, imaju bubrežasto jedro i granuliranu citoplazmu<br />
29
koja, izmedju ostalog, sadrži lizozome, fagocitne vakuole i citoskeletne filamente. Kada dospeju u<br />
tkiva, ove elije sazrevaju i postaju makrofage. Nakon aktivacije, makrofage se mogu razviti u<br />
razliite morfološke forme. One koje se nalaze u blizini epitelnih elija u koži, razvijaju izrazito<br />
veliku citoplazmu i nazivaju se epiteloidne elije. Aktivirane makrofage se mogu fuzionisti i tako<br />
formirati multinukleatne džinovske elije. Makrofage se nalaze u svim organima, i vezivnim<br />
tkivima, i u <strong>za</strong>visnosti od lokali<strong>za</strong>cije imaju razliite nazive. Na primer, u CNS se zovu mikrogli-<br />
jalne elije; kada oblažu vaskularne sinuse u jetri, nazivaju se Kupferove elije; u pluima su<br />
alveolarne makrofage; dok se multinukleatni fagociti kosti zovu osteoklasti.<br />
Makrofage, koje su fagocitirale antigene, prikazuju te antigene na svojoj membrani, efektornim T<br />
limfocitima. Efektorni T limfociti, onda, aktiviraju makrofage da unište antigene. Ovakva<br />
Slika 2.14. Sazrevanje mononuklearnog fagocita<br />
dešavanja predsta-<br />
vljaju glavni mehani-<br />
<strong>za</strong>m elijskog imunog<br />
odgovora protiv intra-<br />
celularnih mikroba<br />
(antigena).<br />
Makrofage, takodje, aktiviraju naivne T limfocite i indukuju primarni IO. Ipak, smatra se da su<br />
dendritske elije mnogo efikasnije u indukovanju primarnog IO. Mononuklearni fagociti su,<br />
takodje, znaajne efektorne elije u nespecifinom i u specifinom IO (prirodnom i steenom IO).<br />
Efektorne funkcije makrofaga ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> nespecifinu imunost su fagocito<strong>za</strong> mikroba i produkcija<br />
citokina koji aktiviraju druge elije ukljuene u inflamatorni odgovor. U adaptivnom IO,<br />
makrofage takodje, imaju znaajne efektorne funkcije: u elijskom IO, antigen-stimulisani T<br />
limfociti aktiviraju makrofage da unište fagocitirani antigen; u humoralnom IO, receptori <strong>za</strong><br />
antitela, koji se nalaze na membrani makrofaga, prepoznaju antigene okružene antitelima<br />
(opsonine) i fagocitiraju ih.<br />
Folikularne dendritske elije. Folikularne dendritske elije (FDCs) su prisutne u<br />
germinalnim centrima limfnih folikula u limfnim vorovima, slezini i mukoznim limfoidnim<br />
tkivima. Veina ovih elija nije poreklom od elija kosne srži i nije srodna dendritskim elijama.<br />
FDCs “hvataju” antigene u kompleksu sa antitelom ili produkte komplementa, i iskazuju ove<br />
antigene na svojim membranama, da bi bili prepoznati od B limfocita.<br />
30
2.2.2. Anatomija i funkcija limfoidnih tkiva<br />
Vrlo važna karakteristika IS, koja omoguava elijske interakcije neophodne <strong>za</strong> faze<br />
prepoznavanja i aktivacije IO, je da su limfociti i ostale elije koje pomazu IO, lokalizovane i<br />
koncetrisane u anatomski definisanim tkivima ili organima. Antigeni koji prodiru u organi<strong>za</strong>m se<br />
transportuju do ovih tkiva, to su mesta njihove koncentracije, i tu se antigeni sreu sa T<br />
Slika 2.15. Limfoidni organi u organizmu oveka<br />
2.2.2.1. Kosna srž<br />
limfocitima. Limfoidna tkiva su klasifikovana<br />
kao:<br />
generativni organi (primarni<br />
limfoidni organi), u kojima limfociti<br />
ekspresuju receptore <strong>za</strong> antigene i<br />
fenotipski i funkcionalno maturiraju;<br />
periferni organi (sekundarni limfoidni<br />
organi), gde se inicira proliferacija i<br />
razvoj limfocita kao odgovor na prodor<br />
stranih antigena.<br />
Primarni limfoidni organi sisara su kosna srž,<br />
gde nastaju svi limfociti, i timus, gde T limfociti<br />
maturiraju i dobijaju funkcionalne kompe-<br />
tencije.<br />
Sekundarnim limfoidnim organima i tkivima<br />
pripadaju limfni vorovi, slezina, kožni i<br />
mukozni imuni sistem, kao i agregati limfocita<br />
koji se nalaze u vezivnom tkivu gotovo svih<br />
organa sa izuzetkom CNS.<br />
Kosna srž je mesto nastajanja svih elija krvi, ukljuujui i nezrele limfocite, kao i mesto gde B<br />
limfociti maturiraju. U toku fetalnog perioda hematopoe<strong>za</strong> se odvija u žumananoj kesi i para-<br />
aortinom mezenhimu, a kasnije i u fetalnoj jetri i slezini. Ovu funkciju postepeno, tokom<br />
vremena, preuzima kosna srž i to pogotovo kosna srž pljosnatih kostiju, tako da u pubertetu<br />
hematopoetsku sposobnost uglavnom imaju srži sternuma, kimenih pršljena, rebara i iliane<br />
31
kosti. Crvena kosna srž ovih kostiju (koja ima hematopoetsku sposobnost) je retikularna formacija<br />
smeštena izmedju trabekula. Prostori u ovoj sundjerastoj formaciji su ispunjeni masnim elijama,<br />
stromalnim fibroblastima i prekursornim elijama krvi. Ove prekursorne elije sazrevaju i ulaze u<br />
gustu mrežu vaskularnih sinusa, i tako ulaze u cirkulaciju. Kada je kosna srž ošteena ili postoje<br />
veliki <strong>za</strong>htevi <strong>za</strong> krvnim elijama, jetra i slezina mogu da budu mesta ekstramedularne<br />
hematopoeze. Sve krvne elije potiu od <strong>za</strong>jednike stem celije, koja delovanjem odredjenih<br />
faktora postaje opredeljena elija <strong>za</strong> odredjenu lozu (eritroidnu, megakariocitnu, granulocitno-<br />
monocitnu i limfocitnu). Stem elije ne poseduju markere karakteristine <strong>za</strong> diferencirane krvne<br />
elije ali ekspresuju proteine CD34 i Sca-1 (engl. stem cell antigen-1), preko kojih je mogua<br />
njihova identifikacija. Proliferacija i matura-cija prekursorskih elija u kosnoj srži je stimulisana<br />
Slika 2.16. Hematopoe<strong>za</strong><br />
citokini-ma (mnogi od<br />
ovih citokina se<br />
nazivaju stimulirajui<br />
faktori kolonije koji se<br />
sekre-tuju iz<br />
stromalnih elija i<br />
makrofaga i<br />
obezbedjuju lokalno<br />
okruženje po-godno <strong>za</strong><br />
hematopoezu. 1<br />
Kosna srž, sadrži i<br />
dugoživece plazma eli-<br />
je koje sekretuju anti-<br />
tela, a koje su nastale<br />
u perifernim limfati-<br />
nim tkivima nakon<br />
susreta sa antigenom.<br />
1 Stem elije imaju potencijal da se razviju u razliite tipove elija. Klase stem elija (u koliko razliitih tipova elija mogu da se diferencijraju):<br />
Totipotentne elije (oplodjena jajna elija)<br />
Pluripotentne<br />
Multipotentne (HSCs, expresuju markere /proteine/ CD34 i Sca-1 – koriste se <strong>za</strong> identifikaciju stem elija iz suspenzije elija kosne srži, prilikom<br />
transplantacije kosne srži).<br />
32
2.2.2.2. Timus<br />
Timus je mesto maturacije T limfocita. Sastoji se iz dva režnja, a svaki režanj je fibroznim septama<br />
podeljen na vei broj lobulusa.<br />
2.2.2.3. Limfni vorovi i limfatini sistem<br />
Svaki lobulus je podeljen na korteks (spolja; gusto<br />
nastanjen T limfocitima - timociti) i medulu (unutra;<br />
redje naseljenu T limfocitima). Rasute po timusu su i<br />
nelimfoidne epitelijalne elije, makrofage i dendritske<br />
elije. Neke od timusnih dendritskih elija ekspresuju<br />
specifine markere, kao sto je CD8 koji je tipian <strong>za</strong> T<br />
limfocite, pa se zovu limfoidne dendritske elije (<strong>za</strong><br />
razliku od mijeloidnih dendritskih elija opisanih ranije).<br />
Timus je dobro vaskularizovan i sadrži eferentni limfatini<br />
sud koji se drenira u medijastinalni limfni vor. Nezreli T<br />
limfociti dospevaju do korteksa krvotokom, i tu <strong>za</strong>poinje<br />
njihova maturacija. U toku maturacije timociti migriraju u<br />
medulu, tako da medula sadrži uglavnom zrele T limfocite.<br />
Zreli T limfociti napuštaju timus i krvotokom dospevaju do<br />
perifernih limfatinih organa.<br />
Slika 2.18. Morfologija timusa<br />
Limfni vorovi su agregati elija bogatih limfocitima, smešteni duž limfnih sudova. Sastoje se od<br />
korteksa i medule. Okruženi su fibroznom kapsu-lom, a brojni aferentni limfatini sudovi izlivaju<br />
limfu u subkapsularni (marginalni) sinus. Limfa napušta vor preko eferentnih limfatinih<br />
sudova, koji izlaze kroz hilum. Ispod subkapsularnog sinusa korteks sadrži agregate elija tzv.<br />
folikule. Neki folikuli sadrže centralne delove, zvane germinalni centri, koji se svetlo boje<br />
klasinim histološkim bojama. Folikuli bez germinalnog centra su primarni folikuli, a oni sa<br />
germinalnim centrima, sekundarni folikuli. Oko limfatinih i vaskularnih sudova se nalaze<br />
prostori koji sadrže limfocite kao i dendritske elije i mononuklearne fagocite. Ispod korteksa,<br />
nalazi se medulla koja je nastanjena makrofagama i plazma elijama. Krv dospeva u limfni vor<br />
arterijama (kroz hilus) koje se u korteksu granaju u kapilare, a napušta vor venskim sudom koji<br />
izlazi kroz hilus.<br />
33
Razliite klase limfocita su rasporedjene u razliitim regionima limfnog vora. Folikuli su B<br />
elijske zone limfnog vora. Primarni folikuli sadrže<br />
uglavnom zrele, naivne B limfocite. Germinalni centri<br />
se razvijaju u <strong>za</strong>visnosti od stimulacije antigenom. To<br />
su mesta intenzivne proliferacije B limfocita, selekcije<br />
elija koje produkuju specifina antitela, i mesta<br />
nastajanja memorijskih elija. Nastavci FDCs formiraju<br />
retikularnu mrežu u germinalnim centrima. T limfociti<br />
nastanjuju korteks ispod i izmedju folikula. Oko 70% T<br />
limfocita korteksa su CD4 + pomone T elije, izmedju<br />
njih se nalaze CD8 + T limfociti. Dendritske elije,<br />
takodje, nastanjuju T elijsku zonu limfnog vora.<br />
Razliita anatomska distribucija odredjenih klasa<br />
limfocita, u limfnom voru, je determinisana<br />
citokinima. Naivni T i B limfociti ulaze u limfni vor<br />
kroz arterije. Ove elije napuštaju cirkulaciju i ulaze u<br />
stromu korteksa limfnog vora kroz specijalizovane<br />
sudove tzv. “high endothelial venules” (HEVs).<br />
Slika 2.18. Morfologija limfnog vora<br />
Naivni T limfociti ekspresuju receptore <strong>za</strong> hemokine<br />
(citokine) tzv. CCR7. CCR7 prepoznaje hemokine koji<br />
se produkuju samo u T zoni nodusa tj. hemokini<br />
privlae naivne T limfocite u T zonu nodusa.<br />
Dendritske elije takodje ekspresuju CCR7 i migriraju<br />
u oblast koju nastanjuju naivni T limfociti. Naivne B<br />
elije, ekspresuju drugi hemokinski receptor, CXCR5, koji prepoznaje hemokine produkovane u<br />
folikulima tj. u B elijskoj zoni limfnog vora. Ovakva anatomska organi<strong>za</strong>cija limfnog vora<br />
omoguava da je svaka populacija limfocita u bliskom kontaktu sa odgovarajucim APCs (npr.<br />
naivni T limfociti sa dendritskim elijama a B elije sa FDCs).<br />
34
Nakon stimulacije sa antigenima B i T elije gube receptore koji ih <strong>za</strong>državaju u odredjenim<br />
Slika 2.18. Raspored T i B limfocita u limfnom voru<br />
regionima limfnog vora. Aktivirani T limfociti izlaze<br />
iz vora i ulaze u cirkulaciju, dok aktivirane B elije<br />
migriraju u germinalne centre ili u medulu odakle<br />
sekretuju antitela.<br />
Antigeni, uglavnom, do limfnih vorova<br />
dospevaju kroz limfne sudove. Koža, epitel i<br />
parenhimatini organi poseduju brojne limfne<br />
kapilare koji absorbuju i dreniraju intersticijalnu<br />
tecnost, limfu. Iz limfnih kapilara limfa se drenira u<br />
vee limfne sudove, pa u još vee i vee a <strong>za</strong>tim u<br />
ductus toracicus koji se uliva u vena cava superior.<br />
Ovim putem se svakodnevno u krvotok vraa par<br />
litara limfe. Antigeni (mikrobi) esto u telo prodiru<br />
preko kože, gastrointestinalnog i respiratornog<br />
trakta. Ova tkiva ispod epitela imaju dendritske<br />
elije. Dendritske elije »hvataju« strane antigene,<br />
migriraju u limfni sud i dospevaju do limfnih vorova<br />
koji funkcionišu kao filteri pre ulivanja limfe u<br />
krvotok. Kada limfa kroz aferentne limfne sudove<br />
udje u limfni vor, ona se izliva u stromu limfnog<br />
vora. Dendritske elije koje nose antigene migriraju<br />
u T elijsku zonu (stromu) i tu se <strong>za</strong>državaju.<br />
Solubilni antigeni bivaju fagocitrani od strane<br />
dendritskih elija i makrofaga koje se nalaze u<br />
stromi limfnih vorova rezultat je akumulacija i koncentracija antigena u limfnim vorovima i<br />
njihova prezentacija u formi koja može biti prepoznata od strane specifinih T limfocita.<br />
2.2.2.4. Slezina<br />
Slezina je smeštena u gornjem levom kvadrantu trbušne duplje i izgradjena je od crvene i bele<br />
pulpe. Bela pulpa se sastoji od limfnog tkiva organizovanog u podruja koja sadrže odvojeno T i B<br />
limfocite. T limfociti su smešteni oko arteriola, tako da formiraju T elijsku zonu tzv.<br />
periarterijalna limfoidna zona. B limfociti su organizovani, slino limfnim vorovima u limfoidne<br />
folikule koji grade B elijsku zonu. B limfociti su organizovani vorovima u limfoidne folikule.<br />
35
Limfoidni folikuli gra-<br />
de B elijsku zonu.<br />
Arteriole se <strong>za</strong>vršavaju<br />
u vaskularnim sinusi-<br />
ma, oko kojih su rasu-<br />
ti eritrociti, makrofage,<br />
dendritske elije, nešto<br />
limfocita i plazma<br />
elija. Ovakva morfolo-<br />
ška organi<strong>za</strong>cija ini<br />
crvenu pulpu slezine.<br />
Mehani<strong>za</strong>m raspodele<br />
razliitih klasa limfoci-<br />
ta je slian onom u li-<br />
mfnim vorovima, i <strong>za</strong>-<br />
visi od prisustva he-<br />
mokina. Antigeni i<br />
limfociti ulaze u slezi-<br />
nu kroz vaskularne si-<br />
nuse. U <strong>za</strong>visnosti od<br />
hemokina T limfociti<br />
bivaju privueni u T elijske zone a B limfociti ulaze u folikule. Splenina vena nosi krv iz slezine<br />
u portalni krvotok. Slezina je mesto gde se odvija filtracija krvi, a crvena pulpa slezine je glavno<br />
mesto fagocitoze opsonizovanih mikroba (okruženih antitelima). Osobe bez slezine su izuzetno<br />
podložne bakterijskim infekcijama i<strong>za</strong>zvnim meningokokama i pneumokokama <strong>za</strong>to što se ove<br />
bakterije eliminišu opsoni<strong>za</strong>cijom i fagocitozom.<br />
2.2.2.5. Kožni imuni sistem<br />
Slika 2.20. Limfni sistem<br />
Koža sadrži specijalizovan imuni sistem koji se sastoji od limfocita i APCs. Koža je najvei organ u<br />
telu i znaajna fizika barijera izmedju organizma i spoljašnje sredine. Koža je aktivni uesnik u<br />
odbrani organizma od stranih patogena i ima sposobnost da generiše i podrži lokalnu imunu i<br />
inflamatornu reakciju. Epidermis kože sadrži vei broj elijskih populacija: keratinociti,<br />
melanociti, epidermalne Langerhansove elije i intraepitelijalne T elije. Melanociti i keratinociti<br />
nemaju naroitog znaaja u adaptivnom imunom odgovoru, iako keratinociti produkuju nekoliko<br />
36
citokina i tako doprinose nespecificnim imunim i inflamatornim reakcijama. Langerhansove elije<br />
su nezrele dendritske elije, koje svojim nastavcima formiraju gotovo kontinu-alnu mrežu <strong>za</strong><br />
hvatanje antigena u supraba<strong>za</strong>lnom epidermisu. Nakon sti-mulacije citokinima, Langerhansove<br />
elije retrahuju svoje nastavke, gube<br />
adhezivne karakteristike koje ih vezuju <strong>za</strong><br />
epide-rmalne elije i migriraju u dermis.<br />
Putem limfe dospevaju do limfnih<br />
vorova. Ovaj proces je sitimulisan<br />
hemokinima koji deluju specifino na<br />
Langerhansove elije. Intraepitelijalni<br />
limfociti ine oko 2% od ukupnog broja<br />
limfocita u koži (ostali se nalaze u<br />
dermisu), veina od njih su CD8 + T<br />
limfociti. Intraepidermalni T limfociti<br />
ekspresuju ogranien set receptora <strong>za</strong><br />
antigene. Kod miševa (i još nekih vrsta)<br />
mnogi intraepidermalni T limfociti<br />
ekspresuju receptor koji nije tipian <strong>za</strong> T limfocite i sastoji se iz i lanaca (<strong>za</strong> razliku od tipinog<br />
receptora <strong>za</strong> antigene na CD4 + i CD8 + elijama, koji je izgradjen od i lanca). receptor <strong>za</strong><br />
antigene je takodje karakteristian i <strong>za</strong> intraepitelijalne T limfocite intestinuma, što je verovatno<br />
pove<strong>za</strong>no sa prepoznavanjem mikroba koji obino prodiru kroz epitel. Dermis, kao i druga vezivna<br />
tkiva, sadrži rasute makrofage i T limfocite (CD4 + i CD8 +) uglavnom oko krvnih sudova. Nije jasno,<br />
da li su ove elije stalno nastanjene u dermisu ili su se tu <strong>za</strong>tekle u recirkulaciji (u tranzitu)<br />
izmedju krvi i limfe.<br />
2.2.2.6. Mukozni imuni sistem<br />
Slika 2.21. Kožni imuni<br />
sistem<br />
Mukozna površina gastrointestinalnog i respiratornog trakta je nastanjena limfocitima i APCs koji<br />
iniciraju IO na progutane i inhalirane antigene. Kao i koža, epitel mukoze je mesto mogueg<br />
prodora stranih antigena, i predstavlja barijeru izmedju spoljašnje i unutrašnje sredine<br />
organizma. U mukozi gastrointestinalnog trakta, limfociti su u veem broju nadjeni u 3 regiona: u<br />
epitelijalnom sloju, rasuti po lamini proprii i u anatomski uoblienim tvorevinama u lamini proprii<br />
tankog creva u tzv. Pajerovim ploama. elije na svakoj od ovih lokacija imaju karakteristine<br />
fenotipske i funkcionalne karakteristike. Veina intraepitelijalnih limfocita su T elije. Kod ljudi,<br />
37
to su uglavnom CD8 +, od kojih 10% ima receptor <strong>za</strong> antigene na T celijama (TCR) u formi <br />
Slika 2.22. Mukozni imuni sistem<br />
lanaca. Lamina pro-<br />
pria sadrži mešanu<br />
populaciju elija koja<br />
ukljuuje T limfocite,<br />
uglavnom CD4 +, koji<br />
imaju fenotip aktivi-<br />
ranih elija. Verova-<br />
tno, T limfociti prepo-<br />
znaju i odgovaraju na<br />
antigene, u mezente-<br />
rinom limfnom vo-<br />
ru, a <strong>za</strong>tim migriraju<br />
na<strong>za</strong>d u intestinum<br />
gde naseljavaju lami-<br />
nu propriu. Lamina<br />
propria, takodje, sa-<br />
drži i veliki broj akti-<br />
viranih B limfocita,<br />
plazma elija, kao i<br />
makrofage, dendri-<br />
tske elije, eozinofile i<br />
mastocite. Pored ra-<br />
sutih limfocita, mu-<br />
kozni imuni sistem,<br />
sadrzi organizovana limfna tkiva tzv. Pajerove ploe. Kao limfoidni folikuli slezine i limfnih vo-<br />
rova centralni delovi folikula su B elijske zone koje esto sadrže i germinalne centre. U<br />
interfolikularnim regionima Pajerovih ploa se nalaze malobrojni CD4 + limfociti. Neke od<br />
epitelijalnih elija koje prekrivaju Pajerove ploe su specijalizovane M (membranske) elije. Ove<br />
elije su izgubile mikrovile, i <strong>za</strong>dobile funkciju aktivne pinocitoze tj. transportuju makromolekule<br />
iz crevnog lumena u subepitelijalno tkivo. Smatra se da M elije imaju važnu ulogu u transportu<br />
antigena do Pajerovih ploa. Folikuli slini Pajerovim ploama su <strong>za</strong>stupljeni u apendiksu i u<br />
manjem broju u ostalim regionima gastrointestinalnog i respiratornog trakta.<br />
38
2.2.2.7. Putevi i mehanizmi recirkulacije limfocita<br />
Limfociti se stalno kreu kroz krvotok i limfni sistem, kreui se od jednog do drugog perifernog<br />
limfatinog tkiva, kao i ka mestima prodora antigena tj. ka mestima inflamacije.<br />
Ovo stalno kretanje limfocita izmedju razliitih lokacija naziva se recirkulacija limfocita, a<br />
mehanizmi koji regulišu koji limfociti e nastaniti koja tkiva = ‘homing” limfocita (npr. odredjene<br />
populacije limfocita ulaze u jedna tkiva a ne u druga). Putevi recirkulacije naivnih limfocita se<br />
razlikuju od puteva efektornih i memorijskih elija. Tako naivni limfociti recirkulišu kroz periferne<br />
limfoidne organe, dok efektorni limfociti migriraju u periferna tkiva ka mestima infekcije i<br />
inflamacije.<br />
Slika 2.23. Putevi recirkulacije T limfocita<br />
39
Recirkulacija limfocita i njihova migracija u odredjeno tkivo je omoguena:<br />
adhezionim molekulima na limfocitima, endotelijalnim elijama i u ekstracelularnom<br />
matriksu;<br />
hemokinima koji se produkuju u endotelu i u drugim tkivima.<br />
Adhezija limfocita <strong>za</strong> endotelne elije koje oblažu postkapilarne venule, determiniše koja tkiva e<br />
biti nastanjena limfocitima.<br />
Adhezija limfocita <strong>za</strong> komponente ekstracelularnog matriksa u tkivu i njihovo odvajanje od<br />
matriksa, odredjuje koliko dugo e limfociti biti <strong>za</strong>držani u odredjenom ekstravaskularnom<br />
prostoru, pre nego što limfom i limfotokom budu ponovo vraeni u krvotok.<br />
Adhezione molekule koje se ekspresuju na limfocitima se nazivaju “homing” receptori a ligandi<br />
koji se ekspresuju na vaskularno-endotelnim elijama su adresini.<br />
“Homing” receptori na limfocitima su molekule koje pripadaju familijama:<br />
selektina<br />
integrina i<br />
Ig superfamiliji.<br />
Naravno, ovi receptori su razliiti od receptora <strong>za</strong> antigen, a model recirkulacije limfocita je<br />
ne<strong>za</strong>visan od antigena.<br />
Recirkulacija naivnih T limfocita kroz limfoidne organe<br />
Naivni T limfociti uglavnom nastanjuju i recirkulišu kroz periferne limfatine organe, gde<br />
prepoznaju i odgovaraju na strane antigene. Kao što je poznato, antigeni su koncentrisani u<br />
limfnim vorovima i slezini, gde su iska<strong>za</strong>ni na membranama dendritskih elija, a kretanje<br />
naivnih limfocita kroz limfne vorove i slezininu poveava verovatnou susreta sa tim antigenima<br />
(a samim tim i iniciranje adaptivnog imunog odgovora) 2. Naivni limfociti koji udju u limfni vor,<br />
napuštaju cirkulaciju kroz modifikovane postkapilarne venule tzv. “high endotelial venules”<br />
(HEVs), i migriraju u stromu limfnog vora. HEVs su prisutne i u mukoznim limfoidnim organima<br />
kao što su Pajerove ploe u crevu. Migracija naivnih limfocita iz cirkulacije u stromu limfnog vora<br />
ukljuuje seriju interakcija, izmedju limfocita i endotelnih elija HEVa. Naivni limfociti na svojoj<br />
membrani ekspresuju homing recepror, L-selektin (CD62L, pripada familiji selektina), a HEVs<br />
ekspresuju adresin (peripheral node addressin, PNAd) koji je ligand <strong>za</strong> L-selektin. Vezivanje L-<br />
selektina <strong>za</strong> ligand je interakcija niskog afiniteta, tako da strujanje krvi kroz venulu kida tu vezu,<br />
nakon ega se ve<strong>za</strong> ponovo uspostavlja ali na drugom mestu. Drugim reima, T limfociti ostaju<br />
ve<strong>za</strong>ni <strong>za</strong> HEV samo nekoliko sekundi, <strong>za</strong>tim se odvajaju i vežu ponovo na drugom mestu. Ovo<br />
izgleda kao valjanje limfocita po površini endotela. U limfnom voru se produkuju hemokini, koji<br />
2 Neto protok limfocita kroz limfne ovorove je vrlo visok ~25 x 10 9 elija prodje kroz limfni vor u toku jednog dana<br />
40
se takodje iskazuju na površini endotelnih elija, tako da limfociti koji se valjaju po površni<br />
endotela reaguju i sa hemokinima. Ovo poveava silu vezivanja limfocita <strong>za</strong> endotel i oni mogu da<br />
se provuku izmedju endotelnih elija u stromu limfnog vora. U stromi limfociti migriraju prema<br />
gradijentu hemokina koji ih privlae. T elije, koje ekspresuju CCR7, migriraju u zonu koja<br />
produkuje hemokine koji e se ve<strong>za</strong>ti <strong>za</strong> ove receptore (T elijsku zonu), a B elije, koje ekspresuju<br />
CXCR5, migriraju u limfoidne folikule pod uticajem hemokina koji se vezuju <strong>za</strong> CXCR5. Naivni T<br />
limfociti koji ulaze u limfni vor mogu biti aktivirani antigenom. Nekoliko sati posle prodora<br />
antigena, protok krvi kroz limfni vor može biti povean i do 20 puta. Ovo poveava broj naivnih<br />
limfocita koji dospevaju<br />
na mesto koncentracije<br />
antigena. Naivne T elije<br />
koje ulaze u limfni vor<br />
“skeniraju” dendritske<br />
elije na prisustvo<br />
antigena i ako prepo-<br />
znaju antigen, one se<br />
aktiviraju, umnožavaju<br />
(klonalna ekspanzija) i<br />
diferenciraju na efekto-<br />
rne i memorijske T<br />
elije. T elije koje se ne<br />
susretnu sa antigenom,<br />
izlaze iz limfnog vora<br />
kroz eferentne limfatine<br />
sudove, vraaju se u ci-<br />
rkulaciju, a potom na-<br />
stanjuju drugi limfni<br />
vor. Malo se zna o ho-<br />
mingu limfocita u slezini<br />
-nema morfoloski difere-<br />
nciranih HEVs-a.<br />
Slika 2.24. Migracija naivnih i<br />
efektornih T limfocita<br />
41
Migracija efektornih i memorijskih T limfocita na mesto inflamacije<br />
Efektorne i memorijske elije koje napuštaju limfne vorove odlaze u periferno tkivo, na mesto<br />
infekcije gde su neophodne <strong>za</strong> eliminaciju mikroba u efektornoj fazi adaptivnog imunog odgovora.<br />
Diferencijacija naivnih u efektorne elije je praena i promenama ekspresije nekoliko adhezionih<br />
molekula. Ekspresija L-selektina opada, a nivo E- i P-selektina i CD44 raste. Diferencirane<br />
efektorne elije, takodje, gube ekspresiju CCR7 receptora <strong>za</strong> hemokine. Kao rezultat gubitka<br />
receptora, efektorne elije ne ostaju u limfnom voru, ve eferentnim limfatikim sudovima ulaze<br />
u cirkulaciju. Kao rezultat nespecifi-nog odgovora, na mestu infekcije, se produkuju citokini.<br />
Neki deluju na endotel i stimulišu ekspresiju liganda <strong>za</strong> integrine, kao i E- i P-selektine. Integrini<br />
T elija se vežu <strong>za</strong> svoje ligande na endotelnim elijama i migriraju iz krvnog suda u podruje<br />
infekcije. Integrini i CD44 se takodje vezuju <strong>za</strong> proteine ekstracelularnog matriksa što <strong>za</strong>država<br />
efektorne T elije u podruju infekcije.<br />
Memorijske elije poseduju heterogen model ekspresije adhezionih molekula, i u <strong>za</strong>visnosti od njih<br />
migriraju i <strong>za</strong>državaju se u odredjenim limfoidnim tkivima.<br />
Recirkulacija B limfocita<br />
Migracija B limfocita u razliita tkiva je slina migraciji T limfocita, i regulisana je istim<br />
molekularnim mehanizmima.<br />
Naivne B elije migriraju u folikule limfnih vorova, (L-selektin CXCR5 receptor <strong>za</strong> hemokine na<br />
membrani naivnih B limfocita). Nakon aktivacije B elije gube ekspresiju CXCR5, napuštaju<br />
folikul i ulaze u T zonu limfoidnog organa. Aktivirane B elije ekspresuju integrine, koje koriste da<br />
migriraju u periferna tkiva. Neke plazma elije koje produkuju antitela, migriraju u kosnu srž.<br />
Mehani<strong>za</strong>m ove migracije nije poznat. Ostale elije koje produkuju antitela ostaju u limfoidnim<br />
organima, a antitela ulaze u cirkulaciju i putem krvi dospevaju do antigena.<br />
42
PREPOZNAVANJE ANTIGENA 03<br />
Adaptivni imuni odgovor <strong>za</strong>poinje specifinim prepoznavanjem antigena od strane limfocita. U<br />
ovom delu e biti opisana molekularna i elijska osnova prepoznavanja antigena, kao i<br />
specifinosti T i B limfocita ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> prepoznavanje antigena.<br />
Osnovni nosioci funkcije prepoznavanja antigena u adaptivnom IO su 3 klase molekula:<br />
antitela<br />
molekuli glavnog kompleksa histokompatibilnosti (major histocompatibility complex; MHC)<br />
receptor <strong>za</strong> antigen na T limfocitima (T cell antigen receptor; TCR).<br />
Medju njima, antitela su najbolje prouena, imaju najširi dijapazon vezivanja razliitih antigenih<br />
struktura, imaju veliku sposobnost razlikovanja razliitih antigena, i imaju najvei afinitet <strong>za</strong><br />
antigene.<br />
3.1. KARAKTERISTIKE ANTIGENA<br />
Antigen je bilo koja supstanca koja može specifino da se veže <strong>za</strong> antitelo ili TCR. Antitela mogu<br />
da prepoznaju razliite biološke molekule, ukljuujui, jednostavne intermedijarne metabolite,<br />
šeere, lipide, hormone, kao i makromolekule kao što su kompleksi karbohidrata, fosfolipida,<br />
nukleinskih kiselina i proteina. Medjutim, samo su makromolekule sposobne da stimulišu B<br />
limfocite i iniciraju humoralni imuni odgovor. Molekuli koji su sposobni da iniciraju imuni<br />
odgovor se nazivaju imunogeni. Mali molekuli, mogu da se vežu <strong>za</strong> antitela ali nisu sposobni da<br />
iniciraju imuni odgovor (nisu imunogenini). U praksi, ovakve molekule (hapteni) se vezuju <strong>za</strong><br />
makromolekule pre imuni<strong>za</strong>cije. Kompleks hapten-nosa može da funkcioniše kao imunogen.<br />
Molekuli su obino mnogo vei nego deo preko koga se vežu <strong>za</strong> antitelo/receptor.<br />
43
Antitelo se vezuje <strong>za</strong> odredjen mali deo molekule antigena koji se zove antigena determinanta ili<br />
epitop. Antigene determinante mogu biti formirane kovalentnom strukturom ili kao u sluaju<br />
proteina i nukleinskih kiselina, nekovalentnim organizovanjem molekule u prostoru. Ukoliko<br />
epitope formira nekoliko susednih ostataka aminokiselina tj. determinisane su linearnom<br />
sekvencom zovu se linearne determinante. Ako ih ine ostaci aminokiselina koji nisu u linearnoj<br />
sekvenci nego predstavljaju ostatke aminokiselina u 3D prostoru onda su to konformacione<br />
determinante. Antitela koja prepoznaju konformacione determinante obino prepoznaju nativne<br />
proteine dok antitela koja prepoznaju linearne determinante obino prepoznaju denaturisane<br />
proteine.<br />
Makromolekule obino sadrže multiple determinante. Neke od njih se ponavljaju a <strong>za</strong> svaku može<br />
da se veže antitelo/receptor. Prisustvo multiplih identinih determinanti se oznaava kao<br />
multivalentnost ili polivalentnost antigena. Mnogi globularni proteini ne sadrže multiple<br />
identine epitope i nisu polivalentni ukoliko nisu u agregatima. Polisaharidi i nukleinske kiseline,<br />
obino imaju identine epitope koji se ponavljaju, koji su obino odvojeni nekim drugim epitopom<br />
(polivalnentni su). Površina elija, ukljuujui i mikrobe, obino sadrži polivalentne regione<br />
proteinskih i ugljenohidratnih antigenih determinanti.<br />
Determinante koje prepoznaju B elije:<br />
linearne sekvence determinanti (primarna sekvenca rezidua) ili konformacione determinante<br />
(sekundarna, tercijarna, kvaternarne);<br />
male, obino 4-8 rezidua (AK ili šeera)<br />
Determinante koje prepoznaju T elije:<br />
primarna sekvenca rezidua (ne prepoznaju polisaharide ili nukleinske kiseline; proteini su<br />
T-<strong>za</strong>visni Ag, šeeri T-ne<strong>za</strong>visni Ag).<br />
Ag je proteolitiki degradiran u male peptide. T-elije ne prepoznaju slobodan peptid nego<br />
kompleks peptid + MHC;<br />
Ag determinante - obino 8-15 AK.<br />
44
3.2. ANTITELA<br />
Antitela su glikoproteini, koji specifino vežu antigene u fazi prepoznavanja, i u efektornoj fazi<br />
humoralnog imunog odgovora.<br />
Razlikuju se dve forme antitela, a to su:<br />
membranska forma, antitelo je ve<strong>za</strong>no <strong>za</strong> membranu B limfocita i funkcioniše kao receptor<br />
<strong>za</strong> antigene na B elijama (BCR), i<br />
sekretovana forma, antitelo se sintetiše u antigen-stimulisanim B elijama i egzocitozom<br />
izbacuje u krv ili telesne tenosti.<br />
Interakcija antigena sa BCR inicira odgovor B elija i time <strong>za</strong>poinje fa<strong>za</strong> prepoznavanja<br />
humoralnog imuniteta. U efektornoj fazi humoralnog imunog odgovora, sekretovana antitela vežu<br />
antigene i aktiviraju nekoliko efektornih mehani<strong>za</strong>ma koji ih eliminišu.<br />
Sekretovana antitela su prisutna u krvi, mukoznim sekretima i intersticijalnom fluidu gde<br />
neutrališu i eliminišu mikrobe i toksine tj. funkcionišu kao efektorne molekule humoralnog<br />
imuniteta. Sekretovana antitela i BCR prepoznaju antigene svojim varijabilnim domenima, dok<br />
konstantni regioni sekretovanih antitela imaju sposobnost da vežu druge molekule (npr. receptore<br />
na fagocitima, mastocitima, elijama prirodnim ubicama ili proteine komplementa) u smislu<br />
eliminacije štetnog antigena. Može se rei da antitela imaju dve funkcije u humoralnom<br />
imunitetu: BCR prepoznaje antigene i inicira humoralni imuni odgovor, dok sekretovana antitela<br />
eliminišu antigene u efektornoj fazi imunog odgovora.<br />
3.2.1. Molekularna struktura antitela<br />
Zbog razliite rastvorljivosti, serumski glikoproteini se mogu razdvojiti na albumine i globuline iz<br />
kojih se dalje <strong>za</strong>hvaljujui razliitoj elektroforetskoj pokretljivosti mogu izdvojiti razliite frakcije.<br />
Veina antitela je izolovana iz tree grupe migrirajuih globulina tzv. gama globulina ili<br />
imunoglobulina (Ig). Svi molekuli antitela imaju <strong>za</strong>jednike osnovne strukturne karakteristike ali<br />
ispoljavaju i znaajnu raznolikost u regionima koji vežu antigene.<br />
Molekul antitela je izgradjen od dva identina teška lanca (H) i dva identina laka lanca (L) koja<br />
grade varjabilni region i jedan ili više konstantnih regiona. etiri lanca su pove<strong>za</strong>na tako da<br />
formiraju molekul koji ima oblik slova Y. Disulfidnim ve<strong>za</strong>ma su medjusobno pove<strong>za</strong>na dva teška<br />
lanca, kao i laki <strong>za</strong> teške lance. Teški i laki lanci su izgradjeni iz serije ponavljanih homologih<br />
45
jedinica koji imaju globularnu konformaciju – Ig domen. Teški i laki lanci su izgradjeni od amino-<br />
terminalnog varijabilnog regiona (V) koji je odgovoran <strong>za</strong> prepoznavanje antigena i karboksi-<br />
terminalnog konstantnog kraja (C). U teškom lancu V region je izgradjen od jednog Ig-domena, a<br />
C region se sastoji od 3-4 Ig-domena. Svaki laki lanac se sastoji od jednog V i jednog C regiona.<br />
Varijabilni regioni sadrže razliite sekvence aminokiselinskih ostataka, koje su specifine <strong>za</strong><br />
antitela produkovana u B limfocitima odredjenog klona i razlikuju se od antitela drugih klonova B<br />
limfocita. Deo antitela koji sadrži ceo laki lanac (VL i CL) pove<strong>za</strong>n sa VH i prvim CH regionom teskog<br />
lanca je deo antitela <strong>za</strong>dužen <strong>za</strong> prepoznavanje antigena tzv. Fab (engl. fragment antigen binding).<br />
Slika 3.1. Molekularna struktura antitela.<br />
V region teškog lanca (VH) i V<br />
region lakog lanca (VL) formiraju<br />
antigen vezujue mesto. Zbog<br />
toga što je svaki molekul antitela<br />
izgradjen iz dva teška i dva laka<br />
lanca, svako antitelo sadrži dva<br />
mesta <strong>za</strong> koja se vezuje antigen<br />
tj. dvovalentno je. C regioni ne<br />
doprinose prepoznavanju<br />
antigena. C regioni teških lanaca<br />
formiraju tzv Fc region (engl.<br />
fragment crystalline) koji<br />
interaguju sa efektornim<br />
molekulama i elijama imunog<br />
sistema, i tako su odgovorni <strong>za</strong><br />
veinu bioloških funkcija<br />
antitela. Karboksi-terminalni<br />
kraj teškog lanca je pove<strong>za</strong>n sa<br />
membranom B limfocita, tako da<br />
formira antitela ve<strong>za</strong>na <strong>za</strong><br />
membranu tj. BCR.<br />
Postoje dve klase ili dva izotipa<br />
lakih lanaca i laki lanci koji<br />
se razlikuju po sastavu karboksi<br />
terminalnog konstantnog (C) regiona. Molekul antitela ima ili dva laka lanca ili dva laka lanca.<br />
Za sada nije poznata funkcionalna razlika izmedju antitela koja sadrže lance i lake lance.<br />
46
Postoji 5 tipova teških lanaca koji se razlikuju u C regionu (, , , , ). U <strong>za</strong>visnosti od teškog<br />
lanca koji sadrže, antitela se mogu klasifikovati u 5 klasa (izotipova): IgM, IgD, IgG, IgE, i IgA.<br />
Fizike i biološke karakteristike ovih klasa kao i njihove efektorne funkcije sumirane su u tabeli<br />
3.1.<br />
Tabela 3.1. Osnovne karakteristike pojedinih klasa antitela<br />
Klasa Izoforme H lanac Koncentracija u Poluživot u Forma u kojoj se sekretuje Funkcija<br />
antitela<br />
serumu (mg/mL) serumu (dani)<br />
IgA IgA1, 2 (1 ili 2) 3.5 6 Monomer, dimer, trimer Mukozni imunitet, neonatalni<br />
pasivni imunitet<br />
IgD - u tragu 3 - Receptor <strong>za</strong> antigene na naivnim B<br />
limfocitima<br />
IgE - 0.05 2 monomer Aktivacija mastocita<br />
IgG IgG1-4 (1.2.3,4) 13.5 23 monomer Opsoni<strong>za</strong>cija, aktivacija<br />
komplementa, citotoksinost<br />
<strong>za</strong>visna od antitela, neonatalna<br />
imunost, inhibicijaB limfocita<br />
povratnom spregom<br />
IgM - µ 1.5 5 pentamer Receptor <strong>za</strong> antigene na B<br />
elijama, aktivacija komplementa<br />
B limfociti, pripadnici istog klona mogu da se razlikuju po tome što u toku imunog odgovora mogu<br />
da produkuju antitela razliite strukture. B elije inicijalno produkuju samo Ig koji su pove<strong>za</strong>ni sa<br />
elijskom membranom tj. BCR. Ovi receptori na naivnim B limfocitima, su u stvari molekuli IgM i<br />
IgD ve<strong>za</strong>ni <strong>za</strong> membranu elija. Nakon stimulacije naivnih B limfocita sa antigenima i T elijama<br />
pomonicama, antigen-specifini klon proliferiše i diferencira se u plazma elije koje sekretuju<br />
antitela. Drugim reima, promene na karboksi-terminalnom kraju antitela vodi ka produkciji<br />
antitela koja se sekretuju ali imaju istu specifinost <strong>za</strong> odredjeni antigen. Neke plazma elije<br />
poreklom od iste naivne B elije sekretuju IgM a druge IgD antitela. Ova mogunost sinteze<br />
antitela razliite klase tj razliitog izotipa teškog lanca Ig nosi naziv «haevy chain class (isotype)<br />
switching». Iako tokom humoralnog imunog odgovora, može doi do <strong>za</strong>mene C regiona teškog<br />
lanca antitela, svaki klon B limfocita <strong>za</strong>država svoju specifinost, <strong>za</strong>to što se V region ne menja.<br />
Drugim reima razliiti izotipovi antitela su nosioci razliitih efektornih funkcija. Pri tom svi<br />
izotipovi imaju istu antigensku specifinost. Zašto je to potrebno? Sinte<strong>za</strong> Ig razliitih klasa<br />
omoguava humoralnom imunom odgovoru da se adaptira na karakteristike konkretnog antigena<br />
tj. pronalaženja optimalnog naina <strong>za</strong> eliminaciju antigena. Mnogi od molekula koji posreduju u<br />
prepoznavanju adheziji i vezivanju u kimenjakom imunom sistemu imaju delimino istu<br />
sekvencu AK i tercijarnu strukturu – koja je identifikovana u Ig teškog i lakog lanca = Ig<br />
superfamilija<br />
47
Slika 3.2. Forme teškog lanca imunoglobulina (membranskih i sekretovanih). Membranska forma teškog lanca sadrži transmembranski<br />
region izgradjen od hidrofobnih ostataka aminokiselina i citoplazmatini region koji se razlikuje kod razliitih izotipova. Citoplazmatini region<br />
membranske forme teškog lanca sadrži 3 rezidue, dok 3 sadrži 28 ostataka aminokiselina. C- termilani region teških lanaca sekretovanih<br />
imunoglobulina se takodje razlikuje: lanac ima rep (21 ostatak) koji je ukljuen u formiranje pentamera, dok 3 ima kratak rep (samo 3<br />
aminokiseline).<br />
48
Slika 3.3. Super familija imunoglobulina<br />
3.2.2. Sinte<strong>za</strong> i ekspresija Ig<br />
molekula<br />
Teški i laki lanci Ig, kao i veina<br />
proteina u eliji se sintetiše na<br />
granuliranom endoplazmatskom<br />
retikulumu. Odgovarajua prosto-<br />
rna organi<strong>za</strong>cija teškog lanca Ig i<br />
njihovo povezivanje sa lakim<br />
lancima je regulisano proteinima<br />
endoplazmatskog retikuluma tzv.<br />
aperonima (engl. chaperones). Ovi<br />
proteini (ukljuujui i klaneksin i<br />
BiP (binding protein)) se vežu <strong>za</strong><br />
novosintetisani polipeptid Ig, i time<br />
ga obeležavaju <strong>za</strong> degradaciju<br />
ukoliko od njega ne nastane<br />
molekul Ig. U endoplazmatskom<br />
retikulumu se teški i laki lanci<br />
kovalentno vezuju (preko disulfidne<br />
veze i N- glikozilacije). Nakon<br />
spajanja, molekuli Ig se odvajaju od<br />
aperona i dospevaju u cisterne<br />
Goldži kompleksa gde se pakuju u<br />
vezikule (modifikacija karbohidra-<br />
ta), transportuju do plazma<br />
membrane i egzocitozom sekretuju<br />
iz elije. Biosinte<strong>za</strong> proteina koji su<br />
ve<strong>za</strong>ni <strong>za</strong> Ig lance je koordinisana<br />
sa sintezom Ig. Na primer, IgA i IgM<br />
se sekretuju kao multimeri koji su pove<strong>za</strong>ni sa J lancem. U elijama koje produkuju takva<br />
antitela, transkripcija gena teškog i lakog lanca Ig je koordinisana sa transkripcijom gena i<br />
biosintezom <strong>za</strong> J lanac. Maturacija B elija (od progenitorne elije kosne srži) je praena<br />
49
promenama u ekspresiji Ig gena i produkcijom razliitih formi Ig molekula. Pre-B elija (najranija<br />
forma koja produkuje polipeptide Ig) sintetiše menbransku formu teškog lanca. Za<br />
novosintetisane polipeptide se veže aperon, što ograniava njegovo kretanje iz elije, tako da ovi<br />
polipeptidi ostaju u citoplazmi pre-B elija i degradiraju se intracelularno. Mala koliina lanaca<br />
se ekspresuje na površini limfocita i <strong>za</strong>jedno sa proteinima koji se nazivaju »surogati lakog lanca«<br />
formira pre-B elijski receptor. Nezreli i zreli B limfociti produkuju ili lake lance koji se vežu <strong>za</strong><br />
lanace i formiraju molekule IgM. Ovakvo povezivanje spreava degradaciju teškog lanca i<br />
dozvoljava IgM da se ekspresuje na elijskoj membrani. Zreli B limfociti ekspresuju membranske<br />
forme IgM i IgD ( i teški lanci pove<strong>za</strong>ni sa ili lakim lancima). Ovi membranski Ig receptori<br />
funkcionišu kao receptori <strong>za</strong> antigen i iniciraju proces aktivacije B elija. BCR je nekovalentno<br />
pove<strong>za</strong>n sa dva druga membranska proteina Ig i Ig koja funkcionišu u prenosu signala. Kada<br />
antigen aktivira zrelu B eliju, <strong>za</strong>poinje njena diferencijacija u eliju koja sekretuje antitela<br />
(plazma elija). Ovaj proces je praen promenama u modelu produkcije Ig. Jedna od ovih promena<br />
je konverzija membra-nskih Ig u Ig koji se sekretuju iz elije. Druga promena je ekspresija<br />
3.2.3. Karakterisike antitela ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> prepoznavanje antigena<br />
razliitih izotipova<br />
teškog lanca tj. »havy<br />
chain isotype<br />
switching«.<br />
Slika 3.4. Ekspresija imunoglobulina<br />
tokom maturacije B<br />
limfocita<br />
Antitela specifino prepoznaju razliite antigene i vezuju se <strong>za</strong> njih sa razliitim afinitetom. V<br />
region antitela je odgovoran <strong>za</strong> sve karakteristike ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> prepoznavanje antigena.<br />
Specifinost antitela su vrlo specifina <strong>za</strong> antigen, prepoznaju i vrlo male razlike u hemijskoj<br />
strukturi 3. Ipak, nekad antitela proizvedena <strong>za</strong> jedan antigen mogu da reaguju i sa drugim,<br />
strukturno slinim antigenom »cross-reaction«.<br />
3 Smatra se da individue produkuju ogroman broj strukturno razliitih antitela, verovatno oko 10 9, a pri tome svako antitelo ima razliitu specifinost.<br />
50
Diverzitet (raznolikost) postojanje velikog broja antitela koja reaguju sa razliitim antigenima.<br />
3.2.4. Antigen-antitelo interakcija<br />
Ukupna kolekcija antitela razliite<br />
specifinosti repertoar antitela.<br />
Afinitet suma privlanih i odbojnih<br />
sila izmedju jedne Ag determinante i<br />
jednog veznog mesta na Ab 4.<br />
Aviditet je mera ukupne jaine<br />
vezivanja antigena sa mnogim<br />
antigenim determinantama i multi-<br />
valentnim antitelom. Aviditet <strong>za</strong>visi od<br />
valentnosti antigena i od valentnosti<br />
antitela (on je više nego suma<br />
individualnih afiniteta).<br />
Slika 3.5. Valentnost i aviditet interakcije<br />
antitelo-antigen<br />
Reakcija izmedju antigena i antitela je reverzibilna reakcija, koja se ostvaruje nekovalentnim<br />
ve<strong>za</strong>ma npr. vodonikovim ve<strong>za</strong>ma, elektrostatikim ve<strong>za</strong>ma, Van der Waals-ovim silama i<br />
hidrofobnim ve<strong>za</strong>ma.<br />
Ag + Ab AgAb<br />
4 Antitela produkovana tokom primarnog imunog odgovora na jedan proteinski antigen obino imaju Kd izmedju 10 -7 – 10 -9 M, dok u sekundarnom imunom odgovoru<br />
afinitet raste, Kd je 10 -11 M ili više.<br />
51
3.2.5. Karakteristike antitela ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> efektorne funkcije<br />
Mnoge od efektornih funkcija imunoglobulina su posredovane Fc regionom molekula, tako<br />
da antitela koja se razlikuju u Fc regionu, ispoljavaju razliite funkcije.<br />
Antitela mogu ispoljiti efektorne funkcije samo ako su ve<strong>za</strong>na sa antigenom (slobodni Ig ne<br />
ispoljavaju efektorne funkcije).<br />
Promene u izotipovima antitela tokom humoralnog imunog odgovora utiu na to kako i gde<br />
e se ispoljiti efektorne funkcije antitela.<br />
C region teškog lanca, takodje determiniše i tkivnu distribuciju antitela.<br />
Iako se antitela produkuju u limfnim vorovima, ona se sekretuju i putem krvi, te dospevaju do<br />
mesta infekcije gde ispoljavaju razliite efektorne funkcije. Efektorne reakcije humoralnog imunog<br />
odgovora prika<strong>za</strong>ne su u tabeli 3.2.<br />
Funkcija antitela Objašnjenje<br />
Tabela 3.2. Efektorne reakcije humoralnog imunog odgovora<br />
Neutrali<strong>za</strong>cija Neutrališu infektivnost mikroba/patogenost toksina vezujui se <strong>za</strong> njih te smanjuju sposobnost mikroba da se vežu <strong>za</strong> eliju dmaina<br />
Opsoni<strong>za</strong>cija Opsonini stimulišu fagocitozu tako što se Fc regioni antitela vezuju <strong>za</strong> Fc receptore na fagocitima. Vezivanje Fc regiona <strong>za</strong> Fc<br />
receptor stimuliše baktericidnu funkciju fagocita<br />
Aktivacija komplementa Aktivacija komplementa je objašnjena ranije. Aktivacija komplementa vodi ka formiranju citolitikog kompleksa membrane. Razliiti<br />
produkti aktivacije komplementa promovišu fagocitozu, i<strong>za</strong>zivaju lizu elija i stimulišu inflamaciju.<br />
Mukozni imunitet IgA se produkuje u lamini proprii mukoznih organa i aktivno transportuje kroz epitel (vezivanjem <strong>za</strong> Fc receptor) u lumen, gde blokira<br />
sposobnost mikroba da prodru u epitel<br />
Neonatalni imunitet Novorodjene je <strong>za</strong>štieno IgG majke koja prolaze kroz placentu (fetus) ili je <strong>za</strong>štieno antitelima iz majinog mleka, tako što se IgG<br />
transportuje kroz epitel creva (neonatalni Fc receptor).<br />
52
3.3. MOLEKULE GLAVNOG HISTOKOMPATIBILNOG KOMPLEKSA (MHC)<br />
Osnovne funkcije T limfocita su odbrana protiv intracelularnih mikroba i aktivacija drugih elija<br />
kao što su makrofage i B limfociti. Receptori <strong>za</strong> antigene na T limfocitima (TCR, engl. T cell<br />
receptor), mogu da prepoznaju samo proteinske antigene koji su iska<strong>za</strong>ni na površini drugih<br />
elija, tako da je <strong>za</strong> ispoljavanje njihove funkcije nužno da reaguju sa drugim elijama npr. sa<br />
inficiranim elijama domaina, antigen-prezentujuim elijama, makrofagama i B limfocitima.<br />
Specijalizovani proteini, koji imaju ulogu u<br />
iskazivanju antigena T limfocitima, su produkti<br />
gena glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC,<br />
engl. major histocompatibility complex). TCR<br />
prepoznaje strukturu antigeninog peptida kao i<br />
odredjene ostatke MHC molekula, na površini<br />
antigen-prezentujuih ili drugih elija domaina.<br />
Slika 3.6. TCR prepoznaje MHC+antigenini peptid<br />
Produkati MHC gena su podeljeni u dve grupe u <strong>za</strong>visnosti od tipa proteinskog antigena koje<br />
iskazuju: klasa I MHC i klasa II MHC molekula. Klasa I uestvuje u iskazivanju citosolnih<br />
(intracelularnih) antigena <strong>za</strong> koje svojim receptorima mogu da se vežu CD8 + citolitini T limfociti.<br />
Klasa II je ukljuena u ekspresiju ekstracelularnih antigena koji su prvo fagocitirani i iska<strong>za</strong>ni<br />
CD4 + T elijama pomonicama. Poznavanje strukture i biosinteze MHC molekula i njihovog<br />
povezivanja sa peptidima antigena je osnova <strong>za</strong> razumevanje kako T elije prepoznaju strane<br />
antigene.<br />
3.3.1. Osobine MHC gena<br />
Dva tipa polimorfnih MHC gena (geni MHC klase I i geni MHC klase II), kodiraju dve grupe<br />
strukturno razliitih ali homologih proteina. Klasa I MHC molekula prezentuje peptide da<br />
bi bili prepoznati od CD8 + T limfocita a klasa II MHC molekula prezentuje peptide CD4 + T<br />
elijama.<br />
MHC geni su najpolimorfniji geni prisutni u genomu. Serološkim anali<strong>za</strong>ma je <strong>za</strong> neke HLA<br />
lokuse identifikovano vise od 250 alela. Molekularnim sekvenciranjem je poka<strong>za</strong>no da<br />
53
svaki serološki definisan HLA alel ima multiple varijante koje se medjusobno razlikuju.<br />
Drugim reima, polimorfi<strong>za</strong>m je mnogo vei od onog poka<strong>za</strong>nog serološkim studijama.<br />
MHC geni se kodominantno ekspresuju u svakoj individui.<br />
Set MHC alela prisutnih na svakom hromozomu se zove MHC halotip.<br />
3.3.2. Osobine MHC molekula<br />
Svi MHC molekuli imaju iste osnovne strukturne karakteristike koje su od suštinskog znaaja <strong>za</strong><br />
njihovu funkciju tj. <strong>za</strong> iskazivanje peptida antigena i njegovog prepoznavanja od T limfocita.<br />
Svaki MHC molekul se sastoji od ekstracelularne peptid-vezujue pukotine, 2<br />
imunoglobulinu (Ig)-slina domena, transmembranskog domena preko kog je privršen <strong>za</strong><br />
elijsku membranu, i citoplazmatinog domena.<br />
Polimorfne aminokiselinske rezidue MHC molekula se nalaze pored vezujue pukotine.<br />
Zbog varijabilnosti u aminokiselinskom sastavu, u ovom regionu, razliite MHC molekule<br />
vezuju i iskazuju razliite peptide koji bivaju specifino prepoznati od Ag-receptora na T<br />
elijama.<br />
Ne polimorfan Ig-slian domen MHC molekule sadrži vezno mesto <strong>za</strong> CD4 i CD8 molekule<br />
T limfocita.<br />
Tabela 3.3. Karakteristike molekula MHC klase I i II<br />
OSOBINA MHC KLASE I MHC KLASE II<br />
Polipeptidni lanac (44-47 kD)<br />
(32-34 kD)<br />
2-mikroglobulin (12 kD)<br />
(29-32 kD)<br />
Lokacija polimorfne rezidue 1 i 2 domeni 1 i 2 domeni<br />
Vezno mesto <strong>za</strong> T celijski koreceptor 3 region veze CD8 2 region veze CD4<br />
Velicina pukotine koja vezuje peptid<br />
Nomenklatura<br />
Peptide od 8-11 rezidua Peptide od 10-30 rezidua ili vise<br />
covek<br />
HLA-A, HLA-B, HLA-C<br />
HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP<br />
mis<br />
H-2K, H-2D, H-2L<br />
I-A, I-E<br />
54
3.3.3. MHC molekuli klase I<br />
Klasa I MHC molekula se sastoji od dva nekovalentno pove<strong>za</strong>na polipeptidna lanca: MHC-kodiran<br />
lanac (teški lanac; od 44-47 kD), i MHC-nekodiran lanac 2-mikroglobulin (12 kD).<br />
lanci su orjentisani tako da se oko 3/4<br />
polipeptida nalazi ekstracelularno. Imaju<br />
kratak hidrofoban transmembranski<br />
segment, i karboksi terminalni kraj koji se<br />
nalazi u citoplazmi. Amino terminalni region<br />
sadrzi 1 i 2 domene (svaki sadrži oko 90<br />
aminokiselinskih rezidua) koji formiraju<br />
veznu pukotinu. Veliina pukotine je dovoljno<br />
velika da može da veže peptide koji sadrže<br />
oko 8-11 aminokiselinskih ostataka. Dakle,<br />
nativni globularni proteini treba da budu<br />
procesovani i da se fragmenti koji su dovoljno<br />
mali vežu <strong>za</strong> MHC molekulu.<br />
Slika 3.7. Struktura MHC molekula klase I<br />
1 i 2 domeni sadrže polimorfne rezidue<br />
koje doprinose varijabilnosti razliitih alela klase I u vezivanju peptida koji se prezentuju T<br />
limfocitima. Konzervisani region, u pogledu sastava polipeptidnog lanaca ima 3 segment, <br />
lanca, koji gradi Ig-slian domen. Ovaj segment sadrži vezno mesto <strong>za</strong> CD8 receptore.<br />
Laki lanac MHC klase I ne kodiraju geni MHC kompleksa. Ovaj lanac je identian sa proteinom<br />
koji je identifikovan u urinu i nosi naziv 2 mikroglobulin. Strukturno, 2 mikroglobulin ima Ig-<br />
slian domen i nekovalnentno se veže <strong>za</strong> 3 segment lakog lanca.<br />
Potpuno formiran MHC molekul klase I je heterotrimer koji sadrži: lanac + 2<br />
mikroglobulin + antigenini peptid.<br />
Za stabilnu ekspresiju molekula na elijskoj membrani potrebno je prisustvo sve tri komponente<br />
heterotrimera.<br />
Svaka heterozigotna individua, na svakoj eliji, ekspresuje 6 razliitih molekula klase I. lanci<br />
ovih molekula su derivati dva alela HLA-A, HLA-B i HLA-C gena koji su nasledjeni od roditelja.<br />
55
3.3.4. MHC molekuli klase II<br />
Klasa II molekula se sastoji od dva nekovalentno pove<strong>za</strong>na polipeptidna lanca: lanac od 32-34<br />
kD i lanac od 29-32 kD. Oba lanca, molekula MHC klase II, su kodirana polimorfnim MHC<br />
genima. N terminalni, 1 i 1 segmenti<br />
formiraju veznu pukotinu. Polimorfne<br />
rezidue su locirane u/oko 1 i 1<br />
segmenta (kod ljudi segment ima vei<br />
polimorfi<strong>za</strong>m od segmenta). 2 i 2<br />
segmenti molekula klase II su savijeni<br />
tako da formiraju Ig-sline domene, koji<br />
su, slino molekulama klase I,<br />
konzervisani tj. nisu polimorfni. Petlja<br />
2 segmenta sadrži vezno mesto <strong>za</strong> CD4<br />
receptore T limfocita. Oba lanca ( i )<br />
sadrže transmembranske i<br />
citoplazmatine regione. Novosintetisani<br />
molekuli klase II su pove<strong>za</strong>ni sa tzv.<br />
invarijantnim lancima (Ii) . To su<br />
nepolimorfni polipeptidi, ija je uloga u<br />
determinaciji kretanja molekule u eliji.<br />
Formiran MHC molekul klase II je heterotrimer koji sadrzi: lanac + lanac + ve<strong>za</strong>n antigenini<br />
peptid. Kao i u sluaju molekula klase I, ekspresovan molekul na elijskoj membrani sadrži sve tri<br />
komponente heterotrimera.<br />
3.3.5. Osobine peptid-MHC interakcija<br />
Svaki peptid koji može da bude antigenian mora da sadrži neke ostatke aminokiselina kojima se<br />
vezuje <strong>za</strong> MHC pukotinu, kao i ostatke koji se projektuju iz pukotine i koje e biti prepoznate od T<br />
limfocita. Nabrojane su osobine MHC-peptid interakcija:<br />
Slika 3.8. Struktura MHC molekula klase II<br />
56
Molekuli klase I i klase II imaju pukotinu koja može da «primi» razliite antigenine<br />
peptide.<br />
Peptidi koji se vezuju <strong>za</strong> MHC pukotinu imaju strukturne karakteristike koje<br />
promovišu/stimulišu interakciju sa molekulama MHC. To podrazumeva, na primer, da ve-<br />
3.3.6. Ekspresija MHC molekula<br />
liina peptida odgovara veliini pukotine u koju treba da se<br />
smesti, i da peptid ima ostatke aminokiselina koje su<br />
komplementarne sastavu MHC pukotine 5.<br />
Povezivanje antigeninih peptida i MHC molekula je<br />
saturaciona reakcija, malog afiniteta (Kd oko 10 -6 M) 6.<br />
MHC molekule ne razlikuju strane od sopstvenih<br />
peptida, tako da MHC molekule iskazuju strane, kao<br />
i sopstvene peptide. T elije nadgledaju iskazivanje<br />
antigeninih peptida, a smatra se da je blaga<br />
stimulacija sopstvenim antigenima neophodna <strong>za</strong><br />
održavanje ovih elija u životu.<br />
Slika 3.9. Kompeticija antigena <strong>za</strong> T limfocit<br />
S obzirom da je ekspresija MHC molekula neophodna <strong>za</strong> iskazivanje antigena T limfocitima, u<br />
daljem tekstu e biti navedene neke osnovne/znaajne karakteristike njihove ekspresije.<br />
Molekuli MHC klase I se konstitutivno ekspresuju na svim nukleiranim elijama, dok se klasa II<br />
ekspresuje samo na dendritskim elijama, B limfocitima, makrofagama i na još nekoliko elijskih<br />
tipova. Ovakav model ekspresije je ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> funkciju T limfocita koji prepoznaju molekule klase I i<br />
II. Na primer, efektorna funkcija CD8 + T limfocita, koji prepoznaju MHC klasu I, je da unište elije<br />
inficirane intracelularnim mikrobima, kao što su npr. virusi. S obzirom da virusi mogu da<br />
5 Ostaci aminokiselina antigeninog peptida sadrže bone lance koji se vežu <strong>za</strong> komplementarne aminokiseline MHC molecule (esto hidrofobnim<br />
interakcijama). Ovakvi ostaci se nazivaju “anchor residue” a nalaze se ili u centru ili na krajevima antigeninog peptida. Svaki molekul MHC-peptid<br />
sadrži jedan ili dva regiona preko kojih se ostvaruje ova medjusobna interakcija.<br />
6 Afinitet peptid-MHC interakcije je mnogo manji nego afinitet vezivana antigen-antitelo (Kd oko 10 -7 do 10 -11 ). Saturacija molekula klase II sa<br />
peptidom traje oko 15-30 minuta. Jednom ve<strong>za</strong>n peptid može da bude ve<strong>za</strong>n duži period, od nekoliko sati do nekoliko dana!!!<br />
57
inficiraju bilo koji eliju koja ima nucleus, ligandi koje prepoznaju CD8 + T limfociti, treba da se<br />
ekspresuju na svim nukleiranim elijama. Suprotno, set efektornih funkcija CD4 + T limfocita, koji<br />
prepoznaju MHC molecule klase II, je ogranien na mali broj elijskih tipova. Na primer, naivne<br />
CD4 + T elije treba da prepoznaju antigene prezentovane od strane dendritskih elija u perifernim<br />
limfatinim organima. Diferencirane CD4 + T pomone elije, aktiviraju makrofage koji onda<br />
eliminišu predhodno fagocitiran ekstracelularni antigen, i aktiviraju B limfocite da sintetišu<br />
antitela koja se takodje ukljuuju u eliminaciju ekstracelularnih antigena.<br />
Ekspresija MHC molekula je stimulisana citokinima koji se produkuju tokom nespecifinog i<br />
specifinog IO. Interferoni, IFN-, IFN- i IFN-, kao i TNF i limfotoksin (LT), poveavaju ekspresiju<br />
molekula MHC klase I u veini elijskih tipova. Interferoni se produkuju tokom ranog<br />
nespecifinog imunog odgovora na mnoge<br />
viruse, a TNF i LT na mnoge mikrobne<br />
infekcije. Tako, nespecifian imuni odgovor<br />
na mikrobe poveava ekspresiju MHC<br />
molekula koji prikazuju mikrobne antigene<br />
specifinim T limfocitima. Ekspresija mole-<br />
kula klase II je takodje regulisana razliitim<br />
citokinima u razliitim elijama. IFN- je<br />
osnovni stimulator ekspresije molekula klase<br />
II u APCs. IFN- se produkuje u NK elijama<br />
tokom nespecifinog imunog odgovora (me-<br />
hani<strong>za</strong>m kojim nespecifini stimuliše<br />
specifini/adaptivni imuni odgovor). Takodje,<br />
IFN- se produkuje i u antigenom-<br />
aktiviranim T limfocitima u reakcijama<br />
adaptivnog imunog odgovora, a njegova<br />
sposobnost da stimuliše ekspresiju molekula<br />
klase II na APCs predstavlja mehani<strong>za</strong>m<br />
amplifikacije adaptivnog imunog odgovora.<br />
Slika 3.10. IFN- stimuliše ekspresiju molekula MHC klase II<br />
58
Citokini, u mnogim elijskim tipovima, stimulišu ekspresiju MHC molekula, preko<br />
stimulacije transkripcije gena <strong>za</strong> klasu I/II. Stimulacija transkripcije <strong>za</strong>poinje vezivanjem<br />
transkripcionih faktora, koji su aktivirani citokinima, <strong>za</strong> regulatorne DNA sekvence u<br />
promotornom regionu MHC gena. Nekoliko transkripcionih faktora se vezuje <strong>za</strong> protein “class II<br />
transcription activator” (CIITA), a itav kompleks (CIITA+transkripcioni faktori) se veže <strong>za</strong><br />
promoter klase II i pokree transkripciju. Zbog toga što formira kompleks sa transkripcionim<br />
faktorima, CIITA funkcioniše kao glavni regulator ekspresije gena klase II.<br />
Ekspresija mnogih proteina ukljuenih u procesovanje i prezentaciju antigena je specifino<br />
regulisana i koordinisana. Na primer, IFN- poveava transkripciju gena, ne samo MHC klase I/II,<br />
nego i 2-mikroglobulina, gena koji kodiraju dve subjedinice proteozoma, kao i gene <strong>za</strong> subjedinice<br />
TAP heterodimera.<br />
59
3.4. PROCESOVANJE I PREZENTACIJA ANTIGENA T LIMFOCITIMA<br />
T limfociti imaju centralnu ulogu u reakcijama adaptivnog imunog odgovora na proteinske<br />
antigene. U okviru elijskog imunog odgovora, CD4 + T limfociti aktiviraju makrofage da unište<br />
fagocitirane antigene, a CD8 + T limfociti ubijaju elije inficirane intracelularnim mikrobima. U<br />
humoralnom imunom odgovoru, CD4 + T elije pomonice interaguju sa B limfocitima i stimulišu<br />
ih na proliferaciju i diferencijaciju. APCs prikazuju MHC-antigenine peptide naivnim T elijama u<br />
fazi prepoznavanja (iniciraju imuni odgovor), kao i diferenciranim T elijama u efektornoj fazi<br />
(stimulišu mehanizme koji eliminišu antigene). U ovom odeljku e biti opisane karakteristike APCs<br />
i procesi kojima se formiraju i iskazuju antigeni na APCs.<br />
3.4.1. Karakteristike antigena koje prepoznaju T limfociti<br />
Antigeni koje prepoznaju T limfociti su razliiti po svojim fiziko-hemijskim karakteristikama od<br />
onih koji mogu biti prepoznati antitelima ili B limfocitima. Neke karakteristike prepoznavanja<br />
antigena su jedinstvene i ve<strong>za</strong>ne samo <strong>za</strong> T limfocite.<br />
Tabela 3.4. Karakteristike antigena koje prepoznaju T limfociti<br />
KARAKTERISTIKE ANTIGENA KOJE PREPOZNAJU T LIMFOCITI OBJAŠNJENJE<br />
T elije prepoznaju samo peptide MHC može da veže samo peptide<br />
T elije prepoznaju linearnu a ne konformacionu determinantu peptidnih<br />
antigena<br />
Peptidi se vezuju u pukotinu MHC molekula u linearnoj konformaciji i ne mogu da<br />
formiraju konformacionu determinantu<br />
T elije prepoznaju samo antigene ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> elijsku membranu MHC molekule su membranski proteini koji iskazuju stabilno ve<strong>za</strong>n peptid na<br />
elijskoj membrani<br />
CD4 + i CD8 + T elije prepoznaju antigene iz ekstracelularnog ili<br />
citoslonog pula<br />
CD4 + elije pomonice prepoznaju peptide ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> klasu II MHC molekula,<br />
Dok CD8 + citotoksini T limfociti prepoznaju peptide ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> klasu I MHC<br />
molekula.<br />
Veina T limfocita prepoznaje samo peptide, dok B elije prepoznaju peptide, proteine,<br />
nukleinske kiseline, polisaharide, lipide i hemikalije malih molekula. Drugim reima, T elijski<br />
imuni odgovor se indukuje samo proteinskim antigenima (izvor peptida), dok humoralni imuni<br />
odgovor nastaje kao reakcija na proteinske i neproteinske antigene. Neke T elije su specifine <strong>za</strong><br />
male molekule = haptene (npr. dinitrofenol ili laktam). U ovim sluajevima hapten se veže sa<br />
„sopstvenim proteinom“ i takav konjugat hapten-nosa biva prepoznat od T limfocita.<br />
60
T elije su specifine <strong>za</strong> sekvencu aminokiselina u peptidu. Nasuprot, B elije mogu da<br />
prepoznaju konformacione determinante, koje postoje kada su antigeni u svojoj nativnoj<br />
tercijarnoj konfiguraciji. TCR prepoznaje samo nekoliko rezidua i peptida. Razliite T elije<br />
odgovaraju na antigene koji se razlikuju samo u jednoj aminokiselini.<br />
T elije prepoznaju i odgovaraju na strane peptide samo kada su pove<strong>za</strong>ni sa membranom<br />
APCs. B elije i sekretovana antitela prepoznaju solubilne antigene kao i one koji se nalaze na<br />
elijskoj membrani.<br />
T elije jedne individue prepoznaju peptidne antigene samo ako su ti peptidi pove<strong>za</strong>ni i<br />
prika<strong>za</strong>ni u kompleksu sa MHC molekulima te individue. Ovakvo prepoznavanje antigena koje<br />
nosi naziv MHC restrikcija (engl. self MHC restriction), može biti demonstrirano u<br />
eksperimentalnim situacijama kada se T limfociti jedne individue pomešaju sa APCs druge. MHC<br />
restrikcija je posledica procesa selekcije tokom sazrevanja T limfocita u timusu, koji osiguravaju<br />
da T elije jedne individue prepoznaju samo antigene iska<strong>za</strong>ne na membrani APCs te iste<br />
individue (prepoznaju strani peptid samo kada je ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> odredjen alelski oblik MHC molekula).<br />
Iako T elije pokazuju osobinu MHC restrikcije, one mogu da prepoznaju strane MHC molekule<br />
prisutne u graftovima tkiva prilikom transplantacije i dovedu do odbacivanja grafta.<br />
CD4 + elije pomonice prepoznaju peptide u kompleksu sa MHC molekulama klase II, dok<br />
CD8 + CTLs prepoznaju komplekse antigeninih peptida i MHC molekula klase I. Ve<strong>za</strong>no <strong>za</strong><br />
predhodno, CD4 + T limfociti prepoznaju peptide poreklom od ekstracelularnih proteina koji su<br />
internalizovani u vezikule APCs, dok CD8 + CTLs prepoznaju peptide poreklom od citosolnih,<br />
obino, endogeno sintetisanih proteina.<br />
Pored prezentacije antigena ve<strong>za</strong>nih <strong>za</strong> MHC molekule, postoji još jedan sistem prezentacije,<br />
specijalizovan <strong>za</strong> prezentaciju lipidnih antigena. CD1 molekule se ekspresuju na razliitim APCs i<br />
elijama epitela i smatra se da su ukljuene u iskazivanje lipidnih antigena, neuobiajenim<br />
populacijama T limfocita. Istraživanja na elijskim linijama T limfocita su poka<strong>za</strong>la da razliite<br />
elije mogu da prepoznaju lipidne antigene iska<strong>za</strong>ne sa CD1. To su CD4 + , CD8 +, kao i CD4 - CD8 -<br />
T limfociti koji ekspresuju TCR kao i T elije. Takodje, CD1-pove<strong>za</strong>ne lipide može da<br />
prepozna i mala populacija T limfocita koje ekspresuju marker <strong>za</strong> NK elije tzv. NK-T elije.<br />
61
3.4.2. Prezentacija proteinskih antigena CD4 + T limfocitima<br />
CD4 + elije pomonice kontrolišu imune odgovore na proteinske antigene. One su efektorne elije<br />
u elijskom imunitetu i obezbedjuju stimuluse koji su znaajni <strong>za</strong> proliferaciju i diferencijaciju B<br />
limfocita i citolitinih T limfocita. Kao što je ve reeno, CD4 + limfociti prepoznaju antigene na<br />
membrani samo onih elija koje ekspresuju MHC molekule klase II, a to su APCs (dendritske<br />
elije, makrofage, B limfociti). Antigen-<br />
prezentujue elije «hvataju» ekstracelularne<br />
proteinske antigene, transportuju ih,<br />
koncentrišu u limfnom voru, i iskazuju u formi<br />
koja može biti prepoznata od antigen-specifinih<br />
CD4 + T limfocita.<br />
Slika 3.11. APCs su neophodne <strong>za</strong> aktivaciju T elija<br />
APCs imaju dve važne funkcije u aktivaciji CD4 + T limfocita. One „konvertuju“ proteinske antigene<br />
u peptide i prikazuju ih u kompleksu sa MHC molekulama T limfocitima. Proces konverzije<br />
nativnih proteina u peptidne fragmente pove<strong>za</strong>ne sa MHC molekulama je procesovanje antigena.<br />
Druga važna funkcija APCs je da obezbedjuju dodatne stimuluse <strong>za</strong> aktivaciju T limfocita. Dodatni<br />
stimulusi, koji se ostvaruju preko hemijskih medijatora tzv. kostimulatora, su neophodni <strong>za</strong><br />
punu aktivaciju T elija.<br />
3.4.2.1. Tipovi elija koje prezentuju antigene CD4 + T elijama<br />
Mnoge sisarske elije imaju sposobnost endocitoze i proteolitikog razlaganja proteinskih<br />
antigena, ali samo<br />
specijalizovane populacije<br />
elija ekspresuju MHC<br />
molekule klase II.<br />
elije koje funkcionišu kao<br />
APCs <strong>za</strong> T elije pomonice su<br />
dendritske elije, mononukle-<br />
arni fagociti i B limfociti<br />
(profesionalne APCs).<br />
Slika 3.12. Funkcije razliitih APCs<br />
62
Dendritske elije su najefikasnije APCs u iniciranju T elijskog odgovora. Makrofage iskazuju<br />
antigene diferenciranim CD4 + T elijama u efektornoj fazi elijskog imunog odgovora, a B limfociti<br />
iskazuju antigene T elijama pomonicama u humoralnom imunom odgovoru.<br />
Dendritske elije su prisutne na glavnim mestima prodora mikroorgani<strong>za</strong>ma (nalaze se u<br />
perifernim limfatinim organima, u epitelu kože, gastrointestinalnom, i respiratornom traktu, kao<br />
i u skoro svim parenhimatinim organima). Prototip nezrelih dendritskih elija su Langerhansove<br />
elije epidermisa, koje zbog svojih dugakih nastavaka okupiraju ak 25% površine epidermisa<br />
iako ine manje od 1% elijskih populacija prisutnih u koži. Funkcija epitelijalnih dendritskih<br />
elija je da „hvataju/love“ proteinske antigene, da ih internalizuju i transportuju do limfnih<br />
vorova. Tokom migracije do limfnih vorova, dendritske elije maturiraju i postaju sposobne da<br />
efikasno iskažu antigene na svojoj me-<br />
mbrani. Zrele dendritske elije prikazuju<br />
antigene T limfocitima u T elijskoj zoni<br />
limfnog vora.<br />
Makrofage su APCs koje aktivno<br />
fagocitiraju velike partikule. One imaju<br />
velikog znaaja u prikazivanju antigena<br />
poreklom od fagocitiranih bakterija ili<br />
parazita. U efektornoj fazi elijskog imu-<br />
nog odgovora, diferencirani T limfociti,<br />
prepoznaju antigene na membrani<br />
fagocita, i stimulišu ih, da aktiviraju<br />
procese uništavanja fagocitiranih anti-<br />
gena.<br />
B limfociti preko BCR-a (receptora <strong>za</strong><br />
antigene) vezuju i internalizuju solubilne<br />
proteinske antigene koje potom<br />
procesuju i iskazuju na membrani, T<br />
elijama pomonicama. Antigen-<br />
prezentujua funkcija B limfocita je vrlo<br />
važna <strong>za</strong> T-<strong>za</strong>visnu produkciju antitela.<br />
Slika 3.13. Putevi prodora ekstracelularnih antigena<br />
63
Endotelne elije vaskularnog sistema, takodje mogu da ekspresuju MHC molekule klase II i da<br />
prikažu antigene T elijama krvi.<br />
3.4.2.2. „Hvatanje“ i prezentacija proteinskih antigena<br />
Kao što je ve spomenuto, nezrele dendritske elije „hvataju“ antigene na mestima njihovog<br />
prodora i transportuju ih do limfatinog vora. Nezrele dendritske elije ekspresuju membranske<br />
receptore kojim vežu mikrobe (manozni receptor, „toll-like receptor“, videti kasnije), internalizuju<br />
ih, i <strong>za</strong>poinju procesovanje proteina koji e se ve<strong>za</strong>ti sa produktima gena MHC klase II.<br />
Mikroorganizmi stimulišu nespecifie imune reakcije, tokom kojih se produkuju inflamatorni<br />
citokini. Kombinacija delovanja mikroorgani<strong>za</strong>ma i citokina aktivira dendritske elije, one gube<br />
kontakt sa epitelom i poinju da ekspresuju hemokinske receptore, CCR7, koji su specifini <strong>za</strong><br />
hemokine produkovane u T elijskoj zoni limfnog vora. Nezrele dendritske elije koje su<br />
internalizovale mikroorganizme sazrevaju tokom migracije do limfnog vora i postaju elije koje<br />
iskazuju peptidne antigene naivnim T limfocitima. Zrele dendritske elije ekspresuju visok nivo<br />
MHC molekula klase II <strong>za</strong> koje su ve<strong>za</strong>ni antigenini peptidi, kao i kostimulatore neophodne <strong>za</strong><br />
aktivaciju T elija (aktivacija primarnog T elijskog odgovora).<br />
U efektornoj fazi elijskog odgovora, predhodno aktivirani efektorni ili memorijski CD4 + T limfociti,<br />
mogu da prepoznaju strane antigene i odgovore na njih na bilo kom mestu u organizmu (a ne<br />
samo u limfatinom tkivu). Drugim reima, aktivirani T limfociti migriraju na mesta inflamacije,<br />
gde makrofage ili druge APCs iskazuju antigene.<br />
3.4.3. Prezentacija proteinskih antigena CD8 + T limfocitima<br />
Sve elije (koje imaju nukleus) mogu na svojoj membrani da iskažu citosolne peptidne antigene u<br />
kompleksu sa MHC molekulama klase I. Ovakve antigene prepoznaju CD8 + T limfociti.<br />
Antigeni koji se iskazuju uz pomo molekula MHC I su endogeni tj. citosolni antigeni. Na primer,<br />
to su viralni proteini u sluaju virusnih infekcija ili mutirani proteini kod tumorskih elija.<br />
Efektorni CD8 + limfociti (citotoksini) prepoznaju ovakve antigene, i uništavaju elije koje ih<br />
iskazuju. Ostaje pitanje kako te elije dospeju do limfatinog tkiva gde mogu biti prepoznate od<br />
strane naivnih CD8 + T limfocita i kako se aktiviraju naivni CD8 + limfociti? Objašnjenje aktivacije<br />
naivnih CD8 + T limfocita možda predstavlja problem, zbog toga što antigen može biti produkovan<br />
u bilo kojoj eliji koja nije profesionalna antigen-prezentujua elija. Da bi se aktivirali i da bi<br />
proliferisali naivni CD8 + T limfociti treba da prepoznaju kompleks peptid-MHC klase I, i da budu<br />
64
kostimulisani od strane antigen-prezentujuih elija, ili da prime signal od T elija pomonica.<br />
Verovatno je da antigen-prezentujue elije (dendritske elije) fagocitiraju virusom inficirane ili<br />
tumorske elije i da ekspresuju viralne ili tumorske antigene na svojoj površini. Njih prepoznaju<br />
naivni CD8 + T limfociti koji <strong>za</strong>poinju primarni imuni odgovor. Ovaj proces se naziva «unakrsna-<br />
Slika 3.14. Unakrsna prezentacija. Antigen prezentujue elija fagocitira inficiranu eliju i<br />
iskazuje antigen-MHC I na svojoj membrani. Antigen-MHC I prepoznaju naivni CD8 + T limfociti<br />
koji se aktiviraju i iniciraju primarni imuni odgovor.<br />
3.4.4. Procesovanje antigena<br />
prezentacija» (engl. cross-<br />
presentation) i oznaava<br />
da antigen-prezentujue<br />
elije mogu da iskažu<br />
antigene drugih elija<br />
(inficiranih virusom ili<br />
tumorske) i na taj nain<br />
aktiviraju T limfocite spe-<br />
cifine <strong>za</strong> taj antigen.<br />
Proteinski antigeni prisutni u acidnim vezikulama APCs se povezuju sa MHC molekulama klase II, dok<br />
antigeni prisutni u citosolu reaguju sa MHC molekulama klase I.<br />
Ova osnovna razlika izmedju vezikularnih (endocitozom unetih) i citosolnih antigena je poka<strong>za</strong>na<br />
eksperimentalno. Prezentacija/sudbina istog antigena u APCs se razlikuje ukoliko on na razliite<br />
naine unese u eliju.<br />
3.4.4.1. Procesovanje internalizovanog antigena<br />
Procesovanje internalizovanog antigena podrazumeva proces proteolitike razgradnje antigena u<br />
endocitoznim vezikulama, i vezivanje antigeninih peptida <strong>za</strong> MHC molekule klase II.<br />
Internali<strong>za</strong>cija ekstracelularnog proteina<br />
Razliite APCs, vezuju proteinske antigene, na razliite naine, sa razliitom efikasnošu i<br />
specifinošu. Dendritske elije i makrofage, ekspresuju raznolike površinske receptore koji<br />
prepoznaju strukture koje su <strong>za</strong>jednike mnogim mikroorganizmima (videti kasnije). Makrofage,<br />
takodje, ekspresuju receptore <strong>za</strong> Fc fragmente antitela, kao i receptor <strong>za</strong> C3b protein<br />
komplementa. Vezivanje antigena u kompleksu sa antitelom/komplementom stimuliše njihovu<br />
65
internali<strong>za</strong>ciju. B limfociti na membrani imaju imunoglobuline, koji funkcionišu kao BCR, i koji<br />
efikasno posreduju internali<strong>za</strong>ciju antigena. Ovi receptori funkcionišu kao receptori visokog<br />
afiniteta i vežu antigene pri vrlo malim koncentracijama u ekstracelularnoj tenosti.<br />
Nakon internali<strong>za</strong>cije proteinski antigen je lokalizovan u intracelularnoj vezikuli tzv. endozomu,<br />
koja sadrži proteolitike enzime i ima nisku pH vrednost. Endozom se, na svom intracelularnom<br />
putu sree sa lizozomom (vezikula koja sadrži enzime ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> membranu). Partikularni antigeni<br />
se internalizuju u vezikule,<br />
zvane fagozomi, koje mogu<br />
da se fuzionišu sa lizozomom<br />
i na taj nain nagrade tvore-<br />
vine zvane fagolizo-zomi ili<br />
sekundarni lizozomi.<br />
Slika 3.15. Eksperimentalni prikaz iskazivanja<br />
ekstracelu-larnog i intracelularnog<br />
prote-inskog antigena na istim APCs.<br />
Kada se protein (ovalbumin) doda APCs<br />
kao ekstracelularni antigen, APCs (koje<br />
ekspresuju MHC klase I i klase II) e<br />
prezentovati antigenine peptide u<br />
kompleksu sa molekulama klase II (A).<br />
Kada se ovalbumin sintetiše intracelularno<br />
kao rezultat transfekcije gena <strong>za</strong> ovalbumin<br />
(B) ili kada se protein ubaci u eliju<br />
korišenjem npr. osmotskog šoka (C),<br />
antigeni peptidi e se ekspresovati u<br />
kompleksu sa molekulama MHC klase I.<br />
Procesovanje internalizovanih proteina u endozomalnoj i lizozomalnoj vezikuli<br />
Internalizovani proteini se, u endozomima i lizozomima, enzimatski razlažu na peptide, od kojih<br />
mnogi imaju strukturne karakteristike koje omoguavaju njihovo vezivanje <strong>za</strong> „pukotinu“ MHC<br />
molekula klase II. Degradacija proteinskih antigena u vezikulama je aktivan proces koji se odvija<br />
delovanjem protea<strong>za</strong> koje imaju optimum aktivnosti pri niskim pH vrednostima (npr. katepsini).<br />
Biosinte<strong>za</strong> i transport MHC molekula klase II<br />
Biosinte<strong>za</strong> MHC molekula klase II se odigrava u endoplazmatskom retikulumu, a novosintetisani<br />
MHC molekuli su pove<strong>za</strong>ni sa invarijantnim lancem (Ii), koji okupira pukotinu u koju e se<br />
ve<strong>za</strong>ti antigenini peptid. i lanci molekula klase II se sintetišu i medjusobno povezuju u<br />
66
endoplazmatskom retikulumu. Novonastali dimeri klase II, su strukturno nestabilni, a njihovo<br />
formiranje je pomognuto aperonima, prisutnim u endoplazmatskom retikulumu (npr. kalneksin).<br />
Takodje, u endoplazmatskom retikulumu se heterodimer povezuje sa Ii lancem. Tokom<br />
kretanja ka površini elije, egzocitozna vezikula koja transportuje MHC molekule klase II od/iz<br />
endoplazmatskog retikuluma, se fuzioniše sa endocitoznom vezikulom koja sadrži internalizovane<br />
i procesovane antigene. Formacija u kojoj se MHC molekule spajaju sa antigeninim peptidom<br />
nose naziv MHC klase II kompartmani (MHC) ili vezikule klase II (CIIV; nalaze se u makrofagama<br />
i B elijama miša). MIIC ima karaktristinu lamelarnu strukturu i sadrži sve komponente<br />
potrebne <strong>za</strong> nastajanje kompleksa peptid-MHC II, ukljuujui i enzime koji degradiraju proteinske<br />
antigene, molekule klase II, Ii lanac, i humani leukocitni antigen DM (HLA-DM).<br />
Slika 3.16. Procesovanje i iskazivanje ekstracelularnih proteinskih antigena u kompleksu sa MHC molekulama klase II<br />
Nastajanje kompleksa peptid+MHC II<br />
U okviru MIIC, delovanjem proteolitikih enzima i HLA-DM, Ii lanac se odvaja od molekula klase<br />
II, a antigenini peptidi vežu <strong>za</strong> pukotinu na molekulu klase II. Proteolitiki enzimi koji su<br />
uestvovali u nastajanju antigeninog peptida (katepsin S), takodje, razlažu Ii lanac do CLIP<br />
67
peptida (engl. class II-associated invariant chain peptide), koji se i dalje nalazi u veznoj pukotini.<br />
Da bi pukotina bila slobodna da se u nju veže antigenini peptid, potrebno je ukloniti CLIP iz nje.<br />
Ovo se dešava delovanjem HLA-DM (molekule koja je takodje kodirana MHC genima i koja ima<br />
strukturu slinu MHC molekulama klase II). HLA-DM funkcioniše kao «izmenjiva peptida»,<br />
olakšavajui odvajanje CLIP-a iz pukotine i njegovu <strong>za</strong>menu <strong>za</strong> antigenini peptid.<br />
Ekspresija kompleksa peptid+MHC II na membrani APCs<br />
Vezivanjem antigeninog peptida <strong>za</strong> molekul MHC klase II, formira se stabilan kompleks koji se<br />
transportuje do elijske membrane gde se prezentuje CD4 + T limfocitima. Interesantno je da samo<br />
kompleksi peptid+MHC II putuju, od MIIC vezikularnog kompartmana do elijske membrane, a ne<br />
i ostali proteini ukljueni u prezentaciju antigena (molekuli kao što su DM ostaju u vezikuli).<br />
Mehani<strong>za</strong>m ovog selektivnog iskazivanja samo odredjenih proteina, nije poznat.<br />
3.4.4.2. Procesovanje citosolnog antigena<br />
Antigenini peptidi, nastaju proteolitikom razgradnjom citosolnih proteina, transportom nastalih<br />
peptida do endoplazmatskog retikuluma, i njihovim vezivanjem <strong>za</strong> novosintetisane molekule klase<br />
I.<br />
Slika 3.17. Procesovanje i iskazivanje citosolnin proteinskih antigena u kompleksu sa MHC molekulama klase I<br />
68
Produkcija proteina u citosolu<br />
Veina proteina, od kojih nastaju peptidi koji e biti iska<strong>za</strong>ni na membrani u komleksu sa<br />
molekulama klase I, se produkuje endogeno u citosolu nukleiranih elija. Strani antigeni u<br />
citosolu, mogu biti produkti virusa ili drugih intracelularnih mikroorgani<strong>za</strong>ma, koji inficiraju<br />
eliju i produkuju svoje proteine tokom svog životnog ciklusa. U tumorskim elijama, mutirani<br />
geni ili onkogeni, diktiraju sintezu proteinskih antigena. Nekada i partikularni antigeni, koji su<br />
fagocitirani u fagozome, mogu biti iska<strong>za</strong>ni na membrani kao kompleks sa molekulama klase I.<br />
Neki mikroorganizmi su sposobni da oštete membranu fagozoma i na taj nain formiraju pore<br />
kroz koje mogu da dospeju u citoplazmu. Kada fagocitirani antigeni prodru u citoplazmu oni se<br />
dalje procesuju kao i drugi citosolni antigeni.<br />
Proteolitika degradacija citosolnih proteina<br />
Glavni mehani<strong>za</strong>m nastajanja peptida od proteinskih antigena je njihova proteoli<strong>za</strong> u<br />
proteazomima. Proteazomi su multiproteinski enzimski kompleksi sa širokim proteolitikim<br />
delovanjem, nadjeni u gotovo svakoj eliji. Oni su odgovorni <strong>za</strong> degradaciju razliitih<br />
citoplazmatinih proteina i time ukljueni u održavanje osnovnih funkcija svake elije. Mali<br />
Transport peptida iz citosola do endoplazmatskog retikuluma<br />
polipeptidi tzv. ubikvitinini (engl.<br />
ubiquitin), obeležavaju proteine<br />
koji eliji nisu potrebni, a ovako<br />
markirane proteine prepoznaje i<br />
razlaže proteazom.<br />
Slika 3.18. Uloga TAP-a u prezentaciji<br />
peptid+MHC I kompleksa. U elijama koje<br />
nemaju funkcionalan TAP, molekuli klase I ne<br />
mogu da se vežu sa antigeninim peptidom,<br />
nestabilni su i degradiraju se u endo-plazmatskom<br />
retikulumu. Kada se elije transfekuju sa TAP<br />
genom i on se sintetiše u funkcionalan protein,<br />
mogua je ekspresija kompleksa antigenini<br />
peptid+MHC I na elijskoj membrani.<br />
Nastali peptidi se iz citosola translociraju u endoplazmatski retikulum, gde je mogua njihova<br />
interakcija sa novosintetisanim molekulama klase I. S obzirom da su antigenini peptidi nastali u<br />
citosolu, a da molekuli klase I nastaju u endoplazmatskom retikulumu, mora postojati<br />
mehani<strong>za</strong>m kojim e se citosolni peptidi dostaviti u endoplazmatski retikulum. Antigenini peptidi<br />
69
se iz citosola u endoplazmatski retikulum transportuju ATP-<strong>za</strong>visnim transporterom, tzv.<br />
transporterom pove<strong>za</strong>nim sa procesovanjem antigena (TAP; engl. transporter associated with<br />
antigen processing). Tap je heterodimer (izgradjen od dva lanca kodirana MHC genima), koji se<br />
uglavnom nalazi u endoplazmatskom retikulumu, a transportuje peptide koji su optimalne<br />
veliine <strong>za</strong> kasnije povezivanje sa molekulama klase I (od 6-30 aminokiselinskih ostataka). U<br />
lumenu endoplazmatskog retikuluma, TAP je proteinskim linkerom (tapasinom) pove<strong>za</strong>n sa<br />
novosintetisanim molekulama klase I. Na taj nain su MHC I molekule strateški locirane na mesto<br />
gde mogu da prime peptide.<br />
Nastajanje i ekspresija peptid+MHC I kompleksa<br />
Kao što je ve spomenuto, novosintetisani i 2-mikroglobulin dimeri u endoplazmatskom<br />
retikulumu, se vežu <strong>za</strong> TAP kompleks (preko tapasina), i stupaju u kontakt sa odgovarajuim<br />
antigeninim peptidom. Kompleks peptid+MHC I se odvaja od tapasina, izlazi iz endoplazmatskog<br />
retikuluma i transportuje do Goldži kompleksa, gde se pakuje u egzocitozne vezikule i<br />
transportuje do površine elije. Na elijskoj membrani, ovakav kompleks, e prepoznati CD8 + T<br />
limfociti. i 2-mikroglobulin dimeri, <strong>za</strong> koje se nisu ve<strong>za</strong>li antigenini peptidi su nestabilni, tako<br />
da se degradiraju u endoplazmatskom retikulumu.<br />
Tabela 3.5. Karakteristike procesovanja i prezentovanja antigena i MHC molekula klase I i II<br />
Osobina Put iskazivanja antigeninog peptida+ MHC klase II Put iskazivanja antigeninog peptida+ MHC klase<br />
I<br />
Sastav kompleksa peptid + MHC Polimorfni i lanci + peptid<br />
Dendritske elije, mononuklearni fagociti, B limfociti,<br />
Polimorfni lanac i 2-mikroglobulin + peptid<br />
Tipovi antigen-presentujuih elija endotelne elije, epitel timusa Sve elije koje imaju nukleus<br />
T elije koje prepoznaju CD4 + elije CD8 + elije<br />
Izvor proteinskog antigena Endozomalni/lizozomalni proteini (uglavnom<br />
internalizovani iz ekstracelularnog okruženja)<br />
Enzimi odgovorni <strong>za</strong> formiranje peptida Endosomalne i lizozomalne protease Citosolni proteozom<br />
Mesto formiranja kompleksa MHC+peptid Specijalizovani vezikularni kompartman Endoplazmatski retikulum<br />
Molekuli ukljueni u transport i vezivanje<br />
<strong>za</strong> MHC molekule<br />
Kalneksin u endoplazmatskom retikulumu, invarijantni<br />
lanac u endoplazmatskom retikulumu<br />
Fiziološki znaaj prezentacije antigena u sastavu MHC molekula<br />
Citosolni proteini (uglavnom sintetisani u eliji; mogu<br />
da dospeju u citosol iz fagosoma)<br />
Kalneksin, kalretikulin, TAP u endoplazmatskom<br />
retikulumu<br />
MHC molekuli obezbedjuju da T limfociti prepoznaju samo antigene koji se nalaze u elijama, kao<br />
i da te antigene prepozna odgovarajui tip T limfocita (elije pomonice ili CTLs), koji je<br />
najefikasnij u borbi protiv odredjenog antigena.<br />
70
3.5. RECEPTOR ZA ANTIGENE NA T LIMFOCITIMA (TCR) I POMONE MOLEKULE<br />
T limfociti reaguju na peptidne fragmente proteinskih antigena koji su iska<strong>za</strong>ni na APCs.<br />
Zapoinjanje odgovora podrazumeva:<br />
specifino prepoznavanje antigena,<br />
adheziju T limfocita na APCs,<br />
transdukciju signala do T elija.<br />
Za svaki od ovih dogadjaja su odgovorni razliiti setovi molekula na T limfocitu. U narednom<br />
tekstu e biti opisane osnovne karakteristike molekula ukljuenih u prepoznavanje, adheziju i<br />
transdukciju signala na T limfocitima. T limfociti imaju<br />
dvojnu specifinost: oni prepoznaju polimorfne rezidue MHC<br />
molekula (MHC restrikcija tj. da prepoznaju sopstvene MHC<br />
molekule) i prepoznaju antigene koji su iska<strong>za</strong>ni tim<br />
molekulama (specifinost). Receptor koji prepoznaje peptid-<br />
MHC kompleks je receptor <strong>za</strong> antigene na T limfocitima (TCR).<br />
On je klonalno distribuiran tj. klonovi T elija sa razliitim<br />
specifinostima ekspresuju razliite receptore <strong>za</strong> antigene.<br />
Biohemijski signal koji se ostvaruje nakon prepoznavanja<br />
antigena (vezivanja TCR + peptid-MHC) se ne prenosi samim<br />
TCR nego su u taj proces ukljueni proteini koji su<br />
nekovalentno ve<strong>za</strong>ni <strong>za</strong> antigenski receptor (CD i ) TCR<br />
kompleks.<br />
Slika 3.19. TCR i pomone molekule.<br />
Za prepoznavanje antigena i prenos signala (signaling) su odgovorna dva seta molekula:<br />
visoko varjabilni TCR na T limfocitima i membranski Ig na B limfocitima i<br />
signalni proteini (CD i lanci na T elijama kao i Ig i Ig u B elijama).<br />
T elije ekspresuju i druge membranske receptore koji ne prepoznaju antigene ali doprinose<br />
odgovoru T elija na antigene (adhezione molekule koje stabilizuju vezivanje T elija <strong>za</strong> APCs,<br />
adhezione molekule koje regulišu migraciju i druge). To su pomone molekule.<br />
71
3.5.1. Struktura TCR<br />
TCR koji se ekspresuje na CD4 + elijama pomonicama i CD8 + citolitinim T limfocitima je<br />
heterodimer sastavljen od dva transmembranska, polipeptidna lanca ( i ), kovalentno pove<strong>za</strong>na<br />
disulfidnim ve<strong>za</strong>ma. i lanci se sastoje od N-terminalnog varijabilnog domena (V),<br />
konstantnog domena (C), hidrofobnog transmembranskog domena i kratkog citoplazmatinog<br />
domena. V domeni i lanaca sadrže regione visoke varijabilnosti (hipervarijabilne domene ili<br />
CDRs; engl. complementarity-determining regions). Tri<br />
CDRs na lancu su rasporedjena pored tri slina<br />
regiona na lancu tako da formiraju region TCR-a koji<br />
specifino prepoznaje peptid-MHC kompleks. U i <br />
lanacu, CDR3 ima najveu varjabilnost i najviše dopri-<br />
nosi ukupnoj varjavilnosti TCR-a. V domen lanaca<br />
sadrži i CDR4 koji ne doprinosi vezivanju <strong>za</strong> antigen ali<br />
se veže <strong>za</strong> mikrobijalne produkte tzv. superantigene.<br />
Oba TCR lanca, kao i teški i laki lanci Ig, su kodirani<br />
multiplim genskim segmentima koji podležu somatskim<br />
rekombinacijama tokom maturacije T limfocita.<br />
Slika 3.20. Struktura TCR<br />
C domeni i lanaca sadrže regione koji imaju rezidue cisteina koje doprinose medjusobnom<br />
disulfidnom povezivanju dva lanca. Transmembranski (hidrofobni) domen sadrži rezidue pozitivno<br />
naelektrisanih aminokiselina, kao što je lizin u lancu, i lizin i arginin u lancu. Ove rezidue<br />
interaguju sa negativnim reziduama u transmembranskim regionima drugih polipeptida koji<br />
formiraju TCR kompleks (CD i ). Oba lanca, imaju kratke citoplazmatine repove (5-12 ostataka<br />
aminokiselina). Kao i membranski Ig na B limfocitima, ovi citoplazmatini regioni su previše<br />
kratki da bi imali funkciju u transdukciji signala. Ovu funkciju vrše molekule koje su fiziki<br />
pove<strong>za</strong>ne sa TCR-om i grade TCR kompleks.<br />
Iako molekuli TCR-a i imunoglobulina pokazuju strukturnu slinost, mogu se <strong>za</strong>paziti i znaajne<br />
razlike izmedju ova dva tipa molekula. TCR se nikada ne sekretuje iz elije i on sam ne ispoljava<br />
efektorne reakcije. Umesto efektornih reakcija, TCR inicira signale koji aktiviraju efektorne<br />
funkcije T limfocita. Takodje, <strong>za</strong> razliku od Ig, lanci koji grade TCR imaju uvek isti C region (ne<br />
postoje razliite klase molekula u <strong>za</strong>visnosti od razliite ekspresije C regiona, kao kod Ig tj. ne<br />
postoji “isotype switching”).<br />
72
Tabela 3.6. Osobine receptora <strong>za</strong> antigene: TCR i imunoglobulina<br />
T elijski receptor (TCR) Imunoglobulin (Ig)<br />
Komponente i lanci Teški i laki lanci<br />
Broj Ig domena Jedan V i jedan C domen u svakom lancu Teški lanac: jedan V domen, tri od etri C domena<br />
Laki lanac: jedan V domen I jedan C domen<br />
Broj CDRs Tri u svakom lancu <strong>za</strong> vezivanje antigena; etvriti<br />
hipervarijabilni region u lancu (nepoznata<br />
funkcija)<br />
Tri u svakom lancu<br />
Udružene signalne molekule CD3 i Ig i Ig<br />
Afinitet <strong>za</strong> antigen (Kd) 10-5-10-7 M 10-7-10-11 M (sekretovani Ig)<br />
Promene nakon elijske aktivacije<br />
Produkcija sekretovane forme<br />
………………………………………….<br />
Zamena izotipova<br />
………………………………………….<br />
Somatske mutacije<br />
Ne<br />
………………………………………….<br />
Ne<br />
………………………………………….<br />
Ne<br />
3.5.2. Uloga TCR-a u prepoznavanju peptid+MHC kompleksa<br />
i lanci TCR-a specifino prepoznaju peptid-MHC kompleks preko CDR-a.<br />
Da<br />
………………………………………….<br />
Da<br />
………………………………………….<br />
Da<br />
Mesto preko koga se ostvaruje interakcija sa antigenom je ravna površina koju formiraju CDRs, <br />
i lanca. Zapanjujua je injenica da boni lanci samo jedne ili dve aminokiseline antigeninog<br />
peptida, ve<strong>za</strong>nog <strong>za</strong> MHC, ostvaruje kontakt sa TCR-om. Ovo ilustruje neverovatnu sposobnost T<br />
limfocita da razlikuju razliite antigene na osnovu samo par/nekoliko razlika u aminokiselinskim<br />
ostacima. Afinitet TCR-a <strong>za</strong> MHC-peptid kompleks je mala. Konstanta disocijacije (Kd) <strong>za</strong> intera-<br />
kciju TCR-a i MHC-peptid kompleksa<br />
varira izmedju 10 -5 – 10 -7 M. Ovaj mali<br />
afinitet je verovatno razlog postojanja<br />
pomonih molekula tj. postojanja potrebe<br />
<strong>za</strong> stabili<strong>za</strong>cijom adhezije izmedju T elija<br />
i APCs. TCR i pomone molekule na T<br />
elijama formiraju sa svojim ligantima na<br />
membrani APCs supramolekularne stru-<br />
kture tzv. imunološke sinapse.<br />
Formiranje sinapsi inicira signal koji se<br />
prenosi u eliju.<br />
Slika 3.21. Komponente TCR kompleksa<br />
73
Sve elije koje ekspresuju TCR su MHC ograniene, u smislu da ekspresuju ili CD4 ili CD8<br />
koreceptor. Malobrojna populacija T limfocita, ekspresuje marker karakteristian <strong>za</strong> NK elije. To<br />
su NK-T elije. TCR lanac na NK-T elijama ima ogranien diverzitet TCR prepoznaje lipide<br />
koji su ve<strong>za</strong>ni <strong>za</strong> CD1 molekule. Ostale elije koje prepoznaju lipide+CD1 komplekse i na njih<br />
reaguju produkcijom citokina kao što su interleukin-4 i interferon su: CD4 +, CD8 +, ili CD4 -,<br />
CD8 - T elije.<br />
3.5.3. CD3 i proteini<br />
CD3 i proteini su nekovalentno pove<strong>za</strong>ni sa TCR heterodimerom. Kada TCR prepozna<br />
antigen, ovi proteini prenose signal (ogovorni su <strong>za</strong> signalnu transdukciju) koji vodi ka aktivaciji T<br />
elija. CD3 molekula se sastoji iz 3 proteina: , i . TCR kompleks, takodje sadrži i disulfidno<br />
pove<strong>za</strong>n homodimer lanaca. CD3 i proteini su identini na svim T elijama, ne<strong>za</strong>visno od<br />
njihove specifinosti, što je ve<strong>za</strong>no <strong>za</strong> njihovu funkciju prenosa signala, a ne prepoznavanja<br />
antigena.<br />
3.5.3.1. Struktura CD3 i proteina<br />
Kao što je ve spomenuto CD3 proteini se sastoje od tri CD3 proteina to su , i lanci. N-<br />
terminalni ekstracelularni regioni ovih lanaca sadrže Ig-slian domen – pripadaju Ig superfamiliji.<br />
Transmembranski domeni, sva tri CD3 lanca, sadrže negativno naelektrisani aspartat koji se veže<br />
<strong>za</strong> pozitivno naelektrisane rezidue transmembranskog domena ilanacaTCR-a. – održava<br />
kompleks intaktan. Citoplazmaticni domeni , i lanaca (od 44-81 ostataka aminokiselina)<br />
sadrže po jednu kopiju konzervisane sekvence važne <strong>za</strong> transmisiju signala “immunoreceptor<br />
tyrosine-based activation motif” (ITAM). ITAM ima centralnu ulogu u signalingu preko TCR<br />
kompleksa. On je takodje, nadjen, na citoplazmatinim regionima drugih membranskih proteina<br />
limfocita koji su ukljueni u proces transdukcije signala ( lanci TCR kompleksa, lanci Igi<br />
Igmembranskih Ig na B limfocitima, kao i kod nekoliko Fc receptora). lanci su izgradjeni od:<br />
kratkog ekstracelularnog regiona (9 aminokiselinskih ostataka), transmembranskog regiona koji<br />
sadrži negativan aspartat i dugakog citoplazmatinog repa (113 ostataka aminokiselina koje<br />
imaju 3 ITAMa). lanac je takodje pove<strong>za</strong>n sa signalingom drugih receptora na limfocitima (Fc<br />
receptor na NK elijama).<br />
Za ekspresiju TCR kompleksa potrebna je sinte<strong>za</strong> sve tri komponente.<br />
74
3.5.3.2. Funkcije CD3 i proteina<br />
Slika 3.22. Ekspresija TCR kompleksa.<br />
U nedostaku CD3 (u stvari bilo koje<br />
komponente) nee doi do formiranja TCR<br />
kompleksa, a svi proteini koji ga grade e biti<br />
degradirani u eliji. Transfekovanjem elija sa<br />
genom koji nedostaje (u ovom sluaju gen <strong>za</strong><br />
CD3) e dovesti do formiranja i ekspresije TCR<br />
kompleksa na elijskoj membrani.<br />
CD3 i proteini povezuju prepoznavanje antigena i biohemijske dogadjaje koji dovode do<br />
funkcionalne aktivacije T limfocita.<br />
Posle prepoznavanja antigena dolazi do fosforilacije tirozinske rezidue ITAMs u citoplazmatinom<br />
repu CD3 i proteina. Fosfotirozin postaje vezno mesto <strong>za</strong> adapterne proteine i <strong>za</strong> tirozin kinazu<br />
sa Src homologim 2 domenom (SH2), ukljuujui i ZAP-70 kinazu, koja se veže <strong>za</strong> lanac, kao i<br />
Fyn kinazu koja se veže <strong>za</strong> CD3. Aktivacija ovih kina<strong>za</strong> aktivira put signalne transdukcije koji<br />
vodi ka promenama ekspresije gena u T elijama.<br />
3.5.4. TCR<br />
TCR je drugi tip TCR-a koji se ekspresuje na malom broju T elija. To je disulfidno ve<strong>za</strong>n<br />
heterodimer koji je, takodje, pove<strong>za</strong>n sa CD3 i proteinima. i TCR lanci se sastoje od<br />
ekstracelularnog Ig-slinog V regiona i C regiona, hidrofobnog transmembranskog domena, i<br />
kratkog citoplazmatinog repa.<br />
TCR se povezuje sa istim CD3 i lancima kao i heterodimer. Veina elija koje ekspresuju <br />
TCR ne ekspresuju CD4 i CD8.<br />
Više od 50% intraepitelijalnih limfocita su limfociti koji ekspresuju TCR .<br />
TCR ne prepoznaju peptid-MHC komplekse, nego prepoznaju drugaije forme antigena. Neke<br />
elije koje imaju TCR prepoznaju male fosforilisane molekule, alkil-amine ili lipide, koje su<br />
iska<strong>za</strong>ne “neklasinim” MHC I-slinim molekulima.<br />
75
3.5.5. Pomone molekule<br />
T elije ekspresuju nekoliko integralnih proteina membrane, koji imaju važnu ulogu u odgovoru T<br />
limfocita na antigene. Svi ovi proteini se esto nazivaju pomone molekule.<br />
Slika 3.23. Pomone molekule<br />
na T limfocitu.<br />
Pomone molekule imaju nekoliko <strong>za</strong>jednikih osobina koje determinišu njihovu ulogu u imunom<br />
odgovoru:<br />
pomone molekule T limfocita reaguju sa ligandima koji se nalaze na membrani drugih<br />
elija kao što su: APCs, endotelne elije krvnih sudova i u ekstracelularnom matriksu;<br />
pomone molekule su nepolimorfne i nepromenljive (identine na svim T elijama i kod<br />
svih individua jedne vrste);<br />
mnoge pomone molekule prenose signale u unutrašnjist T elija tako da su znaajne <strong>za</strong><br />
regulaciju funkcije T limfocita (najbolje prueni CD8 i CD4 koreceptori);<br />
vezivanje pomonih molekula <strong>za</strong> ligande na površini APCs poveava adheziju izmedju T<br />
limfocita i APCs;<br />
vezivanje pomonih molekula <strong>za</strong> endotelijalne elije i proteine ekstracelularnog matriksa je<br />
odgovorno <strong>za</strong> “homing” i <strong>za</strong>državanje T elija u tkivima;<br />
pomone molekule su korisni elijski “markeri” <strong>za</strong> identifikaciju T elija u normalnom I<br />
patološkom tkivu.<br />
76
Ime molekule Sinonimi Biohemi-jske<br />
CD4 T4 (ovek)<br />
L3T4(miš)<br />
CD8 T8 (ovek)<br />
Lyt2(miš)<br />
odlike<br />
Tabela 3.7. Osnovne pomone molekule T limfocita<br />
Familija gena elijska<br />
ekspresija<br />
55-kD monomer Ig T limfociti<br />
ogranieni na<br />
klasu MHC II<br />
ili dimer;<br />
78-kD lanac;<br />
32- do 34-kD b<br />
lanac<br />
CD28 Tp44 Homodimer od<br />
44-kD veliine<br />
lanaca<br />
CTLA-4<br />
(CD152)<br />
CD45R T200; <strong>za</strong>jedniki<br />
antigen<br />
leukocita<br />
CD2 T11, antigen<br />
pove<strong>za</strong>n sa<br />
funkcijom<br />
leukocita (LFA) -<br />
2<br />
Homodimer od<br />
lanaca veliine<br />
33- do 34-kD;<br />
može biti<br />
monomer;<br />
90 je<br />
intracelula-ran<br />
180-220-kD<br />
monomer;<br />
citoplasma-tske<br />
fosfataze<br />
LFA-1 CD11aCD18 Dimer od 180kD<br />
lanca, 95kD<br />
lanca<br />
L-selektin CD62L, Mel-14 150-kD<br />
monomer<br />
CD44 Pgp-1 80-200 kD<br />
monomer<br />
Ig T limfociti<br />
ogranieni na<br />
klasu MHC I<br />
Ig 90 CD4 + T<br />
elija, 50<br />
CD8 + T elija<br />
Ig Aktivirane T<br />
elije<br />
50-kD monomer Ig 90 T elije<br />
(ovek), NK<br />
elije<br />
Integrin Leukociti,<br />
trombociti<br />
Ligand Afinitet<br />
Kdx10 -6M<br />
Uloga u aktivaciji T<br />
elija<br />
Adhezija Signaling<br />
Klasa II MHC +<br />
-<br />
+<br />
Klasa I MHC 200 +<br />
-<br />
B7-1 (CD80), B7-2<br />
(CD86)<br />
B7-1<br />
B7-2<br />
4 - +<br />
0,4 - +<br />
Leukociti Nepoznat - +<br />
LFA-3 10-20 + +<br />
Intracelularna<br />
adheziona<br />
molekula (ICAM)-1<br />
ICAM-2<br />
ICAM-3<br />
0,1 + +<br />
-<br />
Selektin Leukociti Ugljeni hidrati kao<br />
ligandi na HEV<br />
105 + -<br />
Limfociti,<br />
granulociti<br />
Proteini matriksa + +<br />
-<br />
3.5.6. CD4 i CD8 koreceptori ukljueni u aktivaciju T limfocita<br />
CD4 i CD8 su proteini koji se vezuju <strong>za</strong> nepolimorfni region MHC molekule i ukljueni su u<br />
prenos signala tj. <strong>za</strong>jedno sa signalom TCR kompleksa iniciraju aktivaciju T elija. Zreli T<br />
limfociti ekspresuju ili CD4 ili CD8 molekule. CD4 i CD8 reaguju sa MHC molekulama kada TCR<br />
specifino prepozna peptid-MHC kompleks na površini elije koja iskazuje antigene.<br />
+<br />
77
3.5.6.1. Struktura CD4 i CD8 koreceptora<br />
CD4/CD8 su transmembranski glikoproteini, lanovi Ig superfamilije.<br />
CD4 se ekspresuje kao monomer, na površini perifernih T limfocita, timocita, a prisutan je<br />
i na mononuklearnim fagocitima i nekim dendritskim elijama. Ima 4 ekstracelularna Ig-slina<br />
domena, hidrofobni transmembranski domen, i citoplazmatini rep (38 ostataka aminokiselina).<br />
Preko svoja dva N-terminalna Ig-slina domena, veže se <strong>za</strong> 2 domen MHC molekula klase II.<br />
CD8 su disulfidno pove<strong>za</strong>ni heterodimeri, sastavljeni od CD8 i CD8 lanca. Oba lanca<br />
imaju jedan ekstracelularan Ig-slian domen, hidrofobni transmembranski region, i<br />
citoplazmatini rep (25 aminokiselinskih ostataka). Ig domen CD8 se vezuje <strong>za</strong> nepolimorfni 3<br />
domen MHC molekula klase I. Neke elije ekspresuju CD8 homodimere (izgleda da imaju<br />
drugaciju funkciju), dok je populacija T limfocita koja ekspresuje CD8 heterodimer mnogo vea.<br />
3.5.6.2. Funkcija CD4 i CD8 koreceptora<br />
CD8 koreceptori se selektivno vezuju <strong>za</strong> MHC molekule klase I. Kao što je poznato, ova klasa<br />
molekula se ekspresuje na svim nukleiranim elijama i uglavnom je ve<strong>za</strong>na <strong>za</strong> prezentaciju<br />
intracelularnih antigena. CD4 koreceptori se selektivno vezuju <strong>za</strong> MHC molekule klase II, koji se<br />
ekspresuju na APCs i ve<strong>za</strong>ni su <strong>za</strong> prezentaciju ekstracelularnih antigena. T elije koje ekspresuju<br />
CD4 koreceptor (i ograniene su na interakciju sa MHC II molekulama) produkuju citokine,<br />
nazivaju se T elije pomonice. T limfociti koji ekspresuju CD8 koreceptor (i ogranieni su na<br />
interakciju sa MHC I molekulama) su citotoksini (citolitini; CTL) T limfociti ukljueni u<br />
eliminaciju intracelularnih antigena. CD4/CD8 doprinose transdukciji signala nakon prepoznava<br />
Slika 3.24. Lck signalni put u T limfocitima.<br />
Lck je tirozin kina<strong>za</strong> (Src familija) pove<strong>za</strong>na sa citoplazmatinim repom CD4 i CD8.<br />
CD4/CD8 asocirana Lck je neophodna <strong>za</strong> maturaciju i aktivaciju T elija.<br />
nja antigena. Signalni put koji se aktivira vezivanjem<br />
<strong>za</strong> CD4/CD8 koreceptore se ukljuuje u aktivaciju<br />
specifine familije Src kina<strong>za</strong> tzv. Lck koja je<br />
nekovalentno ve<strong>za</strong>na <strong>za</strong> citoplazmatini rep CD4 i<br />
CD8 koreceptora. Prenos signala je posredovan Lck<br />
kinazom. Ve<strong>za</strong> CD4/CD8 i Lck je neophodna <strong>za</strong><br />
maturaciju i aktivaciju T limfocita. Kada TCR<br />
prepozna antigen, CD4/CD8 koreceptori se vežu <strong>za</strong><br />
odgovarajue MHC molekule. Ovo vezivanje<br />
približava koreceptor i njegovu Lck, do TCR komple-<br />
ksa, a Lck fosforiliše tirozinske ostatke ITAM-a u<br />
CD3 i lancima i tako inicira aktivaciju T elija.<br />
78
Sem uloge u signalnoj transdukciji, CD4/CD8 koreceptori, poveavaju adheziju T limfocita <strong>za</strong><br />
ciljnu eliju (eliju koja prezentuje antigen+MHC I/II).<br />
3.5.7. CD28 i CTLA-4: receptori koji regulišu aktivaciju T elija<br />
Kao što je poznato, <strong>za</strong> proliferaciju i diferencijaciju B i T limfocita u efektorne elije su potrebna<br />
dva ekstracelularna signala. Prvi signal je obezbedjen vezivanjem <strong>za</strong> antigen-specifian receptor (u<br />
sluaju T elija to je vezivanje peptid-MHC molekula <strong>za</strong> TCR i koreceptore CD4/8). Drugi signal je<br />
obezbedjen vezivanjem <strong>za</strong> molekule koje imaju <strong>za</strong>jednini naziv kostimulatori. Najbolje definisani<br />
kostimulatori <strong>za</strong> T limfocite su proteini B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86) koji se ekspresuju na<br />
profesionalnim APCs. Receptor <strong>za</strong> ove proteine na T limfocitima je molekula CD28. Ovaj receptor<br />
se ekspresuje na CD4 T elijama (~90%) i na CD8 T elijama (~ 50% kod ljudi i na svim naivnim<br />
elijama pacova). CD28, je membranski protein koji<br />
obezbedjuje sekundarni signal potreban <strong>za</strong> aktivaciju T<br />
limfocita tj. <strong>za</strong>jedno sa signalima poreklom od TCR<br />
kompleksa uestvuje u aktivaciji T elija. CD28 je<br />
homodimer izgradjen od 2 lanca koji imaju Ig-sline<br />
domenime.<br />
Slika 3.25. Interakcija B7 liganda i CD28/CTLA-4 receptora<br />
Vezivanje B7 molekula (APCs) <strong>za</strong> CD28 signal<br />
koji indukuje ekspresiju anti-apoptotikih<br />
proteina, stimuliše produkciju faktora rasta i<br />
drugih citokina i stimulise proliferaciju i<br />
diferencijaciju T elija. Vezivanjem B7 molekula<br />
sa membrane APCs, <strong>za</strong> CD28 receptore T<br />
limfocita, indukuje se ekspresija anti-<br />
apoptotikog proteina, stimuliše produkcija<br />
faktora rasta i drugih citokina, i promoviše<br />
proliferacija i diferencijacija T elija.<br />
Slika 3.26. Stimulacija proliferacije i diferencijacije T limfocita<br />
79
Na T limfocitima je otkriven još jedan receptor <strong>za</strong> B7 molekule, a to je CTLA-4 (CD152). Ovaj<br />
receptor je strukturno homolog CD28 receptorima, ali se ekspresuje na aktiviranim CD4 + i CD8 + T<br />
elijama. Funkcija ovog receptora je da inhibiše aktivaciju T elija tj. uestvuje u terminaciji<br />
odgovora T limfocita.<br />
3.5.8. CD45 i CD2: molekuli koji uestvuju u signalnoj transdukciji<br />
CD45 je protein, tirozin fosfata<strong>za</strong>, koja ima<br />
ulogu u regulaciji tirozin kina<strong>za</strong> tokom rane<br />
aktivacije T elija.<br />
CD2 je membranski molekul T limfocita<br />
koji doprinosi adheziji i ima ulogu u<br />
prenosu signala.<br />
Slika 3.27. Pomone molekule<br />
3.5.9. Adhezione molekule T limfocita: integrini, selektini, CD44<br />
Neke pomone molekule T limfocita, funkcionišu kao intercelularne adhezione molekule koje<br />
imaju znaajnu ulogu u interakciji T elija sa APCs, kao i u procesu migracije T limfocita na<br />
mesto infekcije.<br />
Integrini su heterodimerni proteini, koji se ekspresuju na leukocitima, a nijhovi citoplazmatini<br />
domeni su u kontaktu sa citoskeletom. Postoje dve podfamilije integrina. Pripadnici obe familije<br />
ekspresuju konzervisane lance (1 ili CD18 i 2 ili CD29), pove<strong>za</strong>ne sa razliitim lancima.<br />
Naješe adhezivne molekule koje se ekspresuju na T limfocitima su 1 integrini, takodje poznati i<br />
kao VLA (engl. very late activation) i 2 integrin, esto zvan i LFA-1 (engl. leukocyte function-<br />
associated antigen-1). Integrini T elija LFA-1 i VLA-4 se vezuju <strong>za</strong> ICAMs i VCAM-1 na površini<br />
drugih elija. Ove adhezivne interakcije su znaajne <strong>za</strong> stabilnu interakciju T elija i APCs, kao i<br />
80
<strong>za</strong> migraciju T elija iz krvi u tkiva. Integrini su odgovorni i <strong>za</strong> <strong>za</strong>državanje antigen stimulisanih T<br />
elija u limfoidnim organima, kao i na perifernim mestima infekcije.<br />
Tabela 3.8. Integrini<br />
Subjedinice Ime Ligandi Funkcije<br />
1 1 VLA-1 (CD49aCD29) Kolagen, laminin Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
2 VLA-2 (CD49bCD29) Kolagen, laminin Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
3 VLA-3 (CD49cCD29) Fibronektin, kolagen, laminin Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
4 VLA-4 (CD49dCD29) Fibronektin, VCAM-1, MadCAM-1 Adhezija elija <strong>za</strong> matriks;<br />
“homing”; kostimulacija T elija?<br />
5 VLA-5 (CD49eCD29) Fibronektin Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
6 VLA-6 (CD49fCD29) Laminin Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
7 CD49gCD29 Laminin Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
8 CD49hCD29 ? ?<br />
v CD51fCD29 Vitronektin, fibronektin Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
2 L CD11aCD18(LFA-1) ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 Adhezija leukocita na<br />
endotelijum; T elija-APC<br />
M CD11bCD18(MAC-1, CR3) iC3b, fibrinogen, factor X, ICAMadhezija;<br />
kostimulacija T el<br />
Adhezija leukocita i fagocito<strong>za</strong>;<br />
1<br />
adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
X CD11cCD18(p150,95;CR4) iC3b; fibrinogen Adhezija leukocita i fagocito<strong>za</strong>;<br />
adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
3IIb GPIIb/IIIa (CD41CD61) Fibrinogen, fibronektin, von<br />
Willebrand factor, vitronektin,<br />
trombospondin<br />
Adhezija i agregacija trombocita<br />
V Vitronektin receptor<br />
Fibrinogen, fibronektin, von Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
(CD51CD61)<br />
Willebrand factor,<br />
trombospondin,<br />
fibronektin,osteopontin, kolagen<br />
46 CD49fCD104 Laminin Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
5 Vitronektin Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
6 Fibronektin Adhezija elija <strong>za</strong> matriks<br />
7 LPAM-1 Fibronektin, VCAM-1, MadCAM-1 Vraanje limfocita u mukozna<br />
limfoidna tkiva<br />
E HML-1 E-kadherin Zadržavanje intraepitelijalnih T<br />
elija<br />
Skraenice: APC, antigen prezentujue elije; iC3b, C3b inaktivisan; ICAM, intracelularna adheziona molekula; VCAM-1, “vascular cell adhesion molecule-1”; LFA,<br />
“leukocyte function-assosiated antigen”; MadCAM-1, “mucosal addressin cell adhesion molecule-1”<br />
Aviditet integrina <strong>za</strong> svoje ligande se poveava nakon delovanja hemokina na T elije, kao i posle<br />
stimulacije T elija kroz TCR kompleks. Ekspresija integrina se poveava posle TCR stimulacije, a<br />
ekspresija liganada <strong>za</strong> integrine na APCs, je poveana posle stimulacije sa inflamatornim<br />
citokinima.<br />
81
Selektini su karbohidratni vezujui proteini, prisutni na membranei leukocita, endotelijalnih<br />
elija i trombocita. Osnovna funkcija im je da regulišu migraciju leukocita u razliita tkiva.<br />
Selektin koji se ekspresuje na leukocitima (L-selektin) je prisutan i na naivnim T limfocitima, i<br />
njegova ekspresija se smanjuje kod aktiviranih oblika. L-selektin je ukljuen u navodjenje naivnih<br />
limfocita u limfne vorove, tokom njihove migracije. Dva druga selektina tzv. E-selektin (koji se<br />
ekspresuje na endotelnim elijama) i P-selektin (na trombocitima i endotelnim elijama) se brzo<br />
produkuju na endotelnim elijama nakon aktivacije sa citokinima tokom inflamatorne reakcije.<br />
CD44 su odgovorni <strong>za</strong> retenciju T elija u ekstravaskularnom prostoru na mestima infekcije, kao i<br />
<strong>za</strong> vezivanje aktiviranih i memorijskih elija <strong>za</strong> endotel u tkivima koja su <strong>za</strong>hvaena inflamacijom.<br />
3.5.10. Efektorne molekule T limfocita<br />
T limfociti ekspresuju mnoge druge molekule koje su ukljuene u njihove efektorne funkcije.<br />
Aktivirani CD4 + T limfociti ekspresuju površinski protein, CD40 ligand (CD40L ili CD154) koji se<br />
vezuje <strong>za</strong> CD40 receptor na B limfocitima, makrofagama, dendritskim elijama i endotelnim<br />
elijama i aktivitra ih. Drugim reima CD40L je znaajan medijator mnogih efektornih reakcija T<br />
elija pomonica, kao što je stimulacija B elija da produkuju antitela i aktivacija makrofaga da<br />
unište fagocitirane mikroorganizme.<br />
Aktivirane T elije, takodje ekspresuju ligand <strong>za</strong> Fas receptor. Vezivanje Fas-a, <strong>za</strong> a Fas ligand T<br />
elija, dovodi do apoptoze T limfocita. Ovaj proces ima naroit znaaj u eliminaciji T limfocita,<br />
nakon ponavljane stimulacije antigenima. Angažovanje Fas liganda, takodje, obezbedjuje jedan od<br />
puteva kojim CTLs eliminišu ciljne elije.<br />
82
AKTIVACIJA I REGULACIJA T I B<br />
LIMFOCITA 04<br />
4.1. AKTIVACIJA T LIMFOCITA<br />
Vezivanje antigena <strong>za</strong> svoje receptore <strong>za</strong>jedno sa drugim stimulusima, aktivira ekspanziju i<br />
diferencijaciju naivnih T limfocita kao i efektorne funkcije diferenciranih limfocita. Razliite<br />
populacije T elija se razlikuju u nainu stimulacije kao i razliitim modelom odgovora na tu<br />
stimulaciju. U daljem tekstu e ukratko biti sumirane generalne karakteristike aktivacije T<br />
limfocita.<br />
Naivni T limfociti prepoznaju antigene u perifernom limfatinom voru, i tu se aktiviraju.<br />
Aktivacija limfocita vodi ka ekspanziji antigen-specifine limfocitne populacije i<br />
diferencijacije elija na efektorne i memorijske.<br />
Efektorne T elije prepoznaju antigene u limfoidnim organima ili u nelimfoidnom tkivu i tu<br />
se aktiviraju i postaju sposobne <strong>za</strong> ispoljavanje efektornih funkcija.<br />
Da bi se T limfociti aktivirali oni moraju da prepoznaju antigen iska<strong>za</strong>n na APCs,<br />
kostimulatore (drugi signal), i citokine produkovane iz APCs kao i iz drugih T limfocita.<br />
Da bi se aktivirali naivni T limfociti, oni moraju da prepoznaju antigene na dendritskim<br />
elijama, dok efektorne T elije mogu da odgovore na antigene prezentovane na membrani<br />
razliitih APCs.<br />
83
4.1.1. Funkcionalni odgovor T limfocita<br />
Slika 4.1. Aktivacija naivnih i efektornih T limfocita.<br />
Antiigeni koje dendritske elije transportuju u limfne vorove<br />
prepoznaju naivni T limfociti koji recirkulišu kroz ove limfne<br />
vorove. T elije se aktiviraju da bi se diferencirale u efektorne<br />
i memorijske elije koje mogu ostati u limfoidim organima, ili,<br />
mogu migrirati u nelimfoidna tkiva. Na mestu infekcije, efektorne<br />
elije se opet aktiviraju antigenima i obavljaju razliite<br />
funkcije.<br />
Odgovor T limfocita na prepoznavanje antigena, delovanje kostimulatora i drugih signala se sastoji<br />
od sekrecije citokina, proliferacije i diferencijacije.<br />
Jedan od prvih odgovora T elija na prepoznavanje antigena, je sekrecija proteina tzv. citokina. U<br />
T elijama signal, koji potie od prepoznavanja antigena i kostimulatora, aktivira transkripciju<br />
nekoliko citokinskih gena koja vodi ka sintezi ovih proteina. Interleukin, IL-2 je tipian citokinski<br />
protein koji se produkuje iz naivnih T elija i funkcioniše kao faktor rasta <strong>za</strong> T elije. U <strong>za</strong>visnosti<br />
od razliitih uslova aktivacije, naivne T elije se mogu diferencirati u razliite grupe elija koje<br />
produkuju razliite citokine i izvode razliite efektorne funkcije. Na primer, TH1 i TH2 populacije<br />
efektornih CD4 + elija pomonica produkuju citokine koji aktiviraju makrofage i B limfocite u<br />
efektornoj fazi elijskog i humoralnog imuniteta. Aktivirane T elije se mogu identifikovati preko<br />
ekspresije novosintetisanih površinskih proteina tzv. aktivacionih markera (npr. lanac IL-2<br />
receptora).<br />
84
Slika 4.2. Faze odgovora<br />
T elija.<br />
Prepoznavanje antigena<br />
od strane T elija indukuje<br />
produkciju citokina<br />
(IL-2), a potom klonalnu<br />
ekspanziju kao rezultat<br />
IL-2 indukovane autokrine<br />
proliferacije elija, i<br />
na kraju diferencijaciju T<br />
elija u efektorne ili<br />
memorijske elije. U<br />
efektornoj fazi odgovora,<br />
efektorne CD4+ T<br />
elije odgovaraju na<br />
antigen produkujui citokine<br />
koji indukuju aktivaciju<br />
makrofaga i B<br />
limfocita, dok efektorne<br />
CD8+ tj. CTLs odgovaraju<br />
tako što ubijaju<br />
druge elije.<br />
Proliferacija T limfocita, koja se aktivira kao odgovor na prepoznavanje antigena, nastaje kao<br />
rezultat autokrinog delovanja citokina koji stimulišu rast. Citokini se produkuju u eliji koja je<br />
aktivirana, a ta ista elija ekspresuje i površinske receptore <strong>za</strong> te citokine. Osnovni autokrini<br />
faktor rasta <strong>za</strong> veinu T elija je IL-2. Produkcija IL-2, kao i ekspresija receptora <strong>za</strong> IL-2 je<br />
stimulisana prepoznavanjem antigena. elija koja je prepoznala antigen, vezuje IL-2 koji je<br />
sekretovala, i tako, kao odgovor na sopstvene citokine, proliferiše. IL-2 nije jedini faktor rasta <strong>za</strong> T<br />
elije. APCs i druge nelimfoidne elije, produkuju citokin IL-15, koji stimuliše proliferaciju CD8 + T<br />
elija, posebno memorijskih elija iz CD8 + subpopulacije. Rezultat proliferacije naivnih T elija je<br />
ekspanzija klona - iz malog pula naivnih antigen-specifinih limfocita, generiše se veliki broj elija<br />
potrebnih <strong>za</strong> eliminaciju antigena.<br />
Nakon stimulacije sa antigenom i proliferacije, neke od proliferisanih elija se diferenciraju u<br />
efektorne elije koje eliminišu antigene i mogu da aktiviraju druge imune elije. Neke od antigen-<br />
stimulisanih T elija se razvija u dugo-živee, funkcionalno mirne memorijske elije.<br />
85
Nakon eliminacije antigena, T elijski odgovor opada tj. vraa se na ba<strong>za</strong>lni nivo. S obzirom da je<br />
antigen eliminisan, limfociti su lišeni stimulusa neophodnih <strong>za</strong> njihovo preživljavanje<br />
(obezbedjenih antigenom, kostimulatorima i citokinima produkovanim tokom inflamatorne<br />
reakcije), veina antigen-stimulisanih elija umire apoptozom.<br />
4.1.2. Uloga kostimulatora u aktivaciji T limfocita<br />
Kao što je ve više puta izneto, <strong>za</strong> proliferaciju i diferencijaciju T limfocita potreban je signal od<br />
APCs tzv. kostimulatora kao i specifian signal poreklom od antigena. Najbolje opisan<br />
kostimulatorni put aktivacije T elija<br />
ukljuuje interakciju površinske mo-<br />
lekule T elija, CD28, i kostimula-<br />
tornih molekula ekspresovanih na<br />
APCs B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86).<br />
Slika 4.3. Funkcije kostimulatora u aktivaciji T<br />
elija.<br />
A - APCs koja nije aktivirana skoro da ne ekspresuje<br />
kostimulatore ili ih ekspresuje u maloj koliini te ne<br />
može da aktivira naivne T elije.<br />
B – Mikrobi, kao i citokini produkovani tokom urodjenog<br />
imunog odgovora aktiviraju APCs da ekspresuju kostimulatore,<br />
kao što je B7. Na ovaj nain APCs postaju<br />
sposbne da aktiviraju naivne T elije. Takodje, aktivirane<br />
APCs produkuju citokine (IL-12) koji stimulišu diferencijaciju<br />
naivnih T elija u efektorne.<br />
Preko CD28 elija dobija signale koji pojaavaju odgovore na antigen, stimulišu produkciju<br />
citokina kao što je IL-2, i diferencijaciju naivnih elija u efektorne i memorijske.<br />
Inicijacija T elijskog odgovora “u pravo vreme i na pravom mestu” je omoguena regulacijom<br />
ekspresije kostimulatora. Ekspresija B7 kostimulatora je stimulisana mikrobijalnim produktima<br />
npr. endotoksinom i citokinima kao što je INF- koji se produkuju tokom nespecifinog imunog<br />
odgovora. Kada su T elije aktivirane, one ekspresuju molekul CD40L, koji se veže <strong>za</strong> CD40 na<br />
membrani APCs i inicira ekspresiju B7 kostimulatora na APCs.<br />
86
Slika 4.4. B7 koaktivacija.<br />
A – APC koja nema kostimulatora ne stimuliše odgovore<br />
CD4+ i može indukovati anergijuT elija (anergija je stanje u<br />
kome nema odgovora na antigensku stimulaciju i esto se<br />
naziva klonska anergija jer predstavlja nesposobnost<br />
kolonova T i B elija da odgovore na antigen; engl. anergy)<br />
B, C, D, E – Ekspresija B7 molekula indukovana transfekcijom<br />
gena (B) ili improvi<strong>za</strong>cija stimulatornog signala sa<br />
anti-CD28 antitelom (C) prouzrokuje aktivaciju T elija.<br />
Slino, u<strong>za</strong>jamno povezivanje TCR kompleksa sa antitelom<br />
specifinim <strong>za</strong> TCR/CD3 kompleks ne aktivira T elije (D),<br />
ali dodatak aktivacionog anti-CD28 antitela indukuje<br />
odgovor T elija.<br />
Eksperiment prika<strong>za</strong>n na slici pokazuje da je B7:CD28<br />
kostimulacija medjusobno pove<strong>za</strong>na.<br />
Slika 4.5. Uloga CD40 u aktivaciji T elija.<br />
Prepoznavanje antigena od strane T elija indukuje ekspresiju CD40 liganda (CD40L). CD40L vezuje CD40 na antigen-prezentujuim elijama<br />
(APCs) i stimuliše ekspresiju B7 molekula kostimulatora i sekreciju citokina, što aktivira T elije. Zakljuak: CD40 pravi APCs “boljim” APCs. T elije<br />
mogu ekspresovati CD40L i bez stimulacije, ali to <strong>za</strong>hteva B7:CD28 kostimulaciju, kao i antigen. Prema tome B7 i CD40 se u<strong>za</strong>jamno stimulišu.<br />
87
4.1.3. Signalna transdukcija preko TCR kompleksa<br />
Cilj aktivacije kaskada signalnih reakcija u T elijama, je koordinisana aktivacija transkripcije<br />
gena u naivnim elijama, a od ijih produkata <strong>za</strong>visi odgovor i funcije aktiviranih T elija. Signalni<br />
put koji se aktivira stimulacijom TCR kompleksa je najveim delom definisan in vitro anali<strong>za</strong>ma na<br />
razliitim populacijama T elija. Dobijeni rezultati su definisali osnovne karakteristike signalne<br />
transdukcije u T elijama:<br />
multiplim vezivanjem <strong>za</strong> TCR i koreceptore, aktivira se signalni put TCR-a;<br />
kao odgovor na prepoznavanje antigena dolazi do grupisanja membranskih receptora (engl.<br />
clustering), fosforilacije tirozinskih ostataka nekoliko proteina, i aktivacije adapternih<br />
proteina;<br />
signali TCR kompleksa koordinativno aktiviraju nekoliko biohemijskih puteva: signalni<br />
put.<br />
Ras-MAP kina<strong>za</strong>, put<br />
protein kinaze C, i<br />
kalcijum-kalcineurin<br />
signalni put. Aktivacija<br />
ovih enzima se dešava vrlo<br />
brzo nakon stimulacije<br />
TCR-a (nekoliko minuta), a<br />
aktivacija svakog od ovih<br />
puteva indukuje<br />
transkripcione faktore koji<br />
stimulišu ekspresiju<br />
razliitih gena T elija<br />
(proces koji traje nekoliko<br />
sati).<br />
Slika 4.6. Signalni putevi koji se aktiviraju<br />
aktivacijom TCR kompleksa.<br />
Vezivanje TCR i koreceptora <strong>za</strong> kompleks<br />
peptid-MHC na APCs inicira dogadjaje na<br />
poetku signalnog puta, što dovodi do fosforilacije<br />
-lanca, vezivanja i aktivacije ZAP-70,<br />
fosforilacije adapternih proteina i aktivacije razliitih<br />
elijskih enzima, što onda aktivira<br />
transkripcione faktore koji stimulišu ekspresiju<br />
razliitih gena ukljuenih u odgovor T elija.<br />
88
U narednom tekstu e biti opisani glavne etape u TCR signalnoj kaskadi.<br />
4.1.3.1. Rani dogadjaji na membrani: formiranje imunološke sinapse i aktivacija protein<br />
kina<strong>za</strong> i adapternih proteina<br />
Odmah nakon prepoznavanja antigena, na membrani T limfocita se pokreu procesi koji grupišu<br />
molekule koji uestvuju u signalnoj transdukciji.<br />
Formiranje imunološke sinapse<br />
Kada TCR kompleks prepozna MHC-peptid na APCs dolazi do brze mobili<strong>za</strong>cije membranskih<br />
proteina, i intracelularnih signalnih molekula, na mesto kontakta APCs i T elija. Region fizikog<br />
kontakta izmedju T elija i APCs se naziva imunološka sinapsa. Molekuli na membrani T elija se<br />
brzo mobilišu oko centra sinapse koja ukljuuje: TCR kompleks (TCR, CD3, lance), CD4 ili CD8<br />
koreceptore, receptore <strong>za</strong> kostimulatore (kao što su CD28), kao i enzime i adapterne proteine koji<br />
su pove<strong>za</strong>ni sa citoplazmatinim repom transmembranskih receptora. Integrini se nalaze na<br />
periferiji sinapse, gde doprinose stabili<strong>za</strong>ciji kontakta izmedju T elije i APC. Mnoge sinapse se<br />
nalaze u regionima elijske membrane koji se razlikuju u lipidnom sastavu od ostalih regiona<br />
membrane – mikrodomeni obogaeni glikolipidima. Prepoznavanje antigena stimuliše<br />
organi<strong>za</strong>ciju membranskih molekula u sinapsi i angažovanje signalnih puteva koji aktiviraju<br />
proteine citoskeleta.<br />
Aktivacija tirozin kina<strong>za</strong><br />
Odmah nakon organi<strong>za</strong>cije membranskih molekula i formiranja sinapse dolazi do aktivacije tirozin<br />
kina<strong>za</strong> 7 pove<strong>za</strong>nih sa citoplazmatinim domenima molekula CD3 i koreceptornih proteina, kao i<br />
fosforilacija tirozna u CD3 i lancima. Citoplazmatini regioni CD3 i lanaca sadrže peptidnu<br />
sekvencu tzv. ITAM (engl. immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) koja e biti<br />
fosforilisana Lck-om, kinazom koja pripada Src familiji tirozin kina<strong>za</strong>, i koja je pove<strong>za</strong>na sa<br />
citoplazmatinim repom CD4/CD8 koreceptora 8. Lck može biti aktivirana autofosforilacijom, a<br />
aktivna Lck fosforiliše tirozinske ostatke ITAM-a u CD3 i lancima. Još jedna kina<strong>za</strong> je fiziki<br />
pove<strong>za</strong>na sa TCR kompleksom. To je Fyn, kina<strong>za</strong> koja je pove<strong>za</strong>na sa CD3 proteinom i ima slinu<br />
ulogu kao Lck.<br />
7 Tirozin kinaze su enzimi koji katališu fosforilaciju ostatka tirozina u razliitim proteinskim supstratima.<br />
8 Kada se TCR veže <strong>za</strong> peptid-MHC kompleks, ve<strong>za</strong>e se i CD4 ili CD8 koreceptori <strong>za</strong> nepolimorfne regione molekula klase II ili I vezivanje e<br />
približiti citoplazmatine repove CD4/CD8 koreceptora, ITAM regionima, CD3 i lanaca.<br />
89
Slika 4.7. Šematski prikaz formiranja imunološke sinapse.<br />
Pre prepoznavanja antigena razliiti receptori na T elijama i njihovi ligandi na APC su dispergovani/rasuti po površini plazma membrana ove dve elije. Kada T elija<br />
prepozna antigen izložen i prezentovan od strane APC, selektovani receptori i njihovi odgovarajui ligandi se redistribuiraju u definisanu zonu kontakta elija-elija<br />
formirajui sinapsu. Molekule u centralnom delu sinapse formiraju centralni supramolekularni aktivacioni klaster (engl. central SupraMolecular Activation Cluster -<br />
cSMAC), dok molekuli na periferiji sinapse formiraju periferni supramolekularni aktvivacioni klaster (engl. peripheral SupraMolecular Activation Cluster - pSMAC).<br />
90
Slika 4.8. Fosforilacija tirozina u toku<br />
aktivacije T elija.<br />
Nakon prepoznavanja antigena, CD4-pove<strong>za</strong>na<br />
Lck postaje aktivna i fosforiliše ITAM-e<br />
CD3 i lanaca. ZAP-70 se veže <strong>za</strong> fosfotirozine<br />
lanca i fosforiliše ih i aktivira. Aktivni<br />
ZAP-70 fosforiliše tirozine u razliitim<br />
adaptornim molekulama kao što je LAT (B).<br />
Adapterni protein postaje vezno mesto <strong>za</strong><br />
elijske enzi-me kao što je PLC1 i proteine<br />
koji aktiviraju Ras i MAP kinaze (C), a ovi<br />
enzimi aktiviraju razliite elijske odgovore.<br />
Fosforilisani tirozin u okviru ITAM sekvence postaje vezno mesto (“docking site”) <strong>za</strong> tirozin kinazu<br />
ZAP-70 (engl. -associated protein of 70-kD). ZAP-70 sadrži dva konzervisana regiona koja se vežu<br />
<strong>za</strong> fosfotirozine ITAM sekvenci lanaca. Ve<strong>za</strong>ni ZAP-70 postaje substrat <strong>za</strong> susednu Lck, koja<br />
fosforiliše tirozine ZAP-70. Jednom aktivirani ZAP-70, može da se autofosforiliše kao i da<br />
fosforiliše brojne signalne molekule. Kritino mesto <strong>za</strong> aktivaciju “downstream” signalnih<br />
molekula je aktivacija ZAP-70. Da bi se dostigao kritian nivo angažovanja ZAP-70 molekula<br />
potrebna je njegova multipla aktivacija i multipla fosforilacija ITAMs-a lanaca 9.<br />
9 Potreba da se jedna T elija veže <strong>za</strong> antigen više puta svaki in vezivanja dovodi do ponovne fosforilacije ITAM-a lanaca, što vodi ka<br />
multiplom angažovanju ZAP-70 molekula.<br />
91
Još jedna kina<strong>za</strong> koja ima ulogu u aktivaciji T elija je PI-3 kina<strong>za</strong> (engl. phosphatidylinositol-3),<br />
koja fosforiliše inozitol-lipide pove<strong>za</strong>ne sa membranom. Ovaj enzim se regrutuje aktivacijom TCR-<br />
a i adapternih proteina, a on generiše nastajanje fosfatidilinozitol trifosfata (PIP3) od membranskih<br />
bifosfata. PIP3 je vezno mesto <strong>za</strong> fosfolipazu C kao i <strong>za</strong> Itk kinazu (i Btk u B limfocitima). PI-3<br />
kina<strong>za</strong> je ukljuena i u signaling koji potie od CD28 molekula. Aktivnost kina<strong>za</strong> u T elijama je<br />
kontrolisana delovanjem tirozin fosfata<strong>za</strong>. Tirozin fosfataze mogu da defosforilišu tirozinske<br />
ostatke, i na taj nain inhibišu ili stimulišu enzimsku aktivnost kina<strong>za</strong>. TCR kompleks angažuje<br />
dva tipa fosfata<strong>za</strong>. To su SHP-1 i SHP-2, koje funkcionišu tako što inhibišu signalnu transdukciju<br />
uklanjanjem fosfatne grupe iz kljunih signalnih molekula.<br />
Regrutovanje i aktivacija adapternih proteina<br />
Aktivirani ZAP-70 fosforiliše nekoliko adapternih proteina koji aktiviraju/vežu signalne molekule.<br />
Adapterni proteini 10 vežu signalne molekule i organizuju ih u specifiane elijske kompartmane<br />
(regione) i tako promovišu aktivaciju odredjenog signalnog puta. Za aktivaciju TCR signalne<br />
kaskade, neophodna je aktivacija ZAP-70 i fosforilacija LAT adapternog proteina (engl. linker<br />
activation of T cells). Fosforilisani tirozini LAT molekule su vezno mesto <strong>za</strong> SH2 domene drugih<br />
adapternih molekula i enzima ukljuenih u nekoliko signalnih kaskada. Aktivirani LAT direktno<br />
vezuje fosfolipazu C1 (kljuni enzim aktivacije T elija), i koordiniše regrutovanje nekoliko drugih<br />
adapternih proteina (SLP-76 kao i Grb-2) u imunološku sinapsu.<br />
4.1. 3.2. Signalni put Ras-MAP kinaze u T limfocitima<br />
Ras je pripadnik familije guanozin nukleotid-vezujuih proteina (mali G proteini) koji su ukljueni<br />
u aktivaciju razliitih procesa u mnogim elijama. On je pove<strong>za</strong>n sa elijskom membranom preko<br />
kovalentno ve<strong>za</strong>nih lipida. U neaktivnoj formi, vezno mesto Ras-a <strong>za</strong> nukleotide guanina je<br />
okupirano guanozin-difosfatom (GDP). Kada se ve<strong>za</strong>ni GDP <strong>za</strong>meni guanozin-trifosfatom (GTP),<br />
Ras se konformaciono izmeni i može da regrutuje/aktivira razliite enzime.<br />
Kada ZAP-70 fosforiliše LAT, <strong>za</strong> LAT se vezuje Grb-2 (preko svog SH2 domena). Grb-2<br />
angažuje Ras GTP/GDP faktor razmene, nazvan Sos, koji katališe <strong>za</strong>menu GDP sa GTP<br />
molekulom i tako nastaje forma Ras-a ve<strong>za</strong>na sa GTP-om (RasGTP). RasGTP funkcioniše kao<br />
alosterni aktivator enzima zvanih MAP kinaze (mitogen activated protein). U T elijama postoje tri<br />
glavne MAP kinaze: ERK, JNK i p38.<br />
10 Adapterni proteini sadrže strukturne motive/domene kojim se vezuju <strong>za</strong> druge proteine. Ovi motivi ukljuuju motive koji vežu Src 2 i 3 domene<br />
(SH2 i SH3), fosfotirozin-vezujue domene (PTB) i PH domene.<br />
92
RasGTP stimuliše aktivaciju, MAP kinazne kaskade, koja ukljuuje najmanje tri razliite<br />
kinaze, a svaka od njih fosforiliše/aktivira sledeu u kaskadi. Aktivacija, MAP kinazne kaskade<br />
dovodi do aktivacije ERK-a (engl. extracellular receptor-activated kinase) koji fosforiliše protein<br />
Elk, koji stimuliše Fos, komponentu neophodnu <strong>za</strong> aktivaciju transkripcionog faktora AP-1<br />
(activation protein-1).<br />
Paralelno sa aktivacijom Ras-a, TCR-pove<strong>za</strong>ne kinaze takodje mogu da aktiviraju i drugi<br />
GTP/GDP izmenjivaki protein, tzv. Vav, koji deluje na drugi “mali G protein” – Rac. RacGTP<br />
inicira aktivaciju enzimske kaskade, koja rezultuje aktivacijom MAP kinaze, zvane JNK (engl. c-<br />
Jun N-terminal kinase). Aktivirana<br />
JNK fosforiliše c-Jun, drugu ko-<br />
mponentu neophodnu <strong>za</strong> aktiva-<br />
ciju AP-1 transkripcionog faktora.<br />
Trei pripadnik familije MAP ki-<br />
na<strong>za</strong>, je p38. Ova kina<strong>za</strong> se<br />
takodje aktivira RacGTP siste-<br />
mom, a rezultat njenog angažova-<br />
nja je aktivacija razliitih transkri-<br />
pcionih faktora.<br />
Slika 4.9. Ras-MAP signalni put u aktivaciji T<br />
limfocita.<br />
ZAP-70 se aktivira prepoznavanjem antigena (videti sliku<br />
4.8.), fosforiše adapterne proteine ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> membranu,<br />
što onda dovodo do vezivanje drugog adaptera Grb-2.<br />
ZAP-70 fosforiliše Grb-2 pravei mesto <strong>za</strong> privlaenje Sos<br />
faktora <strong>za</strong> GTP/GDP razmenu. Sos konvertuje RasGDP<br />
u RasGTP (nije prika<strong>za</strong>n) koji aktivira kaskadu enzima,<br />
što kulminira aktivacijom MAP kinaze koja se zove ERK<br />
kina<strong>za</strong>. Paralelan Rac-<strong>za</strong>vistan put koji se naziva stresomaktiviranog<br />
proteina (engl. Stress-Activated Protein - SAP),<br />
ili SAP-<strong>za</strong>visni kinazni put generiše drugu aktivnu MAP<br />
kinazu koja se zove JNK kina<strong>za</strong> (nije prika<strong>za</strong>no na slici).<br />
4.1.3.3. Kalcijum- i protein kinaze C-posredovan signalni put u T limfocitima<br />
TCR signalni put ukljuuje i aktivaciju 1 izoforme fosfolipaze C (PLC1), a produkti nastali<br />
hidrolitikim razlaganjem membranskih lipida aktiviraju transkripcione faktore u T elijama. PLC1<br />
je citosolni enzim specifian <strong>za</strong> inozitol fosfolipide. Fosforilisani LAT, aktivira PLC1, koja katališe<br />
hidrolizu membranskih fosfolipida tj. fosfatidilinozitol 4,5-bifosfata (PIP2). Nastali produkti<br />
93
inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3) i diacilglicerol (DAG) aktiviraju dva odvojena signalna puta u T<br />
elijama.<br />
IP3 difunduje kroz citoplazmu do endoplazmatskog retikuluma, gde se vezuje <strong>za</strong> receptor i<br />
stimuliše oslobadjanje Ca ++ iz endoplazmatskog retikuluma, poveavajui nivo slobodnog Ca ++ u<br />
citoplazmi sa 100 nM do 600 ili ak 1000 nM. Ca ++ se vezuje <strong>za</strong> kalmodulin, a kompleks Ca ++ -<br />
kalmodulin aktivira nekoliko enzima, ukljuujui i serin/treonin fosfatazu – kalcineurin.<br />
DAG je hidrofobna molekula koja ostaje u elijskoj membrani, na mestu gde je formirana.<br />
Kombinacija povišenog nivoa intracelularnog Ca ++ i DAG-a, aktivira PKC koja je pove<strong>za</strong>na sa<br />
elijskom membranom. Akti-<br />
virana PKC se konforma-<br />
ciono menja, tako da njeno<br />
katalitiko mesto postaje<br />
dostupno supstratu.<br />
Slika 4.10. Signaling preko metabolizma<br />
membranskih inozitol fosfolipida.<br />
LAT (adapterni protein na T elijama koji se<br />
fosforiliše tokom njihove aktivacije) se<br />
vezuje <strong>za</strong> PLC1 aktiviranu fosforilacijom<br />
sa ZAP-70 i drugim kina<strong>za</strong>ma (npr. Itk).<br />
Aktivna PLC1 hidrolizuje membranski PIP2<br />
i stvara IP3 (stimuliše poveanje kalcijuma u<br />
citosolu) i DAG (aktivira enzim PKC).<br />
Poveanje citosolskog kalcijuma i aktivacija<br />
PKC potom aktivira razliite transkripcione<br />
faktore, što rezultira formiranjem raznolikih<br />
elijskih odgovora.<br />
4.1.3.4. Aktivacija transkripcionih faktora koji regulišu ekspresiju gena u T limfocitima<br />
Enzimi angažovani TCR signalnom kaskadom, aktiviraju transkripcione faktore, koji se vezuju <strong>za</strong><br />
regulatorne domene brojnih gena u T elijama, i aktiviraju njihovu transkripciju. Citoplazmatini<br />
putevi signalne transdukcije vode ka aktivaciji efektornih enzima, kao što su kinaze ERK, JNK i<br />
PKC, kao i fosfata<strong>za</strong> kalcineurin. Ovi enzimi doprinose aktivaciji transkripcionih faktora kao što<br />
94
su NFAT, AP-1 i NF-B koji funkcionišu kao stimulatori ekspresije gena u antigen-stimulisanim T<br />
elijama.<br />
Slika 4.11. Aktivacija transkripcionih faktora u T elijama.<br />
Veliki broj signalnih puteva konvergira u antigenima-stumulisanim T elijama,u cilju aktivacije i generisanja transkripcionih faktora koji stimulišu ekspresiju razliitih<br />
gena (u ovom sluaju IL-2 gena). Kalcijum–kalmodulinom aktivirani NFAT, kao i Ras i Rac signalni putevi generišu dva komponenete AP-1. Manje se zna o linku<br />
izmdju TCR signala i aktivacije NF-kB (NF-kB je prika<strong>za</strong>n kao kompleks od dve subjedinice koje su tipino p50 i p65 proteini nazvani prema njihovoj molekulskoj<br />
veliini u kilodaltonima). PKC je važna u aktivaciji T elija, a PKC je posebno važna u aktivaciji NF-kB. Svi ovi transkripcioni faktori funkcionišu koordinativno u<br />
regulaciji genske ekspresije. Obratiti pažnju na injenicu da je prika<strong>za</strong>no da razliiti signalni putevi aktiviraju jedinstvene trankripcione faktore, ali postoji i razumljivo<br />
preklapanje pojedinih signalnih puteva, pa svaki signalni put može da igra ulogu u aktivaciji velikog broja transkripcionih faktora.<br />
95
NFAT (engl. nuclear factor of activated T cells) je transkripcioni faktor neophodan <strong>za</strong> ekspresiju<br />
IL-2, IL-4, TNF i drugih citokinskih gena. On je prisutan u inaktivnoj, serin-fosforilisanoj formi u<br />
citoplazmi nestimulisanih T limfocita. NFAT se aktivira kalcijum-kalmodulin <strong>za</strong>visnom fosfatazom,<br />
kalcineurinom. Kalcineurin defosforiliše citoplazmatski NFAT, i na taj nain i<strong>za</strong>ziva njegovu<br />
translokaciju u nukleus.<br />
AP-1 je transkripcioni factor nadjen u mnogim tipovima elija. AP-1 je ime <strong>za</strong> familiju DNA-<br />
vezujuih faktora izgradjenih od dimera dva proteina koja se medjusobno vežu preko <strong>za</strong>jednikih<br />
strukturnih motiva tzv. “leucine zipper”. AP-1 faktor, koji je najbolje opisan, se sastoji iz Fos i Jun<br />
proteina.<br />
NF-B su homodimerni ili heterodimerni proteini, koji su homologi sa proto-onkogenima<br />
znaajnim <strong>za</strong> transkripciju mnogih gena, u razliitim tipovima elija. NF-B je prisutan u<br />
citoplazmi u kompleksu sa proteinima – inhibitorima B (IB) koji spereavaju njegovu<br />
translokaciju u nukleus. Signalne kaskade PKC, MAP kinaze, kao porast intracelularnog<br />
kalcijuma stimulišu fosforilaciju IB kinaze koja fosforiliše IB. Za fosforilisanu formu IB se<br />
vezuju peptidi ubikvitina, koji je obeležavaju <strong>za</strong> proteolitiku degradaciju u proteazomima. Nastali<br />
NF-B se translocira u nukleus, gde doprinosi aktivaciji citokinskih gena i gena <strong>za</strong> receptore<br />
citokina.<br />
96
4.2. AKTIVACIJA B LIMFOCITA<br />
4.2.1. Generalne karakteristike humoralnog imunog odgovora<br />
Proces aktivacije B elija i nastajanje elija sposobnih da produkuju antitela je proces koji<br />
se sastoji iz nekoliko fa<strong>za</strong>. Kao što je ve napisano, antigen-specifini B limfociti sazrevaju<br />
u kosnoj srži a <strong>za</strong>tim naseljevaju periferne limfne vorove, koji su i mesto njihovog susreta<br />
sa stranim antigenom. Humoralni imuni odgovor se inicira prepoznavanjem antigena od<br />
strane antigen-specifinog klona B limfocita. Antigen se vezuje <strong>za</strong> membranske IgM i IgD<br />
receptore, na naivnim B elijama, i aktivira ih. Aktivacija B elija se sastoji od serije<br />
odgovora koji vode ka ekspanziji antigen-specifinog klona tj. proliferaciji i diferencijaciji<br />
pri emu nastaju efektorne elije koje sekretuju antitela i memorijske elije. Neke<br />
aktivirane B elije poinju da produkuju antitela koja su drugaija od IgM i IgD tj. da<br />
produkuju druge izotipove antitela – “heavy chain class/isotype switching”.<br />
CD4 + T elije pomonice prepoznaju proteinske antigene i imaju važnu ulogu u aktivaciji B<br />
limfocita. Termin “pomonice” proizilazi iz potrebe da ove elije stimulišu ili pomognu B<br />
limfocitima da produkuju antitela.<br />
Humoralni odgovor na neproteinske antigene, kao što su polisaharidi i lipidi, ne ukljuuje<br />
angažovanje antigen-specifinih T elija pomonica.<br />
Aktivirane B elije se diferenciraju u elije koje sekretuju antitela (neke od njih produkuju<br />
antitela duži period) i dugoživee memorijske elije.<br />
Humoralni odgovor na proteinske antigene koji ukljuuje “heavy chain class/isotype<br />
switching” je ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> funkcije T elija pomonica.<br />
Primarni i sekundarni humoralni odgovor se razlikuje u kvalitetu i kvantitetu. Primarni<br />
odgovor nastaje nakon stimulacije naivnih B elija, dok sekundarni nastaje posle<br />
stimulacije memorijskih B elija. Sekundarni odgovor se brže razvija od primarnog i<br />
produkuje se vea koliina antitela. U sekundarnom odgovoru se produkuje više izotipova<br />
antitela (heavy chain class/isotype switching).<br />
97
4.2.2. Prepoznavanje antigena i antigenom-indukovana aktivacija B elija<br />
Aktivacija antigen-specifinih B limfocita je inicirana vezivanjem antigena <strong>za</strong> membranske<br />
imunoglobuline, koji funkcionišu kao receptori <strong>za</strong> antigene. Antigeni receptor, na B limfocitima,<br />
ima dve kljune uloge u njihovoj aktivaciji:<br />
prepoznavanje antigena indukuje grupisanje receptora i drugih signalnih molekula u<br />
membrani (clustering), i prenos biohemijskih signala koji iniciraju proces aktivacije B<br />
limfocita;<br />
receptor koji je ve<strong>za</strong>o antigen se internalizuje u endozomalnu vezikulu, i ako je antigen<br />
protein, procesuje u peptide koji se prezentuju na membrane B elija da bi bili prepoznati<br />
od T elija pomonica.<br />
4.2.2.1. Signalna transdukcija od BCR kompleksa<br />
Vezivanje antigena <strong>za</strong> BCR inicira grupisanje receptora na membrani B limfocita. Da bi BCR<br />
ispoljio funkciju signalne molekule, potrebno je da se dva ili više receptora dovedu u vezu ili da<br />
receptori budu pove<strong>za</strong>ni multivalentnim antigenima. IgM i IgD, koji funkcionišu kao BCR na<br />
naivnim limfocitima, imaju kratak citoplazmatini<br />
rep (3 aminokiseline) nedovoljan <strong>za</strong> transdukciju<br />
signala. Signali se, u stvari, prenose preko dva druga<br />
molekula, Ig i Ig, medjusobno pove<strong>za</strong>na<br />
disulfidnim ve<strong>za</strong>ma. Ig i Ig su nepohodni i <strong>za</strong><br />
površinsko ekspresovanje imunoglobulinskih<br />
receptora i <strong>za</strong>jedno sa njima grade BCR kompleks.<br />
Drugim reima, Ig i Ig imaju istu funkciju kao CD3<br />
i lanci na T limfocitima. Citoplazmatini rep Ig i<br />
Ig lanaca sadrži ITAM motiv, koji je neophodan <strong>za</strong><br />
prenos signala, a grupisanje membranskih Ig dovodi<br />
u vezu nekoliko ITAM motiva.<br />
Slika 4.12. BCR kompleks.<br />
Memnbranski IgM (kao i IgD) na površini maturiranih B elija je asociran sa<br />
invarijatnim Ig i Ig molekulama, koje sadrže na svojim citoplazmatinim<br />
repovima ITAM koji ima posreduje i ima funkciju u signalingu. Uoiti slinosti sa<br />
TCR kompleksom (Slika 3.21. u poglavlju 3.5.).<br />
98
Rani dogadjaji u signalnoj transdukciji koja potie od BCR su vrlo slini dogadjajima u TCR<br />
signalnom putu.<br />
Grupisanje membranskih Ig indukuje fosforilaciju tirozina u sastavu ITAM motiva Ig i Ig<br />
lanaca. Tirozin kinaze Lyn, Blk i Fyn (pripadnici Src familije tirozin kina<strong>za</strong>), koje su<br />
ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> BCR kompleks, uestvuju u fosforilaciji tirozina Ig i Ig. Za fosfotirozinske<br />
ostatke Ig i Ig, se vezuje tirozin kina<strong>za</strong> Syk, koja je ekvivalent kinazi ZAP-70 u T<br />
limfocitima.<br />
Syk i druge tirozin kinaze, aktiviraju “downstream” signalne puteve koji su regulisani<br />
adapternim proteinima. U B elijama, adapterni protein SLP-65 (BLNK) ima kljuno mesto<br />
u formiranju veze sa drugim adapternim proteinima, izmenjivaima guanozin nukleotida, i<br />
drugim enzimima, kao što su fosfolipa<strong>za</strong> C, i Btk, Itk tirozin kinaze.<br />
Signalni put Ras-MAP kina<strong>za</strong> se aktivira u antigen-stimulisanim B limfocitima. SLP-65<br />
regrutuje Sos (GDP/GTP factor razmene) koji, verovatno preko interakcije sa Grb-2,<br />
aktivira Ras. Signalni put aktiviranog Ras-a je slian onom u aktiviranim T limfocitima.<br />
U aktiviranim B limfocitima se aktivira i PLC signalni put. PLC2 se aktivira vezivanjem<br />
SLP-65 ili je fosforilisana Syk i Btk tirozin kinazom. Aktivna PLC razlaže PIP2, dajui IP3 i<br />
DAG. IP3 mobiliše kalcijum iz intraelijskih depoa, a porast intacelularnog kalcijuma<br />
stimuliše kalcijum-<strong>za</strong>visne enzime. DAG aktivira neke izoforme PKC koja fosforiliše<br />
serin/treonin ostake drugih proteina.<br />
Aktivacija BCR signalnih kaskada aktivira transkripcione faktore, koji indukuju ekspresiju<br />
gena, iji produkti su neophodni <strong>za</strong> funkcionalnu aktivaciju B elija.<br />
Signalne puteve, koji su angažovani stimulacijom membranskih IgM i IgD naivnih elija, koriste i<br />
membranske forme IgG, IgA, i IgE. Ove izoforme su, takodje, pove<strong>za</strong>ne sa Ig i Ig.<br />
99
Slika 4.13. Signalni put BCR kompleksa.<br />
Antigenom-indukovano u<strong>za</strong>jamno povezivanje membanskih imunoglobulina na B elijama vodi ka grupisanju Ig i Ig molekula i fosforilaciji<br />
tirozina na citoplazmatinom repu ITAMs molekula. Ovo vodi ka privlaenju Syk i posledinoj fosforilaciji tirozina Ig i Ig molekula ovom kinazom.<br />
Nekoliko signalnih kaskada prati ovaj dogadjaj, kao što je prika<strong>za</strong>no, vodei ka aktivaciji nekoliko transkripcionih faktora. Ovi putevi signalne<br />
transdukcije su slini putevima opisanim kod T elija (videti poglavlje 4.1., Slika 4.8.).<br />
100
4.2.2.2. Receptori <strong>za</strong> komplement obezbedjuju sekundarni signal<br />
Za aktivaciju B limfocita, neophodan je i sekundarni signal koji obezbedjuju proteini<br />
komplementa. Sistem komplementa se sastoji od plazma proteina, koji se aktiviraju vezivanjem ili<br />
<strong>za</strong> kompleks antigen-antitelo (klasian put aktivacije), ili se vezuju direktno <strong>za</strong> neke polisaharide i<br />
površinu mikroorgani<strong>za</strong>ma (alternativni ili lektinski put). Aktivacija komplementa dovodi do<br />
proteolize proteina komplementa. Kljuna komponenta sistema komplementa je protein C3, a<br />
njegovo razlaganje dovodi do formiranja C3b molekula koji se kovalentno veže <strong>za</strong> mikroorgani<strong>za</strong>m<br />
ili kompleks antigen-antitelo. C3b se dalje degradira u C3d koji ostaje ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> antigen. B<br />
limfociti ekspresuju receptore <strong>za</strong> C3d tzv. receptori <strong>za</strong> komplement tipa 2 (CR2 ili CD21).<br />
Kompleks C3d i antigen, ili C3d i kompleks antigen-antitelo se vezuje <strong>za</strong> B elije preko<br />
membranskog receptora <strong>za</strong> antigene (BCR) i CR2 koji prepoznaje ve<strong>za</strong>ni C3d. CR2 se ekspresuje<br />
na zrelim B limfocitima, kao kompleks sa druga dva membranska proteina, CD19 i CD81.<br />
Kompleks CR2-CD19-CD81 se esto naziva i kompleks koreceptora B elija, <strong>za</strong>to što CR2 vezuje<br />
antigen preko C3d molekula, a u isto vreme antigen je ve<strong>za</strong>n direktno preko membranskih Ig.<br />
Aktivacija CR2, dovodi u vezu citoplazmatini domen CD19 sa kina<strong>za</strong>ma pove<strong>za</strong>nim sa BCR<br />
kompleksom, tako da one fosforilišu<br />
citoplazmatini domen molekula<br />
CD19. Fosforilisani CD19 aktivira<br />
nekoliko signalnih puteva (jedan od<br />
njih je ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> PI-3 kinazu, koja<br />
pojaava signaling iniciran vezivanjem<br />
antigena <strong>za</strong> membranske Ig).<br />
Slika 4.14. Uloga komplementa u aktivaciji B limfocita.<br />
B elije ekspresuju kompleks od CR2 receptora komplementa,<br />
CD19 i CD81. Antigeni mikoba koji su ve<strong>za</strong>li C3d<br />
mogu simultano <strong>za</strong>uzeti i molekul CR2 kao i membranski<br />
ve<strong>za</strong>ni Ig na površini B elije. Ovo vodi ka inicijaciji<br />
kaskade signalinga i od BCR kompleksa i od CR2<br />
kompleksa. Zbog svega toga je dogovor na Cd3-antigen<br />
kompleks mnogo pojaan, u odnosu na odgovor u kojem<br />
je prisutan samo antigen.<br />
101
4.2.2.3. Funkcionalni odgovori B elije na prepoznavanje antigena<br />
Rane faze koje su inicrane signalnom transdukcijom preko aktivacije BCR kompleksa, aktiviraju<br />
proliferaciju B elija i njihovu diferencijaciju, kao i pripremu <strong>za</strong> interakciju sa T elijama<br />
pomonicama. Prepoznavanje antigena stimuliše ula<strong>za</strong>k elija koje su prethodno bile u miru u G1<br />
fazu elijskog ciklusa koja je praena poveanjem veliine elije, uveanjem citoplazmatine RNK i<br />
biosintezom organela kao što su ribozomi. Preživljavanje B elija je poveano kao rezultat<br />
indukcije razliitih anti-apoptotikih gena. Aktivirane B elije, takodje, pokazuju mali nivo<br />
proliferacije i sekrecije antitela. Ekspresija nekoliko citokinskih receptora (citokini su produkti T<br />
elija) je takodje poveana, što omoguava antigen-specifinim B limfocitima da odgovaraju na<br />
pomo T elija. Istovremeno, B elije menjaju nivo ekspresije receptora <strong>za</strong> hemokine, što im<br />
omoguava da migriraju u pravcu T elija pomonica i da interaguju sa njima.<br />
4.2.3. Humoralni odgovor na proteinske antigene <strong>za</strong>visi od T elija pomonica<br />
Humoralni odgovor na proteinske antigene <strong>za</strong>hteva prepoznavanje antigena od strane T elija<br />
pomonica i kooperativnost izmedju antigen-specifinih B i T limfocita. Funkcija T elija pomonica<br />
Slika 4.15. Poetni i kasni dogadjaji u humoralnom imunom odgovoru <strong>za</strong>visnom od T-elija pomonica<br />
je otkrivena još 1960 godine,<br />
pre klasifikacije limfocita u dve<br />
klase na T i B limfocite. Kasnije<br />
studije su poka<strong>za</strong>le da je veina<br />
T elija pomonica CD4 +CD8 - i<br />
da prepoznaju peptidne<br />
antigene iska<strong>za</strong>ne u kompleksu<br />
sa MHC molekulima klase II.<br />
Pomoni T limfociti stimulišu<br />
klonalnu ekpanziju B elija,<br />
”isotype switching”, afinitetnu<br />
maturaciju, kao i direfencijaciju<br />
u memorijske B elije.<br />
102
Razliite faze T-<strong>za</strong>visne aktivacije B elija odvijaju se u razliitim anatomskim regionima<br />
perifernog limfatinog tkiva. Poetna fa<strong>za</strong> se odvija na granici izmedju T elijske zone i primarnih<br />
folikula, a rezultira proliferacijom B elija, inicijalnom sekrecijom antitela i malim brojem “isotype<br />
switching” procesa. Kasna fa<strong>za</strong> T-<strong>za</strong>visnog humoralnog imunog odgovora se odvija u<br />
mikrookruženju germinativnih centara u okviru limfoidnih folikula, a rezultira afinitetnom<br />
maturacijom, generisanjem B elija i veim brojem “isotype switching” procesa.<br />
4.2.3.1. Rane faze humoralnog odgovora koji je <strong>za</strong>visan od T elja su: interakcija T-B<br />
elija, proliferacija B elija, sekrecija antitela i “isotype switching”.<br />
Interakcija izmedju T elija pomonica i B limfocita postupno ukljuuje: antigenom-indukovanu<br />
aktivaciju oba elijska tipa; fiziki kontakt izmedju elija; prezentaciju antigena od strane B elija<br />
diferenciranim T elijama pomonicama; aktivaciju T elija pomonica i ekspresiju membranskih i<br />
sekretornih molekula od strane T elija pomonica, a koji e aktivirati B elije.<br />
Antigenom-indukovana migracija B elija i T elija pomonica.<br />
Specifini B i T limfociti prepoznaju proteinske antigene u perifernim limfatinim tkivima.<br />
Aktivirani limfociti migriraju jedni prema drugima i iniciraju humoralni imuni odgovor. U<br />
perifernom limfatinom tkivu se nalazi mali broj naivnih B i T limfocita specifinih <strong>za</strong> odredjeni<br />
antigen (1 na 10 5 ili 10 6), tako da je malo verovatno da e se potrebna elija nai na pravom mestu<br />
u pravo vreme. Ovaj problem je rešen regulisanim kretanjem limfocita u limfnom organima. Kao<br />
što je ve spomenuto (vidi 2.2) naivni B i T limfociti nastanjuju razliite oblasti limfnih organa, a<br />
nakom aktivacije sa antigenom migriraju jedni prema drugima. Na ovaj nain se obezbedjuje<br />
njihov susret samo kada <strong>za</strong> to postoji potreba. Jedan do dva dana od prodora antigena, naivne<br />
CD4 + T elije prepoznaju antigene iska<strong>za</strong>ne na membrani profesionalnih APCs (dendritske elije) u<br />
T elijskoj zoni limfnog organa. Aktivirane T elije smanjuju ekspresiju CCR7 (receptor koji<br />
reaguje na hemokine produkovane u T-elijskoj zoni), i napuštaju ovu oblast. U isto vreme B<br />
limfociti prepoznaju antigen u folikulu, aktiviraju se, poinju da ekspresuju CCR7, i time<br />
stimulišu migraciju ka T-elijskoj zoni folikula. Drugim reima aktivirane T i B elije se susreu<br />
na granici izmedju folikula i T zone u limfnom organu. Aktivirane T elije pomonice ekspresuju<br />
membranske molekule i sekretuju citokine koji stimulišu B elije na proliferaciju i diferencijaciju.<br />
3-7 dana nakon prodora antigena, B elije koje sekretuju antitela su nadjene blizu aktiviranih T<br />
limfocita.<br />
103
B limfociti prezentuju proteinske antigene T elijama pomonicama<br />
Slika 4.16. B limfociti iskazuju antigene T elijama pomonicama<br />
Antigen-specifini membranski Ig, na B limfocitima,<br />
prepoznaju i vezuju nativne antigene, a <strong>za</strong>tim se kompleks<br />
internalizuje, procesuje u endozomalnim vezikulama, i<br />
peptidni fragmenti antigena iskazuju na membrani u<br />
kompleksu sa molekulima MHC klase II. Na ovaj nain, u<br />
humoralnom imunom odgovoru, B limfociti funkcionošu<br />
kao APCs i iskazuju antigene CD4 + T limfocitima.<br />
B limfocit u „T elija – B elija konjugatu”, je izložen<br />
delovanju signala sa membrane T limfocita, kao i<br />
delovanju visokih koncentracija citokina produkovanih u T<br />
limfocitima tj. stimulisan je <strong>za</strong> proliferaciju i<br />
diferencijaciju. Sekretovana antitela su specifina <strong>za</strong><br />
konformacionu determinantu antigena, <strong>za</strong>to što su<br />
membranski Ig B limfocita sposobni da vežu<br />
konformacione epitope nativnih antigena. Ovakva<br />
sposobnost prepoznavanja antigena odredjuje finu<br />
specifinost antitela, koja nije <strong>za</strong>visna od T elija<br />
pomonica sposobnih da prepoznaju samo linearnu<br />
sekvencu antigena.<br />
Vezivanje antigena <strong>za</strong> membranske Ig, poveava ekspresiju kostimulatora što poveava<br />
sposobnost B limfocita da aktiviraju T elije pomonice. Kostimulatori koji se ekspresuju na<br />
aktiviranim B limfocitima su B7-2 i B7-1. Obe ove molekule se vezuju <strong>za</strong> CD28 na T elijama<br />
pomonicama. Na ovaj nain, T elije pomonice se aktiviraju prepoznavanjem dva signala:<br />
antigen-MHC kompleksa (signal 1) i kostimulatora (signal 2), i ispoljavaju efektorne funkcije tj.<br />
“pomažu” proliferaciju i diferencijaciju B limfocita.<br />
Aktivacija B limfocita posredovana T elijama pomonicama: uloga interakcije CD40:CD40<br />
ligand i uloga citokina.<br />
Aktivirane T elije pomonice (antigenom i B7 kostimulatorima), na svojoj membrani ekspresuju<br />
molekule tzv. CD40 ligande (CD40L) koji se vezuju <strong>za</strong> CD40 receptore na B limfocitima koji su<br />
104
iska<strong>za</strong>li antigene (slika 4.20). Ova interakcija stimuliše proliferaciju i diferencijaciju B elija.<br />
CD40L (CD154) je membranski protein T elija, koji je strukturno homolog TNF i Fas ligandima.<br />
CD40 se konstitutivno ekspresujue na B elijama, a CD40L na površini aktiviranih T elija<br />
pomonica. Vezivanje CD40L <strong>za</strong> CD40 dovodi do oligomeri<strong>za</strong>cije CD40 molekula i njihovog<br />
povezivanja sa citoplazmatinim proteinima tzv. TRAFs (engl. TNF receptor associated factors).<br />
TRAF – CD40 interakcija aktivira enzimsku kaskadu, koja aktivira transkripcione faktore,<br />
ukljuujui i NF-B i AP-1. T elije pomonice na ovakav nain tj. direktnim elijskim kontaktom,<br />
stimulišu/aktiviraju i druge ciljne elije (npr. CD40L – CD40 interakcija koja aktivira makrofage).<br />
Slika 4.17. Mehani<strong>za</strong>m aktivacije B limfocita posredovan T elijama pomonicama<br />
Aktivirane T elije pomonice sekretuju citokine koji <strong>za</strong>jedno sa CD40L stimulišu proliferaciju i<br />
diferencijaciju B limfocita. Citokini imaju dve osnovne funkcije:<br />
stimulišu proliferaciju B elija (koja je inicirana CD40 signalima)<br />
stimulišu produkciju razliitih izotipova antitela (haevy chain switching).<br />
Za antigenom aktivirane B limfocite je karakteristino da imaju višestruko uvean odgovor na<br />
citokine. Naime, prepoznavanje antigena od strane B limfocita stimuliše ekspresiju receptora <strong>za</strong><br />
citokine, a B limfociti koji su u direktnom kontaktu sa T elijama pomonicama, su izloženi<br />
delovanju visoke koncentracije citokina, što sve vodi ka stimulaciji odgovora antigen-specifinih B<br />
limfocita. Citokini (IL-2, IL-4 i IL-5) produkovani u T elijama pomonicama, stimulišu<br />
proliferaciju B limfocita. IL-6, koji se sekretuje iz makrofaga T elija kao i mnogih drugih tipova<br />
elija funkcioniše kao factor rasta <strong>za</strong> ve diferencirane B limfocite koji produkuju antitela.<br />
105
Diferencijacija B limfocita u elije koje produkuju antitela<br />
CD40 i citokini aktiviraju transkripcione faktore koji stimulišu transkripciju gena <strong>za</strong> Ig kao i<br />
sintezu Ig. Citokini, kao što su IL-2, IL-4, i IL-6 stimulišu sintezu i sekreciju antitela iz aktiviranih<br />
B limfocita. U limfnim organima elije koje sekretuju antitela se uglavnom nalaze izvan folikula,<br />
na mestima kao što su crvena pulpa slezine i medulla limfnog vora.Mnogi B limfociti koji<br />
sekretuju antitela se transformišu u tzv. plazma elije. To su elije koje se morfološki razlikuju od<br />
limfocita i strukturno su opredeljene <strong>za</strong> produkciju velike koliine antitela. Dve do tri nedelje<br />
nakon prodora antigena, plazma elije migriraju u kosnu srž, tako da ona postaje glavno mesto<br />
produkcije antitela. Plazma elije mogu da sekretuju antitela i nekoliko meseci pa ak i godina,<br />
nakon eliminacije antigena iz organizma. Smatra se da je oko polovine antitela u krvi zdravih<br />
osoba produkt dugo-živeih plazma elija kosne srži, koja predstavljaju neposrednu <strong>za</strong>štitu u<br />
sluaju ponovnog prodora istog antigena. elije koje produkuju antitela ne cirkulišu, ve<br />
sekretuju antitela u krv i u mukozne sekrete i tako se cirkulacijom distribuiraju po organizmu.<br />
Diferencijacija B elija, od elija koje specifino prepoznaju antigene u efektorne elije, ukljuuje<br />
promenu u ekspresiji membranskih Ig u sekretovane Ig. Molekuli membranskih Ig se od<br />
sekretovanih Ig razlikuju u karboksi-terminalnom regionu, a „izmena“ membranske u neku od<br />
klasa Ig koji se sekretuju, podrazumeva promenu u procesovanju mRNA teškog lanca Ig.<br />
Izmena teškog lanca imunoglobulina (heavy chain isotype switching)<br />
U <strong>za</strong>visnosti od stimulacije citokinima i angažovanja CD40 molekula, neki od aktiviranih B<br />
limfocita koji ekspresuju IgM i IgD, ulaze u proces koji vodi ka izmeni teškog lanca (heavy chain<br />
isotype switching), tj. produkciji antitela koja u svom sastavu imaju teške lance razliitih klasa<br />
kao što su ,, i lanci 11 (slika 4.18.).<br />
“Isotype switching” se dešava u perifernom limfatinom tkivu, u B elijama koje su aktivirane i<br />
nalaze se na granici folikula. Neophodnost stimulacije B limfocita preko angažovanja CD40<br />
signala je dobro dokumentovana kod miševa ili osoba koje nemaju CD40 ili ligand <strong>za</strong> CD40. U<br />
ovom sluaju, aktivirani B limfociti produkuju uglavnom IgM, bez/ili sa malom produkcijom<br />
11 Osnovni molekularni mehani<strong>za</strong>m izmene u sintezi teškog lanca (isotype switching) je proces rekombinantne izmene (engl. switch<br />
recombination) u okviru kog u B limfocitima dolazi do rekombinacije VDJ segmenta sa C regionom.<br />
106
antitela drugih klasa. Mehani<strong>za</strong>m preko kog CD40 molekuli indukuju promenu transkripcije<br />
teškog lanca još uvek nije poznat.<br />
Slika 4.18. Proces “izmene” teškog lanca imunoglobulina - Ig “heavy chain isotype switching”.<br />
B elije aktivirane signalima (CD40L, citokini) od strane T elija pomonica prolaze “switching” proces tako da produkuju nekoliko razliitih izotipova<br />
imunoglobulina koji imaju razliite efektorne funkcije.<br />
Citokini, takodje imaju važnu ulogu u regulisanju produkcije teških lanaca razliitih klasa. Na<br />
primer, IL-4, koji se uglavnom sekretuje iz CD4 + T elija, je glavni faktor koji reguliše “izmenu”<br />
teškog lanca u teški lanac IgE. Takodje, produkcija IgG2 kod miševa <strong>za</strong>visi od interferona-, koji<br />
se sintetiše u T elijama i NK elijama.<br />
Produkcijom razliitih tipova antitela omoguena je velika plastinost humoralnog imunog<br />
odgovora, zbog toga što generisanje antitela koja imaju razliite efektorne funkcije omoguava<br />
107
eliminaciju razliitih tipova antigena (slika 4.21). Izmena tipa teškog lanca Ig, je regulisana<br />
aktivacijom odredjenog tipa T elija pomonica, u <strong>za</strong>visnosti od tipa mikroorganizma koji je<br />
aktivirao imuni odgovor. Na primer, glavni humoralni imuni odgovor na bakterije koje imaju<br />
kapsulu bogatu polisaharidima, se sastoji od antitela klase IgM. IgM se vežu <strong>za</strong> bakteriju,<br />
aktiviraju komplement, i indukuju fagocitozu bakterije. Dakle, polisaharidni antigeni koji ne<br />
stimulišu T elije pomonice, i<strong>za</strong>zivaju produkciju IgM antitela (sa vrlo malom/bez, promene ka<br />
IgG). Imuni odgovor na viruse i mnoge bakterije se sastoji od produkcije antitela IgG klase, koji<br />
svoje efektorne funkcije ispoljavaju opsoni<strong>za</strong>cijom i vezivanjem komplementa. Virusi i mnoge<br />
bakterije aktiviraju T elije pomonice, TH1 podklase, koje produkuju IFN- <strong>za</strong> koji se smatra da je<br />
glavni stimulator B elija <strong>za</strong> izmenu u produkciji antitela ka IgG. Imuni odgovor na mnoge<br />
parazite (Helmintes) je uglavnom produkcija IgE, koji eliminišu antigen ukljuivanjem eozinofila.<br />
Takodje, ova antitela posreduju alergijskim reakcijama. Helmintes aktiviraju TH2 populaciju T<br />
elija pomonica, koje produkuju IL-4. IL-4 je odgovoran <strong>za</strong> izmenu u sintezi antitela ka IgE klasi.<br />
Takodje, anatomska lokali<strong>za</strong>cija B elija determiniše “isotype switching”. Na primer, B limfociti u<br />
mukoznom tkivu produkuju IgA, klasu antitela koja se najefikasnije transportuje kroz epitel u<br />
mukozni sekret. Izmenu u sintezi antitela ka IgA stimuliše TGF-, koji se produkuje u mnogim<br />
tipovima elija u mukozi, kao i IL-5 iz T elija pomonica. Navedeni primeri izmene u sintezi<br />
teškog lanca ilustruju funkciju T elija pomonica kao kontrolora imunog odgovora tj. kako se u<br />
<strong>za</strong>visnosti od tipa antigena, aktiviraju razliite T elije pomonice koje preko sekrecije razliitih<br />
citokina regulišu produkciju antitela odredjenih klasa.<br />
4.2.3.2. Kasnije faze humoralnog odgovora <strong>za</strong>visnog od T elija pomonica: reakcije<br />
germinalnog centra<br />
Kasne faze humoralnog odgovora, koje ukljuuju afinitetnu maturaciju i nastajanje memorijskih<br />
elija, se odigravaju u germinalnim centrima folikula. Kao što je ve spomenuto, odgovor B elija<br />
na proteinske antigene <strong>za</strong>poinje na granici izmedju folikula i T-zone u limfnom voru. etiri do<br />
sedam dana nakon prodora antigena, neke aktivirane B elije migriraju u folikul i poinju da<br />
proliferišu, formirajui svetlo obojen centralni deo folikula tzv. germinalni centar. Germinalni<br />
centar je mesto brze proliferacije limfocita. Izraunato je od jedne aktivirane B elije u<br />
germinalnom centru, <strong>za</strong> 5 dana nastane 5000 progenitornih elija. Svaki formirani germinativni<br />
centar sadrži elije nastale od jedne ili nekoliko antigen specifinih klonova B elija.<br />
Arhitektura limfoidnih folikula kao i reakcije germinalnog centra <strong>za</strong>vise od prisustva folikularnih<br />
dendritskih elija (FDCs). FDCs ekspresuju receptore <strong>za</strong> complement (CR1, CR2 i CR3) kao i Fc<br />
108
eceptor (molekule ukljuene u selekciju B limfocita u germinalnim centrima). FDCs ne<br />
ekspresuju molekule MHC klase II. Poreklo ovih elija je nepoznato. One ne nastaju u kosnoj srži<br />
i znaajno se razlikuju od dendritskih elija koje ekspresuju MHC II molekule koje prezentuju<br />
proteinske antigene CD4 + T elijama. FDCs imaju dugake nastavke koji formiraju “mrežu” oko<br />
germinalnih centara.<br />
Formiranje germinalnih centara <strong>za</strong>visi i od prisustva T elija pomonica i interakcije izmedju CD40 i<br />
CD40L. Kod ljudi i miševa sa genetikim defektom u razvoju i aktivaciji T elija, kao u sluaju<br />
Slika 4.19. Selekcija B elija u germinalnim centrima<br />
mutiranih CD40 i CD40L ne dolazi do<br />
formiranja germinalnih centara.<br />
“Afinitetna maturacija” je proces<br />
produkcije antitela poveanog afiniteta<br />
<strong>za</strong> odredjeni antigen (afinitet raste u<br />
kasnim fa<strong>za</strong>ma humoralnog odgovora).<br />
Ona nastaje kao rezultat somatske<br />
mutacije gena <strong>za</strong> Ig teškog i lakog lanca<br />
(„point mutation” tako da nastaju<br />
mutanti CDR regiona varjabilnog regiona<br />
molekule, praene selektivnim preži-<br />
vljavanjem onih B elija koje produkuju<br />
antitela najveeg afiniteta <strong>za</strong> antigen. T<br />
elije pomonice i CD40:CD40L interakcije<br />
su neophodne <strong>za</strong> proces “sazrevanja<br />
afiniteta”. Drugim reima, ovaj proces se<br />
dešava samo u humoralnom imunom<br />
odgovoru na proteinske antigene, koji je<br />
<strong>za</strong>visan od T elija pomonica. B limfociti<br />
germinalnog centra koji sadrže mutirane<br />
gene <strong>za</strong> Ig lance migriraju ka nastavcima<br />
FDCs. Ovi B limfociti e biti <strong>za</strong>hvaeni<br />
apoptozom ukoliko se ne vežu <strong>za</strong> antigen<br />
koji je iska<strong>za</strong>n na FDCs.<br />
109
Drugim reima, samo one elije koje poseduju specifine receptore <strong>za</strong> iska<strong>za</strong>ne antigene e<br />
preživeti. Kao rezultat ovog procesa selekcije, u germinalnom centru e ostati samo one elije koje<br />
produkuju Ig visokog afiniteta <strong>za</strong> taj antigen.<br />
Nastajanje memorijskih elija i sekundarni imuni odgovor<br />
Neke od aktiviranih B elija se ne razvijaju u elije koje sekretuju antitela, ve postaju dugovene.<br />
Ove elije koje se nazivaju memorijske elije, imaju sposobnost dugog života bez stimulacije sa<br />
antigenom, i odgovorne su <strong>za</strong> nastajanje brzog imunog odgovora na ponovni prodor istog antigena.<br />
Za sada nije poznato <strong>za</strong>što se neki od prekursora klonova antigen-stimulisanih B elija diferencira<br />
u elije koje sekretuju antitela a <strong>za</strong>što neke elije ostaju “funkcionalno mirne” dugo-živee<br />
memorijske elije. Neke memorijske elije ostaju u limfnom voru, druge izlaze iz germinalnih<br />
centara folikula, cirkulišu putem krvi i nastanjuju druga limfna tkiva. Memorijske elije obino<br />
ekspresuju “mutirani” receptor, visokog afiniteta <strong>za</strong> antigen i molekule Ig koje poseduju<br />
“izmenjene” teške lance (prošle su proces “isotype swithing”). Produkcija velike koliine<br />
odgovarajuih izotipova Ig velikog afiniteta <strong>za</strong> antigen mnogostruko ubr<strong>za</strong>va<br />
inaktivaciju/eliminaciju antigena nakon njegovog ponovnog prodora u organi<strong>za</strong>m.<br />
Za mnoge karakteristike sekundarnog humoralnog imunog odgovora, su odgovorne CD4 + T elije<br />
pomonice. Tako, izmena teškog lanca Ig, koja je tipina karakteristika sekundarnog odgovora,<br />
nastaje <strong>za</strong>hvaljujui interakciji B limfocita sa citokinima sekretovanim iz T elija pomonica.<br />
Porast afiniteta produkovanih antitela, koji nastaje posle svakog narednog prodora antigena<br />
(proces afinitetne maturacije), takodje, nastaje kao rezultat interakcije B limfocita sa specifinim T<br />
elijama pomonicama 12.<br />
4.2.4. Humoralni odgovor na T-ne<strong>za</strong>visne antigene<br />
Mnogi neproteinski antigeni, kao što su polisaharidi i lipidi, stimulišu produkciju antigena bez<br />
pomoi T elija. Ovi antigeni se zovu timus-ne<strong>za</strong>visni ili T-ne<strong>za</strong>visni antigeni. Mnogi od ovih<br />
antigena, ukljuujui polisaharide, glikolipide i nukleinske kiseline su polivalentni, mogu da se<br />
multiplo vežu <strong>za</strong> membranske Ig na B elijama, i da aktiviraju komplement tj. mogu direktno da<br />
aktiviraju B elije bez pomoi T elija. T-ne<strong>za</strong>visni antigeni stimulišu produkciju antitela <strong>za</strong> koju je<br />
12 Antitela visokog afiniteta su neophodna <strong>za</strong> brzu i efikasnu eliminaciju mikroorgani<strong>za</strong>ma i njihovih toksina. Zato vakcine protiv mnogih<br />
mikroorganizma moraju da indukuju afinitetnu maturaciju i formiranje memorijskih elija (obe reakcije se dešavaju aktivacijom T elija pomonica).<br />
Ovakav koncept se može primeniti i u di<strong>za</strong>jnu vakcina <strong>za</strong> neke polisaharidne antigene, koje ne stimulišu T elije. U ovakvim sluajevima<br />
polisaharidni antigen se vezuje <strong>za</strong> strani protein tako da se formira konjugat koji e aktivirati T elije pomonice konjugovane vakcine.<br />
110
karakteristino da nema/ima vrlo malo, izmene izotipova teškog lanca. Drugim reima, produkuju<br />
se antitela, malog afiniteta, uglavnom klase IgM ili/i male koliine IgG. Takodje, <strong>za</strong> humoralni<br />
odgovor na T-ne<strong>za</strong>visne antigene je karakteristino da ne dolazi do formiranja memorijskih elija,<br />
jer je <strong>za</strong> nastajanje memorijskih elija neophodna aktivacija T elija pomonica, koja je u ovom<br />
sluaju izostala.<br />
4.2.5. Regulacija humoralnog imunog odgovora preko Fc receptora<br />
Sekretovana antitela mogu da inhibišu dalju aktivaciju B elija, formiranjem antigen-antitelo<br />
Slika 4.20. Regulacija aktivacije B limfocita preko Fc receptora<br />
kompleksa koji se vezuje <strong>za</strong> receptor<br />
<strong>za</strong> antigene kao i <strong>za</strong> Fc receptore<br />
na antigen specifinim B limfocitima<br />
(slika 4.23). Ovo je osnova <strong>za</strong><br />
funkionisanje negativne povratne<br />
sprege antitela tj. smanjivanje<br />
sekrecije antitela. IgG inhibišu<br />
aktivaciju B elija formiranjem<br />
kompleksa sa antigenima i ovi<br />
kompleksi se preko Fc regiona IgG<br />
vezuju <strong>za</strong> receptor Fc II (CD32).<br />
Citoplazmatini domen ovog rece-<br />
ptora sadrži motiv (6 aminokiselina:<br />
izoleucin-X-tirozin-X-X-leucin) <strong>za</strong> koji<br />
je karakteristiano da prenosi “nega-<br />
tivne” signale. Po analogiji sa ITAM-<br />
om, ovaj motiv nosi naziv ITIM (engl.<br />
immunoreceptor tyrosine-based<br />
inhibition motif).<br />
Aktivacija Fc receptora dovodi do fosforilacije tirozina koji se nalazi u sastavu ITIM-a, što formira<br />
vezno mesto <strong>za</strong> inozitol-5-fosfatazu, SHIP (engl. SH2 domain-containig inositol phosphatase).<br />
111
Regrutovana SHIP hidrolitiki razlaže PIP3 (koji nastaje nakon gruisanja BCR-a, o emu je bilo<br />
ranije rei) i vezuje PLC i Btk (koje su ukljuene u signaling preko BCR-a). Kompleks antigen-<br />
antitelo reaguje sa receptorom <strong>za</strong> antigen (antigen se veže <strong>za</strong> BCR), kao i sa Fc receptorom (Ig se<br />
preko Fc regiona veže <strong>za</strong> receptor) i na taj nain se inhibitorne fosfataze dovode u kontakt sa<br />
komponentama BCR signalnog puta, koji inhibišu.<br />
Drugim reima, aktivacija inhibitornog signalnog puta, koja se ostvaruje preko citoplazmatinog<br />
regiona Fc receptora, <strong>za</strong>ustavlja aktivaciju B elija.<br />
112
EFEKTORNI MEHANIZMI<br />
IMUNOG ODGOVORA 05<br />
Fiziološka funkcija svih imunih odgovora je eliminacija mikroba ili drugih štetnih agenasa. U<br />
prethodnim delovima (treem i etvrtom) su opisani mehanizmi kojima specifini limfociti<br />
prepoznaju i reaguju na strane antigene (prepoznavanje i fa<strong>za</strong> aktivacije adaptivnog imunog<br />
odgovora). Poglavlja koja pripadaju ovom delu skripte su posveena efektornim mehanizmima koji<br />
se aktiviraju tokom imunog odgovora i njihovom medjusobnom kordinisanom delovanju u odbrani<br />
organizma.<br />
U poglavlju 5.1. se opisuju citokini, solubilni posrednici i urodjene i adaptivne imunosti. Poglavlje<br />
5.2. se odnosi na efektorne mehanizme urodjenog imunog odgovora i ranu odbranu organizma<br />
uperenu protiv štetnih agenasa. U poglavlju 5.3. se opisuju efektorni mehanizmi imunog odgovora<br />
posredovanog elijama i to T-limfocitima i makrofagima koji funkcionišu kao odbrambeni<br />
mehanizmi protiv intraelijskih (intracelularnih) mikroba. Poglavlje 5.4. prikazuje efektorne<br />
mehanizme humoralnog imuniteta, odnosno imuniteta posredovanog antitelima ukljuujui i<br />
sistem komplementa, koji omoguavaju odbranu protiv vanelijskih mikroba.<br />
113
5.1. CITOKINI<br />
Generalno posmatrano, citokini su peptidi ili polipeptidi koji su produkt sekretorne aktivnosti<br />
jedne elije a mogu da utiu na rast i aktivnost drugih elija. To je familija proteina koje sekretuju<br />
elije urodjenog i adaptivnog imuniteta i koji posreduju veliki broj funkcija ovih elija, pa time i<br />
efektornih funkcija urodjenog i steenog imunog odgovora. Jedna vrsta elija može sekretovati<br />
razliite citokine, ali razliite elije mogu sekretovati isti tip citokina, a i jedan tip citokina može<br />
delovati na spektar razliitih elija. Citokini se sintetišu kao odgovor na inflamatorne ili antigene<br />
stimuluse i obino deluju lokalno, u autokrinom i/ili parakrinom maniru vezujui se <strong>za</strong> svoje<br />
receptore na ciljnim elijama. Neki citokini mogu biti produkovani u dovoljnoj koliini da cirkulišu<br />
i ispoljavaju endokrine efekte. Na veliki broj elija citokini deluju kao faktori rasta. Razliiti<br />
citokini stimulišu raznolike odgovore elija ukljuene u imunitetu i inflamaciji. U aktivacionoj fazi<br />
adaptivnog imunog odgovora citokini stimulišu rast i diferencijaciju limfocita a u efektornoj fazi<br />
urodjenog i adaptivnog imuniteta oni aktiviraju razliite efektorne elije i stimulušu ih da<br />
eliminišu antigene. U klinikoj medicini citokini su važni kao terapeutski agensi i kao ciljne<br />
molekule <strong>za</strong> specifine antagoniste u velikom broju imunih i inflamatornih bolesti.<br />
Nomenklatura citokina se esto bazira na njihovim elijskim izvorima. Citokini koje produkuju<br />
mononuklearni fagociti nazivaju se monokini, dok se oni koje produkuju limfociti zovu limfokini.<br />
Sa razvojem anti-citokinskih antitela i proba postalo je jasno da isti protein može biti sintetizovan<br />
i od strane limfocita i monocita, a i raznih drugih tkivnih elija, ukljuujui endotelijalne elije i<br />
neke epitelijalne elije. S obzirom na to da je najvei broj citokina produkovan od strane leukocita<br />
(makrofaga i T elija) i da oni ispoljavaju efekat na druge leukocite oni se nazivaju i interleukini.<br />
Ovaj termin nije sasvim preci<strong>za</strong>n zbog toga što postoji veliki broj citokina sekretovan od strane<br />
limfocita i koji deluju na limfocite a ne zovu se interleukini (jer je njihovo otkrie prethodilo<br />
imenu), i obrnuto, mnogi citokini se zovu interleukini a niti su produkti leukocita, niti pak na njih<br />
deluju. Ovaj termin je ipak koristan zbog toga što se novi citokini, nakon molekularne<br />
karakteri<strong>za</strong>cije, oznaavaju kao interleukin (IL) broj (npr. IL-1, IL-2 i dr.). U ovoj skripti se koristi<br />
termin citokini bez restrikcije u pogledu na elijski izvor ili biološku aktivnost date molekule.<br />
114
5.1.1. Osnovne karakteristike citokina<br />
Citokini su polipeptidi koji se produkuju kao odgovor na mikroorganizme i druge antigene i koji<br />
su posrednici i regulišu imuni i inflamatorni odgovor (Slika 5.1.). Iako su strukturno razliiti, neke<br />
osnovne karakteristike su im <strong>za</strong>jednike (Slika 5.2.):<br />
Citokini se sekretuju<br />
veoma brzo i taj proces je<br />
samo-limitirajui. Citokini se<br />
ne deponuju u eliji kao<br />
molekule spremne da obave<br />
svoju funkciju, nego je njihova<br />
sinte<strong>za</strong> inicirana novog genskom<br />
transkripcijom a kao posledica<br />
aktivacije elije. Ova transkri-<br />
pciona aktivacija je prolazna i<br />
informacione RNK koje kodiraju<br />
veinu citokina su nestabilne, te<br />
je i sinte<strong>za</strong> citokina takodje<br />
transientna.<br />
Slika 5.1. Uloga citokina u odbrani<br />
organizma.<br />
Produkcija nekih citokina može dodatno biti kontrolisana procesovanjem RNK, kao i post-<br />
transkripcionim mehanizmima, kao što su proteolitiko oslobadjanje aktivnog produkta-peptida<br />
od inaktivne prekusorske molekule. Jednom sintetisani, citokini se veoma brzo sekretuju i to u<br />
znaajnoj koliini, što rezultira veoma burnim otpuštanjem kada je potrebno.<br />
Efekti citokina su esto plejotropni i redundantni (Slika 5.2.). Plejotropi<strong>za</strong>m<br />
predstavlja sposobnost jednog citokina da deluje na razliite elije, što omoguava datom citokinu<br />
da bude medijator u razliitim biološkim efektima. Bez obzira na ovu osobinu, terapeutska<br />
primena citokina je ograniena zbog toga što se esto pri administraciji citokina u željene svrhe,<br />
javljaju brojni neželjeni sporedni efekti. Redundancija je sposobnost veeg broja citokina da<br />
ispolje istu funkciju. Kod ove osobine efekat mutacije jednog gena ili citotokinskih antagonista ne<br />
mora imati funkcionalne posledice jer funkcija „inhibisanog“ citokina može biti kompenzovana<br />
nekim drugim.<br />
115
Citokini esto utiu na sintezu i aktivaciju drugih citokina. Sposobnost jednog<br />
citokina da stimuliše produkciju drugih vodi ka kaskadi u kojoj drugi ili trei u kaskadnom nizu<br />
mogu da posreduju biološku aktivnost prvog. Dva citokina mogu ispoljavati antagonistiki, ili<br />
aditivni ili pak sinergistiki (vei od oekivanog) efekat jedan prema drugom (Slika 5.2.).<br />
Citokini mogu delovati<br />
lokalno ili sistemski. Veina<br />
citokina ispoljava svoju biološku<br />
aktivnost u blizini mesta sopstvene<br />
produkcije, ili na samu eliju koja<br />
ih je sekretovala (autokrina<br />
aktivnost) ili na elije u okolini<br />
(parakrina aktivnost). Ukoliko se<br />
produkuju u veoj koliini citokini<br />
mogu da ulaze u cirkulaciju i da<br />
deluju na mestima udaljenim od<br />
mesta njihove produkcije.<br />
Slika 5.2. Osnovne karakteristike citokina.<br />
plejotropi<strong>za</strong>m- jedan citokin ima multiple efekte na<br />
razliite elijske tipove; redundancija- razliiti citokini<br />
imaju isti ili slian efekat; sinergi<strong>za</strong>m-dva ili vise<br />
citokina imaju aditivne effekte; antagoni<strong>za</strong>m- jedan<br />
citokin inhibira dejstvo drugog<br />
Citokini ispoljavaju svoj<br />
efekat vezivanjem <strong>za</strong> specifine<br />
membranske receptore na ciljnim<br />
elijama. Receptori <strong>za</strong> citokine<br />
esto vezuju svoje ligande sa velikim<br />
afinitetom (Kd u opsegu od 10 -10 do 10 -12 M). Ova osobina omoguava da veoma male koliine<br />
citokina „okupiraju“ receptore u dovoljnoj meri da i<strong>za</strong>zovu biološki efekat. Veliki broj elija<br />
ekspresuje veoma ni<strong>za</strong>k nivo citokinskih receptora (u nizu od 100 do 1000 receptora po eliji), ali<br />
je ovaj broj adektvatan da indukuje odgovor upravo zbog velikog afiniteta receptora prema<br />
ligandu.<br />
Spoljašnji signali regulišu ekspresiju citokinskih recptora, a time i odgovor elija na<br />
citokine. Poznato je da stimulacija T ili B limfocita antigenima dovodi do poveane ekspresije<br />
116
citokinskih receptora. Zbog ove osobine tokom imunog odgovora antigen-specifini limfociti<br />
dominiraju u pogledu odgovora na sekretovane citokine. Ovo je jedan od mehani<strong>za</strong>ma kojima se<br />
održava specifinost imunog sistema iako citokini sami po sebi nisu antigen specifini. Ekspresija<br />
citokinskih receptora je regulisana i samim citokinima, ukljuujui i to da isti citokin koji se<br />
vezuje <strong>za</strong> receptor, istovremeno dozvoljava i stimulaciju pozitivne amplifikacije ili negativne<br />
povratne sprege.<br />
elijski odgovor na najvei broj citokina je sadržan u ekspresiji gena u ciljnoj eliji,<br />
što rezultuje ekspresijom nove funkcije, a nekada i proliferacijom ciljne elije. Veina<br />
promena u ekspresiji gena indukovana citokinima rezultira diferencijacijom T i B limfocita i<br />
aktivacijom efektornih elija, kao što su makrofagi. Izuzetak od pravila da citokini funkionišu tako<br />
što menjaju obra<strong>za</strong>c ekspresije gena su hemokini koji prouzrokuju rapidnu migraciju elija, kao i<br />
citokin koji se zove faktor nekroze tumora (engl. Tumor Necrosis Factor – TNF) i koji indukuje<br />
apoptozu aktiviranjem elijskihe enzima, bez nove genske transkripcije ili sinteze proteina.<br />
5.1.1.1. Funkcionalne kategorije citokina<br />
Prema svojoj osnovnoj biološkoj aktivnosti citokini su klasifikovani u tri funkcionalne kategorije.<br />
(1) Medijatori i regulatori urodjenog imuniteta se produkuju uglavnom od strane<br />
mononuklearnih fagocita, a kao odgovor na infektivne agense. Bakterijski produkti kao što su<br />
lipopolisaharidi (LPS) i viralni produkti kao što je dvostruka RNK direktno stimulišu makrofage da<br />
sekretuju citokine kao deo urodjene otpornosti. Isti citokini mogu takodje biti produkovani i<br />
sekretovani i od strane makrofaga koji su aktivirani antigen-stimulišuim T elijama, te su tako<br />
deo adaptivnog elijama-posredovanog imuniteta.<br />
(2) Medijatori i regulatori adaptivnog imuniteta se produkuju uglavnom od strane T limfocita,<br />
a kao odgovor na specifino prepoznavanje stranih antigena. Neki citokini T elija funkcionišu<br />
primarno u regulaciji rasta i dfierencijacije razliitih limfocitnih populacije, te tako igraju važnu<br />
ulogu u aktivacionoj fazi T elijama-posredovanog imunog odgovora. Drugi citokini poreklom od T<br />
elija regrutiraju, aktiviraju i regulišu specijalizovane efektorne elije kao što su: mononuklearni<br />
fagociti, neutrofili i eozinofili, u efektornoj fazi adaptivnog imunog odgovora.<br />
(3) Stimulatori hematopoeze se produkuju od strane stromalnih elija kosne srži, leukocita i<br />
drugih elija, a stimulišu rast i diferencijaciju nezrelih leukocita.<br />
Generalno, citokini i urodjenog i adaptivnog imuniteta su produkti razliitih elijskih populacija, a<br />
svoj ekfekat ispoljavaju na razliite ciljne elije. I pored toga, ove raznovrsnosti nisu apsolutne<br />
zbog toga što neki od citokina može biti produkovan i tokom urodjenog i adaptivnog imunog<br />
117
odgovora, a biološka aktivnost razliitih citokina koji se produkuju tokom ovih odgovora može se<br />
medjusobno „preklapati“.<br />
Tabela 5.1. Citokini i njihove funkcije<br />
CITOKIN O P I S<br />
Interferon alfa (IFN) Spreava replikaciju virusa i inhibiše elijski rast; sekretuju ga elije inficirane virusima<br />
Interferon beta (IFN) Spreava replikaciju virusa, inhibiše elijski rast, smanjuje ekspresiju MHC I i MHC II; sekretuju ga fibroblasti<br />
inficirani virusima<br />
Interferon gama (IFN) Obuhvata oko 20 razliitih proteina koji aktiviraju makrofage i prirodne elije ubice, stimulišu steeni imunitet<br />
poveavajui ekspresiju MHC I i MHC II i spreavajui replikaciju virusa; sekretuju ih T elije pomonice,<br />
citotoksine T elije i elije ubice.<br />
Interleukin–1 (IL-1) Kostimulacija B i T elija, pospešuje produkciju prostaglandina i razvijanje inflamatornih procesa, delujui na<br />
hipotalamus dovodi do nastanka groznice (pirogeno dejstvo); sekretuju ga makrofagi, B elije i fibroblasti<br />
Interleukin-2 (IL-2) Kostimulacija B i T elija, aktivacija makrofaga i elija ubica; sekretuju ga T elije pomonice<br />
Interleukin-4 (IL-4) Aktivira B elije i uestvuje u alergijskim reakcijama, što rezultuje produkcijom imunoglobulina E (IgE); sekretuju ga<br />
T elije pomonice<br />
Interleukin-5 (IL-5) Stimuliše eozinofilne granulocite i tako uestvuje u odgovoru na prisustvo parazita; sekretuju ga T elije pomonice<br />
Interleukin-8 (IL-8) Kao hemotaksini faktor privlai neutrofilne i bazofilne granulocite i pospešuje inflamatorne procese; sekretuju ga<br />
makrofagi<br />
Interleukin-10 (IL-10) Inhibiše sekreciju interferona gama i interleukina; sekretuju ga supresorske T elije<br />
Limfotoksin Ubija ciljne elije; sekretuju ga citotoksine T elije<br />
Perforin Dovodi do formiranja pukotine u membrani ciljne elije, što rezultira liziranjem elije; sekretuju ga citotoksine T<br />
elije<br />
Faktor nekroze tumora<br />
(Tumor necrosis factor -TNF) Aktivira makrofage i pospešuje razvijanje groznice (pirogeno dejstvo); sekretuju ga makrofagi<br />
5.1.1.2. Citokinski receptori i signaling<br />
Citokini svoj efekat ispoljavaju vezujui se sa velikim afinitetom <strong>za</strong> svoje receptore koji pripadaju<br />
odredjenim strukturnim familijama. Aktivacija receptora stimuliše specijalizovane signalne puteve<br />
kao što je npr. JAK/STAT signalni put (Janus tirozin Kinaze u citoplazmi koje fosforilišu STAT-<br />
engl. Signal Transducer and Activator of Transcription).<br />
Svi citokinski receptori se sastoje od jednog ili više transmembranskih proteina iji<br />
ekstracelularni deo je odgovoran <strong>za</strong> vezivanje citokina, a citoplazmatski deo je odgovoran <strong>za</strong><br />
inciranje signalnih puteva. Ovo su tipini putevi signalne transdukcije koji se aktiviraju ligand-<br />
indukovanom aktivacijom receptora, približavajui citoplazmatske delove jedne ili više receptornih<br />
118
molekula u procesu analognom signalingu preko T i B receptora (pogledati ranije u delovima o<br />
aktivaciji T i B limfocita).<br />
Najrasprostranjenija klasifikacija citokinskih receptora <strong>za</strong>sniva se na strukturalnoj homologiji<br />
ekstracelularnih citokin-vezujuih domena. Prema ovoj klasifikaciji citokinski receptori su<br />
podeljeni u pet familija (Slika 5.3A.).<br />
Tip I citokinski receptori (hemopoetinski receptori), sadrže jednu ili više kopija<br />
domena sa dve konzervisane cisteinske rezdue i membransku proksimalnu sekvencu triptofan-<br />
serin-X-triptofan-serin (WSXWS), gde X predstavlja bilo koju amino kiselinu. Ovi receptori vezuju<br />
citokine koji nose 4 lanca -heliksa. Konzervirana struktura receptora je deo koji veže citokine sa<br />
4 lanca -heliksa, dok se specifinost prema svakom tipu citokina determiniše amino kiselinskim<br />
ostacima koji se razlikuju od jednog do drugog receptora. Ovi receptori sadrže unikatni lanac<br />
ligand-vezujueg domena i jedan ili više tzv. signal-tansducing lanaca (deo molekule receptora<br />
odgovoran <strong>za</strong> transdukciju/prenos signala) koji je esto isti kod receptora <strong>za</strong> razliite citokine<br />
(Slika 5.3A).<br />
Tip II citokinski receptori su slini tip I receptorima u organi<strong>za</strong>ciji ekstracelularnih<br />
domena sa konze-<br />
rvisanim cisteinima,<br />
ali ne sadrže WSXWS.<br />
Ovi receptori imaju<br />
jedan ligand vezujui<br />
polipeptidni lanac i<br />
jedan lanac <strong>za</strong><br />
signalnu transdu-<br />
kciju.<br />
Slika 5.3. Strukture<br />
citokinskih receptora.<br />
A – Receptori <strong>za</strong> razliite citokine<br />
klasifikovani su u familije na osnovu<br />
konzervisane strukture ekstracelularnog<br />
domena (WSXWS: triptofan<br />
-serin-X-triptofan-serin); B - Razliiti<br />
citokinski receptori izgraeni su od<br />
specifinog ligand-vezujueg lanca<br />
koji se nekovalentno asocira sa<br />
signalnom subjedinicom koja je<br />
<strong>za</strong>jednika <strong>za</strong> receptore razliitih<br />
citokina.<br />
119
Citokinski receptori koji pripadaju Ig superfamiliji imaju ekstracelularni<br />
imunoglobulinski (Ig) domen. Ovi receptori vezuju raznolike tipove citokina ime se aktiviraju<br />
razliiti mehanizmi signalne transdukcije.<br />
TNF receptori pripadaju familiji receptora (u kojoj neki lanovi nisu citokini) sa<br />
ekstracelularnim domenima bogatim cisteinima. Vezivanje liganda uslovljava da receptor aktivira<br />
intracelularne proteine sa kojima je asociran, a koji indukuju apoptozu i/ili stimulišu ekspresiju.<br />
GPCR (engl. G-Protein Coupled Receptors) ili receptori koji -heliksom sedam puta<br />
prolaze/presecaju (engl. seven-transmembrane -helical receptors) elijsku membranu se još<br />
nazivaju i serpentinski receptori izbog toga što njihov transmembranski domen ima oblik zmije i<br />
sedam puta prolazi napred, na<strong>za</strong>d od spoljašnje do unutrašnje strane membrane i obratno. Naziv<br />
GPCR potie od toga što njihov signalni put ukljuuje vezivanje GTP-vezujuih proteina tzv. G-<br />
proteina. Genom sisara kodira veliki broj ovakvih receptora koji su ukljueni u prenošenju signala<br />
iz elijskog okruženja. U imunom sistemu pripadnici ove klase receptora posreduju brze i prolazne<br />
(tranzijentne) odgovore na citokine iz familije hemokina.<br />
Citokinski receptori takodje mogu biti grupisani prema putevima signalne transdukcije koje<br />
aktiviraju (Tabela 5.2.). Ovakvo grupisanje esto korelira sa strukturnom homologijim u<br />
citoplazmatskom domenu signalnog lanca receptora. Drugim reima, lanovi familije definisani<br />
prema ekstracelularnom domenu, aktiviraju sline puteve transdukcije signala u eliji.<br />
PUTEVI SIGNALNE<br />
TRANSDUKCIJE<br />
Tabela 5.2. Mehanizmi signalne transdukcije citokinskih receptora<br />
CITOKINSKI RECEPTOR KOJI<br />
KORISTI DATI SIGNALNI PUT SIGNALNI MEHANIZAM<br />
JAK/STAT put Tip I i tip II citokinskih receptora JAK-posredovana fosforilacija i aktivacija STAT transkripcionih faktora<br />
Signaling TNF receptora<br />
preko TRAF<br />
Signaling TNF receptora<br />
preko tzv. »death« domena<br />
Tirozin kinaze pove<strong>za</strong>ne sa<br />
receptorima<br />
TNF familija receptora:<br />
TNR-RII, CD40<br />
TNF familija receptora:<br />
TNR-RI, Fas<br />
M-CSF receptor<br />
Receptor faktora stem elija (SCF)<br />
Vezivanje adapterskih proteina, aktivacija transkripcionih faktora<br />
Vezivanje adapterskih proteina, aktvacija kaspaze<br />
Unutrašnja aktivnost tirozin kinaze u receptoru<br />
G protein signaling Hemokinski receptori<br />
GTP <strong>za</strong>mena i disocijacija G:GTP od G, G:GTP aktivira razliite<br />
elijske enzime, ali i neke druge proteine<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
120
5.1.2. Citokini koji posreduju i regulišu urodjeni imunitet<br />
Veoma važna komponeneta ranog/poetnog urodjenog imunog odgovora na viruse i bakterije je<br />
sekrecija citokina koji posreduju u mnogobrojnim funkcijama urodjenog imuniteta (prirodne<br />
otpornosti organizma). Aktivirani makrofagi produkuju citokine koji posreduju u urodjenim<br />
mehanizmima otpornosti: TNF i IL-1 (medijatori akutne inflamatorne reakcije); hemokini<br />
(privlae leukocite do inflamatorne zone); IL-12 stimuliše produkciju IFN- koji aktivira makrofage<br />
te time ima udela u mehanizmima kako urodjenog, tako i adaptivnog imunog odgovora.; tip I IFN<br />
ima antiviralno dejsvo; IL-10 inhibitor makrofaga. Ove efektorne funkcije citokina u prirodnom<br />
imunom odgovoru ispoljavaju se prema razliitim klasama mirkroorgani<strong>za</strong>ma.<br />
Tabela 5.3. Citokini urodjenog imuniteta<br />
CITOKIN VELIINA GLAVNI ELIJSKI IZVOR GLAVNE CILJNE ELIJE i BIOLOŠKI EFEKTI<br />
TNF 17 kDa; 51-kDa<br />
homotrimer<br />
IL-1<br />
17 kDa zrela forma<br />
33-kDa prekursor<br />
Makrofage, T elije<br />
Makrofage, endotelijalne elije,<br />
neke epitelijalne elije<br />
Hemokini 8-12 kDa Makrofage, endotelijalne elije, T<br />
elije, fibroblasti, trombociti<br />
IL-12 Heterodimer od:<br />
35-kDa+40-kDa<br />
Tip I IFNs:<br />
IFN- IFN-<br />
IFN-: 15-21 kDa<br />
IFN-: 20-25 kDa<br />
IL-10 Homodimer od<br />
30-40 kDa<br />
Endotelijalne elije: aktivacija (inflamacija; koagulacija)<br />
Neutrofili: aktivacija<br />
Hipotalamus: groznica<br />
Jetra: sinte<strong>za</strong> proteina akutne-faze<br />
Mišii i masno tkivo: kataboli<strong>za</strong>m<br />
Mnogi elijski tipovi: apopto<strong>za</strong><br />
Endotelijalne elije: aktivacija (inflamacija; koagulacija)<br />
Hipotalamus: groznica<br />
Jetra: sinte<strong>za</strong> proteina kutne-faze<br />
Leukociti: hemotaksija; aktivacija; migracija u tkiva<br />
Makrofage, dendritske elije T elije: diferencijacija TH1 elija<br />
NK elije i T elije: sinte<strong>za</strong> IFN-; poveanje citolitike aktivnosti<br />
IFN-: makrofage<br />
IFN-: fibroblasti<br />
Makrofage, T elije<br />
(uglavnom TH2)<br />
IL-6 19-26 kDa Makrofage, endotelijalne elije,<br />
T elije<br />
Sve elije: doprinose antiviralnom stanju; poveanje ekspresije MHC I<br />
Makrofage, dendritske elije: inhibicija produkcije IL-12<br />
i ekpresija kostimulatora i MHC II<br />
Jetra: sinte<strong>za</strong> proteina kutne-faze<br />
B elije: proliferacija efektornih elija koje produkuju antitela<br />
IL-15 13 kDa Makrofage, druge elije NK elije: proliferacija; T elije: proliferacija memorijskih CD8 + elia<br />
IL-18 17 kDa Makrofage NK elije i T elije: sinte<strong>za</strong> IFN-;<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
121
5.1.2.1. Faktor nekroze tumora (engl. Tumor Necrosis Factor – TNF)<br />
TNF je glavni medijator akutnog inflamatornog odgovora na gram-negativne bakterije i<br />
druge infektivne mikroorganizme i odgovoran je <strong>za</strong> mnoge sistemske komplikacije u ozbiljnim<br />
infekcijama (TNF se još naziva TNF- iz istorijskih razloga, da bi se razlikovao od blisko pove<strong>za</strong>nog<br />
TNF- ili limfotoksina). TNF je prvobitno identifikovan i nazvan kao supstanca prisutna u<br />
serumu životinja tretiranih bakterijskim endotoksinom, lipopolisaharidom (LPS), koji prouzrokuje<br />
nekrozu tumora u in vivo uslovima, a što je <strong>za</strong>pravo posledica patoloških komplikacija usled<br />
velikih koncentracija TNF. Najvei elijski izvor TNF su aktivirani mononuklearni fagociti, iako<br />
i antigenom-stimulisani T limfociti, NK elije i mastociti takodje mogu da sekretuju ovaj proteini.<br />
Najsnažniji stimulus koji poveava produkciju TNF od strane makrofaga je LPS, a najvea<br />
koliina TNF može biti produkovana u infekciji gram-negativnim bakterijama koje sekretuju LPS.<br />
IFN- sekretovan iz T elija i NK elija, stimuliše sintezu TNF od strane LPS-stimulisanih<br />
makrofaga.<br />
Postoje dva razliita TNF<br />
receptora koja se razlikuju po veliini<br />
molekula: 55 kDa je tip I TNF receptor<br />
(TNF-RI) ili p55 receptor, dok je 75<br />
kDa tzv. tip II TNF receptor (TNF-RII)<br />
ili p75 receptor. Afinitet ovih<br />
receptora <strong>za</strong> TNF je neobino mali, ali<br />
su prisutni na membrani skoro svih<br />
ispitivanih elija. TNF receptori su<br />
lanovi velike familije proteina, od<br />
kojih su mnogi ukljueni u imunom i<br />
infalmantornom odgovoru. Aktivacija<br />
TNF receptora može da stimuliše<br />
ekspresiju gena (Slika 5.4A) i/ili da<br />
indukuje apoptozu (Slika 5.4B).<br />
Slika 5.4. Signalna transdukcija preko TNF receptora.<br />
TNF-R1 može stimulisati ekspresiju gena (A) ili indukovari<br />
apoptozu (B). Oba razliita efekta idu preko proteina adaptera<br />
(TRADD, TRAF, RIP) koji vode do ekspresije gena ili preko<br />
adaptera FADD koji vodi eliju do apoptoze. Aktivacijom TNF<br />
receptora dolazi do indukcije gena koji kodiraju medijatore<br />
inflamacije, kao i gena koji kodiraju antiapoptotine proteine.<br />
122
Biološki efekti TNF. Glavna fiziološka funkcija TNF je da stimuliše „regrutovanje“ i<br />
„dopremanje“ neutrofila i monocita do mesta infekcije i da aktivira ove elije da iskorene<br />
mikroorganizme (Slika 5.5.). TNF posreduje ove efekte preko stimulacije aktivnosti vaskularnih<br />
endotelijalnih elija i leukocita. TNF prouzrokuje da vaskularne endotelijalne elije ekspresuju<br />
adhezione molekule i time ine površinu endotela adhezivnom <strong>za</strong> leukocite, inicijalno samo <strong>za</strong><br />
neutrofile, a kasnije i <strong>za</strong> monocite i limfocite. Najvažniji adhezioni molekuli <strong>za</strong> pomenute elije su<br />
selektini i ligandi <strong>za</strong> integrine. TNF stimuliše endotelijalne elije i makrofage da sekretuju<br />
hemokine koji poveavaju afinitet leukocitnih integrina <strong>za</strong> njihove ligande, a i indukuje<br />
hemotaksiju leukocita i njihovo „regrutovanje“ do mesta infekcije. TNF stimuliše mikorobicidnu<br />
aktivnost neutrofila i makrofaga, a u in vitro uslovima indukuje apoptozu. U ozbiljnim<br />
infekcijama TNF se produkuje u ogromnim koliinama i prouzrokuje sistemske klinike i<br />
5.1.2.2. Interleukin-1 (IL-1)<br />
patološke abnormalnosti (preko hipota-<br />
lamusa indukuje groznicu te se naziva<br />
endogeni pirogen; u jetri poveava sintezu<br />
serumskih proteina kao što su serum<br />
amiloid A protein i fibrinogen, a koji su<br />
ukljueni u akutnoj-fazi odgovora na<br />
inflamatorne stimuluse; prouzrokuje<br />
intravaskularnu trombozu; velike<br />
koncentracije cirkulišueg TNF inhibišu<br />
kontrakcije miokarda i tonus vaskularnih<br />
glatkih mišia, kao i pad koncentracije<br />
glukoze u krvi do niova nepodobnog <strong>za</strong><br />
život; itd).<br />
Slika 5.5. Biološki efekti TNF.<br />
Pri niskoj koncentraciji TNF deluje na leukocite i endotelijum tako što<br />
indukuje akutnu inflamaciju. Kako koncentracija raste TNF posreduje<br />
u sistemskim efektima inflamacije. Pri visokim koncentracijama TNF<br />
i<strong>za</strong>ziva patološke abnormalnosti i septiki šok.<br />
Glavna funkcija IL-1 je, slino kao i TNF, posredovanje u inflamatornom odgovoru<br />
organizma na infekciju i druge inflamatorne stimuluse. Ovaj citokin, <strong>za</strong>jedno sa TNF funkcioniše<br />
u urodjenom imunitetu i inflamaciji.<br />
123
Glavni intraelijski izvor IL-1 su, kao i <strong>za</strong> TNF aktivirani mononuklearni fagociti. Za<br />
razliku od TNF i neke druge elije (makrofagi, neutrofili, epitelijalne elije-keratinociti i<br />
endotelijalne elije) mogu da produkuju IL-1. Produkcija IL-1 je stimulisana od strane LPS i<br />
TNF. Postoje dve forme IL-1: IL-1 i IL-1 sa manje od 35% medjusobne homologije, ali se vezuju<br />
<strong>za</strong> iste receptore na površini membrane elija. Oba se sintetišu od prekursora (33-kDa), a<br />
sekretuju kao zrele forme proteina (17 kDa).<br />
Okarakterisane su dve vrste membranskih receptora <strong>za</strong> IL-1 i obe su lanovi Ig<br />
superfamilije. Tip I receptor je ekspresovan u skoro svim elijskim tipovima i on je glavni<br />
receptor preko koga IL-1 posreduje odgovore. Tip II receptor je ekspresovan na membrani B<br />
elija, ali njegova ekspresija može biti indukovana i u drugim elijama. Vezvanje IL-1 <strong>za</strong> tip I<br />
receptor vodi ka aktivaciji kinaze koja se zove „sa IL-1 receptorom-asocirana kina<strong>za</strong>“ (engl. IL-1<br />
Receptor Associated Kinase - IRAK) i konano aktivaciji NF-kapaB i AP-1 transkripcionih faktora<br />
(Slika 5.4.).<br />
Biološki efekti IL-1 su vrlo slini kao i TNF i <strong>za</strong>vise od koliine produkovanog citokina.<br />
Sekretovan u malim koncentracijama IL-1 funkcioniše kao medijator lokalne inflamacije i<br />
aktivira endotelijalne elije da poveaju ekpresiju površinskih molekula (ligandi <strong>za</strong> integrine) koji<br />
posreduju u adheziji leukocita. Sekretovan u veim koliinama IL-1 ulazi u cirkulaciju i<br />
prouzrokuje endokrine efekte. Sistemski IL-1 slino kao TNF prouzrokuje groznicu, indukuje<br />
sintezu proteina akutne-faze, itd. Slinost izmedjue efekata IL-1 i TNF je iznenadjujua s obzirom<br />
da su ovi citokini i njihovi receptori strukturalno veoma razliiti. Prihvatljivo objašnjenje <strong>za</strong> sline<br />
biološke efekte je da oba citokina vezujui se <strong>za</strong> svoje receptore aktiviraju sline puteve signalne<br />
transdukcije i iste transkripcione faktore (Slika 5.4.).<br />
5.1.2.3. Hemokini<br />
Hemokini su velika familija strukturalno homologih citokina koji stimulišu kretanje<br />
leukocita i regulišu migraciju leukocita iz krvi u tkiva. Ime hemokini je <strong>za</strong>pravo skraenica od<br />
„hemotaksini citokini“. Neki hemokini mogu biti produkovani od strane razliitih elija kao<br />
odgovor na inflamatorne stimuluse i imati ulogu u regrutovanju leukocita do mesta infekcije.<br />
Drugi hemokini se produkuju u normalnim, fiziološkim uslovima u razliitim tkivima i regrutuju<br />
leukocite (uglavnom limfocite) do datih tkiva i u odsustvu inflamacije.<br />
Svi hemokini su polipeptidi (8- do 12-kDa) koji sadrže dve internalne disulfidne petlje.<br />
Identifikovano je oko 50 razliitih hemokina, a verovatno ih ima još mnogo više. Na osnovu broja i<br />
lokacije N-terminalnih cisteinskih rezidua (ostataka) izvršena je klasifikacija hemokina u familije.<br />
Dve najvee subfamilije su: CC (cisteinske rezidue su pove<strong>za</strong>ne) i CXC (cisteinske rezidue su<br />
124
odvojene jednom amino kiselinom). U inflamaciji, hemokini CXC familije deluju uglavnom na<br />
neutrofile, dok CC hemokini deluju na monocite, limfocite i eozinofile. Mali broj hemokina ima<br />
jedan cistein (C familija) ili dva cisteina razdvojena sa tri amino kiseline (CX3C).<br />
Hemokini ukljueni u inflamatornu reakciju se produkuju od strane leukocita, a kao<br />
odgovor na spoljašnje stimuluse. Hemokini koji regulišu elijsko kretanje/“elijski saobraaj“<br />
(engl. cell traffick) kroz tkiva se produkuju konstitutivno u elijama datih tkiva. Hemokine CC i<br />
CXC subfamilija produkuju leukociti, kao i nekoliko tipova tkivnih elija (endotelijalne elije,<br />
epitelijalne elije i fibroblasti). U mnogim od ovih elija sekrecija hemokina je indukovana<br />
mikroorganizmima i inflamatornim citokinima (uglavnom TNF i IL-1). Nekoliko CC hemokina je<br />
produkovano od strane antigenima-stimulisanih T elija, te na taj nain ovi citokini predstavljaju<br />
vezu izmedju adaptivnog imuniteta i regrutovanja inflamatornih leukocita. Neki hemokini se<br />
produkuju konstitutivno (bez ikakvog inflamatornog stimusa) u limfoidnim organima i oni su<br />
ukljueni u regulaciju fiziološkog kretanja/“saobraaja“ limfocita kroz organe.<br />
Identifikovano je skoro deset odvojenih i razliitih receptora <strong>za</strong> CC hemokine (CCR1 do<br />
CCR10) i šest <strong>za</strong> CXC hemokine (CXCR1 do CXCR6), a smatra se da lista receptora nije<br />
kompletna. Hemokinski receptori su ekspresovani na leukocitima, a posebno je velika<br />
raznovrsnost ovih receptora na T elijama. Receptori ispoljavaju preklapanje u specifinosti prema<br />
citokinima, a obra<strong>za</strong>c elijske ekspresije receptora determiniše koji tip elija e odgovoriti na koji<br />
hemokin, a time i kakav e biti biološki efekat. Svi hemokinski receptori imaju karakteristinu<br />
strukturu sa sedam-transmembranskih -heliks domena (GPCR).<br />
Biološki efekat hemokina. Hemokini su otkriveni na osnovu njihove sposobnosti da budu<br />
hemoatraktanti leukocita, ali se danas zna da oni obavljaju veliki broj važnih funkcija u imunom<br />
sistemu, kao i u drugim sistemima u organizmu. Hemokini regrutuju odbrambene elije<br />
organizma domaina do mesta infekcije; regulišu kretanje limfocita i drugih leukocita kroz<br />
periferna limfatina tkiva; ukljueni su u razvoj razliitih ne limfatinih organa ( „knock-out“<br />
miševi <strong>za</strong> CXCR4 receptor ispoljavaju fatalan poremeaj u razvoju srca i cerebeluma) itd.<br />
5.1.2.4. Interleukin-12 (IL-12)<br />
IL-12 je glavni medijator ranog urodjenog imunog odgovora na intracelularne<br />
mikroorganizme, ali i kljuni podstreka/inducer elijama-posredovanog imuniteta tj. adaptivnog<br />
imunog odgovora na date mikroorganizme.<br />
IL-12 postoji kao heterodimer od 35-kDa (p35) i 40-kDa (p40) subjedinica pove<strong>za</strong>nih<br />
disulfidnim mostom. Glavni izvor IL-12 su aktivirani mononuklearni fagociti i dendritske elije.<br />
Mnoge elije sintetišu p35 subjedinicu, ali jedino pomenute APC produkuju komponentu p40, te<br />
125
time i biološki aktivnu heterodimernu molekulu IL-12. Produkcija ovog citokina je indukovana<br />
tokom urodjenog imunog odgovora, a kao odgovor na stimulaciju mikroorganizmima, ukljuujui i<br />
LPS, infekciju intracelularnim bakterijama, kao i virusnu infekciju. Takodje, antigenima-<br />
stimulisane T elije pomonice indukuju produkciju IL-12 iz makrofaga i dendritskih elija,<br />
uglavnom preko CD40 liganda koji interaguje sa CD40 na makrofagima i dendritskim elijama.<br />
Receptor <strong>za</strong> IL-12 je je hetero-dimer sastavljen od 1 i 2 subjedinice. Oba lanca su<br />
neophodna <strong>za</strong> veliki afinitet prema citokinu, a 2 je ukljuen u signaling. Ovaj receptor prenosi<br />
signal preko JAK/STAT puta. U ovom signalnom putu vezivanje citokina <strong>za</strong> receptor aktivira<br />
tirozin kinaze koja su<br />
asocirane sa receptorom i<br />
zovu se Janus kinaze (engl.<br />
JAnus Kinases – JAKs), što<br />
konano vodi ka aktivaciji<br />
transkripcionih faktora koji<br />
se zovu signal transduceri i<br />
aktivatori transkripcije<br />
(Signal Transducers and<br />
Activators of Transcription –<br />
STATs). Mnogi citokini<br />
koriste ovaj put da indukuju<br />
odgovore u ciljnim elijama,<br />
a razliiti citokini aktiviraju<br />
razliite kombinacije JAKs i<br />
STATs (Slika 5.6.).<br />
Slika 5.6. Transdukcija signala od IL-12<br />
aktiviranog receptora preko JAK/STAT<br />
signalnog puta.<br />
Vezivanje citokina <strong>za</strong> receptor vodi aktivaciji JAK<br />
i fosforilaciji receptora koji vezuje STAT. JAK<br />
fosforiliše STAT, dolazi do dimeri<strong>za</strong>cije i<br />
migracije STAT u nukleus koji aktivira<br />
transkripciju gena.<br />
Biološki efekti IL-12. Ovaj citokin je neophodan <strong>za</strong> indukovanje ni<strong>za</strong> odgovora koji ukljuuju<br />
makrofage, NK elije i T limfocite, a koji kao rezultat imaju iskorenjivanje intraelijskih<br />
mikroorgani<strong>za</strong>ma ili antigena (Slika 5.7.). IL-12 stimuliše NK elije i T limfocite da produkuju<br />
126
IFN-. Makrofagi produkuju IL-12 kao odgovor na mnoge mikroorganizme. Sekretovani IL-12<br />
stimuliše NL elije i T elije da produkuju IFN- koji onda aktivira makrofage da ubiju fagocitirani<br />
5.1.2.5. Tip I interferoni (IFNs)<br />
mikroorgani<strong>za</strong>m (Slika 5.7.). Prema<br />
tome, urodjeni imunitet je posredovan<br />
citokinima po navedenom sledu<br />
reakcija: mikroorgani<strong>za</strong>modgovor<br />
makrofagaIL-12IFN-aktivacija<br />
makrofaga uništavanje mikroorga-<br />
ni<strong>za</strong>ma. IL-12 stimuliše diferenci-<br />
jaciju CD4 + pomonih T limfocita u<br />
IFN- produkujue TH1 elije. Takodje,<br />
pojaava citolitiku funkciju aktivi-<br />
ranih NK elija i CD8 + citolitikih T<br />
limfocita (CTLs). IL-12 je veoma važna<br />
spona izmedju urodjenog i adaptivnog<br />
imuniteta jer se produkuje tokom rane<br />
reakcije urodjenog imuniteta na<br />
intracelularne mikroorgani<strong>za</strong>ma, a<br />
stimuliše adaptivni imuni odgovor koji<br />
štiti organi<strong>za</strong>m domaina od tih datih<br />
mikroorgani<strong>za</strong>ma.<br />
Slika 5.7. Biološki efekti i uloga IL-12.<br />
IL-12 produkuju makrofagi i dendritske elije koje<br />
odgovaraju na mikrobe i na signale T elija. IL-12 deluje<br />
na T limfocite i elije prirodne ubice i stimuliše ih na<br />
citotoksinu aktivnost kao i da produkuju INF-.<br />
Tip I interferoni posreduju u ranom odgovoru urodjenog imunog sistema na viralne<br />
infekcije. Interferone tipa jedan ine dve razliite grupe proteina: IFN- i IFN-. IFN- predstavlja<br />
<strong>za</strong>pravo familiju od 20 strukturalno slinih polipeptida od kojih je svaki kodiran odvojenim<br />
genom. Osnovni izvor IFN- su mononuklearni fagociti, a IFN- se ponekada naziva leukocitni<br />
interferon. IFN- je jedan protein koga produkuju razne elije, ukljuujui i fibroblaste, pa se<br />
nekada naziva fibroblastni interferon. Najvei stimulus <strong>za</strong> sintezu interferona tipa I je viralna<br />
127
infekcija, a posebno dvostruki lanac RNK koga produkuju virusi tokom njihove replikacije u<br />
inficiranoj eliji. Ovaj fenomen se esto koristi u eksperimentalne svrhe sa sintetikim dvostrukim<br />
lancem RNK koji mimikrira signal produkovan tokom viralne infekcije. Takodje, antigenima-<br />
aktivirane T elije stimulišu mononuklearne fagocite da sintetišu interferone tipa I.<br />
Iako su IFN- i IFN- strukturalno razliiti oni se vezuju <strong>za</strong> isti receptor na površini<br />
membrane elija i indukuju sline biološke odgovore. Receptor <strong>za</strong> interferon tip I je heterodimer<br />
sastavljen od dva polipeptida slinih struktura (oba lanca pripadaju citokinskim receptorima<br />
tip II), pri emu jedan vezuje citokin, a drugi prenosi signal preko JAK/STAT signalnog puta.<br />
Biološki efekti interferona tip I su usmereni u pogledu <strong>za</strong>štite organizma od viralnih<br />
infekcija i stimulaciji elijama-posredovanog imuniteta protiv mikroorgani<strong>za</strong>ma (Slika 5.8.).<br />
Ovi interferoni inhibišu viralnu replikaciju tako što produkuju paletu enzima (npr. 2',5'<br />
oligoadenilat sinteta<strong>za</strong>) koji remete transkripciju viralne RNK ili DNK i viralnu replikaciju.<br />
Antiviralni efekat interferona tip I je primarno parakrini efekat u kojem virusima-inficirana elija<br />
sekretuje interferone tipa I u cilju <strong>za</strong>štite susednih elija koje još uvek nisu inficirane. Za eliju<br />
koja je odgovorila na interferone tipa I i rezistentna je na viralnu infekciju se kaže da je u<br />
„antiviralnom stanju“. Interferoni tipa I<br />
sekretovani od strane inficirane elije<br />
mogu takodje, u autokrinom maniru,<br />
inhibisati viralnu replikaciju u samoj<br />
eliji koja ih je produkovala. Interferoni<br />
tipa I poveavaju ekspresiju klase I<br />
MHC molekula; stimulišu razvoj TH1<br />
elija; u in vitro uslovima inhibišu<br />
proliferaciju nekih elija, ukljuujui i<br />
limfocite; itd. Prema tome, glavna<br />
aktivnost funkcije interferona tipa I je<br />
usmerena ka radikalnom iskorenjivanju<br />
viralne infekcije. Knock-out miševi kojima<br />
nedostaje receptor <strong>za</strong> interferone tipa I su<br />
veoma podložni viralnim infekcijama.<br />
Slika 5.8. Biološki efekti interferona tipa I.<br />
Produkuju ih makrofagi i elije <strong>za</strong>ražene virusom. Inhibiraju<br />
virusnu infekciju i poveavaju aktivnost citotiksinih T limfocita<br />
(CTL) protiv virusom <strong>za</strong>raženih elija.<br />
IFN- se primenjuje u klinici kao anti-<br />
128
viralni agens u specifinim formama hepaitisa, dok se IFN- koristi u terapiji multiple skleroze, ali<br />
mehani<strong>za</strong>m kojim on postiže ovaj veoma koristan efekat nije poznat.<br />
5.1.2.6. Interleukin-10 (IL-10)<br />
Ovaj citokin je inhibitor aktivacije makrofaga i dendritskih elije, te je zbog toga<br />
ukljuen u kontrolu reakcija i mehani<strong>za</strong>ma urodjenog imuniteta, ali i elijama-posredovanog<br />
adaptivnog imunog odgovora. IL-10 ima 4--helinu globularnu domensku strukturu i vezuje se<br />
<strong>za</strong> tip II citokinski receptor. Produkuje se uglavnom od strane aktiviranih makrofaga, a <strong>za</strong>to što<br />
imhibiše funkciju makrofaga koji su ga sintetisali lep je primer negativne povratne sprege u<br />
imunom sistemu. Nije jasno poka<strong>za</strong>no da li razliiti stimulusi mogu da deluju na makrofage i<br />
indukuju produkciju regulatornih citokina kao što je IL-10 i efektornih citokina kao što su TNF i<br />
IL-12, ili isti stimulusi uslovljavaju produkciju svih ovih citokina, ali razliitom kinetikom. T<br />
limfociti takodje produkuju IL-10, a on je takodje sekretovan i od strane nekih nelimfatinih<br />
tipova elija (npr. keratinocita).<br />
Biološki efekti IL-10 su rezultat njegove sposobnosti da inhibiše mnoge funkcije<br />
aktiviranih makrofaga. Kao što je ranije napomenuto, makrofagi odgovaraju na mikroorganizme<br />
sekrecijom citokina i ekspresijom kostimulatora koji pojaavaju aktivaciju T elija i elijama-<br />
posredovani imuni odgovor. IL-10 deluje na aktivirane makrofage u smislu terminacije odgovora<br />
i iniciranja povratka u stanje mirovanja nakon što je infekcija iskorenjena. IL-10 inhibiše<br />
produkciju IL-12 preko aktivacije makrofaga i dendritskih elija. S obzirom da je IL-12 najvažniji<br />
stimulator sekrecije INF- i pojaiva i urodjenog i elijama-posredovanog imunog odgovora<br />
uperenog protiv intracelularnih antigena, IL-10 funkcioniše tako što inhibiše sve ove reakcije,<br />
delujui kao inhibitor IL-12 (tako je i otkriven). IL-10 inhibiše ekspresiju kostimulatora i klase<br />
II MHC molekula na makrofagama i dendritskim elijama i zbog ove funkcije se koristi u<br />
inhibiciji aktivacije T elija i elijama-posredovanih imunih reakcija. Interesantno je da Epstein-<br />
Barr virus sadrži gen homolog humanom IL-10 i da viralni IL-10 ispoljava iste aktivnosti kao<br />
prirodni citokin. Ovo saznanje je otvorilo intrigantnu mogunost da je tokom evolucije virusa<br />
sticanje IL-10 gena dalo virusu mogunost da inhibiše imunitet domaina, a time i savlada<br />
prepreke i preživi u elijama inficiranog organizma.<br />
5.1.2.7. Drugi citokini urodjenog imuniteta<br />
Pored prethodno navedenih, itava plejada drugih citokina, ija funkcija još uvek nije<br />
precizno definisana uetvuje u mehanizmima koje urodjeni imuni sistem koristi da bi se odbranio<br />
od štenih agenasa, a neki od njih uestvuju i u adaptivnom imunom odgovoru.<br />
129
IL-6 stimuliše sintezu proteina akutne-faze u urodjenom imunitetu te doprinosi<br />
sitemskom efektu inflamacije tzv. odgvoru akutne-faze (engl. acute-phase response); <strong>za</strong>jedno sa<br />
kolonija-stimulirajuim faktorima (engl. Colony Stimulating Factors - CSFs) stimuliše produkciju<br />
neutrofila od progenitornih elija kosne srži; u adaptivnom imunitetu stimuliše rast B<br />
limfocita; itd. IL-15 stimuliše proliferaciju NK elija; deluje kao faktor rasta i preživljavanja T<br />
elija, a posebno dugo-živeih memorijskih CD8 + elija. IL-18 je strukturalno homolog IL-1 i<br />
prenosi signal preko slinih receptor-asociranih kina<strong>za</strong> (IRAK), ali ima razliite funkcije. IL-18<br />
stimuliše NK elije i T elije da produkuju IFN- i deluje sinergistiki sa IL-12 u pogledu ovog<br />
efekta. Zbog toga je on inducer elijama-posredovanog imuniteta, posebno u kombinaciji sa IL-12.<br />
Neki od citokina (IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 i IL-26) su identifikovani po sekvenci koja je<br />
homologa familiji IL-10 slinih citokina. Smatra se da oni regulišu inflamatornu reakciju u<br />
tkivma, ali specifine fiziološke funkcije nisu precizno definisane. IL-23 i IL-27 su po strukturi<br />
slini IL-12 i kao IL-12 stimulišu produkciju IFN- od strane NK elija i T elija. Neka istraživanja<br />
pokazuju da je IL-12 veoma važan <strong>za</strong> fiziološku funkciju odbrane uperene protiv intracelularnih<br />
mikroorgani<strong>za</strong>ma, dok je IL-23 više važan u TH1-posredovanoj inflamatornoj reakciji.<br />
5.1.2.8. Uloga citokina u urodjenom imunitetu i inflamaciji<br />
S obzirom da su u ranijem tekstu pojedinano opisani citokini urodjenog imuniteta, korisno je<br />
integrisati ove informacije i razmotriti kako i u kolikoj meri pomenuti citokini doprinose<br />
reakcijama urodjenog imunog odgovora uperenog protiv antigena. Razliiti citokini igraju kljune<br />
uloge u urodjenom imunitetu prema razliitima klasama mikroorgani<strong>za</strong>ma. Citokini koji posre-<br />
duju u urodjenom imunom odgovoru su<br />
sekretovani uglavnom od strane aktiviranih<br />
makrofaga. TNF i IL-1 su medijatori akutne<br />
inflamacione reakcije na mikrobe; hemo-<br />
kini regrutuju leukocite na mesto inflama-<br />
cije; IL-12 stimuliše produkciju IFN-; tip I<br />
interferoni su antiviralni citokini i IL-10 je<br />
inhibitor makrofaga.<br />
Slika 5.9. Uloga citokina u urodjenom imunitetu.<br />
LPS deluje na makrofage tako što indukuje sekreciju brojnih citokina,<br />
(TNF, IL-1, IL-2, TNF i IL-1) koji stimulišu akutnu inflamaciju delujui na<br />
endotelijalne elije i leukocite. IL-12 stimuliše produkciju IFN-. U serumu<br />
se mogu odreivati TNF, IL-1, IL-12 i IFN- . Antagonisti TNF, IL-12 i IFN-<br />
smanjuju patološke komplikacije sepse, a opada i smrtnost ve<strong>za</strong>na <strong>za</strong><br />
septini šok.<br />
130
Citokin koji se u najveoj koliini produkuje iz aktiviranih makrofaga, a kao reakcija na<br />
razliite mikroorganizme, odgovoran je <strong>za</strong> prirodu odgovora urodjenog imuniteta prema<br />
mikroorganizmu koji je prouzrokovao aktivaciju makrofaga.<br />
5.1.3. Citokini koji posreduju i regulišu adaptivni imunitet<br />
Citokini posreduju u proliferaciji i diferencijaciji limfocita nakon prepoznavanja antigena u<br />
aktivacionoj fazi adaptivnog imunog odgovora i posreduju u aktivaciji specijalizovanih<br />
efektornih elija u efektornoj fazi adaptivnog imunog odgovora. Produkcija citokina je glavni<br />
odgovor T limfocita na prepoznavanje antigena. Izlaganje razliitim tipovima antigena može<br />
indukovati diferencijaciju CD4 + pomonih T elija u razliite efektorne populacije kao što su TH1 i<br />
TH2, koje produkuju razliite setove citokina i obezbedjuju razliite funkcije (Tabela 5.4.)<br />
Tabela 5.4. Citokini adaptivnog imuniteta<br />
CITOKIN VELIINA GLAVNI EL. IZVOR GLAVNE CILJNE ELIJE i BIOLOŠKI EFEKTI<br />
IL-2 14-17 kDa T elije<br />
IL-4 18 kDa<br />
IL-5 45-50 kDa od<br />
20-kDa subjed.<br />
IFN-<br />
TGF-<br />
LT<br />
50 kDa glikozilisani<br />
homodimer od<br />
21- 24- kDa subj.<br />
25 kDa<br />
homodimer od<br />
12.5- kDa subjed.<br />
21-24 kDa heterotrimer<br />
Ili ve<strong>za</strong>n sa LT2<br />
CD4 + T elije (TH2)<br />
Mastocite<br />
T elije: proliferacija; poveana sinte<strong>za</strong> citokina; potencirana Fas-ind. apopto<strong>za</strong><br />
NK elije: proliferacija; aktivacija<br />
B elije: proliferacija; sinte<strong>za</strong> antitela (in vitro)<br />
B elije: »isotype swiching« u IgE; T elije: difrencijacija TH2; proliferacija<br />
Makrofage: inhibicija IFN--posredovane aktivacije;<br />
Mastocite: proliferacija (in vitro)<br />
CD4 + T elije (TH2) Eozinofili: aktivacija; poveana produkcija B<br />
elije: proliferacija; produkcija IgA<br />
T elije<br />
(TH1, CD8 + T elije)<br />
NK elije<br />
T elije<br />
makrofage<br />
drugi tipovi elija<br />
Makrofage: aktivacija (poveanje mikrobicidne funkcije)<br />
B elije: »isotype swiching« u opsoniz. i komplemenom-fiksiranim IgG subklas.<br />
T elije: TH1 diferencijacija<br />
Neke druge elije: poveavaju ekspresiju MHC I i MHC II; poveavaju<br />
procesovanje i prezentaciju T elijama<br />
T elije: inhibicija proliferacije i efektorne funkcije<br />
B elije: inhibicija proliferacije; produkcija IgA<br />
Makrofage: inhibicija<br />
T elije<br />
(uglavnom TH2 Regrutovanje i aktivacije neutrofila<br />
Limfoidna organogene<strong>za</strong><br />
IL-13 15 kDa CD4 + T elije (TH2) B elije: »isotype swiching« u Ig E; Epitelijalne elije: poveanje produkcije<br />
mukusa; Makrofage: inhibicija<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
131
5.1.3.1. Interleukin-2 (IL-2)<br />
IL-2 je faktor rasta <strong>za</strong> antigenima-stimulisane T limfocite i odgovoran je <strong>za</strong> klonalnu<br />
ekspanziju T elija. Zbog ove osobine se nakon otkrivanja zvao faktor rasta T elija. Ovaj citokin<br />
u najveoj meri produkuju T elije, a deluje uglavnom na elije koje su ga produkovale tj. kao<br />
autokrini faktor rasta.<br />
IL-2 je glikoprotein u formi globularnog proteina koji sadrži 4--heliksa i prototip je<br />
citokina koji u svojoj strukturi imaju 4--heliksa a interaguju sa citokinskim receptorima tip<br />
II. Ekspresija funkcionalnih receptora je pojaana stimulacijom sa antigenom (Slika 5.10.). Stoga<br />
su T elije koje prepoznaju antigen one koje prve proliferišu kao odgovor na produkciju IL-2 tokom<br />
adaptivnog imunog odgovora. Vezivanje IL-2 <strong>za</strong> njegov receptor rezultuje aktiviranjem velikog<br />
broja puteva transdu-<br />
kcije signala, ukljuu-<br />
jui JAK/STAT (ugla-<br />
vnom JAK1 i JAK3<br />
aktiviraju STAT5) koji<br />
je unikatni <strong>za</strong> citokine,<br />
ali i fosfatidil-inozitol-<br />
3 kinazu i Ras-MAP<br />
signalne puteve koji se<br />
aktiviraju velikim bro-<br />
jem receptora.<br />
Slika 5.10. Regulacija ekspresije<br />
IL-2 receptora.<br />
Naivni T limfociti ekpresuju IL-2R<br />
kompleks koji ima umereni afinitet<br />
prema IL-2. Aktivacija T elija<br />
antigenom, kostimulatori, kao i IL-2 sam<br />
po sebi indukuju ekspresiju vee<br />
koliine IL-2R lanca i formiranju IL-<br />
2R kompleksa velikog afiniteta.<br />
Biološki efekti IL-2 se, pored stimulacije rasta i klonalne ekspanzije T elija, ogledaju u<br />
nekoliko veoma važnih uloga u adaptivnom imunom odgovoru (Slika 5.11.). IL-2, produkovan kao<br />
odgovor na prepoznavanje antigena od strane T elija, je odgovoran <strong>za</strong> proliferaciju antigen-<br />
specifinih elija. Izlaganje T elija IL-2 dovodi do veoma brzog porasta u koncentraciji ciklina<br />
koji su asocirani i aktiviraju razliite ciklin-<strong>za</strong>visne kinase, što konano dovodi do fosforilacije<br />
proteina kao što su Rb koji stimuliše tranziciju od G1 do S faze u elijskom ciklusu. Pored toga,<br />
132
IL-2 stimuliše proliferaciju i diferencijaciju drugih elija imunog sistema: stimuliše rast NK<br />
elija, i pojaava njihovu citolitiku funkciju i stimuliše nastajanje tzv. limfokinima-aktiviranih<br />
5.1.3.2. Interleukin-4 (IL-4)<br />
ubilakih elija (engl. Limphokine-<br />
Activated Killer cells – LAK cells ). IL-<br />
2 ima funkciju „terminatora“ imu-<br />
nog odgovora preko stimulacije<br />
razvoja i funkcije regulatornih T<br />
elija i potenciranja apoptoze T<br />
elija preko Fas signalnog puta.<br />
Slika 5.11. Biološki efekti IL-2.<br />
IL-2 stimuliše proliferaciju i diferencijaciju T i B limfocita i NK<br />
elija. IL-2 takoe funkcioniše kao inhibitor imunog odgovora<br />
(protiv sopstvenih antigena) promovišui Fas-posredovanu<br />
apoptozu T elija i stimulišui aktivnost regulatornih T elija<br />
(ovde nije prika<strong>za</strong>no).<br />
IL-4 je glavni stimulus <strong>za</strong> produkciju IgE antitela i <strong>za</strong> razvoj TH2 elija od naivnih<br />
CD4 pomonih T elija. IL-4 je „<strong>za</strong>štitni znak“ i obeležje TH2 elija i funkcioniše i kao citokin koji<br />
indukuje razvoj ovih elija (inducer), ali i kao posrednik u njihovom efektu (efektor). Glavni izvor<br />
IL-4 su CD4 + T limfociti iz podgrupe TH2, kao i aktivirani mastociti i bazofili.<br />
IL-4 je prototip citokina koji u svojoj strukturi imaju 4--heliksa, te i pripada familiji<br />
citokina sa 4--helikalnom strukturom. IL-4 receptor pripada familiji tip I citokinskih<br />
receptora. Struktura IL-4 receptora limfatinih elija sadrži citokin-vezujui lanac i asociran<br />
je sa c lancem <strong>za</strong>jednikim <strong>za</strong> sve citokinske receptore. IL/4 receptor transdukuje signal preko<br />
JAK/STAT puta (JAK3 ili4/STAT6), kao i preko signalnih puteva koji ukljuuju supstrat koji je<br />
odgovoran <strong>za</strong> insulin (engl. Insulin Responsible Supstrate - IRS) IRS-2. IL-4 je jedini citokin koji<br />
aktivira STAT6 protein koji aktivira transkripciju gena odgovornih <strong>za</strong> mnoge efekte IL-4 kao što<br />
su diferencijacija TH2 elija, kao i produkcija IgE. Aktivacija IRS-2 signalnog puta je odgovorna<br />
<strong>za</strong> IL-4 indukovanu proliferaciju elija. U nelimfatinim elijama lanac IL-4 receptora nije<br />
asociran sa c lancem, nego sa signalnim lancom koji je takodje komponeneta receptora <strong>za</strong> IL-13.<br />
Biološki efekti IL-4 ukljuuju stimulaciju IgE i mastocitima/bazofilima posredovane<br />
reakcije, kao i supresija reakcija <strong>za</strong>visnih od makrofaga (Slika 5.12.). IL-4 je glavni citokin koji u B<br />
limfocitima stimuliše „premeštanje“ tj. „class switching“ teškog Ig lanca u IgE izotip (videti tekst u<br />
prethodnim poglavljima). IgE antitela imaju ulogu u eozinofilima-posredovanoj odbrani uperenoj<br />
protiv infekcija helmintima i artropodama. IgE je takodje glavni medijator alergijskih reakcija, a<br />
133
produkcija IL-4 je veoma važna <strong>za</strong> razvoj alergija. IL-4 stimuliše razvoj TH2 elija od naivnih<br />
CD4 + T elija i funkcioniše kao autokrini faktor rasta <strong>za</strong> razliite TH2 elije, te je tako<br />
5.1.3.3. Interleukin-5 (IL-5)<br />
odgovoran <strong>za</strong> indukcijiu i klonsku<br />
ekspanziju ove podgrupe T elija.<br />
IL-4 antagonizira efekat IFN- u<br />
pogledu aktivacije makrofaga, pa<br />
time <strong>za</strong>pravo inhibiše elijama-<br />
posredovane reakcije.<br />
Slika 5.12. Biološki efekti IL-4.<br />
IL-4 stimuliše B elije na tzv. „isotype class switching“ u<br />
neke imunoglobulinske klase (npr. IgE); IL-4 stimuliše<br />
diferencijaciju naivnih T elija u TH2; IL-4 inhibiše IFN-<br />
indukovanu aktivaciju makrofaga; IL-4 je faktor rasta<br />
mastocita, a posebno u kombinaciji sa IL-3.<br />
IL-5 je aktivator eozinofila i služi kao link/ve<strong>za</strong> izmedju aktivacije T elija i eozinofilne<br />
inflamacije. Glavni izvor ovog citokina su elije TH2 podgrupe CD4 + T elija i aktivirani mastociti.<br />
IL-5 je homodimer, a svaka od subjedinica sadrži 4--helikalni domen. IL-5 receptor je tip<br />
I citokinskog receptora. Ovaj receptor asocira sa 150-kDa signal-transdukcionom subjedinicom<br />
koju imaju i IL-3 i GM-CSF, a ponekad se zove uobiajeni/jednaki lanac. IL-5 signaling je<br />
posredovan JAK/STAT signalnim putem.<br />
Glavni biološki efekti IL-5 su da stimuliše razvoj i diferencijaciju eozinofila i da aktivira<br />
zrele/maturirane eozinofile. Aktivirani eozinofili imaju sposobnost uništavanja helminata.<br />
Eozinofili ekspresuju Fc receptore koji su specifini <strong>za</strong> IgE antitela i veoma su sposobni da vežu<br />
IgE-obložene mikrobe i helminte. Prema tome, dva glavna citokina TH2 elija, IL-4 i IL-5<br />
funkcionišu po narednom sledu dogadjaja: IL-4 stimuliše rodukciju IgE koji opsonizuje helminte i<br />
vezuje eoznofile, dok IL-5 aktivira eoznofile da unište parazita. Knock-out miševi kojima nedostaje<br />
gen <strong>za</strong> IL-5 imaju deficit eozinofilnog odgovora i veoma su podložni infekcijama sa helmintima. IL-<br />
5 stimuše proliferaciju B elija i produkciju IgA (tako je prvi put identifikovan).<br />
5.1.3.4. Interferon- (IFN-)<br />
IFN- je glavni citokin koji aktivira makrofage i ima kritinu i veoma važnu ulogu i u<br />
urodjenom i u adaptivnom elijama-posredovanom imunitetu. IFN- se još naziva imuni ili tip II<br />
IFN. Poseduje neku antiviralnu aktivnost, ali nije potentan antiviralni interferon, te funkcioniše<br />
134
uglavnom kao efektorni citokin imunog odgovora. Produkuju ga NK elije, CD4 + TH1 elije i CD8 +<br />
T elije i obeležje je TH1 podgrupe pomonih T elija.<br />
IFN- je homodimerni protein. Njegov receptor (tip II familija citokinskih receptora) se<br />
sastoji od dva strukturno homologa polipeptida od kojih jedan veže citokine, a drugi participira u<br />
signalingu. Vezivanje citokina aktivira STAT1 koji onda stimuliše transkripciju „IFN--responsive“<br />
gena (ukljuujui i gene koji kodiraju MHC molekule i B7 kostimulatore), enzima koji sintetišu<br />
mikrobicidalne supstance (azot oksid) i citokine (p40 subjedinica IL-12). Razliiti „IFN--<br />
responsive“ geni se aktivraju ili direktno STAT1 proteinom ili indirektno STAT1-indukovanom<br />
aktivacijom druga dva transkripciona faktora (engl. INF response factor-1; class II transactivator).<br />
STAT1 knock-out miševi su apsolutno nesenzitivni na delovanje IFN-.<br />
Biološki efekti IFN- su veoma važni u elijama-posredovanom imunitetu uperenom<br />
protiv intracelularnih antigena (Slika 5.13.). IFN- je tzv. makrofaga-aktivirajui citokin što daje<br />
objašnjenje naina kojim T limfociti i NK elije aktiviraju makrofage u cilju uništavanja fagocitiranog<br />
mikroorganizma. IFN- pojaava mikrobicidnu funkcju makrofaga stimulacijom sinteze reaktivnih<br />
kiseoninih intermedijera/radikala i<br />
azot oksida. Ovaj efekat se ostvaruje<br />
aktivacijom transkripcije gena koji<br />
kodiraju enzime neophodne <strong>za</strong><br />
stvaranje reaktivnih kiseoninih<br />
intermedijera (npr. oksida<strong>za</strong> fago-<br />
cita) i reaktivnih azotnih interme-<br />
dijera (npr. inducibilna azot oksid<br />
sinta<strong>za</strong>). Ovi reaktivni molekuli se<br />
produkuju u lizozomima i oni uni-<br />
štavaju mikroorganizme koji se<br />
nalaze u sklopu fagozoma (detaljnije<br />
o ovom efektornom mehanizmu u na-<br />
rednom poglavlju).<br />
Slika 5.13. Biološki efekti IFN-<br />
IFN- aktivira fagocite i APC i indukuje B elije koje<br />
oslobaaju odreene izotipove Ig (koji esto vezuju<br />
komplement i Fc receptore na fagocitima i razlikuju se<br />
od izotipova indukovanih putem IL-4). TH1-indukujui<br />
efekat IL-4 može biti indirektan, posredovan poveanom<br />
produkcijom IL-12 i ekspresijom receptora.<br />
135
IFN- stimuliše ekspresiju klase II MHC molekula i kostimulatora APCs. IFN- potpomaže<br />
diferencijaciju naivnih CD4 + T elija u TH1 i inhibiše proliferaciju TH2 elija. Deo efekta na<br />
indukciju TH1 elija je posredovan indirektno, aktiviranjem mononuklearnih fagocita da<br />
produkuju IL-12 koji je glavni induktorni citokin TH1 elija. IFN- deluje na B elije i stimuliše<br />
„switching“ (prebacivanje) u odredjene IgG subklase (IgG2a kod miševa) i inhibiše „switching“<br />
u IL-4 <strong>za</strong>visne tipove kao što su IgE i IgG1. IFN- aktivira neutrofile i stimuliše citolitiku<br />
aktivnost NK elija. Sumirani efekat aktivnosti IFN- je da stimuliše makrofagima-bogato<br />
obskrbljenu inflamatornu reakciju istovremeno inhibišui IgE-<strong>za</strong>visnu eozinofilima-bogatu<br />
rekciju. Knock-out miševi kojima nedostaje IFN- ili njegov receptor su veoma podložni<br />
infekcijama prouzokovanim intracelularnim mikroorganizmima (npr. mikobakterija) zbog defekcije<br />
u aktivaciji makrofaga.<br />
5.1.3.5. Faktor transformacije rasta (engl. Transforming Growth Factor-TGF-)<br />
Glavni efekat TGF- u humanom imunom sistemu je da inhibiše proliferaciju i<br />
aktivaciju limofocita i drugih leukocita. Ovaj citokin je otkriven kao tumorski produkt koji<br />
promoviše preživljavanje elija u poluvrstim medijumima <strong>za</strong> kultivisanje. Postoji <strong>za</strong>pravo familija<br />
blisko pove<strong>za</strong>nih molekula koji su kodirani razliitim genima a naješe se imenuju kao TGF-,<br />
TGF-i TGF-. elije imunog sistema (antigenima-stimulisane T elije; LPS-aktivirani<br />
mononuklearni fagociti i dr.) sintetišu uglvanom TGF-.<br />
TGF- je homodimer koji se sintetiše kao prekursor i aktivira proteolitikim „cepanjem“.<br />
TGF- receptori su polipeptidi (tip I i tip II) velikog afiniteta <strong>za</strong> ovaj citokin, a singnaling je ve<strong>za</strong>n<br />
<strong>za</strong> serin/treonin kinazni domen, što na kraju rezultira fosforilacijom tzv. SMAD<br />
transkripcionih faktora (SMADa).<br />
Biološki efekti TGF- ukljuuju inhibiciju proliferacije i diferencijacije T elija i<br />
aktivaciju makrofaga; stimulaciju produkcije IgA antitela koja su važna <strong>za</strong> mukozni imunitet<br />
i ublažavanje efekta proinflamatornih citokina na neutrofile i eozinofile. TGF- ispoljava fiziološke<br />
promene i na elije koje ne pripadaju imunom sistemu inhibišui ili stimulišui njihov rast i<br />
proliferaciju. Ponekada ak u in vitro uslovima može da stimuliše ili inhibiše rast iste elijske<br />
linije <strong>za</strong>visno od uslova kulture i prisutnosti drugih biološki aktivnih molekula. TGF-<br />
prouzrokuje sintezu proteina ekstracelularnog matriksa (kolagen), matriks-modifikujuih<br />
enzima (matriksne metaloproteaze), kao i elijskih receptora <strong>za</strong> matriksne proteina (integrin), što<br />
promoviše oporavak tkiva nakon lokalne imune reakcije, te inflamatorna reakcija može biti<br />
kontrolisana.<br />
136
5.1.3.6. Drugi citokini adaptivnog imuniteta<br />
Pored navedenih, otkriven je i definisan znatan broj drugih citokina i njima slinih<br />
molekula koji imaju funkciju u adaptivnom imunitetu.<br />
Limfotoksin (LT) je citokin koga produkuju T limfociti, ali ponekada i druge elije.<br />
Strukturalno je slian (30% homologije) TNF i ima dosta slinih funkcija, te se stoga zove i TNF-.<br />
Skretovana forma LT (nekada se zove LT) je dimer, slino kao TNF, i vezuje se <strong>za</strong> TNF receptore.<br />
LT je takodje ekspresovan i kao membranski protein kod koga je jedan lanac sekretovane forme<br />
pove<strong>za</strong>n sa dve subjedinice strukturalno-slinog membranskog proteina koji se zove LT (vezuje<br />
se <strong>za</strong> razliite receptore koji takodje pripadaju TNF receptrskoj familiji). LT aktivra endotelijalne<br />
elije i neutrofile, te je stoga medijator akutnog inflamatornog odgovora, obezbedjujui vezu<br />
izmedju aktivacije T elija i inflamacije. Ovaj efekat je isti kao i efekat TNF <strong>za</strong>to što se vezuju<br />
<strong>za</strong> iste receptore, ali je koliina cirkulišueg LT koji je produkovan od antigen-stimulisanih T elija<br />
mnogo manji od koliine TNF produkovanog iz LPS-stimulisanih mononuklearnih fagocita. LT je<br />
citokin koji obino lokalno deluje i nije medijator sistemske infekcije. Istraživanja na knock-out<br />
miševima su poka<strong>za</strong>la da je LT neophodan <strong>za</strong> normalan razvoj limfoidnih organa. Miševi kojima<br />
nedostaje membranski LT ili njegov receptor ispoljavaju brojne defekte u formiranju limfnih<br />
vorova, Payer-ovih ploa i bele pulpe slezine. Kod ovih životinja nije normalan razvoj zone B elija<br />
u limfnim organima i nema germinativnog centra u slezini. Smatra se da LT ima funkciju u<br />
limfoidnoj organogenezi preko produkcije hemokina koji promovišu migraciju limfocita u posebne<br />
delove limfnih organa.<br />
Interleukin-13 (IL-13) je strukturno slian IL-4, a produkuju ga TH2 CD4 + T elije i neke<br />
epitelijalne elije. Njegov receptor se uglavnom nalazi na nelimfoidnim elijama, kao što su<br />
makrofagi, a može biti aktiviran vezivanjem ili IL-13 ili IL-4. IL-13 oponaša efekte IL-4 na<br />
makrofage, ali ispoljava slabiji efekat na T ili B limfocite. Glavno delovanje je inhibicija aktivacije<br />
makrofaga antagonistikim efektom na IFN-. IL-13 stimuliše produkciju mukusa od strane<br />
epitelijalnih elija plua, a smatra se promoviše produkciju IgE u alergijskim reakcijama.<br />
Opisan je znaajan broj citokina ija fiziološka fukcija nije precizno definisana i nije<br />
potpuno jasno da li se sekretuju i u fiziološkim uslovima ili su posledica patološko stanja<br />
organizma: IL-16 (hemoatraktant eozinofila), IL-17 (stimuliše produkciju proinflamatornih<br />
citokina, kao što su TNF, IL-1 i hemokin); IL-25 (stimuliše produkciju IL-4, IL-5 i IL-13);<br />
migracije inhibišui faktor-MIF (imobiliše mononuklearne fagocite; ovo je bila prva opisna<br />
citokinska aktivnost, ali se poka<strong>za</strong>la veoma komplikovanom biohemijska karakteri<strong>za</strong>cija citokina<br />
sa ovom funkcijom).<br />
137
5.1.3.7. Uloga citokina T elija u specijalizovanom adaptivnom imunom odgovoru<br />
Citokini adaptivnog imuniteta su kljuni <strong>za</strong> razvoj imunog sistema i aktivaciju efektornih elija<br />
koje služe u eliminaciji mikroorgani<strong>za</strong>ma. Veliki broj specijalnosti adptivnog imunog sistema je<br />
rezultat delovanja citokina. Mnogi intracelularni mikroorganizmi (virusi i bakterije) indukuju<br />
razvoj TH1 elija koje produkuju IFN- koji aktivira fagocite da unište mikroorgani<strong>za</strong>m-okida<br />
odgovora/reakcije i stimuliše produkciju antitela <strong>za</strong> opsoni<strong>za</strong>ciju koja olakšavaju fagocitozu.<br />
Suprotno, helmintski paraziti stimulišu razvoj TH2 koje produkuju IL-4 i IL-5, što dovodi do<br />
pojaane produkcije <strong>za</strong> parazite specifinih IgE antitela (IL-4) koja oblažu parazite, kao i<br />
aktivacije eozinofila (IL-5) koji vezuju IgE-opsonizovane parazite i uništavaju ih. Citokine su<br />
neophodni <strong>za</strong> razvoj i efikasnog adaptivnog imunog odgovora. Sumirano, citokine koji posreduju i<br />
regulišu funkcije adaptivnog imunog odgovora produkuju uglavnom antigen-stimulisani T<br />
limfociti: IL-2 (osnovni faktor rasta T limfocita); IL-4 (stimuliše produkciju IgE i razvoj TH2 elija<br />
pomonica od naivnih TH elija pomonica); IL-5 aktivira eozinofile; IFN- funkcioniše kao<br />
aktivator makrofaga; TGF- inhibiše proliferaciju T limfocita i aktivaciju leukocita.<br />
5.1.4. Citokini koji regulišu hematopoezu („hematopoezni“ citokini)<br />
Citokini su neophodni <strong>za</strong> normalnu hematopoezu u kosnoj srži i obezbedjuju kosnoj srži<br />
mogunost veoma preciznog i tananog naina odgovora na stimulaciju i regulaciju njene funkcije.<br />
Neki od ranije pomenutih citokina koji se generišu tokom urodjenog i adaptivnog imunog<br />
odgovora stimulišu rast i diferencijaciju progenitornih elija kosne srži, te tako imune i<br />
inflamatorne reakcije koje „troše“ leukocite takodje pomažu produkciju novih leukocita. Zreli<br />
leukociti nastaju od pluripotentne progenitorne stem elije opredeljivanjem i diferencijacijom<br />
prema specifinoj liniji i progresivnom ekspanzijom progenitora (Slika 5.14.). Diferencijacija i<br />
ekspanzija progenitornih elija kosne srži je stimulisana citokinima koji se zovu kolonija<br />
stimulirajui faktori (engl. Colony Stimulating Factors - CSFs) zbog sposobnosti da stumulišu<br />
formiranje kolonija u kulturi kosne srži. Delovanjem specifinih CSFs ove kolonije dobijaju<br />
karakteristike specifinih linija (polimorfonuklearni fagociti, mononuklearni fagociti, limfociti i sl.),<br />
te ime ve<strong>za</strong>no <strong>za</strong> pojedini CSF (stem elija faktor je SCF; granulocita-monocita CSF je GM-CSF;<br />
granulocita CSF je G-CSF; monocita CSF je M-CSF) reflektuje tip kolonija koji se dobija njegovim<br />
delovanjem. Pored CSF, i interleukin-3 (IL-3) i interleukin-7 (IL-7) su citokini koji uestvuju u<br />
regulaciji hematopoeze. U ovoj skripti su opisani samo oni citokini koji su važni <strong>za</strong> razvoj limfocita<br />
138
(Tabela 5.5.), dok su citokini koji stimulišu maturaciju drugih e-lijskih linija uoblie-nih<br />
elemenata krvi predmet tekstova iz hematologije (osnovni pojmovi o ovome se mogu nai u tekstu<br />
skripte iz Uporedne fiziologije životinja; WUS Austria 2005).<br />
Slika 5.14. Uloga citokina u hematopoezi.<br />
CSF – colony-stimulating factor.<br />
CFU – colony-forming unit.<br />
139
Tabela 5.5. Citokini koji regulišu hematopoezu<br />
CITOKIN VELIINA GLAVNI EL. IZVOR GLAVNE CILJNE ELIJE GLAVNA POPULACIJA EL.<br />
KOJU INDUKUJU<br />
Faktor stem elija 24 kDa Stromalne eli. kos. srži Pluripotentne stem elije Sve elije<br />
IL-3 20-26 kDa T elije Nezreli progenitori Sve elije<br />
IL-7 25 kDa<br />
GM-CSF 18- 22 kDa<br />
M-CSF Dimer od: 70-90 kDa;<br />
40-kDa subj.<br />
Fibroblasti, stromalne<br />
elije kosne srži<br />
T elije, makrofagi,<br />
endotelijalne . fibroblasti<br />
Makrofagi, endotelijalne .,<br />
elije kosne srži, fibroblasti<br />
Nezreli limfoidni progenitori B i T limfociti<br />
Nezreli opredeljeni progenitori<br />
zreli/maturirani makofagi<br />
Opredeljeni progenitori Monociti<br />
Granulociti i monociti<br />
Aktivacija makrofaga<br />
G-CSF 19 kDa Makrofagi, fibroblasti,<br />
endotelijalne elije<br />
Opredeljeni progenitori Granulociti<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
5.1.4.1. Faktor stem elija (c-kit ligand)<br />
Faktor stem elija sintetišu stromalne elije kosne srži u formi membranskog ili<br />
sekretornog proteina kao produkt jednog gena (engl. alternative splicing of the RNA). Faktor stem<br />
elija ili C-kit ligand je protein koji interaguje sa tirozin-kinaznim membranskim receptornim<br />
proteinom (engl. c Kit or stem cell factor receptor) koji je produkt elijskog c-kit proto-onkogena, a<br />
ekpresovan je na pluripotentnim stem elijama. Smatra se da je faktor stem elija neophodan i<br />
odgovoran da uini stem elije kosne srži dostupnim <strong>za</strong> delovanje CSFs i omogui im odgovor na<br />
druge CSFs, ali da sam po sebi ne prouzrokuje formiranje kolonija.<br />
5.1.4.2. Interleukin-3 (IL-3)<br />
Ovaj interleukin se još zove faktor koji stimuliše formiranje nekoliko kolonijskih linija (engl.<br />
multilineage colony-stimulating factor or multi-CSF). Produkt je CD4 + T elija koje deluju na<br />
nezrele progenitore u kosnoj srži i pomovišu ekspanziju elija koje se diferenciraju u sve zrele<br />
elijske tipove. U strukturi IL-3 ima 4--helikalna lanca, a receptor se sastoji od citokin-vezujue<br />
kompnente (tip I familija citokinskih receptora) i domena <strong>za</strong> transdukciju signala koji je isti kao i<br />
kod IL-5 i GM-CSF receptora (kod oveka) ili unikatni (kod miša). Signaling IL-3 receptora ide<br />
preko JAK/STAT puta. Pored stimulisanja razvoja veeg broja razliitih linija kolinija, IL-3<br />
stimuiše rast i razvoj mastocita od progenitora, a ovaj efekat je pojaan IL-4.<br />
140
5.1.4.3. Interleukin-7 (IL-7)<br />
Ovaj citokin je sekretovan od strane stromalnih elija u mnogim tkivima koja stimulišu<br />
preživljavanje i ekspanziju nezrelih prekursora opredeljenih u pravcu B i T limocita. Strukturalno,<br />
IL-7 sadrži 4--helikalna lanca, a receptor se sastoji od unikatnog IL-7 vezujueg domena<br />
asociranog sa c lancem koji je prvi put identifikovan kao komponeneta IL-2 receptora. Signaling<br />
IL-7 receptora ide preko JAK3 kinaze. Ovaj citokin je esencijalan <strong>za</strong> preživljavanje naivnih i<br />
memorijskih T ellija, a posebno CD4+ memorijske elije.<br />
5.1.4.4. Drugi hematopoezni citokini<br />
GM-CSF, M-CSF i G-CSF su citokini produkovani od strane aktivirnih T elija, makrofaga,<br />
endotelijalnih elija i elija kosne srži strome, a deluju na progenitore u cilju poveavanja<br />
produkcije inflamatornih leukocita. CSF faktori su identifikovani i nazvani po njihovoj sposobnosti<br />
da stimulišu rast kolonija leukocita u kulturi, a stimulišu i regulišu produkciju i razvoj leukocita<br />
u koštanoj srži (leukopoezu). Oni imaju sposobnost da stimulišu deobu elija (mitozu) ali i<br />
sazrevanje matinih elija. Maturirani (zreli) leukociti gube sposobnost mitoze. GM-CSF promoviše<br />
maturaciju progenitora u dendritske elije i monocite. G-CSF se genenriše na mestu infekcije i<br />
deluje kao endokrini regulator (hormon) u mobili<strong>za</strong>ciji neutrofila iz kosne srži koji bi <strong>za</strong>menili<br />
one koji su potrošeni u iinflamatornoj reakciji. Zahvaljujui tehnologiji rekombinantne DNK danas<br />
je u klinikoj primeni nekoliko genetikim inženjeringom di<strong>za</strong>jniranih CSF (sargramostin i<br />
filgrastim). Rekombinantne forme GM-CSF i G-CSF se koriste u stimulaciji kosne srži nakon<br />
hemoterapije kancera ili transplantacije kosne srži Fascinantan aspekt hematopoeze je da je<br />
produkcija leukocita delom regulisana ve postojeim leukocitima. Ova forma kontrole omoguava<br />
da razvoj leukocita bude voma specifian i usmeravan prema potrebama organizma. Npr. ukoliko<br />
postoji bakterijska infekcija, citokini koji se sekretuju od strane aktivniranih leukocita uestvuju<br />
u sanaciji infekcije i stimulišu produkciju veeg broja neutrofila i makrofaga. Kompleksan proces<br />
kojim se produkcija leukocita “poklapa” sa potrebama organizma još uvek nije jasan i razjašnjen.<br />
Svaki od CSF-a ima predominantna dejstva, ali svi CSF-i i interleukini imaju i meusobno<br />
isprepletana dejstva. Dodatno, oni aktiviraju i održavaju zrele krvne elije. Interesantno je da su<br />
geni <strong>za</strong> mnoge od ovih faktora locirani <strong>za</strong>jedno na dugom kraku hromozoma 5, pa je mogue da su<br />
nastali duplikacijom predakog gena. Pored toga, interesantno je da je ba<strong>za</strong>lna hematopoe<strong>za</strong><br />
normalna kod miševa kojima nedostaje GM-CSF, što ukazuje da gubitak jednog faktora može biti<br />
nadomešten drugim, ali ne u svim funkcijama (npr. odsustvo GM-CSF dovodi do akumulacije<br />
surfaktanata u pluima).<br />
141
Interleukin-9 (IL-9) je citokin koji stimuliše rast T elijskih linija i progenitore mastocita u<br />
kosnoj srži. Ovaj citokin ima c subjedinicu <strong>za</strong> signaling i koristi JAK/STAT signalni put.<br />
Fiziološka funkcija ovog citokina nije jasno definisana.<br />
Interleukin-11 (IL-11) produkuju stromalne elije kosne srži. Za transdukciju signala<br />
koristi istu subjedinicu <strong>za</strong> signaling (gp130) kao IL-6 i JAK/STAT signalni put. Stimuliše<br />
megakariocitopoezu, te se koristi u klinikom tretiranju pacijenata koji boluju od trombocitne<br />
deficijencije nastale usled hemoterapije kancera.<br />
Citokini obezbedjuju široki spektar raznovrsnih funkcija koji su kljuni <strong>za</strong> odbranu od patogena,<br />
ali su i spona izmedju mehani<strong>za</strong>ma prirodne i adaptivne otpornosti. Oni doprinose<br />
specijali<strong>za</strong>ciji imunog odgovora aktivacijom specifinih tipova razliitih efektornih elija.<br />
Pored toga, regulišu veliinu/snagu i prirodu imunog odgovora utiui na rast i diferencijaciju<br />
limfocita. I na kraju, citokini obezbedjuju veoma važan amplifikacioni mehani<strong>za</strong>m koji<br />
omoguava malom broju limfocita koji su specifini <strong>za</strong> bilo koji pojedinani, specifini antigen,<br />
široki spektar efektorinih mehani<strong>za</strong>ma <strong>za</strong> eliminaciju antigena.<br />
142
5.2. EFEKTORNI MEHANIZMI URODJENOG/NESPECIFINOG IMUNOG ODGOVORA<br />
Urodjeni imunitet je prva odbrambena linija organizma. Svi višeelijski organizmi, ukljuujui<br />
biljke, beskimenjake i kimenjake poseduju urodjene mehanizme koji ih štite od<br />
mikroorgani<strong>za</strong>ma. Obzirom da su svi elementi kojima se ostvaruju ti mehanizmi ve prisutni u<br />
organizmu i spremni da prepoznaju stranog agensa, oznaavaju se kao prirodni, urodjeni ii<br />
nespecifini imunitet, odnosno urodjena otpornost. Urodjeni mehanizmi odbrane su<br />
filogenetski stariji i u pripravnosti su <strong>za</strong> efikasno delovanje pre bilo kakve naznake o tome da e<br />
homeosta<strong>za</strong> biti poremeena stranim agensom. U ovom tipu imunog odgovora reakcija organizma<br />
na štetni agens je uvek jednako br<strong>za</strong> i efikasna i svaki put sa jednakom efikasnošu aktiviraju<br />
raspoložive resurse elija i molekula iako se komponente ovog sistema nisu prethodno srele sa<br />
stranim agensom. Mehanizmi prirodnog imunog odgovora su usmereni relativno nespecifino<br />
protiv stranih agenasa, odnosno, prepoznaju, generalno, motive makromolekula koji grade<br />
zid bakterijskih elija i sl. (sekvencu ugljenih-hidrata koja je prisutna u zidu bakterijskih elija),<br />
ali ne specifine funkcionalne grupe. Razlikuju strano od sopstvenog (prisutnog u<br />
homeostazi), ali nikako ne razlikuju vrstu stranog agensa i ne ostavljaju nikakav memorijski<br />
<strong>za</strong>pis o susretu sa stranim agensom. Prirodna otpornost je znaajan odbrambeni mehani<strong>za</strong>m<br />
koji deluje pre no što se aktiviraju mehanizmi steenog imuniteta. S druge strane, steeni<br />
imunitet koristi mehanizme i prirodnog imuniteta u cilju odbrane organizma. U ovom poglavlju e<br />
biti opisane komponenete, specifinost i funkcije urodjenog imunog sistema. Ovaj kompleksni<br />
sistem odbrane ima tri veoma važne i kljune funkcije.<br />
(1) Urodjeni imunitet je inicijalni/poetni/prvi odgovor na mikroorganizme koji spreava<br />
infekciju organizma domaina i mnogo puta može da eliminiše štetni agens.<br />
(2) Efektorni mehanizmi urodjenog imunog sistema se esto koriste da bi se eliminisali<br />
mikroorganizmi i/ili antigeni i u adaptivnom imunom odgovoru. U elijama-posredovanom<br />
imunitetu, T limfociti produkuju citokine koji aktiviraju važne efektorne mehanizme urodjenog<br />
imuniteta, specifino fagocite. U humoralnom imunitetu, B limfociti produkuju antitela koja<br />
koriste efektorne mehanizme urodjenog imuniteta (fagocite i sistem komplementa) da bi<br />
eliminisali mikroorganizme i/ili antigen.<br />
(3) Urodjeni imunitet prema mikrobima stimuliše adaptivni imuni odgovor i može uticati na<br />
prirodu adaptivnog imunog odgovora inei ga optimalno efikasnim protiv razliitih tipova<br />
mikroorgani<strong>za</strong>ma. Prema tome, urodjeni imunitet ne samo da ima odbrambenu funkciju ubrzo<br />
nakon infekcije, nego “šalje upozorenje” da je infekcija prisutna i alarmira adaptivni imuni sistem.<br />
143
Neke komponenete urodjenog imunog sistema su funkcionalne sve vreme, ak i pre infekcije i one<br />
ukljuuju barijere <strong>za</strong> mikroorganizme i druge štetne agense koje ini površina epitela kože,<br />
respiratornog i digestivnog trakta. Druge komponente urodjenog imuniteta su normalno inaktivne<br />
(fagociti; sistem komplementa) ali se veoma brzo aktiviraju i reaguju u prisustvu štetnog agensa.<br />
Tabela 5.6. Poreenje prirodnog, humoralnog i elijskog imunog odgovora<br />
KARAKTERISTIKE PRIRODNI IMUNI ODGOVOR HUMORALNI IMUNI ODGOVOR ELIJSKI IMUNI ODGOVOR<br />
Primarne elije Neutrofilni, eozinofilni i bazofilni<br />
granulociti, mastociti, monociti i<br />
makrofagi<br />
B elije T elije<br />
Poreklo elija Crvena koštana srž Crvena koštana srž Crvena koštana srž<br />
Mesto maturacije Crvena koštana srž (neutrofilni,<br />
eozinofilni i bazofilni granulociti i<br />
monociti) i tkiva (mastociti i makrofagi)<br />
Crvena koštana srž Timus<br />
Mesto gde se<br />
nalaze zrele elije<br />
Krv, vezivno tkivo, limfatino tkivo Krv i limfatino tkivo Krv i limfatino tkivo<br />
Produkti primarne Histamin, kinini, komplement,<br />
Antitela Citokini<br />
sekrecije<br />
prostaglandini, leukotrijeni, interferon<br />
Primarno dejstvo Inflamatorni odgovor i fagocito<strong>za</strong> Zaštita od ekstracelularnih Zaštita od intracelularnih antigena (virusi,<br />
antigena (bakterije, toksini, intracelularne bakterije i gljive) i tumora:<br />
paraziti, virusi)<br />
regulacija antitelo-posredovanog i elijskog<br />
imunog odgovora (T elije pomonice i<br />
supresorske T elije)<br />
Reakcije<br />
Nema Trenutna hipersenzitivnost Odložena hipersenzitivnost (alergija ili infekcija i<br />
hipersenziti<strong>za</strong>cije<br />
(atopija, anafilaksija,<br />
kontaktna hipersenzitivnost)<br />
(preosetljivosti)<br />
citotoksine reakcije,<br />
kompleksni imuni poremeaji)<br />
Urodjeni imuni odgovor, kao i adaptivni imuni odgovor, ima fazu prepoznavanja, aktivacije i<br />
efektronu fazu. U tekstu e biti generalno opisano kako urodjeni imuni sistem prepoznaje<br />
mikroorganizme, <strong>za</strong>tim e biti pomenute osnovne komponenete urodjenog imunog sistema i<br />
njihova funkcija u odbrani organizma.<br />
5.2.1. Karakteristike urodjenog imunog prepoznavanja<br />
Urodjeni imuni sistem ima unikatnu specifinost <strong>za</strong> produkte mikroorgani<strong>za</strong>ma koje se razlikuju<br />
od specifinosti adaptivnog imunog odgovora (Tabela 5.6; Slika 5.15). Komponenete urodjenog<br />
imuniteta prepoznaju strukture koje su karakteristine <strong>za</strong> patogene i koje nisu prisutne kod<br />
sisarskih elija. Urodjeni imuni sistem nije sposoban da prepozna nemikrobialne supstance, dok<br />
je adaptivni imuni sistem sposoban da prepozna mnogo širi spektar stranih agensa bez obzira da<br />
li su ili nisu produkti mikroorgani<strong>za</strong>ma.<br />
144
Slika 5.15. Specifinosti urodjenog i adaptivnog imuniteta<br />
Razliiti imuni odgovori mogu biti specifini <strong>za</strong> strukture koje su <strong>za</strong>jednike <strong>za</strong> razliite klase<br />
mikroorgani<strong>za</strong>ma (Tabela 5.7.). Ove structure ukljuuju aminokiseline koje su unikatne <strong>za</strong><br />
mikrobe, kao što je RNK dvostrukog lanca (engl. double-stranded RNA - dsRNA) pronadjene kod<br />
virusa koji se replikuju; nemetilovana sekvenca CpG nadjena kod bakterija; specifini proteini<br />
karakteristini <strong>za</strong> bakterije (N-formilmetionil peptidi); kompleksi lipida i ugljenih-hidrata koje<br />
sintetišu iskljuivo elije mikroorgani<strong>za</strong>ma, ali ne i sisarske elije (LPS kod gram-negativnih<br />
bakterija; tehoina kiselina kod gram-pozitivnih bakterija; manozom-bogati glikoproteini). Motivi<br />
koji se prepoznaju na mikroorgani<strong>za</strong>ma od strane urodjenog imunog sistema opisani su kao<br />
molekularni obrazci/motivi (engl. molecular patterns), a receptori koji vezuju ove konzervisane<br />
strukture se nazivaju receptori <strong>za</strong> prepoznavanje obrazca/motiva (engl. pattern recognition<br />
receptors). Razliiti mikroogranizmi ekspresuju razliite molekularne obrazce koji bivaju<br />
prepoznati od strane razliitih receptora <strong>za</strong> prepoznavanje ovih obra<strong>za</strong>ca, a koje poseduju elije u<br />
organizmu domaina ili se nalaze u cirkulaciji. Zbog ovih specifinosti i urodjeni imuni sistem je,<br />
kao i adaptivni, sposoban da razlikuje sopstveno od stranog. U sluaju urodjenog imunog<br />
145
sistema to je samo do nivoa razlikovanja (strano) od sisarskih (sopstveno) molekula, ali <strong>za</strong>to nije<br />
sposoban da reaguje protiv sopstvenog, te bolje razlikuje sopstveno od stranog.<br />
Tabela 5.7. Primeri molekularnih obra<strong>za</strong>ca mikroorgani<strong>za</strong>ma i receptornog obrazca prepoznavanja urodjenog imuniteta<br />
MOLEKULARNI MOTIV MIKROBA IZVOR RECEPTOR URODJENOG IMUNITETA<br />
KOJI PREPOZNAJE OBRAZAC/MOTIV<br />
GLAVNI URODJENI IMUNI ODGOVOR<br />
dsRNA Virusi koji se replikuju Toll-like receptor? Produkcija interferona tip I iz inficirane el.<br />
LPS el. zid gram- negativnih bakterija Toll-like receptor/CD14 Aktivacija makrofaga<br />
Nemetilisani CpG nukleot. Bakterijska DNK Toll-like receptor Aktivacija makrofaga<br />
N-formilmetionil peptidi Bakterijski proteini N-formilmetionil Aktivacija neutrofila i makrofaga<br />
Manozom bogati glikani Mikrobijalni glikoprot. I glikolipidi<br />
1. Manozni receptor makrofaga<br />
2. Manoze-vezujui lektin plazme<br />
1. Fagocito<strong>za</strong><br />
2. Opsoni<strong>za</strong>cija; aktivacija komplementa<br />
Fosforilholin i srodnii molekuli Membrane mikroorgani<strong>za</strong>ma C-reaktivni protein plazme Opsoni<strong>za</strong>cija; aktivacija komplementa<br />
Skraenice: dsRNK - dvostruki lanac RNK; LPS- lipopolisaharidi; (preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
Urodjeni imuni sistem esto prepoznaje produkte mikroorgani<strong>za</strong>ma koji su neophodni <strong>za</strong><br />
njihovo preživljavanje. Ova adaptivna karakteristika organizma domaina je veoma važna jer<br />
osigurava urodjenom imunom sistemu „pronalaženje“ cilja, s obzirom da mikrobi ne mogu<br />
odbaciti ovo svoje svojstvo jer bi ih to uništilo (npr. viralna RNK dvostrukog lanca je esencijalna <strong>za</strong><br />
replikaciju nekih virusa i oni ne mogu izbei da je ekspresuju kako bi je „sakrili“ od receptora <strong>za</strong><br />
njeno prepoznavanje u sklopu urodjenog imunog sistema; LPS su neophodna komponenete zida<br />
bakterijskih elija i esencijalna <strong>za</strong> preživljavanje, te nikako ne mogu biti odbaeni). Receptori na<br />
elijama urodjenog imunog sistema su kodirani funkcionalnim genima nasledjene DNK (još<br />
u stadijumu klice, <strong>za</strong>metka). Receptori na elijama adaptivnog imunog sistema se generišu<br />
rekombnacijom i rearanžiranjem somatskih gena, što daje mnogo veu mogunost kombinacija,<br />
raznovrsnosti i specifinosti. Procenjeno je da urodjeni imuni sistem može da prepozna oko 1000<br />
molekularnih obra<strong>za</strong>ca mikroba, dok je adaptivni imuni sistem sposoban da prepozna 10000<br />
puta više (10 7) ili ak i više razliitih antigena. Takodje, adaptivni imunitet razlikuje antigene<br />
razliitih mikroorgani<strong>za</strong>ma u okviru iste klase ili ak i jednog mikroba, dok urodjeni umunitet<br />
razlikuje jedino klase mikroorgani<strong>za</strong>ma. Stepen i intenzitet odgovora kojima urodjeni imuni<br />
sistem reaguje na susrete sa mikroorganizmom su uvek isti (nema imunološke memorije), dok<br />
adativni imuni sistem ima sposobnost pameenja i prilagodjavanja upravo zbog fenomena<br />
imunološke memorije. Urodjeni imuni sistem ne reaguje na sopstveno zbog specifinosti<br />
urodjene imunosti da razlikuju molekularne obrazce elija mikroorgani<strong>za</strong>ma, ali ne i sisara, a i<br />
146
zbog toga što elije sisara ekspresuju regulatorne molekule koje spreavaju delovanje<br />
mehani<strong>za</strong>ma urodjene imunosti.<br />
5.2.2. Komponenete urodjenog imunog sistema<br />
Osnovne komponente urodjenog imunog odgovora kod kimenjaka su: (1) mehanike tj. fizike<br />
ili anatomske barijere koje onemoguavaju prodor mikroorgani<strong>za</strong>ma ili ih uklanjaju sa površine<br />
tela; (2) elije u cirkulaciji i u tkivima koje imaju sposobnost fagocitoze ili uestvuju u fagocitozi<br />
i/ili produkciji hemijskih medijatora koji participiraju u imunom odgovoru; (3) hemijski<br />
medijatori (sekretorne molekule) koje deluju direktno protiv štetnih agenasa i/ili aktiviraju<br />
druge mehanizme (Tabela 5.8.).<br />
Tabela 5.8. Komponenete urodjenog imuniteta<br />
KOMPONENTA GLAVNA FUNKCIJA<br />
Barijere<br />
Epitelijalni sloj Onemoguavanje ula<strong>za</strong>ka mikroorgani<strong>za</strong>ma<br />
Defenzini Uništavanje mikroorgani<strong>za</strong>ma<br />
Intraepitelijalni limfociti Uništavanje mikroorgani<strong>za</strong>ma<br />
Cirkulišue efektorne el.<br />
Neutrofili Rana fagocito<strong>za</strong> i inflamatorni procesi; Uništavanje mikroorgani<strong>za</strong>ma<br />
Makrofagi Najmonija fagocito<strong>za</strong> i uništavanje mikroorgani<strong>za</strong>ma; Sekrecija citokina koji stimulišu inflamaciju<br />
NK elije Liziranje tumorskih elija i elija inficiranih virusima; Aktiviranje makrofage<br />
Cirkulišui efektorni prot.<br />
Komplement Uništavanje mikroorgani<strong>za</strong>ma; Opsoni<strong>za</strong>cija mikroorgani<strong>za</strong>ma; Aktivacija leukocita<br />
Lektin koji vezuje manozu (kolektin) Opsoni<strong>za</strong>cija mikroorgani<strong>za</strong>ma; Aktivacija komplementa (lektinski put)<br />
C-reaktivni prot. (pentraksin) Opsoni<strong>za</strong>cija mikroorgani<strong>za</strong>ma; Aktivacija komplementa (lektinski put)<br />
Faktori koagulacije Oblažu inficirano tkivo<br />
Citokini<br />
TNF, IL-1, hemokini Inflamacija<br />
IFN-, IFN- Rezistencija na viralne infekcije<br />
IFN- Aktivacija makrofaga<br />
IL-12, IL-18, IL-23 Stimulacija produkcije IFN- od strane NK elija i T elija<br />
IL-5 Proliferacija NK elija<br />
IL-10, TGF- Kontrola inflamacije<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
Glavne efektorne elije urodjenog imuniteta su neutrofili, mononuklearni fagociti i NK elije. One<br />
napadaju mikroorganizme koji su prošli epitelijalnu barijeru i ušli u tkiva i/ili cirkulaciju. Svaki<br />
od ovih elijskih tipova ima posebnu ulogu u odgovoru na mikroorganizme. Makrofage i NK elije<br />
sekretuju citokine koji aktiviraju fagocite i stimulišu elijsku reakciju urodjenog imuniteta koja<br />
se zove inflamatorni odgovor. Inflamacija se sastoji od regrutovanja leukocita i izlaska nekoliko<br />
147
cirkulišuih proteina plazme na mesto infekcije, te stimulaciju/aktiviranje ovih leukocita i<br />
proteina da eliminišu infektivni agens. Ukoliko ovaj sistem ne uništi infektivni agens, inflamacija<br />
mobiliše imuni sistem i na neki nain «izoluje» mikroorganizme do momenta dok ne budu<br />
uništeni mehanizmima adaptivnog imunog odgovora. Ukoliko mikroorganizmi prodru u<br />
cirkulaciju oni bivaju „uhvaeni“ razliitim proteinima plazme (proteini sistema komplementa;<br />
lektin koji vezuje manozu i drugi proteini koji prepoznaju molekularne obrazce mikroorgani<strong>za</strong>ma).<br />
Inflamatorni odgovor predstavlja kompleksnu sekvencu dogadjaja koja ukljuuje<br />
sinhronizovano, multidirekciono delovanje efektornih elija i proteina urodjenog imunog sistema i<br />
njihovih produkata. Bakterije, ili ošteeno tkivo i<strong>za</strong>zivaju oslobadjanje ili aktivaciju hemijskih<br />
medijatora (histamin, prostaglandini, leukotrieni, kinini itd.), što prouzrokuje seriju paralelnih<br />
efekata: 1) vazodilataciju koja poveava protok krvi i doprinosi kretanju fagocita i drugih leukocita<br />
do inficiranog regiona; 2) hemotaksino privlaenje fagocita koji napuštaju krv i ulaze u tkiva; 3)<br />
poveanje vaskularne propustljivosti koja dopušta da fibrinogen i komplement iz krvi izlaze u<br />
tkivo. Fibrinogen se konvertuje u fibrin, što spreava širenje infekcije formiranjem izolacionog zida<br />
oko inficiranog mesta. Proteini sistema komplementa dodatno pojaavaju inflamatorni odgovor i<br />
privlae novu koliinu fagocita. Proces oslobadjanja hemijskih medijatora i privlaenja fagocita<br />
traje dok se ne unište bakterije. Fagociti (uglavnom makrofagi) uklanjaju mikroorganizme i mrtvo<br />
tkivo, a ošteeno tkivo se obnavlja proliferacijom i remodelovanjem pod uticajem brojnih himo<strong>za</strong> i<br />
tripta<strong>za</strong>. Inflamacija može da bude lokalna ili sistemska. Simptomi lokalne inflamacije su<br />
ogranieni na specifian prostor u organizmu i ukljuuju crvenilo, oticanje, toplota, bol, gubitak<br />
funkcije tkiva u kome se inflamacija dogadja. Crvenilo, toplota, oticanje nastaju kao rezultat<br />
poveanog protoka krvi i poveanja vaskularne permeabilnosti. Bol je posledica otoka i delovanja<br />
hemijskih medijatora na senzorne receptore ili receptore <strong>za</strong> bol. Gubitak funkcije tkiva se javlja<br />
kao posledica tkivne destrukcije, otoka i bola. Sistemska inflamacija je inflamatorni odgovor koji<br />
<strong>za</strong>hteva vei broj podruja u organizmu. U sistemskoj inflamaciji, pored lokalnih simptoma na<br />
mestima inflamacije postoje i tri dodatne pojave: (1) crvena koštana srž produkuje i oslobadja<br />
velike koliine neutrofila koji stimulišu i pojaavaju fagocitozni odgovor; (2) pirogeni (hemijske<br />
materije sekretovane od strane mikroba, makrofaga, neutrofila i dr. ) stimulišu produkciju toplote<br />
utiui na mehanizme <strong>za</strong> regulaciju temperature u hipotalamusu tako da se konzerviše toplota i<br />
poveava temperatura tela (poveana temperatura i groznica promovišu aktivnost imunog sistema<br />
preko stimulacije fagocitoze, a inhibicije rasta nekih mikroorgani<strong>za</strong>ma); (3) u nekim sluajevima<br />
sistemske inflamacije vaskularna popustljivost je toliko pojaana da se velike koliine tenosti<br />
148
gube iz cirkulacije u tkiva, ime se smanjuje volumen krvi, što može prouzrokovati šok, a nekada i<br />
smrt.<br />
5.2.2.1. Epitelijalne barijere<br />
Intaktna epitelijalna površina formira fiziku barijeru izmedju mikroorgani<strong>za</strong>ma u spoljašnjem<br />
okruženju i organizma domaina. Uobiajena mesta na kojima mikroorganizmi ulaze u organi<strong>za</strong>m<br />
životinja jesu koža, gastrointestinalni trakt i plua, kroz koje mogu da udju putem fizikog<br />
kontakta, udisanja i ingestijom. Ove dodirne površine su <strong>za</strong>štieni epitelom koji pruža fiziku i<br />
hemijsku barijeru protiv infekcije. Koža i mukozne membrane uklanjaju mirkroorganizme i<br />
druge agense sa površine tela na nekoliko naina:<br />
ispiranjem oiju suznom tenošu, usne duplje<br />
pljuvakom, urinarnog trakta urinom. Pored toga,<br />
elije mukozne membrane poetnih delova<br />
respiratornog trakta su bogate cilijama koje svojim<br />
pokretima guraju strane agense u mukus i<br />
usmeravaju ga ka ždrelu, odakle e biti progutan.<br />
Kašljanje i kijanje takodje uklanja mirkoorganizme i<br />
druge agense iz respiratornog sistema. Pored toga,<br />
epitelijalne elije lue aktivne peptide koji ubijaju<br />
mikroorganizme, a telesne šupljine sadrže tenost<br />
(suzna tenost, HCl, vaginalni sekret i sl.) koja u<br />
svom sastavu ima razliite bakteriostatike i<br />
baktericidne materije.<br />
Slika 5.16. Funkcija epitela u urodjenom imunitetu<br />
Predstavlja fiziku barijeru <strong>za</strong> prolaz mikroba, produkuje antimikrobne supstance i sadrži intraepitelijalne limfocite koji ubijaju mikrobe i <strong>za</strong>ražene elije.<br />
Epitel produkuje peptide koji imaju prirodnu antibiotsku fukciju. Najpoznatiji su defensini,<br />
(cisteinima bogati peptidi od 29 do 34 aminokiseline) prisutni u koži mnogih vrsta ukljuujui i<br />
sisare. Ima ih takodje u granulama neutrofila. Defensini su antibiotici širokog spektra delovanja<br />
koji imaju sposobnost uništavanje raznovrsnog i velikog broja bakterija i gljiva. Epitel intestinuma<br />
sekretuje kriptocidine, potentne antimikrobijalne peptide, koji imaju sposobnost lokalne<br />
sterili<strong>za</strong>cije lumena intestinuma, posebno prostora izmedju intestinalnih kripti. Keratinociti<br />
produkuju nekoliko citokina (IL-1), te doprinose nespecifinim efektornim reakcijama,<br />
inflamatornom odgovoru, ali mogu biti i pomagaki hemijski medijatori ukljueni u efektorne<br />
mehanizme adaptivnog imunog odgovora.<br />
149
Epitelijalna barijera i serozne šupljine sadrže intraepitelijalne T limfocite i B-1 podgrupu B<br />
elija i ove elije mogu da prepoznaju i odgovore na mikroorganizme koji uestalo ulaze.<br />
Intraepitelijalni T limfociti su prisutni u epidermisu kože i mukoznom epitelu. Ove elije, kao i<br />
sve druge T elije imaju receptore <strong>za</strong> prepoznavanje antigena, te stoga pripadaju elijskoj<br />
populaciji adaptivnog imunog sistema. Sa druge strane, intraepitelijalne T limfociti ekspresuju<br />
limitirano raznolike receptore kodirane funkcionalnim genima nasledjene DNK bez velike varijacije<br />
u komplementarno-determinišuim regionima. Stoga, neuobiajena priroda receptora i antigena<br />
koje prepoznaju odvaja intraepitelijalne T limfocite u posebnu kategoriju T elija koje više lie<br />
efektornim elijama urodjenog nego adaptivnog imuniteta. One uestvuju u odbrani organizma<br />
sekrecijom citokina, aktivacijom fagocita i uništavanjem inficirane elije. Peritonealna šupljina<br />
sadrži populaciju B limfocita koja se zove B-1 elije. Antigeni receptori ovih elija jesu<br />
imunoglobulinske molekule, kao i kod drugih B limfocita, ali B-1 elije imaju limitiranu<br />
raznovrsnost u prepoznavanju antigena, kao i antigeni receptori intraepitelijalnih T limfocita.<br />
Neke B-1 elije produkuju IgM antitelo pecifino <strong>za</strong> polisaharide i lipidne antigene, kao što su<br />
fosforilholin i LPS karakteristini <strong>za</strong> mnoge bakterije. Interesantno je da normalne individue<br />
sadrže cirkulišua antitela protiv ovakvih molekularnih obra<strong>za</strong>ca bakterija (najvei broj se nalazi<br />
u intestinumu) bez ikakve druge naznake o infekciji. Stoga se ova antitela nazivaju prirodna<br />
antitela, a smatra se da su u najveoj meri produkti aktivnosti B-1 elija. Trea populacija elija<br />
prisutnih subepitelijalno i u seroznim šupljinama su mastociti koji raguju na mikroorganizme i<br />
njihove produkte sekrecijom razliitih<br />
hemijskih medijatora koji stimulišu<br />
infalmaciju. Mastociti su granulisane<br />
elije pronaene u delovima bogatim<br />
vezivnim tkivom, a naroito su brojni u<br />
subepitelijalnom prostoru. Na membrani<br />
mastociti imaju receptore <strong>za</strong> IgE i C5a i<br />
C3a proteine sistema komplementa.<br />
Receptori <strong>za</strong> IgE na elijskoj membrani<br />
omoguavaju proces degranulacije ako se<br />
kompleks antigen-IgE veže <strong>za</strong> njihovu<br />
površinu.<br />
Slika 5.17. Mastocit kao<br />
integrator urodjenog i<br />
steenog imunog odgovora,<br />
a i kao amplifikatori imunosti<br />
150
Citoplazma je bogata biološki aktivnim materija koje omoguavaju mastocitima široki spektar<br />
efektornih funkcija, ne samo u mehanizmima imunog odgovora nego i brojnim drugim procesima.<br />
Granule sadže citokine, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-16, leukotriene, prostaglandine i dr., što<br />
omoguava aktivaciju elija koje uestvuju u steenom imunom odgovoru. Istovremeno, ukljueni<br />
su u inflamatorni odgovor koji je iniciran od strane imunoglobulina IgE i IgG, kao i hemokina,<br />
histamina i dr. Osim efektornih funkcija u steenom imunitetu, mastociti oslobaaju TNF- kao<br />
odgovor na bakterijske produkte (mehani<strong>za</strong>m ne<strong>za</strong>vistan od antitela) i stoga uestvuju u<br />
prirodnom imunom odgovoru. Njihove granule sadrže heparin i predpostavlja se da heparin ima<br />
ulogu u obrazovanju granula. Pored toga, granule sadrže brojne proteaze, himoze i triptaze,<br />
enzime koji su ukljueni u proliferaciju i remodeliranje vezivnog tkiva, kao i dopamin i serotonin.<br />
Sve napred navedeno omoguava mastocitima da funkcionišu kao integratori urodjenog i steenog<br />
imunog odgovora, a i kao amplifikatori imunosti (Slika 5.17.).<br />
Veoma važna osobina koju poseduju sve elije koje uestvuju u urodjenom imunom odgovoru je<br />
sposobnost amboidnog kretanja koja im omoguuje da dospevaju do mesta infekcije. Pored toga,<br />
ispoljavaju sposobnost hemotaksije, odnosno detektuju male razlike u koncentraciji<br />
hemotaksinih faktora. Hemotaksini faktori su sekretorni produkti mikroba koji samostalno ili<br />
u interakciji sa hemijskim materijama produkovanim od strane okolnih elija menjaju<br />
koncentracijsku homeostazu inficiranog tkiva i privlae leukocite koji ameboidnim kretanjem<br />
dospevaju do mesta inflamacije. Hemotaksini faktori, pored navedenih, mogu biti i proteini<br />
sistema komplementa, leukotrijeni, kinini, histamin i dr.<br />
5.2.2.2. Fagociti: Neutrofili i makrofagi<br />
Fagocite su elije ija je primarna funkcija da identifikuju, fagocituju i unište mikroorganizme.<br />
Sve fagocitne elije na svojoj membrani imaju receptore karakteristine <strong>za</strong> elije koje uestvuju u<br />
urodjenim-nespecifinim mehanizmima imunog odgovora. Naješi su receptori <strong>za</strong> sekvencu<br />
ugljenih-hidrata koja je prisutna u zidu bakterijskih elija (manozni receptor; receptor <strong>za</strong><br />
lipopolisaharide-LPS; N-formil-metionil receptor; tzv. »scavenger« receptor i dr.); receptori <strong>za</strong> Fc<br />
fragment; IgG komplement (C3b, C5a); interferon; TNF i odredjene bakterijske komponenete. Ovi<br />
receptori omoguavaju interakciju fagocita sa nekim humoralnim faktorima kao što su TNF, neki<br />
proteini komplementa (C3b, C5a), IL-2 i dr., ime se poveava fagocitna sposobnost i funkcija. U<br />
fagocitne elije se ubrajaju elije koje imaju izraženu monu fagocitnu sposobnost, a to su<br />
polimorfonuklearni leukociti - neutrofili i mononuklearni leukociti – monociti i makrofagi.<br />
151
Neutrofilni polimorfonuklearni leukociti – Neutrofili.<br />
Neutrofili ine oko 90% granulocita u perifernoj cirkulaciji oveka. Njihov dijametar je od 12m-<br />
15m (u cirkulaciji). Obeležava ih prisutnost višerežnjevitog jedra (4-6 segmenata) iji su lobulusi<br />
spojeni hromatinom (Slika 5.18.), kao i dve vrste neutrofilnih granula: primarne ili azurofilne<br />
granule (lizozomi veliine 0.5 m) i sekundarne ili specifine granule. Neutrofili sadrže u svojoj<br />
citoplazmi i glikogen koji se razgradjuje glikolizom i hekso<strong>za</strong>-monofosfatnim putem oksidacije<br />
glukoze da bi se dobila energija. S obzirom na mali broj mitohondrija u ovim elijama, ciklus<br />
limunske kiseline je manje važan i slabije <strong>za</strong>stupljen. Sposobnost neutrofila da prežive u<br />
anaerobnoj sredine je velika adaptivna prednost jer im omoguava da unište bakterije i pomognu<br />
pri uklanjanju ostataka raspadnutih elija u slabije oksigenisanim podrujim, kao što je<br />
inflamatorno ili nekrotino tkivo. Proseni životni vek neutrofila u cirkulaciji je 6 sati, a u<br />
vezivnom tkivu 1-4 dana gde potom odumiru procesom apoptoze (programirane elijske smrti).<br />
Da bi se održao normalan nivo neutrofila u krvi neophodno je da se produkuje 100 biliona<br />
neutrofila na dan. Osnovna funkcija neutrofila je odbrambena. Ona se ostvaruje fagocitozom i<br />
sekrecijom specifinih biološki aktivnih materija, pa se uz monocite i makrofage, nazivaju i tzv.<br />
»profesionalnim fagocitima«. Cirkulišui neutrofili su inaktivni i loptastog oblika, ali nakon što<br />
se privrste <strong>za</strong> vrst supstrat, kao što je kolagen ekstracelularnog matriksa, ispoljavaju<br />
sposobnost ameboidnog kretanja. Mnogi od njih napuštaju cirkulaciju procesom dijapedeze i<br />
ulaze u tkiva, a odatle se preko gatrointestinalnog trakta (GIST) ekskretuju iz organizma. Ukoliko<br />
se cirkulišui neutrofili ne regrutuju na mesto infekcije oni ulaze u programiranu elijsku smrt i<br />
obino su fagocitirani od strane rezidualnih makrofaga u jetri.<br />
Neutrofil Monocit<br />
Slika 5.18. Fagocitne elije urodjenog imunog sistema<br />
152
Mononuklearni leukociti – Monociti - makrofagi<br />
Monociti nastaju u koštanoj srži iz opredeljene progenitorske elije monoblasta, opredeljene<br />
matine elije mijeloidne loze, koja se po svom morfološkom izgledu bitno ne razlikuje od<br />
mijeloblasta. Diferencijacijom monoblasta nastaje promonocit, velika elija (dijametra 18 m) sa<br />
bazofilnom citoplazmom i velikim, blago ugnutim jedrom. Hromatin je rastresit, a jedarca vidljiva.<br />
Promonociti prolazi dve elijske deobe tokom svog razvoja u monocite. Monociti u cirkulaciji imaju<br />
dijametar od 12m-20m, a nukleusi su im ovalni, u obliku potkovice ili bubrežasti, i obino<br />
smešteni ekscentrino. Hromatin je manje kondenzovan nego hromatin u limfocitima, te se zbog<br />
tog rastresitog hromatina jedra monocita boje svetlije od jedara velikih limfocita. Citoplazma<br />
monocita je bazofilna i sadrži sitne azurofilne granule (lizozome) od kojih su neke jedva vidljive<br />
svetlosnim mikroskopom. Te granule su rasporedjene po itavoj citpolazmi i daju joj na obojenim<br />
razmazima plaviasto-sivu boju. Pod elektronskim mikroskopom se uoava da jedro ima jedno ili<br />
dva jedarceta, a u citoplazmi se vidi dobro razvijen granulirani endoplazmatski retikulum,<br />
poliribozomi i mnogo malih mitohodrija. Pored toga, uoava se i dobro razvijen Goldži-jev<br />
kompleks u kome se kondenzuje sadržaj citoplazmatskih granula. Te granule su primarni<br />
lizozomi koji se u monocitima opisuju kao sitne azurofilne granule. Sve nabrojane morfološke<br />
karakteristike ukazuju na veliku sekretornu potenciju ovih elija. Od svih uoblienih elemenata<br />
krvi, monociti prvi ulaze u cirkulaciju i tu se <strong>za</strong>državaju oko 72 sata. Nakon toga oni odlaze u<br />
veliki broj tkiva u organizmu, gde postaju tkivni makrofagi i ine moni fagocitni sistem tkivnih<br />
makrofaga (sistem mononuklearnih makrofaga). Specifini tkivni makrofagi su Langerhans-ove<br />
dendritske elije kože, Kupferove elije jetre, plune alveolarne makrofage, elije mikroglije u<br />
mozgu, M elije u submukozi GIST-a i dr. Sistem makrofaga i njihovih cirkulišuih prekursora,<br />
monocita, se ranije oznaavao kao retikuloendotelni sistem, dok se danas naziva sistem tkivnih<br />
makrofaga. Njihov životni vek u tkivima je nepoznat, ali transplantacija koštane srži ukazuje da<br />
mogu živeti oko 3 meseca. Dosadašnja saznanja ukazuju na to da se ne vraaju u cirkulaciju.<br />
Makrofage aktiviraju limfokini osloboeni od strane T limfocita. Aktivirani makrofagi migriraju,<br />
kao odgovor na hemotaksne stimuluse, proždiru i ubijaju bakterije u principu slinim procesima i<br />
mehanizmima kojim to ine neutrofili. Makrofagi imaju sposobnost da sekretuju preko 100<br />
razliitih biološki aktivnih molekula, ukljuujui faktore koji utiu na limfocite i druge elije,<br />
prostaglandine E serije, faktore koji podstiu zgrušavanje i dr. Zahvaljujui svojoj specifinoj<br />
funkcionalnoj organi<strong>za</strong>ciji i širokoj paleti aktivnih materija koje sekretuju, makrofagi su moni<br />
fagociti. Pored toga, imaju sposobnost da štetne agense koji su “nepoznati” i ne prepoznaju se od<br />
strane komponenti specifinog imunog sistema, obrade (procesuju) i iskažu (prezentuju) na svojoj<br />
površini u formi prepoznatljivoj <strong>za</strong> druge elije imunog sistema, te se zbog toga nazivaju antigen<br />
153
prezentujue elije (APC). Dakle, makrofagi i njihovi cirkulišui prekursori monociti imaju<br />
kljunu ulogu u imunom odgovoru organizma i predstavljaju sponu izmedju urodjenog (prirodnog,<br />
ne specifinog) i adaptivnog (steenog, specifinog) imuniteta. Efektorne funkcije makrofaga u<br />
prirodnom imunom odgovoru su fagocito<strong>za</strong>, kao i produkcija hemijskih medijatore koji aktiviraju<br />
druge elije imunog sistema ili na neki drugi nain uestvuju u eliminaciji štetnog agensa.<br />
Efektorne funkcije u adaptivnom imunom odgovoru su fagocito<strong>za</strong> mikroba i prezentacija<br />
mikrobnih antigena limfocitima koji se nikada pre nisu sreli sa tim antigenom.<br />
Migracija neutrofila na mesto infekcije, kao i pokretanje elija u fagocitozi, ukljuuju mikrotubule<br />
i mikrofilamente i interakciju aktina sa miozinom–I na unutrašnjoj strani elijske membrane.<br />
Proces dijapedeze se ostvaruje tako što se neutrofili privueni selektinima sa površine<br />
endotelijalnih elija vrsto vezuju <strong>za</strong> neutrofil-adhezioni molekul (pripada familiji integrinskih<br />
receptora) i provlae se kroz zid kapilara izmeu endotelnih elija. Ova sposobnost im omoguava<br />
da brže stignu do mesta gde se, kao rezultat invazije bakterija, razvija inflamatorna reakcija. Put<br />
neutrofila od izlaska iz cirkulacije do inficiranog mesta obezbedjuje hemotaksija, odnosno<br />
prisustvo bakterijskih produkata na inficiranom mestu. I ne samo to, nego postoji interakcija<br />
izmedju bakterijskih produkata, faktora iz plazme, kao i onih sekretovanih iz okolnih elija. Ti<br />
hemotaksini agensi su brojni i ukljuuju hemokine, neke komponente sistema komplementa<br />
(C5), leukotrijene, polipeptide poreklom iz limoficta, mastocita, bazofila, ali i mnoge druge. Sve te<br />
molekule u razliitim kombinacijama omoguuju uslove <strong>za</strong> privlaenje leukocita, ali i što<br />
efikasniju fagocitozu bakterije. Jedan od naina je opsoni<strong>za</strong>cija (okruživanje, pojaano vezivanje)<br />
imunoglobulinima (Ig), a naroito IgG, kao i proteinima sistema komplementa (C3b). IgG se kao<br />
opsonin vezuje <strong>za</strong> bakterijsku eliju svojim Fab regionom (engl. antigen binding fragment – Fab),<br />
dok je Fc fragment slobodan i “primamljiv” <strong>za</strong> fagocite koji e se preko svog receptora <strong>za</strong> Fc (gore<br />
pomenuti Fcg) ve<strong>za</strong>ti <strong>za</strong> tako okruženu bakterijsku eliju i fagocitirati je. Dobar opsonin je i C3b<br />
protein sistema komplementa koji se nespecifino vezuje <strong>za</strong> strane organizme, a koga takodje<br />
“prepoznaju” fagocite preko svog receptora. Na taj nain, antitela (IgG) i C3b “markiraju”<br />
mikroorgani<strong>za</strong>m <strong>za</strong> fagocitozu i destrukciju. Aktivacija receptora na elijskoj membrani neutrofila,<br />
preko G-proteinom posredovanog odgovora, injicira poveanje motorne aktivnosti elije,<br />
egzocitozu aktivnih materija i naglo poveanje preuzimanja kiseonika i produkcije<br />
reaktivnih kiseoninih radikala tzv. “respiratornu eksploziju” (engl. respiratory burst).<br />
Poveanje motorne aktivnosti e dovesti do brze ingestiji bakterija endocitozom, odnosno<br />
fagocitozom. Zbog širokog spektra aktivnih materija koje produkuju fagociti ispoljavaju efektorne<br />
funkcije i u prirodnom, ali i u adaptivnom imunom odgovoru. Kao što je napomenuto, u<br />
154
urodjenim odbrambenim mehanizmima uestvuju kao moni fagociti, ali i kao izvor brojnih<br />
aktivnih materija koje ili aktiviraju druge elije imunog sistema, ili imaju funkcije u dijapedezi,<br />
hemotaksiji ili nekim drugim mehanizmima kojim se olakšava eliminacija štetnog agensa. Pored<br />
toga, sekrecija biološki aktivnih materija i njihove funkcije imaju znaaja u efektornim reakcijama<br />
adaptivnih odbrambenih mehani<strong>za</strong>ma.<br />
Funkcionalni odgovor fagocita u odbrani organizma se sastoji od pojedinanih koraka/fa<strong>za</strong>:<br />
aktivnog regrutovanja elija do mesta infekcije; prepoznavanja mikroorganizma; fagocitoze i<br />
destrukcije usvojenog digeriranog miroorganizma. Pored toga, makrofagi produkuju citokine koji<br />
imaju veliki broj važnih uloga u urodjenom i adaptivnom imunom odgovoru.<br />
Regrutovanje leukocita do mesta infekcije<br />
Neutrofili i monociti se regrutuju (obnavljaju) iz krvi do mesta infekcije vezivanjem <strong>za</strong> adhezione<br />
molekule na endotelijalnim elijama i hemoatraktantima produkovanim kao odgovor na infekciju. Ovi<br />
leukociti normalno cirkulišu krvotokom i ne migriraju u tkiva. Njihovo regrutovanje do mesta<br />
infekcije je multifazni proces koji ukljuuje »lepljenje« <strong>za</strong> endotelne elije i migraciju kroz endotel<br />
(Slika 15.19.). Rezidentni tkivni makrofagi koji prepoznaju mikrobe sekretuju TNF, IL-1 i<br />
hemokine. TNF deluje na endotelijalne elije postkapilarnih venula i indukuje ekspresiju nekoliko<br />
adhezivnih molekula. Tokom 1-2 h endotelijalne elije poinju da ekspresuju E-selektin, dok<br />
leukociti ekspresuju na vrhu svojih mikroizraštaja/mikrovilusa (engl. microvilli) ugljenohidratne<br />
ligande <strong>za</strong> selektine koji se vezuju sa selektinima na endotelnim elijama. Ovo vezivanje je slabo i<br />
veoma esto je poremeeno silom protoka krvi, te se leukociti lako odvoje od endotelijalnih elija,<br />
a potom vežu <strong>za</strong> druge i tako se kotrljaju/rolaju po površini endotela. TNF i IL-1 takodje indukuju<br />
ekspresiju liganada <strong>za</strong> integrine i to uglavnom vaskularnih elija adhezioni molekul-1 (engl.<br />
Vascular Cell Adhesion Molecule-1 – VCAM-1; koji je ligand <strong>za</strong> VLA-4 integrin) i intracelularni<br />
adhezioni molekul-1(engl. Intracelular Adhesion Molecule-1 – ICAM-1; koji je ligand <strong>za</strong> LFA-1 i<br />
Mac-1 integrine). Leukociti ekspresuju ove integrine u stanju malog afiniteta. Istovremeno,<br />
hemokini koji se produkuju na mestu infekcije ulaze u cirkulaciju, vezuju se <strong>za</strong> heparin-<br />
glikosaminoglikane endotelijalnih elija i izlažu se u velikim koncentracijama. Ovi hemokini<br />
deluju na »kotrljajue« leukocite (engl. rolling leucocytes) i aktiviraju ih. Kao posledica aktivacije<br />
dolazi do konverzije VLA-4 i LFA-1 integrina iz stanja slabog afiniteta u stanje visokog afiniteta.<br />
Kombinacija idukovne ekspresije integrinskih liganada i aktivacije integrina na leukocitima<br />
rezultuje u stabilnom integrinima posredovanom vezivanju leukocita <strong>za</strong> endotel na mestu<br />
infekcije. Leukociti prestaju da se kotrljaju, njihov citoskelet se reorganizuje i oni se rasporedjuju<br />
155
po površini endotela. Tada hemokini deluju na adherirane leukocite i stimulišu ih da migriraju<br />
kroz interendotelijalni prostor (prostor izmedju elija endotela) prema »hemotaksinom«<br />
koncentracijskom gradijentu prema mestu infekcije. Neto rezultat svega je da se prvo<br />
neutrofili, a potom i monociti rapidno nakupljaju u inficiranom tkivu. Ova rekacija je<br />
centralna komponeneta procesa inflamacije i tipina je <strong>za</strong> mikrobijalne infekcije, ali i nekim<br />
neinfektivni stimulusi mogu da je iniciraju. Neutrofili i monociti dospeli u tkivo (sada se zovu<br />
makrofagi) prepoznaju mikroorganizme i funkcionišu u smislu iskorenjivanja infekcije.<br />
Prepoznavanje mikroorgani<strong>za</strong>ma od strane makrofaga<br />
Slika 5.19. Regrutovanje<br />
leukocita.<br />
Na mestu infekcjie, makrofag<br />
koji je fagocitirao mikroorgani<strong>za</strong>m,<br />
produkuje citokine (TNF i<br />
IL-1) koji aktiviraju endotelijalne<br />
elije u okolini venule da<br />
produkuju selektine (ligande <strong>za</strong><br />
integrine) i hemokine. Selektini<br />
posreduju slabo »sapinjanje« i<br />
rolanje/ valjanje leukocita u krvi<br />
po endotelu; integrini posreduju<br />
vrstu adheziju neutrofila;<br />
hemokini poveavaju afinitet<br />
neutrofila <strong>za</strong> integrine istimulišu<br />
migraciju elija kroz endotel do<br />
mesta infekcije. Cirkulišui<br />
neutrofili, monociti i aktivirani T<br />
limfociti koriste skoro istovetne<br />
mehanizme migracije do mesta<br />
infekcije<br />
Neutrofili i makrofagi ekspresuju površinske receoptore koji preoznaju mikrobe u krvi i<br />
tkivu i stimulišu fagocitozu i uništavanje mikroba. Mehanizmi <strong>za</strong> uništavanje<br />
mikroograni<strong>za</strong>ma (mikrobicidni mehanizmi) su uglavnom odvijaju kompartmenski odvojeni u<br />
intraelijske formacije, lizozome i fagolizozome, kako bi elija <strong>za</strong>štitila sebe od ošteenja.<br />
»Uvlaenje« ili ingestija mikroba u ove strukture je neophodno da bi se mikrobi uništili, a ingestiji<br />
prethodi prepoznavanje mikroba preko razliitih površinskih receptora na makrofagama. Pored<br />
toga, neutrofili i makrofagi ekspresuju i neke receptore koji aktiviraju elije da produkuju citokine<br />
i mikrobicidne supstance i receptore koji stimulišu migraciju elija do mesta infekcija. Postoji<br />
nekoliko klasa receptora (manozni receptori i receptori hvatai; receptori <strong>za</strong> opsonine, »tool-<br />
156
like«-receptori; GPCR receptori) na fagocitima (fagocitnih receptora) koji vezuju mikrobe i<br />
posreduju njihovu internali<strong>za</strong>ciju (Slika 5.20).<br />
Manozni receptori i receptori tzv. hvatai (engl. scavenger receptors). Manozni<br />
receptori su makrofagni lektini koji vezuju terminalne manozne i fruktozne rezidue glikoproteina<br />
glikolipida. Ovi šeeri su tipini molekuli elijskog zida mikroba, dok glikoproteini membrana<br />
elija sisara sadrže kao rezidue salicilnu kiselinu i N-acetilgalakotsamine. Na ovaj nain manozni<br />
receptor makrofaga prepoznaje elije mikroba i razlikuje ih od sopstvenih elija. Receptori hvatai<br />
su originalno definisani kao receptori koji vezuju i posreduju endocitozu oksidovanih ili<br />
acetilovanih partikula lipoproteina male gustine (engl. Low Density Lipoproteins) koji ne mogu<br />
više da interaguju sa konvencionalnim LDL receptorom. Receptori hvatai vezuju razliite<br />
mikrobe, kao i modifikovane LDL partikule. Neki integrini makrofaga, kao što je Mac-1<br />
(CD11bCD18)<br />
takodje mogu<br />
da vezuju mikro<br />
organizme.<br />
Slika 5.20. Receptori<br />
i odgovor fagocita.<br />
Neutrofili i makrofagi<br />
koriste veliki broj razli-<br />
itih receptora da prepoznaju<br />
mikrobe, mikrobijalne<br />
produkte i<br />
supstance koje produkuju<br />
elije domaina u<br />
infekciji. Ovi receptori<br />
aktiviraju elijski odgovor<br />
koji funkcioniše u<br />
smislu stimulacije inflamacije<br />
i iskorenjivanja<br />
mikroba. Prikazne su<br />
samo neke od klasa<br />
receptora.<br />
Receptori <strong>za</strong> opsonine promovišu fagocitozu mikroba obloženih razliitim proteinima.<br />
Opsoni<strong>za</strong>cija predstavlja proces oblaganja mikroba u cilju fagocitoze, a supstance koje oblažu<br />
površinu elije mikroorganizma nazivaju se opsonini. Ove supstance mogu biti antitela, proteini<br />
sistema komplementa i lektini. Jedan od najefikasnijih sistema <strong>za</strong> opsoni<strong>za</strong>ciju je oblaganje sa<br />
IgG antitelom koji se zbog toga i naziva specifian opsonin i koji se prepoznaje od strane Fcg<br />
receptora visokog afininiteta (FcgRI). Komponenete sistema komplementa, posebno fragmenti C3<br />
157
proteina komplementa, su takodje potentni opsonini zbog toga što fagociti ekspresuju receptore<br />
koji se zovu tipi I komplement receptori (engl. Complement Receptors I - CRI) koji prepoznaju<br />
produkte razgradnje C3. Veliki broj proteina plazme, ukljuujui manoze-vezujui lektin,<br />
fibronektin, fibrinogen, kolagen i C-reaktivni protein može da oblaže i da bude prepoznat od<br />
strane receptora na fagocitima.<br />
Toll-Like Receptori (TCRs) su homologi proteinu koji se zove Toll kod Drosofila i koji<br />
funkcioniše kao aktivator fagocita u odgovoru na razliite tipove i komponenete mikroba.<br />
Identifikovano je deset tipova sisasrskih TCRs i smatra se da je svaki tip odgovoran i<br />
neophodan da bi se adekvatno odgovorilo na razliite klase infektivnih patogena. Razliiti<br />
TCR imaju esenci-<br />
jalnu ulogu u e-<br />
ljskom odgovoru na<br />
razliite funkcio-<br />
nalne grupe kara-<br />
kteristineiskljui- vo <strong>za</strong> bakterije<br />
(LPS; bakterijski<br />
proteoglikani; ne-<br />
metilisani CpG nu-<br />
kleotidi).<br />
Slika 5.21. Sisarski Toll<br />
proteinu slini receptori<br />
(TCRs).<br />
A - Tipini TLR sadrži<br />
konzervisane ekstracelularne i<br />
citoplazmatske domene. Razliiti<br />
TLRs sadrže razliit broj i<br />
razliitu organi<strong>za</strong>ciju ekstracelularnih<br />
leucinima-bogatih i<br />
cisteinima-bogatih motiva. TIR -<br />
Toll/IL-1 receptor. B - Razliiti<br />
TLRs su ukljueni u odgovore na<br />
razliite mikrobijalne produkte.<br />
Neki od njih <strong>za</strong>htevaju heterodimeri<strong>za</strong>ciju<br />
sa drugim TLRs<br />
(npr. TLR 2 sa TLR 6). C -<br />
Signalni put preko TLR rezultira u<br />
generisanju NF-kB transkripcionog<br />
faktora. U ovaj signalni put<br />
može biti ukljuen i adapterni<br />
protein MyD88. TLRs su takoe<br />
ukljueni u aktivaciju AP-1.<br />
158
TCR receptori funkcionišu <strong>za</strong>jedno sa receptor-asociranim kina<strong>za</strong>ma, što konano dovodi do<br />
stimulacije produkcije mikrobicidnih supstanci i citokina od strane fagocita (Slika 5.20.).TCRs<br />
takodje mogu biti asocirani i sa drugim molekulima koji participiraju u direktnom prepoznavanju<br />
mikrobija-lnih produkata. Odgvor elije do-maina na LPS ilustruje mnoge funkcionalne<br />
konsekvence prepoznavanja produkata mikroba preko TLRs i asociranih proteina (Slika 5.21.).<br />
Receptori sa sedam-transmembranskih -heliksa ili receptori ve<strong>za</strong>ni sa G-proteinima<br />
(engl. G Proteins Coupled Receptors – GPCRs) se ekspresuju na leukocitima i prepoznaju<br />
mikorobe i neke medijatore koji se produkuju kao odgovor na infekciju, a funkcionišu uglavnom<br />
kao stimulatori migracije leukocita na mesto infekcije. Ovi receptori se nalaze na neutrofilima,<br />
makrofagima, a i nekim drugim tipovima leukocita, i prepoznaju široki spektar razliitih liganada.<br />
Receptori ove klase prepoznaju kratak peptid koji sadrži N-formilmetionil ostatke. S obzirom da<br />
svi bakterijski proteini, a samo neki sisarski (oni sintetisani u mitohondrijama), poinju sa N-<br />
formilmetioninom, ovaj receptor omoguava neutrofilima da odgovaraju na bakerijske proteine.<br />
Neutrofili i neki prostiji oblici makrofaga ekspresuju GPCR receptore <strong>za</strong> neke CXC hemokine (a<br />
posebno IL-8, videti prethodno poglavlje); proteolitike produkte sistema komplementa (C5, videti<br />
kasnije); razliite lipidne medijatore inflamacije (faktore aktivacije trombocita, prostaglandin E,<br />
leukotrijene i dr.). Vezivanja liganda (npr. mikrobijalni produkti, hemokini i dr.) <strong>za</strong> GPCR indukuje<br />
migraciju elija iz krvi kroz endotel i produkciju mikrobicidalnih supstanci aktivacijom produkcije<br />
velike koliine reaktivnih kiseoninih radikala (tzv. respiratorni prasak; engl. respiratory burst).<br />
Receptor inicira intraelijski odgovor preko aktivacije trimernih G proteina (proteini koji vezuju<br />
GTP). U neaktiviranom stanju, receptori su asocirani sa G proteinima u stabilnom inaktivnom<br />
kompleksu koji ima i GDT ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> G subjedinicu. Okupiranje receptora od strane liganda<br />
rezultira <strong>za</strong>menom GDP <strong>za</strong> GTP. Forma G-protein-GTP aktivira veliki broj elijskih enzima,<br />
ukljuujui izoformu fosfatidilinozitol-specifine fofolipaze C (PLC) ija je funkcija da poveava<br />
koncentraciju intracelularnog kalcijuma i da aktivira protein kinazu C (PKC). GPCR takodje<br />
stimuluišu promene u citoskeletu što rezultira poveanjem motiliteta elija.<br />
Fagocti ekspresuju receptore <strong>za</strong> citokine koji se produkuju u reakciji na mikrobe. Jedan<br />
od najvažnijih citokina ovakvog tipa i tzv. glavni citokin koji aktivira makrofage je IFN-. Kao<br />
što je naglašeno u prethodnom poglavlju, njega sekretuju NK elije tokom urodjenog imunog<br />
odgovora i antigenima-aktiviranih T elija tokom adaptivnog imunog odgovora.<br />
Fagocito<strong>za</strong> mikroorgani<strong>za</strong>ma<br />
159
Neutrofili i makrofagi uvlae ve<strong>za</strong>ne mikroorganizme u specijalne kompartmente gde se mikrobi<br />
Uništavanje fagocitovanih mikroorgani<strong>za</strong>ma<br />
uništavaju (Slika 5.22). Fagocito<strong>za</strong> je<br />
proces »gutanja« veih partikula (> 0.5<br />
mm dijametra) <strong>za</strong>vistan od citoskeleta.<br />
Fagociti koriste razliite površinske<br />
receptore <strong>za</strong> vezivanje mikroba. Akti-<br />
vacija receptora na elijskoj membrani,<br />
injicira poveanje motorne ativnosti<br />
elije što dovosti do brze ingestiji<br />
bakterija endocitozom. Prvo se od pla-<br />
zmaleme elije <strong>za</strong> koji je ve<strong>za</strong>n mikrob<br />
formira ašolika tvorevina oko ve<strong>za</strong>nog<br />
mikroba, a kada ona potpuno obavije<br />
mikrob i »<strong>za</strong>robi ga« formira se intra-<br />
elijska vezikula koja se naziva<br />
fagozom i koja ima ovojnicu kao<br />
plazmalema, a sadži ingestirani mikrob.<br />
Površinski receptor fagocita preko svog<br />
signalinga aktivira mehanizme <strong>za</strong><br />
uništavanje fagocitiranog mikroba.<br />
Paralelno sa uništavanjem mikroba,<br />
njegovi peptidi generisani razlaganjem<br />
mikrobijalnih proteina se prezentuju T<br />
limfocitima kako bi inicirali adaptivni<br />
imuni odgovor.<br />
Slika 5.22. Fagocito<strong>za</strong> i intracelularna destrukcija<br />
mikroorganizma.<br />
Mikrobi mogu da se vežu <strong>za</strong> razliite membranske receptore<br />
fagocita. Neki direktno vezuju mikrobe a drugi vrše opsoni<strong>za</strong>ciju<br />
mikroba (npr. Mac-1 integrin sa proteinima komplementa vrši<br />
opsoni<strong>za</strong>ciju mikroba; nije prika<strong>za</strong>no). Mikrobi se internalizuju u<br />
fagozome, koji se fuziraju sa lizozomima i nastaju fagolizozomi u<br />
kojima se mikrobi ubijaju reaktivnim kiseonikom i nitrogen<br />
intermedijatima. iNOS, inducibilna azot oksid sinta<strong>za</strong>; NO, azot<br />
oksid; ROIs, reaktivni kiseonini intermedijati.<br />
160
Aktivirani neutrofili i makrofagi ubijaju fagocitovane mirkoorganizme produkujui mikobicidne<br />
molekule u fagolizozome (Slika 5.22.). Nekoliko receptora koji prepoznaju mikrobe ukljuujui<br />
TLRs, GPCRs, Fc i C3 receptore, receptore <strong>za</strong> citokine (uglavnom IFN-) funkcionišu kooperativno<br />
u aktivaciji fagocita u smislu uništavanja mikroba. Fuzija primarne fagocitne vakuole (fagozoma)<br />
sa lizozomima resultira formiranjem fagolizozoma gde su koncentrisani svi mehanizmi <strong>za</strong><br />
uništavanje mikroorgani<strong>za</strong>ma. Aktivirani neutrofili i makrofagi konvertuju molekularni kiseonik<br />
u reaktivne kiseonine radikale (engl. Reactive Oxygen Species - ROSs) odnosno reaktivne<br />
kiseonine intermedijere (eng. Reactive Oxygen Intermediates – ROIs) koji su veoma reaktivne<br />
molekule sposobne da unište bilo koju eliju, pa i eliju mikroorganizma. Primarni sistem koji<br />
generiše slobodne radikale je sistem fagocitnih oksida<strong>za</strong> koji se nalazi na membrani fagolizozoma.<br />
Ovaj sistem enzima se indukuje i aktivira od strane velikog broja stimulusa ukljuujui IFN- kao<br />
i signale od TLRs, a funkcija mu je da redukuje molekularni kiseonik u reaktivne kiseonine<br />
radikale/intrmedijere kao što je super-oksid radikal (O2 -) koristei kao kofaktor redukovanu formu<br />
nikotinamid adenin dinukleotid fosfata (NADPH). Super-oksid se u reakciji dismutacije prevodi u<br />
vodonik peroksid uz katalitiko delovanje enzima katalaze. Vodonik preoksid koristi enzim<br />
mijeloperoksida<strong>za</strong> da konvertuje normalno nereaktivan halidni jon u veoma reaktivnu hipohalitnu<br />
kiselinu koja je toksina <strong>za</strong> bakterije. Pored reaktivnih kiseoninih radikala, makrofage produkuju<br />
i reaktivne azotne radikale, i to uglavnom azot-oksid (NO) koji može reagovati sa kiseoninim<br />
radikalima (hidroksilnim anjonom) i davati jos reaktivnije produkte (peroksinitril). Azot-oksid se<br />
dobija enzimatskim delovanjem azot-oksid sinta<strong>za</strong> (engl. Nitric Oxide Synthase – NOS). Jedna<br />
forma ovog enzima se indukuje (iNOS) vezivanjem LPS <strong>za</strong> odgovrajue receptore. iNOS je enzim<br />
koji nije prisutan u makrofagima koji nisu aktivirani, ali može biti indukovan kao odgovor na LPS<br />
stimulaciju i druge produkte mikroba koji aktiviraju TLRs, posebno u kobinaciji sa IFN-.<br />
Tabela 5.09. Sadržaj granula u polimorfonuklearnim leukocitima (granulocitima) oveka<br />
Tip elija Specifine granule Azurofilne granule<br />
Neutrofili alkalna fosfata<strong>za</strong><br />
kolagena<strong>za</strong><br />
laktoferin<br />
lizozim<br />
nekoliko nenezimskih<br />
antibakterijskih baznih proteina<br />
kisela fosfata<strong>za</strong><br />
-manozida<strong>za</strong><br />
arilsulfata<strong>za</strong><br />
-galaktozida<strong>za</strong><br />
-glukuronida<strong>za</strong><br />
katepsin<br />
5’-nukleotida<strong>za</strong><br />
elasta<strong>za</strong><br />
kolagena<strong>za</strong><br />
mijeloperoksida<strong>za</strong><br />
lizozim<br />
antibakterijski katjonski proteini<br />
161
Sve fagocitne elije funkcionišu na slian nain i koriste, u kombinacijama, tri modela<br />
intracelularnog uništavanja patogena:<br />
(1) Lizozomalne antibakterijske supstance ukljuujui veliki broj hemijskih medijatora sa<br />
širokim spektrom funkcija (lizozim-razlaže mukopeptide u zidu bakterijske elije; proteolitiki i<br />
hidrolitiki enzimi-digeriraju mikrobe; laktoferin-odzima gvoždje; katepsin-imaju ga samo<br />
makrofage-ošteuje elijsku membranu i uestvuje u prezentaciji antigena; i dr.) koje<br />
omoguavaju efikasno uništavanje patogena (Tabela 5.09.).<br />
2) O2-<strong>za</strong>visni/mijeloperoksida<strong>za</strong>-<strong>za</strong>visni mehanizmi ukljuuju procese halogenacije<br />
bakterijskih proteina koji su katalisani mijeloperoksidazom, ali i ueše H2O2 i drugih reaktivnih<br />
kiseoninih radikala (Tabela 5.10.).<br />
3) O2-<strong>za</strong>visni/mijeloperoksida<strong>za</strong>-ne<strong>za</strong>visni mehanizmi ukljuuju reaktivne kiseonine radikale<br />
(O2 -, OH-, H2O2 i dr.), ali bez ueša mijeloperoksidaze. Antioksidativni enzimi fagocita (katala<strong>za</strong> i<br />
glutation-S-transfera<strong>za</strong>) uklanjaju reaktivne kiseoine radikale kako ne bi oštetili njihovu elijsku<br />
membranu (Tabela 5.10.).<br />
Tabela 5.10. Medijatori antimikrobijalne i citotoksine aktivnosti neutrofila i makrofaga<br />
O2 – ZAVISNO uništavanje O2 – NE ZAVISNO uništavanje<br />
Reaktivni kiseonini radikali (posrednici)<br />
O2 - (superoksidni anjon)<br />
OH - (hidroksil radikal)<br />
H2O2 (vodonik peroksid)<br />
ClO - (hipohloritni anjoni)<br />
Defenzini<br />
TNF (samo u makrofagama)<br />
Reaktivni azotni radikali (posrednici)<br />
Lizozim<br />
NO (azot oksid)<br />
NO2 (azot dioksid)<br />
HNO3 (azotna kiselina)<br />
Ostali<br />
NH4Cl (monohloramin) Hidrolitiki enzimi<br />
Kao što je ranije objašnjeno, proces dijapedeze se ostvaruje tako što se fagociti privueni<br />
selektinima sa površine endotelijalnih elija vrsto vezuju <strong>za</strong> fagocita-adhezioni molekul (pripada<br />
familiji integrinskih receptora) i provlae se kroz zid kapilara izmeu endotelnih elija. Ova<br />
sposobnost im omoguava da brže stignu do mesta gde se, kao rezultat invazije bakterija, razvija<br />
inflamatorna reakcija. Put fagocita od izlaska iz cirkulacije do inficiranog mesta obezbedjuje<br />
hemotaksini koncentracijski grandijent koga stvaraju bakterijski produkti, ali i produkti koje<br />
elije organizma domaina izbacuju kao odgovor na infekciju. I ne samo to, nego postoji<br />
interakcija izmedju bakterijskih produkata, faktora iz plazme, kao i onih sekretovanih iz okolnih<br />
elija. Ti hemotaksini agensi su brojni i ukljuuju hemokine, neke komponente sistema<br />
162
komplementa, leukotrijene, polipeptide poreklom iz limfocita, mastocita, bazofila, ali i mnoge<br />
druge. Sve te molekule u razliitim kombinacijama omoguuju uslove <strong>za</strong> što efikasniju fagocitozu<br />
bakterije. Kako je ranije napomenuto, jedan od naina je opsoni<strong>za</strong>cija (oblaganje, okruživanje)<br />
imunoglobulinima (Ig), a naroito IgG, kao i proteinima sistema komplementa (C3b). IgG se kao<br />
opsonin vezuje <strong>za</strong> bakterijsku eliju svojim Fab regionom, dok je Fc fragment slobodan i<br />
“primamljiv” <strong>za</strong> fagocite koji e se preko svog receptora <strong>za</strong> Fc (ranije pomenuti Fc) ve<strong>za</strong>ti <strong>za</strong> tako<br />
okruženu bakterijsku eliju i fagocitirati je. Dobar opsonin je i C3b protein sistema komplementa<br />
koji se nespecifino vezuje <strong>za</strong> strane organizme, a koga takodje “prepoznaju” fagocite preko svog<br />
receptora. Na taj nain, antitela (IgG) i C3b “markiraju” mikroorgani<strong>za</strong>m <strong>za</strong> fagocitozu i<br />
destrukciju. Aktivacija receptora na elijskoj membrani neutrofila, preko G-proteinom<br />
posredovanog odgovora, injicira TCRs i drugih receptora, poveanje motorne aktivnosti elije,<br />
egzocitozu aktivnih materija i naglo poveanje preuzimanja kiseonika i produkcije<br />
reaktivnih kiseoninih radikala tzv. “respiratornu eksploziju” (engl. respiratory burst).<br />
Poveanje motorne aktivnosti e dovesti do brze ingestije bakterija endocitozom (fagocito<strong>za</strong>). Prvo<br />
se formira primarna fagocitna vakuola-fagozom koja ima membranu koja potie od plazmaleme<br />
neutrofila. Potom dolazi do fuzije lizozoma sa fagozomom i degranulacije neutrofilnih granula koje<br />
su bogate enzimima. Pomou protonske pumpe u membrani fagozoma pH te vakuole se spusti do<br />
oko 5.0, što je optimalan pH <strong>za</strong> maksimalnu aktivnost lizozomalnih enzima. Potom dolazi do<br />
degranulacije azurofilnih granula, te enzimi koji se otpuštaju omogue digestiju fagocitovanog<br />
mikroorganizma. Pored specifinih enzima, granule sadrže i antimikrobijalne proteine tzv.<br />
defenzine. Kod sisara su identifikovana dva tipa defenzina, i , dok su drugi tipovi pronaeni<br />
kod beskimenjaka i biljaka. Dodatno se aktivira i membranski ve<strong>za</strong>n enzim NADPH oksida<strong>za</strong> i<br />
dolazi do produkcije toksinih kiseoninih metabolita. Kombinacija toksinih kiseoninih<br />
metabolita, toksinih reaktivnih azotnih radikala i proteolitikih enzima poreklom iz granula ini<br />
fagocite veoma efektivnim pri uništavanju bakterija. U toku fagocitoze se naglo poveava potrošnja<br />
kiseonika zbog aktivacije Ovo je uzrokovano aktivacijom NADPH oksidaze; asocirana je sa<br />
poveanim preuzimanjem i potrošnjom kiseonika u fagocitima (respiratorna eksplozija), što<br />
dovodi do stvaranja vema reaktivnih kiseoninih radikala. Gubitkom jednog elektrona od O2<br />
nastaje superoksidni anjon (O2 -). O2- je slobodni radikal kiseonika koji nastaje adicijom jednog<br />
elektrona molekulskom kiseoniku i koji je kratkog veka, ali veoma reaktivan. 2O2- reaguju sa<br />
2H+ i nastaje vodonik peroksid (H2O2) u reakciji koju katališe citoplazmatska forma superoksid<br />
dismutaze (SOD-1):<br />
NADPH + H+ + 2O2 NADP+ + 2H+ + 2O2 - O2- + O2- + H+ + H+ H2O2 + O2<br />
SOD-1<br />
163
O2- i H2O2 su jaki oksidanti i efektivni baktericidni agensi. H2O2 se konvertuje u H2O i O2 uz<br />
ueše enzima katalaze. Citoplazmatska forma superoksid dismutaze (SOD-1) je identifikovana u<br />
mnogim elijama. Mutacija gena <strong>za</strong> ovaj enzim dovodi do nasledne forme amiotrofine lateralne<br />
skleroze, jer se verovatno O2- akumulira u motoneuronima i uništava ih. Pored navedenih enzima,<br />
fagociti poseduju i enzim mijeloperoksidazu, koja katališe konverziju Cl-, Br-, I- i SCN- u<br />
odgovarajue kiseline (HOCl, HOBr, itd.), koje su takoe potentni oksidanti. O2- i H2O2 , sa<br />
mijeloperoksidazom ili bez nje, uz sadejstvo halidnih anjona stvaraju snažan citotoksini sistem.<br />
Osim mijeloperoksidaze i defenzina, granule fagocita sadrže i elastazu, dve<br />
metaloproteinaze koje razlažu kolagen, kao i druge razliite proteaze koje potpomažu<br />
uništavanje invazivnih organi<strong>za</strong>ma. Pored toga, lizozim deluje specifino cepanjem veze unutar<br />
peptidoglikana koji je sastavni deo elijskog zida nekih gram-pozitivnih bakterija, što dovodi do<br />
smrti tih bakterija. Još jedan uzronik odumiranja bakterija je i lakotoferin koji u velikim<br />
koliinama vezuje <strong>za</strong> sebe gvoždje i time ga uskrauje bakterijama koje ga koriste u ishrani. Kiseli<br />
sadržaj fagozoma može sam po sebi da prouzrokuje injiciranje apoptoze i smrt mikroorgani<strong>za</strong>ma.<br />
Kombinacija navedenih mehani<strong>za</strong>ma, <strong>za</strong>jedno sa O2- , H2O2 i HOCl, koji nastaju dejstvom NADPH<br />
oksidaze i mijeloperoksidaze, formiraju “smrtonosnu zonu” oko aktiviranih fagocita i tako<br />
uništavaju štetne agense, koji se potom digeriraju putem lizozomalnih enzima.<br />
Iako je navedena zona efektivna u uništavanju invazivnih organi<strong>za</strong>ma, u nekim patološkim<br />
stanjima (npr. reumatoidni artritis), fagociti mogu takoe prouzrokovati lokalnu destrukciju<br />
sopstvenog tkiva. Izumrli neutrofili, bakterije i nepotpuno digerirana materija stvaraju viskoznu,<br />
obino žukastu, tenu masu – gnoj <strong>za</strong> koju se kaže da je groblje neutrofila.<br />
Kada su neutrofili i makrofagi izuzetno snažno aktivirani mogu oštetiti i normalno tkivo organizma<br />
otpuštanjem reaktivnih kiseoninih radikala, azot oksida i/ili lizozomalnim enzimima.<br />
Druge efektorne funkcije aktiviranih makrofaga<br />
Pored uništavanja fagocitiranih mikroorgani<strong>za</strong>ma, aktivirani makrofagi imaju i veliki broj drugih<br />
funkcija, ukljuujui aktivaciju inflamatornih medijatora, kao i stimulaciju remodeliranja tkiva<br />
nakon infekcije u zoni ozlede (Slika 5.23.). Veliki broj ovih funkcija je posredovan citokinima koje<br />
sekretuju aktivirani makrofagi, a koji posreduju u urodjenom imunom odgovoru (Tabela 5.11.).<br />
Pored toga, aktivirani makrofagi produkuju faktore rasta koji deluju na endotelijalne elije i<br />
fibroblaste koji uestvuju u remodeliranju tkiva nakon infekcije i povrede.<br />
164
Tabela 5.11. Funkcije nekih hemijski medijatori koje sekretuju aktivirani makrofagi<br />
HEMIJSKI MEDIJATOR FUNKCIJA<br />
Interleukin-1 (IL-1) Stimuliše inflamatorni odgovor i groznicu<br />
Interleukin-6 (IL-6)<br />
TNF<br />
Stimulišu adaptivni imuni odgovor i eliminaciju<br />
patogena<br />
Proteini sistema komplementa Stimulišu inflamatorni odgovor i eliminaciju patogena<br />
Hidrolitiki enzimi Stimulišu infalmatorni odgovor<br />
Interferon- (IFN-) Stimulišu sintezu antiviralnih proteina u elijama<br />
TNF Uništavaju tumorske elije<br />
GM-CSF; G-CSF; M-CSF Stimulišu indukovanu hematopoezu<br />
Slika 5.23. Efektorne<br />
funkcije makrofaga.<br />
Makrofagi se aktiviraju<br />
mikrobialnim produktima<br />
kao što su lipopolisaharidi<br />
(LPS) i IFN- kog<br />
produkuju NK elije.<br />
Proces aktivacije makrofaga<br />
vodi aktivaciji transkripcionih<br />
faktora, transkripciji<br />
razliitih gena i<br />
sintezi proteina koji posreduju<br />
u funkcionisanju tih<br />
elija. U adptivnom elijskom<br />
imunitetu, makrofagi<br />
se aktiviraju stimulusima od<br />
T limfocita (CD40 ligand i<br />
IFN-) i odgovaraju u<br />
osnovi na isti nain.<br />
165
5.2.2.3. Urodjeno-ubilake elije - elije prirodne ubice - NK (engl. »Natural Killer«) elije<br />
NK elije su podgrupa limfocita koja ubija inficirane elije i elije koje su izgubile sposobnost<br />
ekspresije klase I MHC molekula, a istovremeno i sekretuju citokine i to uglavnom IFN-Osnovna<br />
fiziološka uloga ovih elija je odbrana od infekcija nastalih virusima i nekih drugij intracelularnih<br />
mikroba. Termin urodjeno-ubilake elije je nastao zbog injenice da ako se ove elije izoluju iz<br />
krvi ili slezine imaju sposobnost da uništavaju ciljne elije bez iakakve potrebe <strong>za</strong> dodatnom<br />
aktivacijom (suprotno ovome CD8 + T limfociti moraju biti aktivirani pre nego što se diferenciraju u<br />
citolitike T limfocite sa sposobnošu da unište targetni antigen).<br />
NK elije su derivati pluripotentne progenitorne stem elije kosne srži i ine 5% do 20% od<br />
ukupnih mononuklearnih elija u krvi i slezini, a veoma retko se nalaze u drugim limfoidnim<br />
organima. U perifernoj cirkulaciji oveka ine oko 15% od ukupnog broja limfocita a od T i B elija<br />
se razlikuju, izmedju ostalog, i po tome što ne poseduju iste receptore <strong>za</strong> antigene tj. TCR i BCR.<br />
Od površinskih markera obeležava ih prvenstveno prisustvo CD16 markera (receptor <strong>za</strong> Fc<br />
fragment IgM – FcgRIII) i CD56 markera (adhezijski molekul). Vei broj NK elija se i morfološki<br />
razlikuje od T i B limfocita po sledeim osobinama: vei su; imaju srazmerno više citoplazme;<br />
jedro nije okruglo nego je na jednom delu spljošteno; u citoplazmi postoje azurofilne granule<br />
(stoga se ove elije još nazivaju i velikim granuliranim limfocitima). Neki autori smatraju da oni i<br />
nisu pravi limfociti, nego posebna populacija elija koja se s obzirom na svoj razvoj nalazi izmedju<br />
limfocita i monocita. Osnovna fiziološka funkcija NK elija je delovanje protiv virusom <strong>za</strong>raženih ili<br />
maligno-transformisanih elija.<br />
Prepoznavanje inficirane elije od strane NK elija.<br />
Aktivacija NK elija je regulisana balansom izmedju signala koji se generišu od aktiviranih receptora i<br />
inhibiranih receptora (Slika 5.24.). Postoji nekoliko familija ovih receptora, a oni se sastoje od<br />
ligand-vezujueg lanca i lanca <strong>za</strong> signaling (signaling-lanca). Ligandi koji aktiviraju receptore<br />
ukljuuju molekule koji su ekpresovani na površini inficiranih, ili na drugi nain stresiranih elija<br />
organizma domaina, promovišu aktiviranje NK elija. Inhibitorni receptori NK elija vezuju<br />
sopstvene molekule MHC I kompleksa koji su ekpresovani na veini normalnih elija. Kada su<br />
inhibitorni receptori ve<strong>za</strong>ni, NK elija nije aktivirana i ovo je mehani<strong>za</strong>m koji je prevencija <strong>za</strong><br />
uništavanje normalnih elija domaina. Infekcija elija domaina mikrobima, a posebno virusima,<br />
veoma esto prouzrokuje inhibiciju ekspresije klase I MHC molekula, a time su liganadi <strong>za</strong><br />
inhibitorne receptore nedostupni, što kao rezultat ima »oslobadjanje« NK elija iz njihovog<br />
normalnog inhibisanog/inaktivnog stanja. Istovremeno, ligandi <strong>za</strong> aktivirajue receptore su<br />
ekspresovani, te postoji mogunost da se uništi inficirana elija, što se i realizuje. Karakteristina<br />
i <strong>za</strong>jednika osobina aktivirajuih receptora NK elija je prisustvo signaling molekule sa imuno-<br />
166
eceptornim aktivacionim motivima koji u osnovi imaju tirozin (engl. Imuno-receptor Tyrosine-<br />
based Activation Motif - ITAMs) i smešteni su u citoplazmatskom repu receptora, kao u sluaju<br />
signalnih komponenti antigenih receptora T i B limfocita. Zbog toga nije <strong>za</strong>udjujue što i signalni<br />
putevi ve<strong>za</strong>ni <strong>za</strong> aktivirajue receptore NK elija ukljuuju regrutaciju tirozin kinaze i adapternih<br />
proteina, a potom aktivaciju genske<br />
ekspresije i reorgani<strong>za</strong>ciju cito-<br />
skeleta, slino dogadjajima u T i B<br />
limfocitima tokom prepoznavnja<br />
antigena. Zajednika osobina inhi-<br />
birajuih receptora NK elija je<br />
prisustvo signaling molekule sa<br />
imuno-receptornim inhibicionim<br />
motivima koji u osnovi imaju tirozin<br />
(engl. Imuno-receptor Tyrosine-<br />
based Inhybiory Motif - ITIMs) na<br />
citoplazmatskom repu receptora.<br />
Vezivanjem liganda <strong>za</strong> receptore ovi<br />
ITIMs postaju fosforilisani na<br />
tirozinskim ostacima i vezuju tirozin<br />
fosfataze, kao što je SHP-1, koje<br />
potom defosforilišu signalne mo-<br />
lekule koje posreduju u aktiva-<br />
cionom putu.<br />
Slika 5.24. Aktivirajui i inhibirajui receptori NK<br />
elija.<br />
A - Aktivirajui receptori NK elija prepoznaju ligande<br />
target elija i aktiviraju protein tirozin kinazu (PTK), ija<br />
je aktivnost inhibisana preko inhibitornog receptora koji<br />
prepoznaje klasu I MHC molekula i aktivira protein<br />
tirozin fosfatazu (PTP). Kao rezultat, NK elije nisu<br />
efikasne u uništavanju ciljnih elija koje ekspresuju<br />
klasu I MHC molekula.<br />
B - Ako virusna infekcija inhibira ekspresiju klase I MHC<br />
molekula kod inficiranih elija, inhibrajui receptori NK elija<br />
nisu ve<strong>za</strong>ni i aktivirajui receptor funkcioniše ne ometeno i<br />
inicira odgovore NK elija, kao što su citoli<strong>za</strong> i sekrecija<br />
citokina.<br />
NK elije prepoznaju antitelima-obložene targetne molekule preko receptora FcRIIIa<br />
(CD16) koji je receptor slabog afiniteta <strong>za</strong> Fc segment IgG i IgG3 antitela. Kao rezultat ovih<br />
167
prepoznavanja NK elije ubijaju ciljnu eliju koja je obložena molekulima antitela. Ovaj proces se<br />
naziva od antitela-<strong>za</strong>visna elijama-posredovana citotoksinost i bie objašnjena u poglavlju o<br />
efektornim mehanizmima humoralnog adaptivnog imunog odgovora. Ekspanzija i aktivnost NK<br />
elija su stimulisane citokinima, i to uglavnom IL-15 i IL-12.<br />
Efektorne funkcije NK elija<br />
Efektorne funkcije NK elija su uništavanje inficiranih elija i aktivacija makrofaga u cilju uništavanja<br />
fagocitovanog mikroorganizma (Slika 5.25.).<br />
Mehani<strong>za</strong>m NK elijama posredovane citolize je u<br />
osnovi isti kao i citoli<strong>za</strong> posredovana citolitinim<br />
T limfocitima (engl. Cytolytic T Lymphocytes –<br />
CTLs) što e detaljnije biti opisano u narednom<br />
poglavlju. NK elije imaju granule koje sadrže<br />
proteine koji se nazivaju perforini koji formiraju<br />
pore u membrani ciljne elije, kao i enzime koji<br />
se zovu granizimi i koji ulaze kroz membranu<br />
ciljne elije i indukuju apoptozu ciljne elije.<br />
Uništavajui virusima ili intracelularnim<br />
bakterijama inficiranu eliju NK elije eliminišu<br />
rezervoar infekcije.<br />
Slika 5.25. Funkcije NK elija.<br />
A - NK elije ubijaju inficirane elije, te stoga eliminišu širenje infekcije.<br />
B – NK elije odgovaraju na IL-12 kog produkuju makrofagi, i sekretuju IFN-, koji<br />
aktivira makrofage da ubiju fagocitirane mikrobe.<br />
Neki tumori, posebno oni poreklom od hematopoetinog tkiva su takodje targeti <strong>za</strong> NK elije,<br />
verovatno zbog toga što tumorske elije ne ekspresuju MHC molekule klase I. S obzirom da su NK<br />
elije sposobne da eliminišu neke tumorske elije postoje predpostavke da NK elije imaju ulogu u<br />
organizmu u smislu ubijanja malignih klonova elija in vivo.<br />
Pored pomenutih NK elija, postoje dve populacije elija koje su im sline, ali još uvek<br />
nedovoljno precizno definisane funkcije. Limfokinima aktivirane elije ubice (engl.<br />
Lymphokines Activated Killer cells - LAK cells) su po osobinama sline NK elijama i na slian<br />
nain i funkcionišu. Poka<strong>za</strong>no je da su LAK elije efikasnije od NK elija te da mogu da unište i<br />
maligno transformisane, ali i transformisane ne maligne elije. Populacija K elija (engl. Killer)<br />
nije potpuno morfološki opisana. Poka<strong>za</strong>no je da se K elije <strong>za</strong>kae <strong>za</strong> ciljnu eliju koja je<br />
168
okružena IgG antitelima preko receptora <strong>za</strong> Fc fragment IgG i mogu da liziraju opsonizovanu<br />
eliju. S obzirom da imaju receptore <strong>za</strong> Fc makrofage mogu da funkcionišu kao K elije i tako<br />
aktivirane mogu da ubiju malignu eliju bez ukljuivanja u taj proces antitela.<br />
5.2.2.4. Sistem komplementa<br />
Sistem komplementa ini nekoliko plazma proteina koji se aktiviraju mikoorganizmima i promovišu<br />
destrukciju mikorba i inflamaciju. Sistem komplementa ini grupa od oko 25 proteina cirkulišuih<br />
proteina (ine 10% globulinske komponenete seruma) oznaenih od C1 do C9 (sa podgrupama<br />
obeleženim malim slovima abecede) i faktorima B, D i P (properdin). Ovi proteini mogu biti<br />
produkovani u razliitim tkivima/elijama, ukljuujui hepatocite, makrofage i epitelijalne elije<br />
GIST-a. Svi se nalaze u serumu u<br />
neaktivnoj formi, odnosno, u odsustvu<br />
infekcije cirkulišu u krvi u inaktivnom<br />
stanju. Oni postaju aktivni u reakciji<br />
kaskade komplementa u kojoj<br />
aktivirana komponenta u seriji aktivira<br />
narednu u nizu. Aktivacija i<strong>za</strong>ziva<br />
kaskadnu reakciju koja vodi ka aktivaciji<br />
C5 konvertaze (C5b koja je esencijalna<br />
<strong>za</strong> lizu membrane li<strong>za</strong> patogena).<br />
Nedostatak jedne komponente u<br />
kaskadnoj reakciji vodi ka terminaciji<br />
reakcije. Reorgani<strong>za</strong>cija i destrukcija<br />
mikoba se ostvaruje preko tri puta<br />
aktivacije komplementa: alternativnim,<br />
klasinim i lektinskim (Slika 5.26.).<br />
Slika 5.26. Aktivacija kaskadne reakcije sistema<br />
komplementa<br />
Aktivacija sistema komplementa može biti inicirana razliitim<br />
putevima, ali svi oni vode ka produkciji C3b proteina (rana fa<strong>za</strong>). C3b<br />
inicira kasnije faze u aktivaciji komplementa, a kulminacija je<br />
produkcija peptida koji stimulišu inflamaciju (C5a) i polimeri<strong>za</strong>cija C9<br />
koja formira kompleks koji napada membranu (engl. membrane<br />
attack complex), a tako se zove jer pravi rupe u plazma membrani.<br />
Osnovne funkcije glavnih proteina u sistemu komplementa su date<br />
na slici. Aktivacija, funkcija i regulacija sistema komplementa je<br />
objašnjena sa više detalja u poglavju o efektornim reakcijama<br />
humoralnog imunog odgovora.<br />
169
Prepoznavanje mikroba od strane komplementa se odvija na tri naina: Aktivacija sistema<br />
komplementa se ostvaruje preko dva puta:<br />
(1) alternativni tj. tzv. “properdinski” put je filogenetski najstariji i aktivira se direktnim<br />
prepoznavanjem odredjenih struktura na površini membrane mikroba i komponeneta je urodjenog<br />
imunog odgovora. Ovaj put aktivacije komplementa se injicira preko faktora B, D, P i dr, koji<br />
prouzrokuju “spontanu” aktivaciju C3 proteina u sistemu komplementa, odnosno aktivaciju C3<br />
bez uticaja predhodno aktiviranih elemenata sistema komplementa (C1 i C2). Ova reakcija<br />
aktivacije kaskade komplementa preko C3 predstavlja komponenetu reakcija efektornih<br />
mehani<strong>za</strong>ma prirodnog imunog odgovora. Uobiajeno je da se spontano aktivirani C3 brzo<br />
inaktiviše proteinima na površini tela elije. Medjutim, ponekada se aktivirani C3 kombinuje sa<br />
stranim supstancama, kao što su delovi bakterijske elije ili virusa, pa može postati stabilan i<br />
prouzrokovati aktivaciju kaskade komplementa.<br />
(2) klasian put (tako je imenovan jer je prvi otkriven) se injicira kompleksom antigen-antitelo,<br />
odnosno vezivanjem dela molekule antitela koji se naziva Fc fragment <strong>za</strong> C1 protein sistema<br />
komplementa. Ovaj put koristi plazma protein C1 u detekciji IgM, IgG1 ili IgG3 antitela ve<strong>za</strong>nih <strong>za</strong><br />
površinu mikroba ili drugih struktura. Reakcija aktivacije kaskade komplementa preko C1<br />
proteina predstavlja komponenetu reakcija efektornih mehani<strong>za</strong>ma adaptivnog imunog<br />
odgovora.<br />
(3) lektinski put se aktivira plazma proteinom koji se zove manoze-vezujui lektin (engl.<br />
Mannose-Binding Lectin – MBL) i koji prepoznaje ostatke manoze u glikoproteinima i glikolipidima<br />
mikroorgani<strong>za</strong>ma. MBL ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> microbe aktivira (u odsustvu antitela) jedan od proteina<br />
klasinog puta aktivacije komplemetna, preko stimulacije asociranih serin protea<strong>za</strong>.<br />
Prepoznavanje mikroba bilo kojim od ovih puteva inicira seriju kaskadnih reakcija,<br />
kaskadnu regrutaciju/aktivaciju drugih komponeneti sistema, te pridruživanje aktiviranih<br />
proteina lanova komplementa proteaznim kompleksima. Centralni protein sistema<br />
komplementa je C3 koji se cepa, a njegov vei, C3b fragment se “smešta” na površinu mikroba<br />
gde se komplement aktivira. C3b se kovalentno vezuje <strong>za</strong> funkcionalne grupe na površini<br />
mikroba i, kao što je ranije navedeno, ima funkciju opsonina u promociji fagocitoze mikroba.<br />
Manji fragment C3, C3a se otpušta i stimuliše inflamaciju delujui kao hemoatraktant <strong>za</strong><br />
neutrofile. C3b vezuje druge proteine komplementa da bi se formirala protea<strong>za</strong> koja cepa protein<br />
C5 i generiše manji fragment C5a koji se otpušta i vei fragment C5b koji ostaje ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong><br />
membranu elije mikroba. C5a stimuliše influks neutrofila na mesto infekcije, kao i vaskularne<br />
komponenete inflamacije. C5b inicira formiranje kompleksa proteina C6, C7, C8 i C9 sistema<br />
komplementa u formi pore na membrani mikroba, a to rezultira lizom elije na kojoj je<br />
170
komplement aktiviran. Sisarske elije ekspresuju nekoliko regulatornih proteina koji blokiraju<br />
aktivaciju komplementa, te time preveniraju ošteenje elija domaina.<br />
Aktivirani proteini sistema komplementa obezbedjuju <strong>za</strong>štitu na nekoliko naina: neki<br />
elementi sistema se mogu ve<strong>za</strong>ti <strong>za</strong> membranu bakterijske elije i<strong>za</strong>zivajui lizu elije; neki se<br />
vezuju <strong>za</strong> površinu bakterijske elije i omoguavaju i olakšavaju fagocitozu, a uz to i stimulišu<br />
makrofage da fagocitiraju bakterijsku eliju; vrše opsoni<strong>za</strong>ciju mikroorgani<strong>za</strong>ma; uestvuju u<br />
hemotaksiji elija imunog sistema do mesta infekcije; podstiu inflamatorne reakcije i sl.<br />
Važno je još jednom naglasiti da se kaskadna reakcija sistema komplementa može aktivirati i kao<br />
efektorni mehani<strong>za</strong>m prirodnog, kao i u efektorni mehani<strong>za</strong>m steenog imunog odgovora. Sistem<br />
komplementa e biti opisan sa više detalja u poglavlju o efektornim mehanizmima humoralnog<br />
imunog odgovora.<br />
5.2.2.5. Drugi cirkulišui proteini urodjenog imuniteta<br />
Mnogi proteini plazme, pored lanova sistema komplementa, su ukljueni u urodjenom imunom<br />
odgovoru na mikrobe (Tabele 5.08. i 5.12). Mnogi hemijski medijatori koji uestvuju u<br />
urodjenom (prirodnom) imunom odgovoru su i “pomagai” u steenom (adaptivnom) imunom<br />
odgovoru. Hemijski medijatori su molekule koje su ukljuene u razvoju imunog odgovora (Tabela<br />
5.12.).<br />
Tabela 5.12. Hemijski medijatori koji uestvuju u urodjenom (a i stenom) imunom odgovoru i njihova funkcija<br />
Jedinjenje Opis Jedinjenje Opis<br />
Hemijske materije<br />
na površini i u<br />
telesnim<br />
šupljinama<br />
Histamin<br />
Kinini<br />
Lizozim (u su<strong>za</strong>ma, pljuvaki, sekretu nosne duplje i znoju)<br />
prouzrokuje lizu razliitih elija; kiseli sekreti (sebum kožnih<br />
žlezda i hlorovodonina kiselina želuca) ubijaju<br />
mikroorganizme i spreavaju njihov rast; mukus na mukoznim<br />
membranama veže mikroorganizme pre njihovog uništavanja<br />
Amin koga oslobaaju mastociti, bazofilni granulociti i<br />
trombociti; i<strong>za</strong>ziva vazodilataciju, poveava propustljivost<br />
krvnih sudova, stimuliše sekreciju žlezda (naroito produkciju<br />
mukusa i su<strong>za</strong>), i<strong>za</strong>ziva kontrakcije glatke muskulature<br />
bronhiola u pluima, privlai eozinofilne granulocite<br />
Komplement<br />
Prostaglandini<br />
Polipeptidi koji nastaju od proteina plazme; i<strong>za</strong>zivaju<br />
vazodilataciju, poveavaju propustljivost krvnih sudova,<br />
stimulišu receptore <strong>za</strong> bol, privlae neutrofilne granulocite Leukotrijeni<br />
Interferoni Proteini, produkuju ih mastocite i druge elije, a uestvuju u<br />
viralnim infekcijam<br />
Grupa proteina plazme; poveavaju propustljivost<br />
krvnih sudova, stimulišu oslobaanje histamina,<br />
aktiviraju kinine, lizu elija, pospešuju fagocitozu,<br />
privlae neutrofilne i eozinofilne granulocite,<br />
monocite i makrofage<br />
Grupa lipida (PGEs, PGFs, tromboksani i<br />
prostaciklini); produkuju ih mastociti; i<strong>za</strong>zivaju<br />
relaksaciju glatke muskulature i vazodilataciju,<br />
poveavaju propustljivost krvnih sudova, stimulišu<br />
receptore <strong>za</strong> bol<br />
Grupa lipida, prvenstveno ih produkuju mastociti i<br />
bazofilni granulociti; produžuju trajanje kontrakcije<br />
glatke muskulature (naroito u bronhiolama<br />
plua), poveavaju propustljivost krvnih sudova,<br />
privlae neutrofilne i eozinofilne granulocite<br />
Pirogeni Oslobaaju ih neutrofilni granulociti, monociti i<br />
druge elije; stimulišu nastajanje groznice<br />
171
Neki hemijski medijatori (npr. lizozim, sebum i mukus), se nalaze na površini elije i uništavaju<br />
štetni agens ili onemoguavaju njegov ula<strong>za</strong>k u eliju, dok drugi (npr. histamin, prostaglandini,<br />
leukotrijeni, heparin, pirogeni itd), promovišu inflamaciju preko vazodilatornog efekta,<br />
poveanja vaskularne permeabilnosti, privlaenja leukocita, stimulacije fagocitoze i sl.<br />
Manoze-vezujui lektin (MBL), koji je pominjan ranije je plazma protein koji funkcioniše<br />
kao opsonin. Pripada familiji kolektina (engl. collectin), tako nazvanoj zbog toga što proteini ove<br />
familije imaju kolagenu-slian domen odvojen »vratnim« regionom od kalcijum-<strong>za</strong>visnog (C-tip)<br />
lektinskog (tj. ugljenih hidrata vezujueg) domena. Cirkulišui MBL (MBL plazme), kao i manozni<br />
receptor makrofaga, vezuje ugljene hidrate sa terminalnim manoznim i fruktoznim ostacima, koji<br />
su tipini <strong>za</strong> glikoproteine i glikolipide membrana na površini elija mikroorgani<strong>za</strong>ma. Prema<br />
tome, MBL je solubilni receptor koji prepoznaje molekularne obrazce (engl. soluble pattern<br />
recoginition receptor) koji se vezuje <strong>za</strong> mikrobijalne, ali ne i sisarske elije. MBL je heksamer koji<br />
je strukturalno slian komponenti C1q sistema komplementa. MBL se vezuje <strong>za</strong> receptore na<br />
površini makrofaga koji se zovu C1q receptori (vezuju C1q komponentu sistema komplementa).<br />
Ovaj receptor posreduje u fagocitozi bakterija opsonizovanih mano<strong>za</strong>-vezujuim lektinom. Pored<br />
toga, MBL može aktivirati sistem komplementa.<br />
C-reaktivni protein je plazma protein identifikovan i nazvan zbog svoje sposobnosti da se<br />
vezuje <strong>za</strong> kapsulu pneumokoknih baterija. Pripada pentraksinskoj familiji plazma proteina,<br />
tako nazvanoj jer sadrže pet identinih globularnih subjedinica. Tipino <strong>za</strong> C-reaktivni protein je<br />
da se veže <strong>za</strong> bakterijske fosfolipide, kao što je fosforilholin. Funkcioniše i kao opsonin-vezujui<br />
C1q i interagujui sa C1q receptorom na fagocitima ili vezujui se direktno <strong>za</strong> Fc receptore. Pored<br />
toga, C-reaktivni protein može doprinositi aktivaciji sistema komplementa preko vezivanja <strong>za</strong> C1q,<br />
te aktivacije klasinog puta. C-reaktivni protein se još naziva i akutne-faze reaktant zbog toga što<br />
je njegov nivo u plazmi povean tokom aktune faze mnogih infekcija.<br />
Faktori koagulacije su plazma proteini ija je osnovna funkcija da spree hemoragiju<br />
(iskrvavljenje) formiranjem koaguluma/tromba (krvnog ugruška) kada je integritet krvnih sudova<br />
narušen. Proteaze, kao što je trombin, koje se generišu u kaskadnim reakcijama koagulacije krvi i<br />
formiranja koaguluma, iniciraju inflamatornu reakciju. Pored cirkulišuih proteina, proteini<br />
surfaktanta plua, koji takodje pripadaju familiji kolektina, štite vazdušne puteve od infekcije.<br />
5.2.2.6. Citokini<br />
Citokini urodjene imunosti regrutuju i aktiviraju leukocite, ali i stimulišu sistemske promene,<br />
ukljuujui poveanu sintezu efektornih elija i proteina koji potenciraju antimikrobijalni odgovor. U<br />
urodjenom imunom odgovoru, glavni izvor citokina su makrofagi, neutrofili i NK elije, ali i elije<br />
172
epitela, kao što su keratinociti koje produkuju mnoge takve iste proteine. Kao i u adaptivnom<br />
imunom odgovoru, citokini imaju ulogu u medjusobnoj komunikaciji inflamatornih elija, kao i u<br />
komunikaciji izmedju inflamatornih elija i elija tkiva koje odgovaraju na infekciju, kao što su<br />
elije vaskularnog endotelijuma. Citokini urodjenog imuniteta su opisani u prethodnom poglavlju<br />
i ukljuuju citokine koji kontrolišu viralne infekcije, i to uglavnom IFN- i IFN-; citokine koji<br />
posreduju u inflamaciji, najviše TNF, IL-1 i hemokini; citokini koji stimulišu proliferaciju i<br />
aktivaciju NK elija, uglavnom IL-15 i IL-12; citokine koji aktivraju makrofage, a posebno NK<br />
elijama produkovani<br />
IFN-; kao i citokini koji<br />
imaju ulogu da limi-<br />
tiraju aktivaciju ma-<br />
krofaga, a posebno IL-<br />
10. Pored toga, neki<br />
citokini urodjene imuno-<br />
sti, kao što je IL-6,<br />
poveavaju produkciju<br />
neutrofila u kosnoj srži<br />
i stimulišu sintezu<br />
razliitih proteina (npr.<br />
C-reaktivni protein) koji<br />
su ukljueni u odbranu<br />
elija domaina od<br />
infekcije.<br />
Slika 5.27. Zajedniki i sinergistini<br />
odgovor komponeniti<br />
urodjenog imunog odgovora<br />
protiv invazivne mreže patogena<br />
173
5.2.3. Uloga urodjenog imuniteta u stimulaciji adaptivnog imunog odgovora<br />
Urodjeni imuni odgovor obezbedjuje signale koji funkcionišu, u odnosu na antigen, u smislu<br />
stimulacije proliferacije i diferencijacije antigen-speciinih T i B limfocita (Slika 5.28.). Hipote<strong>za</strong><br />
dva signala, pomenuta u poglavlju o funkcionalnoj organi<strong>za</strong>ciji imunog sistema, opisuje da je prvi<br />
signal (signal 1) uvek antigen, a da je drugi signal (signal 2) ili komponenta/produkt mikroba ili<br />
urodjenog imunog odgovora koji identifikuje da je antigen produkt mikroba. Prema tome, urodjeni<br />
imuni odgovor služi kao inicijalno upozorenje <strong>za</strong> adaptivni imuni sistem da se pripremi <strong>za</strong><br />
odbranu i omogui <strong>za</strong>štitu organizma domaina. Mikroorganizmi koji naseljavaju organi<strong>za</strong>m<br />
domaina bez aktivacije lokalne inflamatorne reakcije, mogu biti neuspešni i u aktiviranju<br />
adptivnog imunog odgovora, kao posledice inflamatorne reakcije. Molekule koje se produkuju u<br />
reakcijama urodjenog imunog<br />
odgovora i koje funkcionišu<br />
kao drugi signali <strong>za</strong> aktivaciju<br />
leukocita su kostimulatori,<br />
citokini i fragmenti/produkti<br />
cepanja komponenti sistema<br />
komplementa.<br />
Slika 5.28. Stimulacija komponenti adaptivnog<br />
imunog odgovora od strane<br />
urodjenog imunog odgovora.<br />
A -Makrofage i dendritske elije odgovaraju na<br />
fagocitirane (sa elijama asocirane) mikrobe<br />
ekspresujui kostimulatore (kao što je B7 protein,<br />
kog prepoznaju CD28 receptori T elija) i sekretujui<br />
citokine (kao što je IL-12). Kostimulatori i IL-12<br />
funkcionišu <strong>za</strong>jedno sa prepoznavanjem antigena u<br />
aktivaciji T limfocita.<br />
B - Sistem komplemenata se aktivira<br />
ekstracelularnim mikrobima i generiše proteinima<br />
kao što je C3d koji se vezuje <strong>za</strong> mikrobe. B limfociti<br />
prepoznaju antigene mikroba preko svojih antigenreceptora<br />
i prepoznaju C3d preko receptora koji se<br />
zove tip 2 receptor komplementa (CR2). Signali sa<br />
receptora <strong>za</strong> antigen i CR2 funkcionišu koperativno u<br />
aktivaciji B elija.<br />
!!! Obratiti pažnju: u oba primera je drugi<br />
(sekundrni) signal koji deluje na limfocite koji takodje<br />
specifino prepoznaju antigene obezbedjen prvim<br />
signalnom<br />
174
Kostimulatori su membranski proteini ekspresovani na antigen prezentujuim elijama<br />
(engl. Antigen Presenting Cells - APCs) koji funkcionišu <strong>za</strong>jedno sa iska<strong>za</strong>nim antigenom u<br />
stimulaciji specifinih T limfocita. U prethodnim poglavljima su opisani kolstimulatori T limfocita,<br />
a najbolje definisani su, strukturalno slini proteini, B7-1 (CD80) i B7-2 (CD86). Kada APCs<br />
dodju u kontakt, prepoznaju i “sukobe se” sa produktima mikroba, kao što su LPS, kao i sa IFN-<br />
iz NK elija, APCs odgovaraju ekspresujui visoke nivoe B7-1 i B7-2 kostimulatora i tako dobijaju<br />
mogunost da stimulišu odgovor T elija. U odgovoru na mikrobe, makrofage i dendritske elije<br />
produkuju citokine koji promovišu rast i diferencijaciju T limfocita. Prototip ovakvih citokina je IL-<br />
12 koji stimuliše diferencijaciju naivnih T limofocta u TH1 efektorne elije koje produkuju<br />
IFN-. Prema tome, fagocitima produkovani IL-12 je kljuni induktor efektornih mehani<strong>za</strong>ma<br />
elijama-posredovanog imunog odgovora koji funkcionišu kao glavni iskorenjivai fagocitiranog<br />
mikroorganizma (videti u narednom poglavlju o efektornim mehanizmima elijama-posredovanog<br />
imuniteta).<br />
Najbolje definisani drugi signal <strong>za</strong> aktivaciju B elija je C3d protein komplementa<br />
(fragment razgradnje C3 proteina komplementa). Mikroorganizmi aktiviraju komplement, ili<br />
direktno ili vezujui se <strong>za</strong> antitela ili MBL u plazmi, i postaju obloženi sa produktima razgradnje<br />
C3, ukljuujui C3d. Receptori <strong>za</strong> C3d se nazvaju tip 2 receptori komplementa (CR2 ili CD21) I<br />
ekspresovani su na maturiranim B limfocitima. Kada B limfociti prepoznaju antigen mikroba<br />
svojim receptorima <strong>za</strong> antigen i simultano prepoznaju i C3d preko receptora <strong>za</strong> komplement<br />
(CR2), ove elije se aktiviraju. Kao rezultat ove aktivacije B elije produkuju antitela kao odgovor<br />
na antigen. Kritina i kljuna uloga sistema komplementa u humoralnom imunom odgovoru je<br />
poka<strong>za</strong>na kod knock-out miševa kojima nedostaje ili C3 protein sistema komplementa ili CR2.<br />
Drugi signal koji se generiše tokom urodjenog imunog odgovora na razliite mikrobe ne samo<br />
da pojaava magnitude reakcija adaptivnog imunog odgovora koje slede nego utie i na prirodu<br />
mehani<strong>za</strong>ma adaptivnog imunog odgovora (Slika 5.28.). U infekcijama sa intracelularnim<br />
mikrobima, makrofagi fagocitiraju ili prepoznaju mikorbe i odgovaraju ekspresovanjem<br />
kostimulatora i produkcijom citokina koji stimulišu T elijama-posredovani imuni odgovor.<br />
Osnovna funkcija elijama-posredovanog imuniteta je aktivacija makrofaga u cilju uništavanja<br />
intracelularnih mikroba. Na suprot tome, veina ekstracleularnih mikroba/antigena koja udje u<br />
krv aktivira cirkulišue proteine komplementa, koji kao odgovor, poveavaju produkciju antitela iz<br />
B limfocita, odnosno, humoralni imuni odgovor funkcioniše u smislu eliminisanja<br />
ekstracelularnih mikroba. Prema tome, kooperacija izmedju urodjenog imunog odgovora i<br />
adaptivnog imunog odgovora je bidirekciona, pri emu se komponenete, kao i efektorni<br />
175
mehanizmi, i jednog i drugog sistema medjusobno funkcionalno “oslanjaju”, pomažu i dopunjuju,<br />
a sve u cilju optimi<strong>za</strong>cije mehani<strong>za</strong>ma odbrane organizma domaina od infekcije (Slika 5.29).<br />
Slika 5.29. Specifinosti urodjenog imuniteta i adaptivnog imuniteta: najznaajnije interakcije u odgovoru na antigen.<br />
176
5.3. EFEKTORNI MEHANIZMI IMUNOG ODGOVORA POSREDOVANOG ELIJAMA<br />
elijama-posredovani imunitet je efektorna funkcija T limfocita i funkcioniše kao odbrambeni<br />
mehani<strong>za</strong>m uperen protiv mikroba koji prežive fagocite ili protiv inficiranih nefagocitnih elija.<br />
5.3.1. Tipovi elijama-posredovanih imunih reakcija<br />
Razliiti tipovi mikroorgani<strong>za</strong>ma iniciraju raznolike odgovore T elija, a u cilju <strong>za</strong>štite organizma<br />
domaina (Slika 5.30). Generalno, dve su osnovne forme elijama-posredovanih imunih reakcija:<br />
(1) CD4+, kao i CD8+ T elije<br />
prepoznaju antigen mikroba koji je<br />
ingestovan fagocitima i aktiviraju<br />
fagocite da unište mikrobe.<br />
(2) CD8+ citotolitiki T limfociti (CTL)<br />
uništavaju bilo koju nukleiranu eliju<br />
koja sadrži strane antigene<br />
(mikrobijalne ili tumorske) u citoplazmi.<br />
Slika 5.30. Tipovi T elijama-posredovanog imuniteta<br />
A – CD4 + TH1 elije i CD8 + T elije prepoznaju klasu II MHCasociranih<br />
peptidnih antigena ili klasu I MHC-asociranih peptidnih<br />
antigena fagocitiranih mikroba i produkuju citokine koji aktivraju<br />
makrofage da unište mikkobe i stimulišu inflamaciju.<br />
B – CD8+ citolitini T limfociti (CTL) prepoznaju klasu I MHCasociranog<br />
peptidnog antigena mikroba koji se nalazi u citoplazmi<br />
inficirane elije i uništavaju eliju.<br />
Adaptivni imuni odgovor na mikrobe koji se nalaze u okviru fagozoma fagocita je posredovan<br />
T limfocitima koji prepoznaju antigen mikroba i aktiviraju fagocite da unište ingestirani<br />
mikroorgani<strong>za</strong>m. Mnogi mikrobi su razvili mehanizme koji im omoguavaju da prežive, pa ak i da<br />
se replikuju u fagocitima, te je stoga urodjeni imunitet ponekad nemoan da iskoreni<br />
mikroorganizme. elijama-posredovani imuni odgovor funkcioniše u smislu da poveava<br />
mikrobicidnu aktivnost fagocita i efikasnost eliminacije mikroba, pri emu je specifinost<br />
odgovora u domenu funkcija T elija ali efektorna funkcija kojom se uništava mikrob je <strong>za</strong>pravo<br />
rezultat aktivnosti fagocita. Ova kooperativnost T limfocita i fagocita ilustruje veoma važnu kariku<br />
izmedju adaptivnog i urodjenog imuniteta. T-elijama posredovana aktivacija makrofaga koja se<br />
ostvaruje preko IFN-, kao i inflamatorna reakcija, može u nekim sluajevima da ošteti tkivo<br />
organizma domaina. Ova reakcija se naziva odloženi-tip hipersenzitivnosti (engl. Delayed-<br />
177
Type Hypersensitivity - DHT), termin hipersenzitivnost se u ovom sluaju odnosi na tkivo ošteeno<br />
imunim odgovorom. DHT se esto koristi kao esej <strong>za</strong> ispitivanje elijama-posredovanih imunih<br />
reakcija i esto prati <strong>za</strong>štitu omoguenu elijama-posredovanim imunim odgovorom.<br />
Adaptivni imuni odgovor uperen protiv mikroba koji su inficirali citoplazmu razliitih elija,<br />
ukljuujui i nefagocitne elije, i u njoj se replikuju je posredovan CD8+ citolitinim T limfocitima<br />
(engl. Cytolytic T Lymphocytes - CTLs). CTLs su osnovni mehani<strong>za</strong>m <strong>za</strong>štite uperen protiv virusa<br />
koji inficiraju razliite tipove elija i imaju sposobnost replikacije u citoplazmi inficirane elije<br />
domaina. Ukoliko elija nema i/ili izgubi sposobnost da uništi mikrob, jedini nain<br />
iskorenjivanja infekcije je uništavanje inficirane elije. CTLs-posredovano uništavanje je takodje<br />
mehani<strong>za</strong>m <strong>za</strong> eliminaciju mikroba koji su se iz nekog razloga “spasili” fagozoma i <strong>za</strong>šli u<br />
citoplazmu gde su van domašaja mikrobicidnih mehani<strong>za</strong>ma fagocita.<br />
Adaptivni imuni odgovor na helmintske parazite je posredovan preko TH2 elija koje stimulišu<br />
produkcju IgE antitela i aktiviraju eozinofile koji uništavaju IgE-obložene parasite. TH2 podgrupa<br />
pomonih T elija takodje inhibiše aktivaciju makrofaga, te je stoga važna <strong>za</strong> limitiranje DHT<br />
reakcije. Protektivan imuni odgovor prema virusima i drugim intracelularnim mikrobima takodje<br />
ukljuuje i NK elije kao kompnenete urodjenog imunog odgovora (opisano u prethodnom<br />
poglavlju o Efektornim reakcijama urodjenog imuniteta).<br />
5.3.2. Razvoj efektornih elija<br />
elijama-posredovani imuni odgovor se sastoji od razvoja efektornih T elija od naivnih elija u<br />
perifernim limfoidnim organima, migracije ovih efektornih T elija i drugih leukocita do mesta<br />
infekcije, i na kraju, ili citokinima-posredovane aktivacije leukocita da unište mikrobe ili direktnog<br />
uništavanja inficirane elije (Slika 5.31.). Naivne T elije migriraju iz krvi u limfoidne organe, a<br />
onda iz jendog limofoidnog organa u drugi, sve dok ne dodju u kontakt sa mikrobom (videti ranije<br />
o recirkulaciji limfocita u poglavlju elije i tkiva imunog sistema). Naivne T elije ne produkuju<br />
efektorne citokine ili molekule neophodne <strong>za</strong> uništavanje drugih elija. Za iskorenjivanje mikroba<br />
naivne T elije moraju da se diferenciraju u efektorne elije da bi mogle dobiti funkcionalne<br />
sposobnosti. Razvoj efektornih T elija ukljuuje sekvencu od nekoliko dogadjaja/procesa:<br />
prepoznavanje antigena asociranog na elijama u perifernim limfoidnim organima; klonalna<br />
ekspanzija i diferencijacija. Sve to je diskutovano ranije, a ovde e biti samo ukratko sumirano.<br />
5.3.2.1. Prepoznavanje antigena od strane T elija i kostimulacija<br />
Direfencijacija naivnih T limfocita u efektorne elije komponente elijama-posedovanog<br />
imuniteta <strong>za</strong>hteva prepoznavanje antigena i kostimulaciju.<br />
178
Slika 5.31. Indukcija i efektorna fa<strong>za</strong> elijama-posredovanog imuniteta.<br />
Indukcija odgovora: CD4+ T elije i CD8+ T elije prepoznaju peptide koji se dobijaju od proteinskih antigena i prezentovani su putem profesionalnih antigen<br />
prezentujuih elija u perifernim limfoidnim organima. T limfociti su stimulisani na proliferaciju i diferencijaciju i kao efektorne elije ulaze u cirkulaciju.<br />
Migracija T elija i drugih leukocita na mesto gde je prisutan antigen: efektorne T elije i drugi leukociti migriraju kroz krvne sudove u periferna tkiva preko<br />
vezivanja <strong>za</strong> endotelne elije koje aktiviraju citokini produkovani kao odgovor na infekciju u tim tkivima.<br />
Efektorske funkcije T elija: efektorne T elije prepoznaju antigen u tkivima i odgovaraju tako što sekretuju citokine koji aktiviraju fagocite koji iskorenjuju infekciju.<br />
T elijama produkovani citokini takodje stimulišu infekciju.<br />
179
Odgovor i diferencijacija CD4+ T elija je iniciran prepoznavanjem antigena prezentovanog<br />
od strane profesionalnih APCs. Paralelno sa prezentacijom antigena, mikrobi ili neki produkti<br />
urodjenog imuniteta iniciraju urodjeni imuni odgovor. Ovo rezultira stimuliacijom APCs da<br />
ekspresuju visok nivo kstimulatora (B7-1 i B7-2) što predstavlja drugi signal <strong>za</strong> aktivaciju T elija<br />
i produkciju IL-12 koji stimuliše difrencijaciju T elija.<br />
Odgovor CD8+ T elja je takodje iniciran prepoznavanjem antigena koji su iska<strong>za</strong>ni preko<br />
profesionalnih APCs, ali neke karakteristike ih ine razliitim od drugih T elija. Prvo, antigeni<br />
koji se prepoznaju od strane CD8+ T elija moraju biti u citoplazmi APCs i to se može dogoditi<br />
ukoliko mikrob direkto inficira APCs. Drugo, diferencijacija naivnih CD8+ T elija u<br />
funkcionalne CTLs može da <strong>za</strong>hteva dodatne signale od CD4+ pomonih elija. U sluaju<br />
kada je jak urodjeni imuni odgovor na mikrobe ili je APCs inficirana, CD4+ T pomone elije<br />
možda nisu potrebne. Medjutim, u sluaju kada je urodjeni imuni odgovor na mikrobe slab i kada<br />
APCs nisu inficirane, kao što je sluaj u latentnim viralnim infekcijama, transplantacijama organa<br />
i tumorima, CD4+ pomone elije su esencijalne <strong>za</strong> punu aktivaciju CD8+ T elija. Pomone T<br />
elije mogu da sekretuju citokine, kao što je IL-2, koji stimuliše proliferaciju i diferencijaciju CD8+<br />
T elija. Antigenom-stimulisane pomone T elije ekspresuju CD40L koji se vezuje <strong>za</strong> CD40 na<br />
APCs i aktivira ove<br />
APCs u smislu<br />
poboljšanja efikasno-<br />
sti u stimulaciji CD8+<br />
T elija.<br />
Slika 5.32. Uloga kostimulatora<br />
i T elija pomonica u<br />
diferencijaciji CD8+ T<br />
limfocita.<br />
Diferencijacija CD8+ T elija u<br />
efektorne citolitine T limfocite (CTL)<br />
<strong>za</strong>hteva prepoznavanje antigena<br />
(signal 1) i dodatne stimuluse (signal<br />
2). Sekundarne signale mogu<br />
obezbediti kostimulatori, kao što je B7<br />
molekul, ekspresovan na<br />
profesionalnim APCs (slika A) ili preko<br />
citokina produkovanih od strane CD4+<br />
T elija pomonica (slika B). CD4+ T<br />
elije pomonice mogu takoe<br />
aktivirati APCs i uiniti ih sposobnim<br />
da stimulišu CTL razvoj, npr.<br />
stimulišui ekspresiju B7 molekula.<br />
180
Pomone T elije takodje promovišu preživljavanje CD8+ T elija, pa prema tome i memorijski<br />
odgovor. Ova uloga CD4+ T elije je prihvaena kao objašnjenje defekta u generisanju CTLs kod<br />
individua inficiranih HIV virusom kod kojih virus inficira i eliminiše jedino CD4+ T limfocite.<br />
5.3.2.2. Klonalna ekspanzija T elija<br />
Nakon što naivne T elije budu izložene antigenu i kostimulatorima u perifernim limfatinim<br />
oganima, one proliferišu uglavnom kao odgovor na autokrino produkovani IL-2. Antigenima-<br />
stimulisane T elije proliferišu u veoma velikom<br />
intenzitetu obezbedjujui ogromnu populaciju<br />
antigen-specifinih limfocita sa kapacitetom I<br />
sposobnostima da se diferencijraju u efektorne<br />
elije (Slika 5.33.).<br />
5.3.2.3. Diferencijacija naivnih CD4+ T elija u efektorne elije<br />
Slika 5.33. Klonalna ekspanzija T elija.<br />
Ekspanzija T elija kao odgovor na infekciju podrazumeva da se neke diferenciraju<br />
u efektorne elije, a neke u memorijske elije, dok mnoge umiru. Kinetika i broj<br />
elija prika<strong>za</strong>ni na slici su tipini <strong>za</strong> odgovor CD8+ T elija u slezini miša <strong>za</strong>raženog<br />
sa virusom.<br />
CD4+ T elije mogu da se diferenciraju u podgrupu efektornih elija koje produkuju razliite i<br />
raznovrsne setove citokina, pa prema tome realizuju i razliite efektorne funkcije (Slika 5.34.).<br />
Jedan od najboljih primera specijali<strong>za</strong>cije adaptivnog imuniteta je sposobnost CD4+ T limfocita da<br />
aktiviraju razliite efektrone mehanizme u odgovoru na razliite mikrobe. Osnova ove specija-<br />
li<strong>za</strong>cije je heterogenost CD4+ T elija ilustrovana prisustvom podgrupa (TH1, TH2) koje se razlikuju<br />
po nainu kako se indukuju, koje citokine produkuju i koje efektorne mehanizme aktiviraju.<br />
Karakteristike TH1 i TH2 podgrupa efektornih T limfocita<br />
Najbolje definisane podgrupe efektornih T elija CD4+ pomone linije su TH1 i TH2 elije, koje se<br />
odlikuju karakteristinim citokinima: IFN- <strong>za</strong> TH1; IL-4 i IL-5 <strong>za</strong> TH2 (Tabela 5.2. i Slika 5.34.).<br />
Populacije pomonih T elija koje se mogu razlikovati na osnovu citokina koje sekretuju su<br />
otkrivene tokom ispitivanja velikog panela kloniranih elijskih linija dobijenih od antigenima-<br />
stimulisanih CD4+ T elja miša. Danas je apsolutno jasno da pojedine T elije mogu da<br />
ekspresuju razliite mešavine citokina i da postoji mogunost postojanja velikog broja<br />
181
subpopulacija sa veom heterogenošu obrazca sekrecije citokina, posebno kod ljudi. Bez obzira<br />
na to, u hroninim imunim reakcijama naješe dominiraju ili TH1 i TH2 populacije. Relativna<br />
proporcija ovih elija indukovana tokom imunog dogovora je glavna determinanta <strong>za</strong>štitne<br />
funkcije i pataloških konsekvenci odgovora. TH1 i TH2 populacije se najjasnije razlikuju preko<br />
citokina koje produkuju (Tabela 5.12. i Slika 5.34.).<br />
Tabela 5.12. Osobine TH1 i TH2 podgrupa CD4 + T elija pomonica<br />
OSOBINA TH1 PODGRUPA TH2 PODGRUPA<br />
Produkcija citokina<br />
IFN- + + + -<br />
IL-4, IL-5, IL-13 - + + +<br />
IL-10 + / - + +<br />
IL-3, GM-CSF + + + +<br />
Ekspresija citokinskih<br />
receptora<br />
IL-12R lanac + + -<br />
IL-18R + + -<br />
Ekspresija hemokinskih<br />
receptora<br />
CCR4 + / - + +<br />
CXCR3, CCR5 + + + / -<br />
Ligandi <strong>za</strong> E- i P-selektin + + + / -<br />
Stimulisani izotipovi<br />
antitela<br />
IgG2a (miš) IgE, IgG1 (miš)<br />
/ IgG4 (ovek)<br />
Aktivacija makrofaga + + + -<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
Do danas nije otkriven ni jedan drugi fenotipski marker koji bi omoguio definitivnu klasifikaciju.<br />
Ove grupe ispoljavaju razlike u ekspresiji razliitih citokinskih receptora, ali ove razliitosti mogu<br />
reflektovati samo aktivacioni status elija i ne moraju biti stabilne. Citokini sekretovani od strane<br />
ovih populacija ne samo da determinišu efektorne funkcije ovih elija, nego takodje participiraju u<br />
razvoju i ekspanziji odredjene podgrupe elija. IFN- sekretovan od strane TH1 elija promoviše<br />
dalje, u autorkinom maniru, diferencijaciju TH1 elija, a inhibiše proliferaciju TH2 elija. Nasuprot<br />
tome, IL-4 produkovan od strane TH2 elija promoviše diferencijaciju ovih elija (kao i nekih<br />
drugih), a inhibiše aktivaciju TH1 elija. Prema tome, svaka podgrupa amplicira sebe samu, a<br />
kros-reguliše u antagonistikom maniru recipronu podgrupu. Iz ovog razloga, kada se imuni<br />
odgovor razvije u pravcu jednog puta postaje poveano polarizovan u tom pravcu, a ekstremno<br />
najvea polari<strong>za</strong>cije je uoena u hroninim infekcijama ili pri hroninom izlaganju antigenima iz<br />
182
okruženja kada je imuna stimulacija perzistenta. Ove populacije pomonih T elija pokazuju<br />
Slika 5. 34. TH1 i TH2<br />
podvrste CD4+ T elija<br />
razliite obrazce migracije do mesta infekcije, što je<br />
posledica razlika u njihovom vezivanju <strong>za</strong> selektine<br />
endotela kapilara, kao i njihovom odgovoru na<br />
razliite hemokine (Tabela 5.12.)<br />
Razvoj TH1 i TH2 pomonih T elija<br />
TH1 i TH2 podgrupe se razvijaju od istog<br />
prekursora koji su naivni CD4+ T limfociti, a obra<strong>za</strong>c<br />
njihove diferencijacije je determinisan stimulusima<br />
prisutnim u ranim fa<strong>za</strong>ma toka imunog odgovora.<br />
Najvažniji stimulusi koji indukuju diferencijaciju su<br />
citokini, sa IL-12 kao glavnim inducerom TH1 elija i<br />
IL-4 kao glavniminducerom TH2 elija (Slika 5.35.).<br />
Isti citokini mogu da funkcionišu i kao faktori rasta i<br />
da prouzrokuju ekspranziju specifinih populacija.<br />
TH1 put diferencijacije je odgovor na mikrobe koji<br />
inficiraju ili aktiviraju makrofage, kao i one koji<br />
aktiviraju NK elije. Diferencijacija antigenima-aktiviranih CD4+ T elija u<br />
TH1 efektore je stimulisana mnogim intracelularnim bakterijama (Listeria), nekim parazitima<br />
(Leishmania) i virusima, i svi oni inficiraju makrofage. Zajednika karakteristika svih ovih<br />
infekcija i uslova imuni<strong>za</strong>cije je što svi mikrobi iniciraju urodjeni imuni odgovor sa produkcijom<br />
IL-12. Neki od mikorba se vežu <strong>za</strong> tzv. Toll-like receptore (TLRs) na makrofagama i dendritskim<br />
elijama i direktno aktiviraju ove elije da sekretuju IL-12 (Slika 5.36.). Drugi mikrobi mogu da<br />
trigeruju sekreciju IL-12 indirektno, na primer, stimulacijom NK elija da produkuju IFN-, koji<br />
potom može povratno da deluje na makrofage i indukuje sekreciju IL-12. T elije mogu dalje da<br />
pojaavaju produkciju IL-12 preko razliitih CD40L na T elijama koji vezuju CD40 na APCs i<br />
stimulišu transkripciju IL-12 gena. Ovaj citokin je glavni i odgovorni citokin u elijama-<br />
posredovanom imunitetu. On se vezuje <strong>za</strong> svoje receptore na antigenima-stimulisanim CD4+ T<br />
limfocitima i aktivira transkripcioni faktor STAT4 koji dalje promoviše diferencijaciju T elija u<br />
TH1 elije (Slika 5.35.). Pored toga, drugi transkripcioni faktor, T-bet, takodje ima kljunu ulogu u<br />
razvoju TH1 elija. T-bet se indukuje delovanjem IFN- te se na taj nain omoguavaju<br />
amplifikacioni mehanizmi <strong>za</strong> odgovore TH1 elija. IFN- takodje promoviše razvoj TH1 elija<br />
183
stimulišui produkciju IL-12 iz makrofaga, kao i ekspresiju funkcionalnih IL-12 receptora na T<br />
limfocitima.<br />
Diferencijacija TH2 populacije se odvija kao odgovor na helminte i alergene koji prouzrokuju<br />
hroninu stimulaciju T elija, veoma esto bez znaajne indukcije urodjenog imunog odgovora ili<br />
atkivacije makrofaga. Di-<br />
ferencijacijaantigenima- stimulisanih T elija u TH2<br />
elije <strong>za</strong>visi od IL-4 koji<br />
funkcioniše preko aktiva-<br />
cije STAT6 transkripcionog<br />
faktora odgovornog <strong>za</strong><br />
razvoj TH2 elija. (Slika<br />
5.35). Drugi transkripci-<br />
oni faktor, GATA-3, tako-<br />
dje ima važnu ulogu u<br />
razvoju TH2 elija, jer sti-<br />
muliše transkripciju gena<br />
<strong>za</strong> citokine koje produkuju<br />
TH2 elije. GATA-3 može<br />
biti produkovan kao odgo-<br />
vor na prepoznavanje anti-<br />
gena, a njegova produkcija<br />
može biti pojaana preko<br />
IL-4, te se tako omoguava<br />
amplifikacija mehani<strong>za</strong>ma<br />
<strong>za</strong> TH2 odgovore.<br />
Slika 5.35. Razvoj TH1 i TH2 podvrsta CD4+ pomonih T elija.<br />
Citokini produkovani u uroenom imunom odgovoru na mikrobe ili rano u adptivnom imunom odgovoru utiu na diferencijaciju naivnih CD4+ T elija<br />
u TH1 i TH2 elije. IL-12 produkovan od strane aktiviranih makrofaga i dendritskih elija, indukuje razvoj TH1 elija preko STAT4-<strong>za</strong>visnog puta. IL-4<br />
koga uglavnom produkuju same T elije, favorizuje indukciju TH2 elija STAT6-<strong>za</strong>visnog puta. Transkripcioni faktor T-bet, produkovan kao odgovor<br />
na IFN- pojaava TH1 odgovor, a GATA-3 je odgovoran <strong>za</strong> diferencijaciju TH2 elije. Drugi citokini koji mogu uticati na diferencijaciju pomonih T<br />
elija nisu prika<strong>za</strong>ni na ovoj slici.<br />
Pored citokina i neki drugi stimulusi mogu da utiu na obra<strong>za</strong>c diferencijacije pomonih T elija.<br />
Ovi stimulusi su koliina antigena i kostimulatora koji su ekpresovani na APCs. Pored toga,<br />
genetika osnova elije domaina je veoma važna determinanta obrazca diferencijacije T elija<br />
184
Efektorne funkcije TH1 i TH2 pomonih T elija<br />
(npr. neki sojevi miševa dobijeni<br />
inbridingom razvijaju odgovore TH2<br />
elija na iste mikrobe koji stimulišu<br />
diferencijaciju TH1 elija kod veine<br />
drugih sojeva).<br />
Slika 5.36. Uloga IL-12 i IFN- u elijamaposredovanom<br />
imunom odgovoru.<br />
APCs sekretuju IL-12 kao odgovor na produkte mikroba kao<br />
što su lipopolisaharidi (LPS). NK elije, T elije i CD40 elije<br />
produkuju IFN-. IL-12 stimuliše diferencijaciju CD4+ T elija<br />
pomonica u TH1 efektorne elije, koje produkuju IFN-, a koji<br />
potom »povratno« aktivira makrofage da fagocitiraju mikrobe i<br />
da sekretuju još više IL-12.<br />
Glavna efektorna funkcija TH1<br />
elija je fagocitima-posredovana odbrana<br />
od infekcije, posebno inicirane<br />
intraceluarnim mikroorganizmima (Slika<br />
5.37.). IFN- produkovan iz TH1 elija<br />
stimuliše mikrobicidnu aktivnost fago-<br />
cita te tako promoviše intracelularnu<br />
destrukciju fagocitovanog mikroba.<br />
IFN-takodje stimuliše produkciju IgG<br />
antitela koje ima sposobnost<br />
opsoni<strong>za</strong>cije i fiksacije komplementa,<br />
ime se promoviše fagocto<strong>za</strong>.<br />
Slika 5.37. Efektorne funkcije TH1 elija.<br />
CD4+ T elije koje se diferenciraju u TH1 elije sekretuju IFN-,<br />
limfotoksine (LT), TNF i IL-2. IFN- deluje na makrofage<br />
poveavajui sposobnost fagocitoze i ubijanja mikroba u<br />
fagolizozomima, a na B limfocitima stimulišu produkciju IgG antitela,<br />
sposobnog da opsonizira mikrobe i promoviše fagocitozu. LT i TNF<br />
aktiviraju neutrofile i stimulišu inflamaciju. IL-2 je autokrini faktor<br />
rasta produkovan od strane TH1 podvrste T elija.<br />
185
Glavna efektorna funkcija TH2 elija je u imunim reakcijama posredovanim IgE i eozinofilima<br />
ili mastocitima (Slika 5.38.). Ove reakcije su indukovane preko IL-4, IL-5 i IL-1. TH2 elije su<br />
odgovorne <strong>za</strong> odbranu od infekcija helmintskim parazitima, kao i <strong>za</strong> alergijske reakcije. Antitela<br />
stimulisana TH2 elijama ne<br />
promovišu fagocitozu, niti efikasno<br />
aktiviraju komponenete sistema<br />
komplementa. Pored toga, nekoliko<br />
citokina koje produkuju TH2 elije<br />
(IL-4, IL-13 i IL-10) antagonizuju<br />
efekte IFN- i inhibišu aktivaciju<br />
makrofaga. Ovo je razlog zbog ega<br />
je razvoj TH2 elija asociran sa<br />
deficijencijom u elijama-<br />
posredovanom imunitetu na<br />
infekcije intracelularnim mikrobima<br />
kao što su Leishmania i<br />
mikobakterija.<br />
5.3.2.4. Diferencijacija naivnih CD4+ T elija u citolitine T elije (CTLs)<br />
Slika 5.38. Efektorne funkcije TH2 elija.<br />
CD4+ T elije koje se diferenciraju u TH2 elije sekretuju IL-4 i<br />
IL-5. IL-4 deluje na B elije i stimuliše ih na produkciju<br />
antitela, kao što je IgE koji se vezuje <strong>za</strong> mastocite. IL-4<br />
deluje i kao autokrini faktor rasta i diferencijacije TH2 elija.<br />
IL-5 aktivira eozinofile. Citokini poreklom iz TH2 elija takoe<br />
inhibišu aktivaciju makrofaga, kao i TH1-posredovane reakcije<br />
Naivne CD8+ T elije se diferenciraju u CTLs koje su efektorne T elije sposobne da prepoznaju i<br />
unište ciljne elije koje ekspresuju strane antigene peptide asocirane sa klasom I MHC molekula.<br />
Diferencijacija pre-CTLs elija u aktivne CTL elije ukljuuje »sklapanje i ukljuivanje« mašinerije<br />
sposobne da omogui uništavanje inficirane ciljne elije. Najspecifinije obeležje CTLs difere-<br />
ncijacije je razvoj membranski-ve<strong>za</strong>nih citoplazmatinih granula koje sadrže proteine, ukljuujui<br />
perforine i granizime, a ija je funkcija da unište druge elije. Signali koji stimulišu diferencijaciju<br />
naivnih CD8+ T elija u CTLs su antigen, kostimulatori i pomone T elije.<br />
186
5.3.3. Migracija efektornih T elija i drugih leukocita na mesto gde je antigen<br />
Efektorne T elije migriraju na mesto infekcije i ostaju na tom mestu (Slika 5.39.).<br />
Da bi se inicirala efikasna efektorna fa<strong>za</strong> elijama-<br />
posredovanog imuniteta, efektorne elije treba da<br />
dodju u kontakt sa fagocitom ili inficiranom<br />
elijom koja prezentuje antigene, inicijatore odgo-<br />
vora. Da bi locirali mikrobe na bilo kom mestu, T<br />
elije koje su se razvile u limfoidnim organima, kao<br />
što su limfni vorovi, i ušle u cirkulaciju, treba da<br />
napuste vaskularni prostor i da stignu do mesta<br />
infekcije. Usmerena migracija efektornih T limfo-<br />
cita na mesto infekcije je deo generalnog procesa<br />
regrutacije leukocita na mesto infekcije, a kao neto<br />
rezultat je razvijanje lokalne inflamatorne reakcije.<br />
Migracija leukocita do mesta infekcije je stimulisana<br />
citokinima koji indukuju ekspresiju adhezionih<br />
molekula na endotelijalnim elijama, kao i<br />
hemotaksiju leukocita (Slika 5.39.). Citokini se<br />
produkuju od strane makrofaga i endotelnih elija<br />
stimulisanih produktima mikroba, a i kasnije u<br />
reakciji odgovora T limfocita na antigen. Najvažniji<br />
citokini u ovoj reakciji su TNF, IL-1 i hemokini.<br />
Efektorni T limfociti ekpresuju adhezione molekule i<br />
hemokinske receptore koji promovišu migraciju<br />
elija do mesta infekcije i inflamaciju. Ova migracija<br />
je posredovana istim adhezionim molekulima,<br />
selektinima i integrinima, odgovornim <strong>za</strong> migraciju<br />
leukocita kroz ctokinima-aktivirani endotel.<br />
Slika 5.39. Migracija i <strong>za</strong>ostajanje (retencija) efektornih i memorijskih T<br />
elija na mestu infekcije.<br />
Prethodno aktivirane efektorne i memorijske T elije migriraju kroz endotel koji je<br />
aktiviran preko citokina (npr. TNF) produkovanih na mestu infekcije. U<br />
ekstravaskularnim tkivima T elije koje specifino prepoznaju antigen su aktivirane i<br />
<strong>za</strong>držane, dok se T elije koje ne prepoznaju antigen vraaju u cirkulaciju, uglavnom<br />
preko limfatinih sudova (nije poka<strong>za</strong>no na slici).<br />
187
Migracija efektornih T elija iz cirkulacije do perifernih mesta infekcije je u najveoj meri i najveem<br />
broju sluajeva ne<strong>za</strong>visna od antigena, ali elije koje prepoznaju antigen u ekstravaskularnom tkivu<br />
imaju tendenciju da se tu i <strong>za</strong>drže (Slika 5.39.). Migracija elija kroz krv i limfatine sudove je<br />
kortrolisana uglavnom adhezionim molekulima, a ne vezivanjem <strong>za</strong> antigene receptore. Prema<br />
tome, proces migracije rezultira regrutovanjem cirkulišuih efektornih T elija na meto infekcije,<br />
bez obzira na antigenu specifinost. Ova adheziono-<strong>za</strong>visna migracija osigurava da e maksimalno<br />
mogui broj prethodno aktiviranih T elija imati mogunost da locira mikrob koji je inicirao<br />
infekciju i da iskoreni infekciju. Neke memorijske elije takodje migriraju u periferna tkiva, ak i u<br />
odsustvu infekcije i pretražuju/ispituju tkivo na mikrobe.<br />
5.3.4. Efektorni mehanizmi elijama-posredovanog imuniteta<br />
Nakon migracije efektornih T elija na periferna mesta infekcije ili izlaganja antigenima, one<br />
prepoznaju antigen <strong>za</strong> koji poseduju specifine receptore i aktiviraju se kako bi bile spsobne da<br />
izvršavaju svoje efektorne fukcnije. U elijama-posredovanom imunitetu glavna efektorna funkcija<br />
CD4+ T elija je da stimuliše mikrobicidnu aktivnost makrofaga i drugih leukocita, dok je glavna<br />
efektorna funkcija CD8+ CTLs da ubijaju inficiranu eliju i aktivišu fagocitozu.<br />
5.3.4.1. T-elijama posredovana aktivacija makrofaga i drugih leukocita<br />
Aktivirani makrofagi su efektorne elije imuniteta posredovanog elijama i funkcionišu u smislu<br />
eliminacije fagocitovanih mikroorgani<strong>za</strong>ma. Monociti se regrutuju iz krvi u tkiva u kojima se izlažu<br />
signalima koji potiu od TH1 efektornih elija i CD8+ efektornih elija, a kao odgovor na antigen u<br />
tkivu. Ove interakcije rezultiraju transformacijom monocita u aktivirane makrofage koji su<br />
sposobni da unište mikrobe. Aktivacija se sastoji u kvantitativnim promenama ekspresije<br />
razliitih proteina koji na kraju aktiviraju makrofag omoguujui mu kapacitet da obavlja neke<br />
funkcije koje ne mogu biti izvedene monocitom.<br />
Stimulusi <strong>za</strong> aktivaciju makrofaga<br />
CD4+ TH1 i CD8+ T elije aktiviraju makrofage preko kontaktom-posredovanih signala omoguenih<br />
/isporuenih preko CD40L-CD40 interakcija, kao i preko citokina IFN- (Slika 5.40. i Tabela 5.13.).<br />
Kada su efektorne TH1 elije i CD8+ T elije stimulisane antigenima one sekretuju citokine,<br />
najviše IFN-, i ekspresuju CD40L. IFN- je glavni citokin koji aktivira makrofage, i to samostalno,<br />
ili funkcionišui <strong>za</strong>jedno sa LPS, ili sa CD40 signalima, pri emu pokree neke druge imune<br />
188
odgovore. Neophodnost CD40L-CD40 interakcije <strong>za</strong> aktivaciju makrofaga osigurava da su<br />
makrofagi koji prezentuju antigen T elijama (tj. makrofagi koji nose intracelularne mikrobe)<br />
takodje makrofagi koji e biti najefikasnije aktivirani T elijama. U nekim sluajevima, CD8+ T<br />
elije mogu da aktiviraju makrofage istim mehanizmima i sa istim funkcionalnim<br />
rezultatom. Ovo se dešava ukoliko T elije prepoznaju antigene mikroba prisutne u citosolu<br />
Efektorne funkcije akiviranih makrofaga<br />
antigen-prezentujuih makrofa-<br />
ga. Isti proces se inicira i<br />
bakterijskim LPS u reakcijama<br />
urodjenog imunog sistema, što<br />
ukljuuje iste biohemijske<br />
puteve kao CD40 i stimuliše NK<br />
elije da sekretuju IFN-.<br />
Slika 5.40. Aktivacija i funkcionisanje<br />
makrofaga u elijama-posredovanom<br />
imunitetu<br />
Makrofagi se aktiviraju interakcijom CD40L-CD40 i<br />
preko IFN- , i tako aktivirani ubijaju mikrobe, stimulišu<br />
inflamaciju i poveavaju antigen-prezentujui kapacitet<br />
elija.<br />
Kao odgovor na CD40 signale i IFN-, poveava se produkcija razliitih aktivnih molekula koji e<br />
uestvovati u efektornim reakcijama uništavanja mikroba. Ligacija CD40 aktivira transkripcione<br />
faktore NF-kappaB i AP1, a IFN- aktivira transkripcione faktore STAT1 i IRF-1. Kao rezultat ovih<br />
signala aktivirani makrofagi produkuju poveanu koliinu proteina odgovornih <strong>za</strong> efektorne<br />
funkcije ovih elija u imunom odgovoru posredovanom elijama (Slika 5.40. i Tabela 5.13.).<br />
Tabela 15. 13. Aktivacija i funkcija makrofaga u elijama-posredovanom imunitetu<br />
ODGOVOR MAKROFAGA ULOGA U ELIJSKOM IMUNOM ODGOVORU<br />
Produkcija reaktivnog kiseoninog<br />
posrednika, azot oksida, poveava nivo<br />
lizozomalnih enzima<br />
Sekrecija citokina<br />
( TNF, IL-1, IL-2)<br />
Uništavanje mikroba u fagolizozomima<br />
( efektorna funkcija makrofaga)<br />
TNF, IL-1: regrutacija leukocita<br />
(inflamacija)<br />
IL-12: diferencijacija TH1, produkcija IFN-<br />
Poveana ekspresija B7 kostimulatora Poveana aktivacija T elija (amplifikacija)<br />
MHC molekula<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
189
Efektorne funkcije aktiviranih makrofaga ukljuuju sledee:<br />
Aktivirani makrofagi ubijaju fagocitovani mikrob uglavnom produkujui mikrobicidne<br />
reaktivne kiseonine radikale/intermedijere, azot-oksid i lizozomalne enzime (ovi mehani<strong>za</strong>mi su<br />
detaljno objašnjeni u poglavlju o Efektornim mehanizmima urodjenog imunog odgovora). Aktivacija<br />
makrofaga poveava potrošnju kiseonika i vodi ka produkciji reaktivnih kiseoninih radikala i<br />
azot oksida koji su veoma potentni mikrobicidni agensi koji se produkuju u lizozomima i sposobni<br />
su da ubiju ingestirane mikrobe. Pored toga, aktivirani makrofagi sadrže poveanu koliinu<br />
lizozomalnih enzima koji uništavaju fagocitovani mikroorgani<strong>za</strong>m nakon fuzije fagozoma sa<br />
lizozomima. Pored toga, reaktivni kiseonini radikali, azot oksid i lizozomalni enzimi mogu biti<br />
otpušteni u okolno tkivo gde takodje ubijaju mikrobe, ali ekstracelularne, ali mogu prouzrokovati i<br />
ošteenje normalnog, neinficiranog tkiva.<br />
Aktivirani makrofagi stimulišu akutnu inflamaciju preko sekrecije citokina, uglavnom TNF, IL-<br />
1 i hemokina, kao i kratko-živeih lipidnih medijatora kao što su trombocita-aktivirajui faktor,<br />
prostaglandini i leukotrijeni. Kolektivno delovanje ovih makrofagima produkovanih citokina i<br />
lipidnih medijatora prouzrokuje lokalnu inflamatornu reakciju bogatu neutrofilima sposobnim<br />
da fagocituju i unište infektivne organizme.<br />
Aktivirani makrofagi (i neutrofili) uklanjanju izumrla tkiva u cilju facilitiranja opravka nakon<br />
kontrolisane infekcije. Oni indukuju formiranje oporavljenog tkiva i produkcijom faktora rasta koji<br />
stimulišu proliferaciju fibroblasta (trobocitima-produkovani faktor rasta; engl. Platelet-Derived<br />
Growth Factor - PDGF); sintezu kolagena (transformišui faktor rasta engl. Transforming<br />
Growth Factor- TGF-) i formiranje novih krvnih sudova ili angiogenezu (faktor rasta fibroblasta;<br />
engl. Fibroblast Growth Factor - FGF). Prema tome, aktivirani makrofagi imaju funkciju<br />
«endogenog hirurga« koji »obradjuje« rane, eliminiše antigen i sanira inflamatornu reakciju.<br />
Uloga TH2 elija i eozinofila u odbrani uperenoj protiv helminata<br />
TH2 elije indukuju inflamatorne reakcije u kojima dominiraju eozinofili i mastociti (Slika 5.38.).<br />
Ovaj tip imunog odgovora fukcioniše u smislu eliminacije infekcije i<strong>za</strong>zvane helmintima, a takodje<br />
može imati ulogu i u odbrani uperenoj protiv nekih ektoprazita. Helminti su previše veliki da bi<br />
bili fagocitirani i rezistentniji su od veine bakterija i virusa na mikrobicidne efektorne mehanizme<br />
aktiviranih makrofaga. Imuni odgovor uperen protiv helminata se sastoji uglavnom od TH2 elija<br />
koje sekretuju IL-4, IL-5 i IL-13. IL-4 i IL-13 stimulišu produkciju IgE antitela koja su specifini<br />
opsonini helminata. IL-5 aktivira eozinofile koji se razliitim Fc receptorima (specifinim <strong>za</strong> <br />
teški lanac) vezuju <strong>za</strong> IgE-obložene helminte. Vezivanje aktivira eozinofile i oni oslobadjaju sadržaj<br />
svojih granula (tzv. degranulacija eozinofila), ukljuujui veliki bazini protein i veliki<br />
190
katjonski protein, koji imaju spsobnost da unište ak i veoma vrst integument helminta.<br />
Mastociti takodje ekspresuju Fc receptor i reaguju na IgE-asocirane antigene<br />
degranulacijom. Granule mastocita sadrže vasoaktivne amine, citokine kao što je TNF, kao i<br />
lipidne medijatore koji indukuju lokalnu inflamatornu reakciju. Pored navedenih efektornih<br />
reakcije, TH2 elije inhibišu elijama-posredovani imuni odgovor preko citokina koji supresuju<br />
aktivaciju makrofaga (videti ranije u poglavlju o Citokinima). Ova uloga TH2 elija se ostvaruje<br />
sekrecijom IL-4 i IL-13 koji deluju kao antagonisti IFN-, te tako blokiraju T elijama-<br />
posredovanu aktivaciju makrofaga, ali i preko sekrecije IL-10, koji direktno inhibiše aktivaciju<br />
makrofaga.<br />
5.3.4.2. Mehanizmi CTL-posredovanog uništavanja inficiranih elija<br />
Intracelularni mikrobi koji se na neki nain nadju izvan fagozoma ne mogu biti eliminisani T<br />
elijama-posrednom aktivacijom fagocita. Jeidni nain da se iskoreni uspostavljna infekcija ovim<br />
mikrobima je ubijanje inficirane elije citolitinim T limfocitima (CTLs). Ovo ubijanje inficirane<br />
elije od strane CTLs je antigen specifino i kontakt-<strong>za</strong>visno. CTLs ubijaju ciljne elije koje ekspre-<br />
suju iste antigene (asocirane <strong>za</strong> klasu I molekula) koji<br />
su inicirali proliferaciju i diferencijaciju pre-CTLs, ali ne<br />
ubijaju okolne neinficirane elije koje ne ekpresuju ovaj<br />
antigen. I ne samo to, nego ak ni CTLs same nisu<br />
ošteene tokom ubijanja ciljne elije koja ekspresuje<br />
antigen. Ova specifinost u funkcionisanju CTLs<br />
osigurava da normalne elije ne budu ubijene u CTLs-<br />
reakciji protiv inficiranih elija. Ovo visoko-specifino<br />
ubijanje se dešava zbog toga što je aktivnost CTLs<br />
inicirana fizikim kontaktom sa njihovim targetnim<br />
elijama i usmerena je ka ciljnoj eliji. Proces ubijanja<br />
ciljne elije od strane CTLs se sastoji od prepoznavanja<br />
antigena, aktivacije CTLs, »isporuivanja smrtonosnog<br />
dodira/udara« koji ubija ciljnu eliju i otpuštanja CTLs<br />
(Slika 5.41.).<br />
Slika 5.41. Faze u CTLs / posredovanoj lizi ciljnih elija.<br />
CTLs prepoznaju antigen-ekspresujue ciljne elije i aktiviraju se, što rezultira oslobaanjem<br />
granula iji je sadržaj smrtonosan <strong>za</strong> ciljne elije. Formiranjem konjugata izmeu CTL i ciljne<br />
elije takoe <strong>za</strong>hteva interakciju izmeu akcesorne molekule (LFA-1, CD 8) na CTL i<br />
specifinih liganada na ciljnim elijama (nije prika<strong>za</strong>no).<br />
191
Prepoznavanje antigena i aktivacija CTLs<br />
CTLs se vezuju <strong>za</strong> ciljnu eliju koristei receptor <strong>za</strong> antigen i akcesorne molekule, kao što su CD8<br />
i LFA-1 integrin. Da bi bila efikasnije prepoznata od strane CTLs, ciljna elija mora da ekspresuje<br />
klasu I MHC molekula u kompleksu sa peptidima (kompleks ima ulogu liganda <strong>za</strong> receptor na T<br />
elijama i CD8 koreceptor), kao i intercelularni adhezioni molekul-1 (glavni ligand <strong>za</strong> LFA-1<br />
integrin). U konjugatu, CTL-ciljna elija, receptor <strong>za</strong> antigen na CTL prepoznaje MHC-asocirani<br />
peptid na ciljnoj eliji. Ovo prepoznavnja indukuje grupisanje/klastering (engl. clustering)<br />
receptora na T elijam u sinapsu i generiše biohemijske signale koji aktiviraju CTL. Biohemijski<br />
signali su identini onima kojima se aktiviraju T elije pomonice (videti ranije u tekstu o<br />
prepoznavanju i aktivaciji T limfocita). Kostimulatori i citokini koji su neophodni <strong>za</strong> diferencijaciju<br />
naivnih CD8+ elija, nisu neophodni <strong>za</strong> iniciranje funkcje CTLs, odnosno <strong>za</strong> uništavanje ciljne<br />
elije. Prema tome, kada su CD8+ specifine <strong>za</strong> dati antigen diferencirane u potpuno funkcionalne<br />
CTLs, one mogu ubiti/uništiti bilo koju nukleiranu eliju koja iskazuje antigen.<br />
Ubijanje ciljne elije od strane CTLs<br />
Nakon prepoznavanja targeta od strane CTLs, narednih nekoliko minuta, targetna elija prolazi<br />
kroz promene koje e indukovati njenu smrt apoptozom. Smrt ciljne elije nastupa 2 do 6 sati i to<br />
ak i ako se CTL odvoji od ciljne elije, pa stoga CTLs »isporuuju smrtonosan dodir/udar/hitac«<br />
(engl. »kiss and death« contact) koji rezultira citolizom cilje elije, te ona umire. Osnovni mehani<strong>za</strong>m<br />
CTL-posredovane citolize je isporuivanje citotoksinih proteinskih granula koje e inicirati apoptozu<br />
ciljne elije (Slika 5.42.).<br />
Slika 5.42. Aktivacija i funkcija<br />
makrofaga u elijama-posredovanom<br />
imunitetu<br />
Citolitini T limfociti (CTLs) ubijaju target<br />
elije preko dva glavna mehanizma:<br />
(1) Perforin se egzocitozira u CTL<br />
granulama, polimerizuje se i gradi poru u<br />
plazma membrani ciljnih elija. Granzimi<br />
se takoe egzocitiraju u CTL granulama,<br />
ulaze u ciljne elije preko perforinskih pora<br />
i indukuju apoptozu ciljne elije.<br />
Fas ligand (FasL) se ekspresuje na<br />
aktiviranim CTL, vezuje Fas na površini<br />
ciljnih elija i indukuje apoptozu<br />
192
Kada receptor <strong>za</strong> antigen na citotoksinim T limfocitima (CTL) prepozna MHC-asocirane<br />
peptide na ciljnoj eliji, citoskelet CTL se reorganizuje tako da se mikrotubularno organizovani<br />
centar CTL pomera u zonu citoplazme blizu kontakta sa ciljnom elijom. Takodje, citoplazmatine<br />
granule CTL se nakupljaju i koncentrišu u istom regionu, membrana granula se fuzioniše sa<br />
membranom CTL, a fuzija membrana rezultira egzocitozom granula na površinu ciljne elije.<br />
Granule CTLs i NK elija sadrže nekoliko molekula koji uestvuju u elijskoj apoptozi:<br />
granizimi A, B i C (koji su serin-proteaze koje »seku« protein nakon aspartatskih ostataka);<br />
perforini (molekul koji je homolog komponenti C9 sistema komplementa i koji narušava<br />
strukturu membrane, engl. membrane-perturbing molecule); serglicin (sulfatovani proteoglikan<br />
koji ima ulogu da poveže kompleks granizima i perforina). I granizimi i perforini su neophodni<br />
<strong>za</strong> efikasno ubijanaje ciljne elije. Poznato je da perforini mogu funkcionisati i u olakšavanju<br />
isporuivanja granizima na membranu ciljne elije, ali nema potvrde o preciznom mehanizmu.<br />
Prema jednom modelu, perforini se mogu polimerizovati i formirati vodene pore na membrani<br />
ciljne elije kroz koje granizimi mogu da udju u ciljnu eliju, ali nije potvrdjeno da je ovaj proces<br />
kritian <strong>za</strong> CTL-posredovano ubijanje ciljne elije. Prema dugom modelu, kompleks granizima,<br />
perforina i serglicina se izbaci/ispali na ciljnu eliju i internalizuje se u endozome receptorom-<br />
posredovanom endocitozom Perforin može da deluje na endozomalnu membranu u smislu<br />
olakšavanja otpuštanja granizima u citoplazmu ciljne elije. Granizimi dospeli u citoplazmu<br />
cepaju razliite substrate i inicraju apoptotiku smrt ciljne elije. Neki granizimima indukovani<br />
signalni putevi koji posreduju u apoptozi ukljuuju kaspaze, a neki ne (npr. granizim B aktivira<br />
kaspazu-3, dok se smatra da granizimi A i C indukuju apoptozu u maniru ne<strong>za</strong>visnom od<br />
kaspa<strong>za</strong>).<br />
Još jedan mehani<strong>za</strong>m CTLs-posredovanog uništavanja ciljnih elija je interakcija<br />
membranskih molekula na CTLs i targetnim elijama. Nakon aktivacije CTLs ekspresuju Fas<br />
ligand - FasL, membranski protein, koji se se vezuje <strong>za</strong> svoj ciljni protein, Fas protein,<br />
ekspresovan na mnogim tipovima elija. Ova interakcija aktivira signaling preko kaspa<strong>za</strong> i<br />
indukuje se apopto<strong>za</strong> ciljnje elije.<br />
U infekcijama uzrokovanim intracelularnim mikrobima ubilaka aktivnost CTLs je veoma<br />
važna <strong>za</strong> iskorenjivanje rezervoara infekcije. Pred toga, kaspaze aktivirane granizimima i FasL<br />
cepaju mnoge supstrate (nukleoproteine, enzime koji degradiraju DNK), ali ne prave razliku<br />
izmedju proteina mikroba i proteina elije domaina. Prema tome, aktiviranjem puteva<br />
apoptotike smrti u ciljnoj eliji CTLs može da inicira destrukciju mikrobijalne DNK, kao i genoma<br />
ciljne elije, i na taj nain eliminiše potencijalno infektivnu DNK. Nakon isporuivanja letalnog<br />
udarca CTLs se odvaja od ciljne elije. Ovaj proces može biti facilitiran smanjenjem afiniteta<br />
193
akcesornih molekula <strong>za</strong> njihove ligande i esto se dešava ak i pre nego što ciljna elija pone da<br />
umire. CTLs nije ošteena tokom procesa ubijanja ciljne elija. Najverovatniji razlog tome je što<br />
usmerena/dirigovana egzocito<strong>za</strong> granula isporuuje sadržaj granula na/u ciljnu eliju, udaljeno<br />
od CTLs.<br />
Sumirano, CD8+s CTLs ubijaju elije koje ekspresuju peptide derivate citosolnih antigena (npr.<br />
viralnih antigena) prezentovane klasom I MHC molekula. CTLs-posredovano ubijanje se ostvaruje<br />
u najveoj meri egzocitozom granula sa granizimima i perforinima. Perforini olakšavanju ula<strong>za</strong>k<br />
granizima u citoplazmu ciljne elije, a granizimi aktiviraju nekoliko signalnih puteva koji »vode« u<br />
apoptozu.Pored toga, CTLs ekspresuju FasL koji vezuje Fas protein na membrani ciljnih elija i<br />
aktivira signalne puteve koji iniciraju apoptozu cilje elije<br />
194
5.4. EFEKTORNI MEHANIZMI HUMORALNOG IMUNOG ODGOVORA<br />
Humoralni imunitet je posredovan sekretovanim antitelim i njegova fiziološka funkcija je odbrana<br />
uperena protiv ekstracelularnih mikroorgani<strong>za</strong>ma i njihovih toksina. Tipovi mikroba protiv kojih<br />
su upereni mehanizmi humoralnog imunog odgovora su razne ekstracelularne bakterije, gljive, pa<br />
ak i obligatni intracelularni mikrobi kao što su virusu koji su target <strong>za</strong> anititela pre nego što<br />
inficiraju elije domaina ili ukoliko se sekretuju iz inficirane elije. U ovom poglavlju e biti dat<br />
pregled efektornih mehani<strong>za</strong>ma koje koriste antitela da eliminišu antigene. Sama struktura<br />
antitela, kao i proces produkcije antitela od strane B limfocita opisan je ranije (delovi 3 i 4).<br />
5.4.1. Pregled humoralnog imunog sistema<br />
Efektorne funkcije antitela su neutrali<strong>za</strong>cija i eliminacija infektivnih mikroba i njihovih<br />
toksina, Fc-receptor <strong>za</strong>visna<br />
fagocito<strong>za</strong> i opsoni<strong>za</strong>cija i<br />
aktivacija sistema komplementa<br />
(Slika. 5.43.). Antitelima-posredo-<br />
vana eliminacija antigena <strong>za</strong>hteva<br />
prisustvo drugih efektornih sistema<br />
kao što su fagociti i sistem<br />
komplementa. Pre nego što budu<br />
opisane pojedini efektorni meha-<br />
nizmi korisno je sumirati<br />
najvažnije karakteristike efekto-<br />
rnih funkcija antitela.<br />
Slika 5.43. Efektorne funkcije antitela.<br />
Antitela protiv mikroba (i njihovih toksina, ali oni ovde nisu<br />
prika<strong>za</strong>ni) neutrališu ove štetne agense; opsonizuju ih <strong>za</strong><br />
fagocitozu i od antitela-<strong>za</strong>visnu elijama-posredovanu citotoksinost,<br />
kao i aktivaciju komplementa. Ove razliite<br />
efektorne funkcije mogu biti posredovane razliitim<br />
izotipovima antigena.<br />
195
Antitela produkuju B limociti i plazma elije limfoidnih organa i kosne srži, ali antitela<br />
obavljaju svoje efektorne funkcije na mestima udaljenim od mesta njihove produkcije.<br />
Anitetela koja posreduju <strong>za</strong>štitni imunitet mogu biti produkovana od strane dugo-živeih<br />
plazma elija generisanih prethodnim susretom sa antigenom, i/ili u sekundarnom imunom<br />
odgovoru aktivacijom memorijskih B elija.<br />
Mnoge efektorne funkcije antitela su posredovane teškim lancem konstantnog regiona<br />
imunoglobulina (Ig) molekula, a razliiti izotipovi teškog lanca Ig obavljaju razliite efektorne<br />
funkcije (Tabela 5.14.).<br />
Iako su mnoge efektorne funkcije antitela posredovane konstantnim regionom teškog lanca<br />
Ig, sve ove funkcije su inicirane/«trigerovane« vezivanjem antigena <strong>za</strong> varijabilni region.<br />
IZOTIP<br />
ANTITELA<br />
IgG<br />
IgM<br />
I<br />
gA<br />
IgE<br />
IgD<br />
Tabela 5.14. Funkcije antitela<br />
IZOTIP- SPECIFINA EFEKTORNA FUNKCIJA<br />
Opsoni<strong>za</strong>cija antigena, pre njihove fagocitoze makrofagama<br />
ili neutrofilima<br />
Aktivacija klasinog puta komplementa<br />
Antitelo- <strong>za</strong>visna elijama- posredovana citotoksinost<br />
(posredovana NK elijama i makrofagama)<br />
Neonatalni imunitet: transport antitela majke kroz placentu i<br />
creva<br />
Inhibicija aktivacije B elija mehanizmom povratne sprege<br />
Aktivacija klasinog puta komplementa<br />
Receptor <strong>za</strong> antigene na naivnim B limfocitima<br />
Mukozni imunitet: sekrecija IgA u lumen gastrointestinalnog i<br />
respiratornog trakta<br />
Antitelo-<strong>za</strong>visna elijama- posredovana citotoksinost, koja<br />
ukljuuje eozinofile<br />
Degranulacija mastocita (neposredna reakcija<br />
hipersenzitivnosti)<br />
Receptor <strong>za</strong> antigene na naivnim B limfocitima<br />
(ova funkcija je posredovana preko membranski<br />
ve<strong>za</strong>nog a ne sekretovanog antiela)<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
5.4.2. Neutrali<strong>za</strong>cija mikroba i njihovih toksina<br />
Antitela protiv mikroba i njihovih toksina blokiraju vezivanje ovih mikroba i toksina <strong>za</strong> elijske<br />
receptore (Slika 5.44.). Na ovakav nain, antitela inhibišu ili “neutrališu” infektivne mikorobe.<br />
196
Mnogi mikrobi ulaze u eliju organizma domaina vezujui se svojim površinskim molekulima <strong>za</strong><br />
proteine elije domaina. Na primer virus gripa koristi svoj hemaglutininski omota da inficira<br />
respiratorni epitel, dok gram-<br />
negativne bakterije koriste<br />
specifine izraštaje <strong>za</strong> “<strong>za</strong>ka-<br />
ivanje” i inficiraju razno-<br />
vrsne elije domaina. Anti-<br />
tela koja se vezuju <strong>za</strong> ovakve<br />
strukture interferiraju i re-<br />
mete sposobnost mikroba da<br />
interaguju sa elijskim rece-<br />
ptorima. U nekim slua-<br />
jevima samo mali broj<br />
molekula antitela može da se<br />
veže <strong>za</strong> mikorbe i indukuje<br />
konformacione promene na<br />
površini mikroba koje spre-<br />
avaju mikrobe da se vežu <strong>za</strong><br />
receptore elije domaina.<br />
Slika 5.44. Neutrali<strong>za</strong>cija mikroba i<br />
njihovih toksina antitelima.<br />
A – Antitela spreavaju vezivanje mikroba <strong>za</strong><br />
elije i prema tome blokiraju sposobnost mikroba<br />
da inficiraju eliju domaina.<br />
B – Antitela inhibišu širenje mikoba od inficirane<br />
elije.<br />
C - Antitela blokiraju vezivanje toksina <strong>za</strong> elije,<br />
te prema tome inhibišu patološke efekte toksina.<br />
Antitelima-posredovana neutrali<strong>za</strong>cija mikroba i toksina <strong>za</strong>hteva jedino antigen-vezujui region<br />
antitela. Ovakva neutrali<strong>za</strong>cija može biti posredovana antitelima bilo kog izotipa u cirkulaciji i<br />
mukoznim sekretima, a eksperimentalno može biti posredovana sa Fab ili F(ab’)2 fragmentima<br />
specifinih antetala. Veina antitela <strong>za</strong> neutrali<strong>za</strong>ciju u krvi su IgG izotipa, dok su u mukoznim<br />
organima to IgA izotip. Najefikasnija antitela <strong>za</strong> neutrali<strong>za</strong>ciju su ona koja imaju visoki afinitet <strong>za</strong><br />
svoje antigene. Ovakva antetela visokog afiniteta <strong>za</strong> svoje antigene se produkuju u procesu<br />
197
afinitetne maturacije. Mnoge profilaktike vakcine funkcionišu tako što stimulišu produkciju<br />
neutrališuih antetela visokog-afiniteta (Tabela 5.15.).<br />
Tabela 5.15. Vakcinom-indukovan humoralni imunitet<br />
INFEKTIVNA BOLEST VAKCINA MEHANIZAM ZAŠTITE IMUNITETA<br />
Polio Oralna aplikacija oslabljenog polio<br />
virus<br />
Neutrali<strong>za</strong>cija virusa mukoznim IgA<br />
antitelima<br />
Tetanus, difterija Toksoidi Neutrali<strong>za</strong>cija toksina sistemskim IgG<br />
antitelima<br />
Hepatitis A i B Rekombinanti proteini virusnog Neutrali<strong>za</strong>cija virusa sistemskim IgG<br />
omotaa<br />
antitelima<br />
Konjugovana vakcina, sastavljena Opsoni<strong>za</strong>cija i fagocito<strong>za</strong> posredovana<br />
Pneumonia i<strong>za</strong>zvana od bakterijskih lipopolisaharida IgM i IgG antitelima, direktno ili<br />
pneumokokama, Haemophylus kapsule i proteina<br />
sekundarno ( preko aktivacije<br />
komplementa)<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
5.4.3. Antitelima-posredovana opsoni<strong>za</strong>cija i fagocito<strong>za</strong><br />
Antitela IgG izotipa oblažu (opsonizuju) mikrobe i promovišu njihovu fagoctozu vezujui se <strong>za</strong> Fc<br />
receptor fagocita. Mononukelarni fagociti i neutrofili ingestuju mikrobe i pripremaju ih <strong>za</strong><br />
intraelijsko ubijanje i degradaciju. Ovi fagociti ekspresuju površinske receptore koji direktno<br />
vezuju mikrobe i fagocitiraju ih ak i bez prisustva anitetela, što je jedan od mehani<strong>za</strong>ma<br />
urodjenog imuniteta (videti poglavlje 5.2.). Efikasnost ovog procesa je veoma poveana ukoliko<br />
fagociti mogu da vezuju partikule sa velikim afinitetom (Slika 5.45.). Mononukearni fagociti i<br />
neutrofili ekspresuju receptor <strong>za</strong> Fc deo IgG antitela kojim se specifino vezuju <strong>za</strong> antitelima-<br />
obložene (opsonizovane) partikule. Mikrobi takodje mogu biti opsonizovani i sa C3b produktom<br />
aktivacije sistema komplementa i fagocitirane od strane leukocita koji se vezuju <strong>za</strong> C3b.<br />
Slika 5.45. Neutrali<strong>za</strong>cija mikro-ba i<br />
njihovih toksina antitelima.<br />
A – Antitela odredjenih IgG podklasa koja se<br />
vezuju <strong>za</strong> mikrobe bivaju prepoznata od strane<br />
Fc receptora na fagocitima. Signalni putevi od Fc<br />
receptora promovišu fagocitozu opsonizovanog<br />
mikroba i aktiviraju fagocite da unište fagocitovani<br />
mikrob.<br />
198
5.4.3.1. Fc receptor fagocita<br />
Fc receptor na leukocitima promoviše fagocitozu opsonizovanih partikula i daje/emituje signale koji<br />
stimulišu mikrobicidne aktivnosti leukocita. Fc receptori <strong>za</strong> razliite izotipove teškog lanca Ig su<br />
ekpresovani na mnogim leukocitima i imaju veoma raznovrsne funkcije (Tabela 5.16.).<br />
Tabela 5.16. Leukocitarni Fc receptori<br />
FcR AFINITET ZA IMUNOGLOBULIN DISTRIBUCIJA ELIJA FUNKCIJA<br />
FcRI<br />
(CD64)<br />
FcRIIA<br />
(CD32)<br />
FcRIIB<br />
(CD32)<br />
FcRIIIA<br />
(CD16)<br />
FcRIIIB<br />
(CD16)<br />
Visok (Kd ~ 10 -9 M); vezuje IgG1 i IgG3;<br />
može vezivati monomer IgG<br />
Makrofage, neutrofili;<br />
kao i eozinofili<br />
Ni<strong>za</strong>k (Kd ~ 0.6 - 2.5 x 10 -6 M) Makrofage, neutrofili;<br />
Eozinofili, trombociti<br />
Fagocito<strong>za</strong>; aktivacija fagocita<br />
Fagocito<strong>za</strong>; aktivacija elija<br />
(neefikasna)<br />
Ni<strong>za</strong>k (Kd ~ 0.6 - 2.5 x 10 -6 M) B limfociti Inhibicija B elija mehanizmom<br />
povratne sprege<br />
Ni<strong>za</strong>k (Kd ~ 5 x 10 -5 M) NK elije Antitelo- <strong>za</strong>visna elijama<br />
posredovana citotoksinost<br />
Ni<strong>za</strong>k (Kd ~ 0.6 - 2.5 x 10 -6 M);<br />
GPI- ve<strong>za</strong>ni protein<br />
FcRI Visok (Kd ~ 10 -10 M);<br />
vezuje monomer IgE<br />
FcRII<br />
(CD23) Ni<strong>za</strong>k (Kd ~ 10 -7 M)<br />
FcR<br />
(CD89)<br />
Neutrofili, druge elije Fagocito<strong>za</strong><br />
(neefikasna)<br />
Mastociti, bazofili,<br />
eozinofili<br />
B limfociti, eozinofili,<br />
Langerhansove elije<br />
elijska aktivacija<br />
(degranulacija)<br />
Nepoznata<br />
Ni<strong>za</strong>k (Kd ~ 10-6 M) Neutrofili, eozinofili,<br />
monociti<br />
Aktivacija elija ?<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
Od svih ovih receptora oni koji su najvažniji <strong>za</strong> fagocitozu opsonizovanih partikula su receptori <strong>za</strong><br />
teški lanac IgG nazvani Fc. Fagocito<strong>za</strong> IgG-obloženih partikula je posredovana vezivanjem Fc<br />
dela molekule antitela koje je opsonizovalo mikrob <strong>za</strong> Fc receptor fagocita. Podtipovi IgG koji se<br />
najbolje vezuju <strong>za</strong> ove receptore (IgG1 i IgG3) e najefikasnije promovisati fagocitozu. Vezivanje<br />
opsonizovanih partikula <strong>za</strong> Fc receptor fagocita, posebno FCRI aktivira fagocite razliitim<br />
signalima ostvarenim od Fc receptora ukljuivanjem razliitih signalnih puteva. Posledica je<br />
aktivranje tirozin kina<strong>za</strong> u fagocitima koje stimulišu produkciju mikrobicidnih molekula. Pored<br />
toga, stimuliše se fagocitna oksida<strong>za</strong>, enzim koji katalizuje intracelularno generisanje reaktivnih<br />
kiseoninih intermedijera koji su toksini <strong>za</strong> fagocitovane mikrobe. Pored toga, leukociti sa<br />
aktiviranim Fc receptorom sekretuju hidrolitike enzime i reaktivne kiseonine intermedijere u<br />
eksternalno okruženje te su na taj nain sposobni da uništavaju mikrobe koji su previše veliki<br />
199
da bi bili fagocitirani. Ovi isti toksini produkti mogu oštetiti i okolno, neinficirano tkivo<br />
organizma domaina, te je ovaj mehani<strong>za</strong>m antitelima-posredovanog ošteenja tkiva veoma važan<br />
kod bolesti hipersenzitivnosti.<br />
Ekspresija FCRI na makrofagama je stimulisana IFN- Izotipovi antetela koja najbolje<br />
vezuju FCreceptore su produkovana kao rezultat IFN-posredovane stimulacije “swhitchinga”<br />
izotipova. Pored toga, kao što je ranije pomenuto (poglavlje 5.3.) IFN- direktno stimuliše<br />
mikrobicidnu aktivnost makrofaga, te je stoga IFN- odlian primer citokina koji ima multiple efe-<br />
kte koji funkcionišu kooperativno u jednom mehanizmu odbrane, eliminaciji mikroba fagocitozom.<br />
5.4.3.2. elijama-posredovana citotoksinost koja <strong>za</strong>visi od antitela<br />
NK elije i drugi leukociti se preko Fc receptora vezuju <strong>za</strong> antitelima-obložene elije i uništavaju ih.<br />
Ovaj proces se naziva od antitela-<strong>za</strong>visna elijama-posredovana citotoksinost (engl. Antibody-<br />
Dependent Cell-mediated Cytotoxicity – ADCC). Prvi put je opisana kao funkcija NK elija koje<br />
koriste svoj Fc receptor, FcRIII, da se vežu <strong>za</strong> antitelima-obložene elije. FcRIII je receptor malog<br />
afiniteta koji vezuju grupisane IgG molekule na površini elije, ali ne vezuje slobodne, cirkulišue<br />
monomenre IgG. Prema tome, ADCC se ispoljava iskljuivo ukoliko je elija obložena molekulima<br />
antitela, a slobodni, cirkulišui plazma IgG monomer, niti aktivira NK elije, niti kompetituje<br />
efektivno sa IgG grupisanim na površini elija u vezivanju <strong>za</strong> FcRIII. Zauzimanje FcRIII sa<br />
antitelima-obloženim elijama aktivira NK elije da sintetišu i sekretuju citokine (IFN-), kao i da<br />
izbacuju sadržaj kojim se posreduje ubilaka funkcija ovih elija (videti ranije u poglavlju 5.2.).<br />
Eozinofili posreduju specijalan<br />
tip ADCC uperen protiv nekih<br />
helmintskih parazita (Slika<br />
5.46.).<br />
Slika 5.46. Od antitela <strong>za</strong>visna elijamaposredna<br />
citotoksinost.<br />
A – Antitela odredjenih IgG podklasa koja se vezuju <strong>za</strong><br />
elije (inficirane elije) i Fc region ve<strong>za</strong>nog antitela biva<br />
prepoznat od strane Fcg receptora NK elija. NK elije<br />
se aktiviraju i ubijaju antitelima-obloženu eliju.<br />
B – IgE anitetla se vezuju <strong>za</strong> helmintske parazite, a Fc<br />
region ve<strong>za</strong>nog antitela biva prepoznat od strane Fc<br />
repceptora na eozinofilima. FcRI-indukovani signalni<br />
putevi aktiviraju odgovor eozinofila u smislu izbacivanja<br />
saržaja njihovih granula kojima se ubijaju paraziti.<br />
200
Helminti su previše veliki da bi bili “progutani” od strane fagocita, a njihov integument je relativno<br />
rezistentan na mikrobicidne produkte neutrofila i makrofaga, ali oni mogu biti ubijeni baznim<br />
proteinom prisutnim u granulama eozinofila. IgE oblaže helminte, a eozinofili mogu da se vežu <strong>za</strong><br />
IgE preko svojih Fc receptora, FcRI. Eozinofili se aktiviraju preko FcRI-indukovanih signala i<br />
otpuštaju sadržaj svojih granula, što kulminira ubijanjem helminta.<br />
5.4.4. Sistem komplementa<br />
Sistem komplementa je jedan od najvažnijih efektornih mehani<strong>za</strong>ma humoranog imuniteta, a<br />
takodje je veoma važan efektorni mehani<strong>za</strong>m i urodjenog imuniteta (videti ranije u poglavlju 5.2.).<br />
Sistem komplementa se sastoji od proteina u serumu/plazmi i na površini elija koji interaguju me-<br />
djusobno, kao i sa drugim molekulama imunog sistema u veoma visoko-regulisanom i koordinisanom<br />
maniru. Proteini sistema komplementa su plazma proteina koji su normalno neaktivni, a<br />
aktiviraju se pod odredjenim uslovima i generišu produkte koji posreduju razliite efektorne<br />
funkcije komplementa.<br />
Nekoliko karakteristika aktivacije komplementa su esencijalne <strong>za</strong> njegovo normalno fukcionisanje:<br />
Aktivacija kompementa ukljuuje sekvencionalno-posledine-kaskadne proteolize proteina<br />
kako bi se generisali enzimi sa proteolitikom aktivnošu. Kaskadni tip proteolize<br />
omoguava neverovatno veliku amplifikaciju zbog toga što svaki enzimski molekul koji je<br />
generisan/aktiviran u jednoj fazi može da generiše multiple-aktivirane enzimske molekule<br />
u narednoj fazi.<br />
Produkti aktivacije komplementa dobijaju sposobnost da se kovalentno vežu <strong>za</strong> površinu elije<br />
mikroba ili antitelo ve<strong>za</strong>no <strong>za</strong> mikrobe ili <strong>za</strong> druge antigene. U cirkulišuoj formi (fluidnoj<br />
fazi) proteini komplementa su ili inaktivni ili prolazno aktivni (na sekunde), a oni postaju<br />
stabilno aktivni nakon što se <strong>za</strong>kae <strong>za</strong> mikrobe ili antitela. Mnogi produkti razgradnje<br />
komponenti sistema komplementa se takodje kovalnetno vezuju <strong>za</strong> mikrobe i antitela.<br />
Aktivacija komplementa je inhibisana regulatornim proteinima koji su prisutni na normalnoj<br />
eliji domaina, a nema ih na površini elija mikroba. Regulatorni proteini su adaptacija<br />
normalnih elija koja minimizira komplementom-posredovana ošteenja elija domaina.<br />
Mikorbima nedostaju ovi regulatorni proteini, te to dozvoljava aktivaciju komplementa koja<br />
se dešava na površini mikroba.<br />
201
5.4.4.1. Putevi aktivacije komplementa<br />
Postoje tri osnovna puta aktivacije komplementa: klasini put, koji se aktivira odredjenim<br />
izotipovima antitela ve<strong>za</strong>nim <strong>za</strong> antigene; alternativni put, koji se aktivira molekulama i/ili grupama<br />
molekula na površinim elija mikoba i u odsustvu antitela; lektinski put, koji se aktivira vezivanjem<br />
plazma lektina <strong>za</strong> manozne ostatke na mikobima (videti Sliku 5.26. u poglavlju ). Iako su putevi<br />
aktivacije komplementa razliiti, svi oni generišu enzimske komplekse koji su sposobni da<br />
“cepaju” najizraženiji protein sistema komplementa C3. Kao što je ranije napomenuto, alternativni<br />
i lektinski put su efektorni mehanizmi urodjenog imuniteta, dok je klasini put aktivacije<br />
komplementa efektorni mehani<strong>za</strong>m adaptivnog imuniteta.<br />
Centralni dogadjaj u aktivaciji komplemeta je proteoli<strong>za</strong> komplementnog proteina C3 da bi se<br />
generisao biološki aktivan produkt, a potom posledino kovalentno vezivanje C3b koji je produkt C3<br />
<strong>za</strong> površinu mikroba ili antitelo ve<strong>za</strong>no <strong>za</strong> antigen (Slika 5.47.). Aktivacija sistema komplementa se<br />
sastoji od ranijih fa<strong>za</strong> koje rezultiraju proteolizom C3, i kasnijih fa<strong>za</strong> koje vode formaciji prote-<br />
inskog kompleksa koji lizira<br />
eliju. U ranijim fa<strong>za</strong>ma<br />
aktivacije komplementa gene-<br />
rišu se dva proteolitika<br />
produkta C3, tzv. C3a i C3b<br />
(prema konvenciji proteolitiki<br />
produkti se identifikuju malim<br />
slovima u sufiksu, pri emu se<br />
“a” odnosi na manji produkt, a<br />
“b” na vei).<br />
Slika 5.47. Ranije faze - “koraci” aktivacije<br />
komplemenata u alternativnom i klasinom<br />
putu.<br />
Alternativni put (A) se aktivira vezivanjem C3b <strong>za</strong><br />
razliite površine, kao što je mikrobijalni elijski zid.<br />
Klasini put (B) je iniciran vezivanjem C1 <strong>za</strong><br />
antigen-antitelo kompleks. C3b nastaje dejtvom C3<br />
konvertaze, vezuje se <strong>za</strong> elijske površine mikroba<br />
ili <strong>za</strong> antitela i postaje komponenta enzima koji<br />
cepaju C5 (C5 konvertaze) i iniciraju kasnije korake<br />
aktivacije komplementa. Kasniji koraci oba puta su<br />
isti (nije prika<strong>za</strong>no na slici), a i aktivacija<br />
komplemenata preko oba puta ima iste funkcije.<br />
202
C3b se kovalentno vezuje <strong>za</strong> površinu elije mikroba ili <strong>za</strong> molekulu antitela, te se tako aktivira a<br />
potom vezuje ostale proteinske kompontente sistema komplementa, aktivira ih i iniciraju se<br />
kasnije faze u aktivaciji sistema komplementa.<br />
Alternativni put<br />
Alternativni put aktivacije komplementa rezultira proteolizom C3 i stabilnim vezivanjem produkta<br />
C3b <strong>za</strong> površinu elija mikroba (Slika 5.48. i Tabela 5.17.). Solublilni C3 u plazmi normalno poka-<br />
zuje sporu i spontanu hidrolizu sopstvenih internalnih tioestarskih ve<strong>za</strong>, što vodi formiranju C3b.<br />
Mala koliina nastalog produkta<br />
C3b može kovalentno da se vezuje<br />
<strong>za</strong> površinu elija mikroba. Na<br />
površini mikroba C3b vezuje Faktor<br />
B (plazma protein) koji se cepa<br />
delovanjem serin-proteaze iz plazme<br />
koja se zove Faktor D i generiše se<br />
fragment Bb koji ostaje <strong>za</strong>kaen <strong>za</strong><br />
C3b, a manji fragment, Ba, se<br />
otpušta. Kompleks C3bBb je C3<br />
konverta<strong>za</strong> alternativnog puta i<br />
funkcioniše tako da cepa još više<br />
molekula C3. Bez obzira što se<br />
formira u kaskadnom putu, C3b i<br />
dalje može da formira kompleks sa<br />
Bb koji je sposoban da razlaže još<br />
više C3 molekula.<br />
Slika 5.48. Alternativni put aktivacije komplementa.<br />
Solubilni C3 u plazmi pokazuje sporu i spontanu hidrolizu<br />
sopstvenih internalnih tioestarskih ve<strong>za</strong>, što vodi formaciji<br />
fluidne-faze C3 konvertaze i formiranju C3b. Kada je C3b<br />
odložen na površinu mikroba, vezuje se <strong>za</strong> faktor B i obrazuje<br />
alternativni put C3 konvertaze. Ova konverta<strong>za</strong> cepa C3 i<br />
produkuje sve više C3b, koji se vezuje <strong>za</strong> mikrobijalne<br />
površine i uestvuje u formiranju C5 konvertaze. C5<br />
konverta<strong>za</strong> cepa C5 i nastaje C5b, što predstavlja inicijalni<br />
dogaaj u kasnijim koracima aktivacije komplemenata.<br />
203
Prema tome C3 konverta<strong>za</strong> alternativnog puta amplifikuje aktivaciju komplementa bilo da se<br />
aktivira alternativnim ili klasinim putem. Kada se C3 razgradi, C3b ostaje <strong>za</strong>kaen <strong>za</strong> eliju, a<br />
C3a se otpušta i ima specifine biolške aktivnosti.<br />
PROTEIN STRUKTURA<br />
Tabela 5.17. Proteini Alternativnog puta aktivacije komplementa<br />
C3 185 kD (-subjedinica 110<br />
kD; -subjedinica 75 kD)<br />
KONCENTRACIJA<br />
SERUMA (g/ml) FUNKCIJA<br />
1000-1200<br />
C3b vezuje se <strong>za</strong> površinu mikroba, gde<br />
funkcioniše kao opsonin i kao komponenta C3 i<br />
C5 konverta<strong>za</strong>.<br />
C3a stimuliše inflamaciju (anafilatoksin)<br />
Faktor B 93 kD monomer 200 Bb je serin protea<strong>za</strong> i aktivan enzim C3 i C5<br />
konverta<strong>za</strong><br />
Faktor D 25 kD monomer<br />
I<br />
1-2 Serin proteaze iz plazme razdvajaju faktor B,<br />
kada je on ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> C3b<br />
Properdin Gradi ga više od etiri 56 kD 25 Stabili<strong>za</strong>cija C3 konverta<strong>za</strong> (C3bBb) na površini<br />
subjedinica<br />
mikroba<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
Stabilna aktivacija alternativnim putem odvija se na površini elija mikroba, ali ne na sisarskim<br />
elijama. Ukoliko se i formira C3bBb na elijama sisara rapidno se degradira i reakcija se <strong>za</strong>vršava<br />
delovanjem nekoliko regulatornih proteina. Nedostatak ovih regulatornih proteina na elijama<br />
mikroba dozvoljava vezivanje i aktivaciju C3 konvertaze alternativnog puta. Pored navdenih, još<br />
jedan protein alternativnog puta, properdin, može da se veže i stabilizuje C3bBb kompleks.<br />
Takodje, neke molekule C3b generisane u toku alternativne aktivacije mogu da se vezuju <strong>za</strong><br />
konvertazu i grade C3bBb3b kompleks koji funkcioniše kao C5 konverta<strong>za</strong> alternativnog puta<br />
i cepa C5 inicirajui kasnije faze aktivacije komplementa.<br />
Klasini put<br />
Klasini put aktivacije komplementa se inicira vezivanjem komplementarnog proteina C1 <strong>za</strong> CH2<br />
domen IgG molekule ili Ch3 domen IgM molekule koje su ve<strong>za</strong>le antigen (Slika 5.49. i Tabela 5.18).<br />
C1 je veliki multimerni proteinski kompleks koji se sastoji od C1q, C1r i C1s subjedinica, pri<br />
emu se C1q vezuje <strong>za</strong> antitelo, a C1r i C1s su proteaze. C1 subjedinica se sastoji od šest lanaca<br />
radijalno rasporedjenih u obliku koji je slian kišobranu, a svaki lanac ima globularnu glavu<br />
pove<strong>za</strong>nu sa kolegenu-slinim ramenom <strong>za</strong> centralnu dršku (Slika 5.50.). Ovi heksameri obavljaju<br />
funkciju prepoznavanja i vezuju se specifino <strong>za</strong> Fc region i nekih teških lanaca. Svaki Fc<br />
region Ig ima jedinstveno C1q-vezujue mesto i svaki C1q molekul mora da veže dva teška lanca<br />
204
Ig kako bi postao aktivan. Ovaj <strong>za</strong>htev objašnjava <strong>za</strong>što samo ve<strong>za</strong>na antitela, a ne i slobodna,<br />
cirkulišua, mogu da iniciraju klaian put aktivacije komplmenta (Slika 5.51.). Zbog toga što sva-<br />
Slika 5.49. Klasini put aktivacije komplemenata.<br />
Kompleks antigen-antitelo, koji aktivira klasini put, može biti solubilan, fiksiran <strong>za</strong> površinu<br />
elija, ili odložen u ekstracelularnom matriksu. Klasini put se inicira vezivanjem C1 <strong>za</strong><br />
kompleks antigen-antitelo, što vodi produkciji C3 i C5 konvertaze ve<strong>za</strong>ne <strong>za</strong> površinu, gde<br />
je odloženo antitelo. C5 konverta<strong>za</strong> cepa C5 i poinju kasniji koraci aktivacije<br />
komplemenata.<br />
ka molekula IgG ima samo<br />
jedan Fc region, vei broj<br />
molekula IgG moraju biti<br />
<strong>za</strong>jedno pre nego što se veže<br />
C1q, a IgG molekule e biti u<br />
grupi jedino ako su ve<strong>za</strong>le<br />
multivalente antigene. Iako je<br />
cirkulišui, slobodni IgM<br />
pentamer, ne vezuje C1q zbog<br />
toga što njegov Fc region ne<br />
dostupan ukoliko antigen nije<br />
ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> IgM molekulu.<br />
Slika 5.50. Struktura C1 subjedinice proteina C1.<br />
C1q sastoji se od šest identinih subjedinica organizovanih tako<br />
da formiraju centralnu osnovu i simetrino projektovane radijalne<br />
grane. Globularna glava na kraju svake grane (obeleženo sa H)<br />
predstavlja kontakt region <strong>za</strong> imunoglobuline. Dva C1r i dva C1s<br />
formiraju tetramer, locirani su izmeu radijalnih grana C1q. Na<br />
krajevima C1r i C1s nalaze se katalitiki domeni<br />
205
C1r i C1s su serin-esteraze koje formiraju tetramer koji sadrži po dve molekule od svakog.<br />
PROTEIN STRUKTURA<br />
Tabela 5.18. Proteini Klasinog puta aktivacije komplementa<br />
KONCENTRACIJA<br />
U SERUMU (g/ml) FUNKCIJA<br />
C1 (C1qr2s2) 750 kD Inicijacija klasinog puta<br />
C1q<br />
460 kD; heksamer<br />
izgraen iz 3 para<br />
lanaca (22, 23, 24 kD)<br />
75-150<br />
Vezuje Fc fragment antitela <strong>za</strong> koji je ve<strong>za</strong>n antigen<br />
C1r 85 kD dimer 50 Serin protea<strong>za</strong>, razdvaja C1s i ini je aktivnom<br />
C1s 85 kD dimer 50 Serin protea<strong>za</strong>, razdvaja C4 i C2<br />
C4<br />
210 kD, trimer izgraen<br />
od 97- 75- i 33-kD<br />
lanaca<br />
300-600<br />
C4b se kovalentno vezuje <strong>za</strong> površinu mikroba ili elija,<br />
<strong>za</strong> koje je ve<strong>za</strong>no antitelo i komplement je aktiviran<br />
C4b vezuje C2, pri cepanju sa C1s<br />
C4a stimuliše inflamaciju (anafilatoksin)<br />
C2 102 kD monomer 20 C2b je serin protea<strong>za</strong>, koja funkcioniše kao aktivan<br />
enzim C3 i C5 konverta<strong>za</strong>, pri razdvajanju C3 i C5<br />
C3 Videti predhodnu tabelu<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
Vezivanje dve ili više globularne glave C1q <strong>za</strong> Fc region IgG ili IgM vodi enzimskoj aktivaciji<br />
asociranog C1r koji se cepa i aktivra C1s (Slika 5.50.).<br />
Aktivirani C1s cepa naredni protein u kaskadi, C4, i<br />
generiše C4b i C4a (manji fragment koji se otpušta). C4b je<br />
homolog C3b i vezuje u kompleks naredni protein, C2, koji<br />
se cepa delovanjem C1s na C2b fragment koji ostaje<br />
stabilno fiziki asociran u kompleksu sa C4b, kao i<br />
solubilni fragment Ca koji se otpušta. Kompleks C4b2b je<br />
C3 konverta<strong>za</strong> klasinog puta i ima sposobnost da<br />
proteolitiki razlaže C3.<br />
Slika 5.51. Vezivanje C1 <strong>za</strong> Fc fragment IgM i IgG.<br />
C1 se mora ve<strong>za</strong>ti <strong>za</strong> <strong>za</strong> dva ili tri Fc fragmenta da bi postao atkivan i da bi se inicirala kaskada<br />
komplemenata. Fc fragmenti pentamernog IgM nisu dostupni <strong>za</strong> C1 (A). Posle vezivanja IgM <strong>za</strong><br />
površinu <strong>za</strong> koju su ve<strong>za</strong>ni antigeni, dolazi do promene oblika što ini dostupnim Fc i omoguava<br />
vezivanje i aktivaciju C1. Solubilni IgG ne mogu aktivirati C1 zbog toga što imaju samo jedan Fc<br />
region (C), ali posle vezivanja <strong>za</strong> površinske elijske antigene Fc fragment IgG može ve<strong>za</strong>ti i<br />
aktivirati C1 (D).<br />
206
Vezivanje kompleksa C4b2b <strong>za</strong> C3 je posredovano C4b komponentom, a proteoli<strong>za</strong> C3 je<br />
katlizovana C2b komponenetom. Cepanjem C3 se pomera i otpušta manji C3a fragment, a C3b<br />
formira kovalentne veze ili sa površinom elije ili antitelom <strong>za</strong> koje gde je aktivacija komplementa<br />
inicirana. Kad se C3b »smesti« može da vezuje faktor B (ukljuivanje i alternativnog puta) i da<br />
generiše više molekula C3 konvertaze. Neto efekat multiplih enzimatskih fa<strong>za</strong> i amplifikacije je da<br />
jedan jedini molekul C3 konvertaze generiše i »smešta« stotine ili hiljade novih molekula C3b na<br />
površinu elije na kojoj je inicirana aktivacija komplementa. Kljuni korak i alternativnog i<br />
klasnog puta je potpuno isti: C3 molekula alternativnog puta je homolog C4 molekuli u<br />
klasinom putu, a faktor B alternativnog je homolog molekulu C2 klasinog puta aktivacije. Slino<br />
kao i u alternativnom, neke C3b molekule generisane u klasinom putu aktivacije komplementa<br />
mogu da se vežu <strong>za</strong> konvertazu i formiraju kompleks C4bC2b3b koji funkcioniše kao C5<br />
konverta<strong>za</strong> klasinog puta (cepa C5 i inicira kasnije faze aktivacije komplementa).<br />
Lektinski put<br />
Lektinski put aktivacije komplementa se inicira u odsustvu antitela, vezivanjem mikrobijalnih<br />
polisaharida <strong>za</strong> cirkulišue lektine kao što je mano<strong>za</strong>-vezujui lektin (engl. Mannose Binding<br />
Lectin – MBL) koji je pominjan u poglavlju 5.2. MLB se vezuje <strong>za</strong> ostatke manoze na<br />
polisaharidima, a pošto je po strukturi veoma slian C1q inicira kaskadu sistema komplementa<br />
ili tako što aktivira C1r-C1s enzimski kompleks (kao C1q) ili tako što se asocira sa drugim<br />
serin-porotea<strong>za</strong>ma koje se zovu sa manoznime-vezujuim-proteinom-asocirane serin<br />
esteraze koje cepaju C4. Sem što se aktivira u odsustvu antitela, ostali deo puta je potpuno isti.<br />
Kasnije faze u aktivaciji komplementa<br />
C5 konverta<strong>za</strong> koja je generisana inicira aktivaciju komponenti koje se nalaze dalje/kasnije u nizu.<br />
PROTEIN STRUKTURA<br />
Tabela 5.19. Proteini kasnijih fa<strong>za</strong> aktivacije komplementa<br />
KONCENTRACIJA<br />
U SERUMU (g/ml) FUNKCIJA<br />
C5 190 kD, dimer izgraen 80 C5b inicira formiranje MAC; C5a stimuliše inflamaciju (anafilatoksin)<br />
C6 110 kD; monomer 45 Komponenta MAC-a: vezuje se <strong>za</strong> C5b i prihvata C7<br />
C7 110 kD dimer 90 Komponenta MAC-a: vezuje se <strong>za</strong> C5b,6 i ugrauje se u lipidne membrane<br />
C8 115 kD trimer 60 Komponenta MAC-a: vezuje se <strong>za</strong> C5b,6,7 i inicira vezivanje i polimeri<strong>za</strong>ciju C9<br />
C9 79 kD, monomer 60 Kom. MAC-a: vezuje se <strong>za</strong> C5b,6,7,8 i polimerizuje, te se formira pora u membrani<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
207
C5 konverta<strong>za</strong> generisana alternativnim, klasinim i lektinskim putem, inicira proteine u daljem<br />
nizu komponenti sistema komplementa, tako da aktivacija kasnijih fa<strong>za</strong> kuliminira formiranjem tzv.<br />
MAC molekula (engl. Membrane Attack Complex), odnosno citocidalnog kompleksa koji napada<br />
membranu (Tabela 5.19. i Slika 5.52.). Konverta<strong>za</strong> C5 cepa C5 u mali C5a fragment koji se otpušta<br />
i C5b fragment (dvolanani) koji ostaje ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> proteine komplementa smeštene na površini<br />
elije. Ostale komponente proteinske kaskade, C6, C7, C8 i C9 su strukturno pove<strong>za</strong>ni proteini i<br />
nemaju enzimsku aktivnost. C5 prolazno održava komformaciju koja je sposobna da poveže<br />
naredne proteine kaskade, C6 i C7. Tako nastaje C5b, 6, 7 kompleks, a njegova hidrofobna<br />
komponenta, C7, se »ubacuje/umee« u lipidni dvosloj elijske membrane, gde postaje<br />
receptor visokog afiniteta <strong>za</strong> jedan C8 molekul. C8 protein je trimerni molekul gradjen od tri<br />
lanca, od kojih se jedan vezuje <strong>za</strong> C5b, 6, 7 kompleks; dok se drugi insertuje u lipidni dvosloj<br />
elijske membrane. Ovako stabilno umetnut C5b, 6, 7, 8 kompleks (C5b-8) ima limitiranu<br />
sposobnost lize elija. Formiranje potpunog aktivnog MAC je omogueno vezivanjem C9,<br />
finalne komponenete kaskade komplementa, <strong>za</strong> C5b-8 kompleks. C9 komponenta<br />
komplementa je serumski protein homolog perforinima pronadjenim u citolitinim T limfocitima<br />
i NK elijama (videti poglavlje 5.3.), a polimerizuje se na mestu gde je ve<strong>za</strong>n C5b-8 kompleks,<br />
formirajui pore u plazma membrani.<br />
Slika 5.52. Kasnije faze – “koraci” aktivacije komplemenata i formiranje MAC.<br />
C5 konverta<strong>za</strong> cepa C5 i nastaje C5b, koji se vezuje <strong>za</strong> konvertazu. C6 i C7 se vezuju<br />
sekvencijalno, pa se C5b,6,7 kompleks direktno ubacuje u lipidni dvosloj plazma<br />
membrane, što je praeno insercijom C8. Više od 15 molekula C9 može se potom<br />
polimerizovati oko kmpleksa i formirati MAC, koji gradi poru u membrani i indukuje lizu<br />
elije. C5a osloboen proteolizom C5 stimuliše inflamaciju.<br />
208
Pore koje se formiraju na membrani elije na kojoj je došlo do aktivacije komplementa su veliine<br />
oko 100 u dijametru (Slika 5.53.) i dozvojavaju slobodan prola<strong>za</strong>k vode i jona. Ula<strong>za</strong>k vode<br />
dovodi do osmotskog bubrenja elije i rupture elije na kojoj je MAC smešten. Nukleirane elije su<br />
otporne na rupturu, ali MAC formiran na njihovoj membrani može da uzrokuje apoptozu,<br />
5.4.4.2. Receptori <strong>za</strong> proteine komplementa<br />
verovatno zbog toga što se poveava koncentraciju<br />
citoplazmatinog kalcijuma jer on ulazi kroz MAC<br />
iz spoljašnje sredine gde ga ima mnogo više nego u<br />
eliji.<br />
Slika 5.53. Struktura MAC u elijskoj membrani.<br />
A - Prikaz elektronskom mikrografijom. Lezije se sastoje od rupa dijametra oko 100 <br />
koje formiraju poli-C9 tubularni kompleks.<br />
B - Zbog poreenja su prika<strong>za</strong>ne membranske lezije indukovane na ciljnim elijama<br />
preko CTL i polimerizovanog perforina. Lezije (B) su morfološki sline (A), sa nešto<br />
veim dijametrom ( oko 160A).<br />
C - Model organi<strong>za</strong>cije subjedinica MAC. Transmembranski region se sastoji od 12 do<br />
15 molekula C9 organizovanih u tubularnu strukturu, sa dodatkom pojedinanih<br />
molekula C6, C7 i C8 i lanaca. C5b, C5b, C8 formiraju dodatak koji se<br />
projektuje iznad transmembranske pore.<br />
Mnoge funkcije sistema komplementa se ostvaruju vezivanjem fragmenata komplementa <strong>za</strong><br />
specifine memebranske receptore ekspresovane na razliitim tipovima elija (Tabela 5.20.).<br />
Tabela 5.20. Receptori <strong>za</strong> fragmente C3<br />
RECEPTOR LIGAND ELIJSKA DISTRIBUCIJA FUNKCIJA<br />
Tip 1 CR (CR1, CD35) C3b > C4b > iC3b<br />
Tip 2 CR (CR2, CD21) C3d, C3dg > iC3b<br />
Mononuklearni fagociti,<br />
nutrofili, B i T elije,<br />
eritrociti, eozinifili, FDCs<br />
B limfociti, FDCs,<br />
nasofaringealni epitelijum<br />
Tip 3 CR (CR3, Mac-1, CD11b/CD18) iC3b, ICAM-1 Mononukearni fagociti,<br />
neutrofili, NK elije<br />
Tip 4 CR (CR4, p150/95, CD11c/CD18) iC3b Mononukearni fagociti,<br />
neutrofili, NK elije<br />
Fagocito<strong>za</strong>; išenje imunih kompleksa;<br />
promocija disocijacije C3 konvertaze delujui kao<br />
kofaktor <strong>za</strong> cepanje C3b,C4b<br />
Koreceptor <strong>za</strong> aktivaciju B elija;<br />
»Pratilac« antigena u germinativnim centrima<br />
Fagocito<strong>za</strong>;<br />
Adhezija leukocita <strong>za</strong> endotelijum preko ICAM-1<br />
Fagocito<strong>za</strong> ???<br />
elijska adhezija ???<br />
CR (engl. Complement Receptor) – receptor komplementa; CCPR (engl. Complement Control Protein Repeat) – protein koji kontroliše ponavljanje proteina komplementa;<br />
FDCs (engl. Follicular Dendritic Cells) – folikularne dendritske elije; ICAM-1 (engl. IntraCellular Adhesion Molecule-1) – intraelijski adhezioni molekul<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
209
5.4.4.3. Regulacija aktivacije komplementa<br />
Aktivacija kaskade komplementa i stabili<strong>za</strong>cija aktivnih proteina komplementa je veoma precizno I<br />
regulisana da bi se prevenirala aktivacija komplementa na normalnim elijama organizma domaina,<br />
kao i da bi se limitiralo trajanje aktvacije komplementa na elijama mikroba i antigen-antitelo<br />
kompleksima. Regulacija aktivacije komplementa je posredovana preko nekolikko cirkulišuih<br />
proteina, kao i pojedinim proteinima ve<strong>za</strong>nim <strong>za</strong> elijsku membranu (Tabela 5.21.).<br />
Tabela 5.21. Regulatori aktivacije komplementa<br />
RECEPTOR DISTRIBUCIJA INTERAGUJU SA FUNKCIJA<br />
C1 inhibitor (C1 INH)<br />
Faktor I<br />
Faktor H<br />
C4-vezujui protein (C4BP)<br />
Membranski kofaktorni protein<br />
(MCP, CD46)<br />
Faktor koji ubr<strong>za</strong>va raspadanje<br />
(engl. Decay-Accelerating Factor – DAF)<br />
CD59<br />
Protein plazme<br />
(konc 200 g/ml) C1r, C1s<br />
Protein plazme<br />
(konc 35 g/ml) C4b, C3b<br />
Protein plazme<br />
(konc 480 g/ml) C3b<br />
Protein plazme<br />
(konc 300 g/ml) C4b<br />
Leukociti; epitelijalne elije;<br />
endotelijalne elije C3b, C4b<br />
elije krvne loze; epitelijalne<br />
elije; endotelijalne elije<br />
C4b2b<br />
C3bBb<br />
Inhibitor serin-protea<strong>za</strong>; vezuje se <strong>za</strong> C1r i C1s i<br />
disocira ih od C1q<br />
Serun-protea<strong>za</strong>; razlaže C3b i C4b koristei kao<br />
kofaktore: faktor H, MCP, C4BP ili CR1<br />
Vezuje C3b i izmešta Bb;<br />
Kofaktor je <strong>za</strong> faktorom I–posredovano cepanje C3b<br />
Vezuje C4b i izmešta C2b;<br />
Kofaktor je <strong>za</strong> faktorom I–posredovano cepanje C4b<br />
Kofaktor je <strong>za</strong> faktorom I–posredovano<br />
cepanje C3b i C4b<br />
Izmešta C2b od C4b, kao i Bb od C3b<br />
(ubr<strong>za</strong>va disocijaciju C3 konverta<strong>za</strong>)<br />
elije krvne loze; epitelijalne<br />
elije; endotelijalne elije C7, C8 Blokira vezivanje C9 i prevenira formiranje MAC<br />
CR (engl. Complement Receptor) – receptor komplementa; MAC (engl. Membrane Attack Complex) – kompleks koji napada/atakuje membranu;<br />
(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)<br />
Mnogi od ovih proteina, kao i neki proteini klasinog i alternativnog puta aktivacije komplementa<br />
pripadaju familiji koja se zove regulatori aktivnosti komplementa (engl. Regulators of Complement<br />
Activity - RCA) i kodirani su homologim i ve<strong>za</strong>nim genima. Aktivacija komplementa mora biti<br />
regulisana iz dva razloga. Prvi: mali nivo aktivacije komplementa ide spontano, te ako se dozvoli<br />
da ova aktivacija ide dalje do normalnih elija, rezultat e biti ošteenje normalnih elija i tkiva.<br />
Drugo: ak i kada je komplement aktiviran onda kada je neophodan, aktivacija mora biti<br />
kontrolisana zbog toga što degradacioni produkti proteina komplementa mogu da difunduju u<br />
susedne elije i da ih ošteuju. Razliiti regulatorni mehanizmi inhibišu razliite faze u aktivaciji<br />
sistema komplementa (npr. formiranje C3 konvertaze u ranim fa<strong>za</strong>ma aktivacije komplementa;<br />
cepanje i aktivaciju C3 i C5 konverta<strong>za</strong>; formiranje MAC u kasnijim fa<strong>za</strong>ma aktivacije itd).<br />
210
5.4.4.4. Funkcije komplementa<br />
Glavne efektorne funkcije proteina sistema komplementa u urodjenom, kao i u specifinom<br />
humoralnom imunitetu su da promovišu fagocitozu mikroba na kojima je komplement aktiviran, da<br />
stimulišu inflamaciju, te da idukuju lizu ovih mikroba na kojima je komplement aktiviran. Pored<br />
toga, produkti aktivacije komplementa obezbedju drugi signal <strong>za</strong> aktivaciju B limfocita i<br />
produkciju antitela. Fago-<br />
cito<strong>za</strong>, inflamacija, kao i<br />
stimulacija mehani<strong>za</strong>ma<br />
humoralnog imunog odgo-<br />
vora su posredovane<br />
vezivanjem proteolitikih<br />
fragmenata proteinskih ko-<br />
mponenti sistema komple-<br />
menta <strong>za</strong> razliite tipove<br />
elija, dok je li<strong>za</strong> elija po-<br />
redovana formiranjem MAC<br />
(Slika 5.54).<br />
Slika 5.54. Funkcije sistema komplemenata.<br />
elijski ve<strong>za</strong>n C3b promiše fagocitozu<br />
okolnih elija (A); proteolitiki produkti<br />
C5a, C3a i C4a stimulišu regrutaciju<br />
leukocita i inflamaciju (B); MAC vrši lizu<br />
elija (C).<br />
Opsoni<strong>za</strong>cija i fagocito<strong>za</strong>. Mikrobi na kojima je komplement aktiviran alternativnim ili klasinim<br />
putem postaju obloženi sa C3b ili C4b. Vezivanje ovih proteinskih fragmenata <strong>za</strong> receptore na<br />
membrani fagocita aktivira fagocite i inicira fagocitozu mikroba na kome je aktiviran komplement.<br />
Stimulacija inflamatornog odgovora. Fragmenti komplementa, C5a, C4a i C3a, sa proteoli-<br />
tikom aktivnosti indukuju akutnu inflamaciju preko aktivacije neutrofila i mastocita (Slika 5.54).<br />
211
Komplementom-posredovana citoli<strong>za</strong>. Komplementom-posredovana li<strong>za</strong> stranog organizma se<br />
ostvaruje formiranjem MAC (Slika 5.54C.). izgleda da je ovaj mehani<strong>za</strong>m veoma važan <strong>za</strong> odbranu<br />
protiv nekoliko tipova mikroba zbog toga što su genetiki defekti MAC komponenti rezultirali<br />
poveanjem osetljivosti jedino na infektivne bakterije roda Neisseria.<br />
Druge funkcije sistema komplementa. Vezivanjem <strong>za</strong> komplekse antigen-antitelo, proteini<br />
sistema komplementa promovišu solubili<strong>za</strong>ciju ovih kompleksa i njihovo uklanjanje fagocitima.<br />
C3d protein koji se formira vezivanjem C3 <strong>za</strong> CR2 receptor na B elijama, aktivira B elije i<br />
obezbedjuje signal <strong>za</strong> iniciranje mehani<strong>za</strong>ma humoralnih imunih odgovora.<br />
Sumarno, biološke funkcije sistema komplementa ukljuuju opsoni<strong>za</strong>ciju organi<strong>za</strong>ma i imunih<br />
kompleksa C3 fragmentima, praenu vezivanjem receptora na fagocitima <strong>za</strong> fragmente<br />
komplementa i fagocitno “išenje/uklanjanje”; aktivaciju infalmatornih elija proteolikim<br />
fragmentima komplementa koji se nazivaju anafilatoksini (C3a, C4a, C5a); citolizu posredovano<br />
formiranjem MAC na površini elije; solubili<strong>za</strong>ciju i “išenje/uklanjanje” imunih komleksa i<br />
pojaavanje humoralnih imunih odgovora.<br />
5.4.5. Funkcija antitela na specijalnim anatomskim mestima u organizmu<br />
Do sada su opisivane efektorne funkcije antitela koje su sistemske i ne pokazuju ni jednu jedinu<br />
specifinu osobinu ve<strong>za</strong>nu <strong>za</strong> lokaciju. Antitela mogu da obavljaju specifine funkcije u odbrani<br />
organizma, a kao rezultat aktivnog transporta u dva anatomska kompartmenta: lumen mukoznih<br />
organa i u placentu u kojoj se razvija fetus. Osnovni i dominantni mehani<strong>za</strong>m <strong>za</strong>štitnog imuniteta<br />
protiv mikroba na ovim mestima je antitelima-posredovana neutrali<strong>za</strong>cija, zbog toga što<br />
leukociti i druge efektorne elije ne mogu da prodju kroz mukozni epitel ili placentu.<br />
5.4.5.1. Mukozni imunitet<br />
IgA je glavna klasa antitela koja se produkuje u mukoznom imunom sistemu. Poznato je da su<br />
gastrointestinalni i respiratorni sistemi dva naješa portala <strong>za</strong> ula<strong>za</strong>k mikroorgani<strong>za</strong>ma. Odbrana<br />
od mikroba koji dospevaju u organi<strong>za</strong>m ovim putevima ostvaruje se antitelima, i to uglavnom IgA,<br />
koji se produkuje u mukoznom limfoidnom tkivu i sekretuje kroz mukozni epitelijum u lumen<br />
organa. U mukoznim sekretima se IgA vezuje <strong>za</strong> mikrobe i njihove toksine prisutne u lumenu<br />
212
organa i neutrališe ih blokirajui njihov ula<strong>za</strong>k u elije organizma domaina (Slika 5.55.).<br />
Mukozni imuni sistem je <strong>za</strong>pravo predstavljen kolekcijom limfocita i akcesornih elija veoma<br />
esto organizovanih u diskretne anatomske strukture koje podseaju na limfoidne folikule, a koje<br />
su lokalizovane u subepitelijalnom prostoru gastrointestinalnog i respiratornog trakta (videti<br />
poglavlje 2.2. elije i tkiva imunog sistema). IgA se produkuje u enormno velikim koliinama u<br />
odnosu na ostale izotipove antitela, najviše zbog veliine površine lumena intestinalnog trakta.<br />
Prema tome, odbrana uperena protiv mikroba i toksina u lumenima mukoznih organa je<br />
obezbedjena IgA antitelima produkovanim u mukoznom limfoidnom tkivu i aktivno<br />
transportovanim kroz epitelijalne elije u lumen mukoznih organa. Sekretovani IgA se<br />
transportuje kroz epitelijalne elije u intestinalni lumen <strong>za</strong>hvaljujui specifinom Fc receptoru <strong>za</strong><br />
5.4.5.2. Neonatalni imunitet<br />
IgA koji se naziva poly-Ig<br />
receptor.<br />
Slika 5.55. Transport IgA kroz epitelijalne<br />
elije.<br />
IgA produkovan od strane plazma elija u<br />
lamini proprii muko<strong>za</strong>lnog tkiva se vezuje <strong>za</strong><br />
poli-Ig receptor baze epitelijalnih elija.<br />
Kompleks se aktivno transportuje kroz elije<br />
epitela, a ve<strong>za</strong>ni IgA se oslobaa u lumen<br />
proteolitikim cepanjem. Proces aktivnog<br />
transporta kroz eliju naziva se transcito<strong>za</strong>.<br />
Neonatalni sisari su <strong>za</strong>štieni od infekcije antitelima koje produkuje majka, a koja se transportuju<br />
kroz placentu u fetalnu cirkulaciji, kao i antitelima iz majinog mleka koja se transportuju kroz<br />
epitelijum intestinuma novorodjeneta. Neonatalni organizmi nemaju sposobnost da održavaju<br />
efikasne immune odgovore protiv mikroba, te im je nekoliko meseci nakon rodjenja glavna<br />
odbrana protiv infekcija pasivni imunitet obezbedjen antitelima majke. IgG majke se transportuje<br />
kroz placentu, a IgA i IgG iz majinog mleka novordjene dobija dojenjem. Ova antitela se<br />
transportuju kroz placentu, kao i epitel digestivnog trakta preko sepcijalizovanih tzv. neonatalnih<br />
Fc receptora (FcRn).<br />
213
214
DODATAK D<br />
Pripremile: Marija Janji i Nataša Stojkov<br />
D.1. LABORATORIJSKE TEHNIKE KOJE SE KORISTE U IMUNOLOGIJI<br />
Veliki broj laboratorijskih tehnika koje se rutinski koriste u naunom i klinikom radu <strong>za</strong>sniva se<br />
na imunološkim metodama i to naješe primeni korišenja antitela i/ili njihovih osobina u<br />
pojedinim metodama. Takodje, veliki broj tehnika molekularne biologije doprinele su sakupljanju<br />
neprocenjivo važnih informacija u modernoj imunologiji. U ovom poglavlju dat je kratak pregled<br />
principa na kojima se <strong>za</strong>snivaju neke od metoda koje se esto koriste u imunologiji. Detalje o tome<br />
kako se izvodi pojedina metoda ili esej mogu se nai u laboratorijskim prirunicima koji su<br />
navedeni u spisku dodatne literature na kraju skripte (a nalaze se u prostorijama Laboratorije <strong>za</strong><br />
Reproduktivnu endokrinologiju i signaling, III sprat, sobe 15, 17, 18).<br />
D.1.1. Laboratorijske metode koje koriste antitela<br />
Antitela (Ab) su veoma pogodne supstance <strong>za</strong> detekciju, purifikaciju i kvantifikaciju antigena (Ag),<br />
<strong>za</strong>hvaljujui svojoj visokoj specifinosti <strong>za</strong> odgovarajue antigene supstance. Primena antitela se<br />
<strong>za</strong>sniva na njihovoj sposobnosti da se vežu <strong>za</strong> specifian antigen i formiraju imuni kompleks, koji<br />
je mogue detektovati razliitim optikim metodama. S obzirom da je sa velikom lakoom mogue<br />
dobiti antitela <strong>za</strong> razliite molekule, metode koje koriste antitela su našle široku primenu u<br />
njihovom prouavanju.<br />
D.1.1.1. Kvantifikacija antigena imunoesejima<br />
Moderne imunohemijske metode se <strong>za</strong>snivaju na formiranju kompleksa Ag-Ab, pri emu se mogu<br />
odrediti koncentracije kako Ag i Ab, tako i kompleksa Ag-Ab. Naješe se primenjuju metode koje<br />
215
se <strong>za</strong>snivaju na kompeticiji izmeu neobeleženih molekula Ag i na neki nain obeleženih molekula<br />
Ag <strong>za</strong> ista vezna mesta na Ab. Ukoliko je Ag obeležen radioizotopom, re je o radioimunoeseju<br />
(RIA), pri emu se kvantifikacija vrši pomou instrumenata koji detektuju radioaktivnost.<br />
D.1.1.2. Purifikacija i identifikacija proteina<br />
Antigen, takoe, može biti<br />
obeležen enzimom i tada je<br />
re o ELISA metodi<br />
(enzyme-linked immun-<br />
osorbent assay), pri emu<br />
se kvantifikacija vrši spe-<br />
ktrofotometrijski (enzim<br />
konvertuje odgovarajui<br />
supstrat u obojeni pro-<br />
dukt). Postoji nekoliko<br />
varijanti RIA i ELISA me-<br />
toda, ali se naješe<br />
primenjuje tzv. sendvi<br />
esej (Slika D.1.).<br />
Slika D.1. Sendvi esej<br />
Antitela se esto upotrebljavaju <strong>za</strong> purifikaciju proteina iz rastvora, kao i <strong>za</strong> njihovu<br />
identifikaciju. Dve naješe korišene metode <strong>za</strong> purifikaciju su: imunoprecipitacija i afinitetna<br />
216
hromatografija; dok je Western blotting tehnika koja se naješe koristi <strong>za</strong> utvrivanje prisustva i<br />
veliine proteina u biološkim uzorcima.<br />
Imunoprecipitacija i afinitetna hromatografija (Slika D.2., A i B) predstavljaju metode koje se<br />
koriste <strong>za</strong> izolaciju odgovarajueg Ag (proteina) iz smeše, pomou Ab specifinih <strong>za</strong> dati Ag<br />
(protein).<br />
Slika D.2. Izolacija antigena imunoprecipitacijom (A) i afinitetnom hromatografijom (B).<br />
A - IMUNOPRECIPITACIJA Odreeni antigen se može izdvojiti iz mešavine razliitih antigena , koji se nalaze u serumu ili nekom drugom rastvoru. Antigen se<br />
može purifikovati (izdvojiti) dodavanjem u rastvor antitela specifinih <strong>za</strong> taj antigen, koja su ve<strong>za</strong>na <strong>za</strong> nerastvorna zrnca (beads). Antigeni koji se nisu ve<strong>za</strong>li se<br />
isperu, a željeni Ag odvaja se od antitela promenom pH ili neke druge osobine eluenta koje time smanjuju afinitet Ag <strong>za</strong> vezivanje. Imunoprecipitacija može<br />
omoguiti purifikaciju, kvantifikaciju ili identifikaciju odreenih Ag. Antigeni purifikovani imunoprecipitacijom se naješe analiziraju SDS-PAGE elektroforezom.<br />
B - AFINITETNA HROMATOGRAFIJA Bazira se na istim principima kao i imunoprecipitacija, s tom razlikom što su antitela fiksirana <strong>za</strong> nerastvorni matriks<br />
ili gel, obino na koloni. Ova metoda se naješe koristi <strong>za</strong> izolaciju rastvorljivih antigena ili <strong>za</strong> izolaciju antitela specifinih <strong>za</strong> antigene koji su imobilisani.<br />
217
Western blotting (Slika D.3.) je metoda koja se koristi <strong>za</strong> utvrivanje relativne koliine i<br />
molekulske težine pojedinanih proteina iz njihove smeše.<br />
Slika D. 3. Karakteri<strong>za</strong>cija antigena Western blotting-om.<br />
Proteini antigena se razdvoje SDS-PAGE elektroforezom i prenesu na membranu, kao postojaniji nosa. Membrana sa proteinima se<br />
inkubira sa radioaktivno obeleženim antitelima ili enzimom obeleženim antitelima. Ukoliko se koriste radioaktivno obeležena antitela<br />
proteini na membrani vizuelizuju se autoradiografijom; dok se u sluaju enzimom obeleženih antitela vizueli<strong>za</strong>cija vrši izlaganjem<br />
fotografskom filmu, <strong>za</strong>hvaljujui osobini enzima da formira hemiluminiscentni signal koji ostavlja trag na filmu.<br />
218
D.1.1.3. Markiranje i detekcija antigena u elijama i tkivima<br />
Za identifikaciju i separaciju pojedinih elijskih tipova iz tkivne ili elijske suspenzije veoma esto<br />
se koriste Ab specifina <strong>za</strong> Ag koji se ekspresuju na/u tim elijama. Za metode bazirane na ovom<br />
principu mogu se upotrebiti Ab koja su radioaktivno obeležena, ve<strong>za</strong>na <strong>za</strong> enzim ili fluorescentno<br />
obeležena.<br />
Imunofluorescencija je metoda kojom se utvruje prisustvo, lokali<strong>za</strong>cija i koliina<br />
specifinog antigena u nekom tkivu ili eliji na osnovi fluorescencije do koje dolazi kada željeni<br />
antigen stupi u reakciju sa specifinim antitelom obeleženim fluorescentnom bojom. Vizuali<strong>za</strong>cija<br />
se vrši fluorescentnim mikroskopom koji pomou svetlosti ekscitira fluorescentnu boju, koja <strong>za</strong><br />
uzvrat emituje svetlost, ali neke druge talasne dužine. Ovom metodom se mogu ispitivati sve<br />
elijske komponente <strong>za</strong> koje postoje antitela. Ispituju se enzimi, strukturni proteini, prisustvo<br />
virusa.<br />
Imunohistohemija kombinuje anatomske, imunološke i biohemijske tehnike <strong>za</strong><br />
identifikaciju specifinih tkivnih komponenti na osnovu reakcije antigen/antitelo pri emu je<br />
antitelo obeleženo vidljivim markerom. Najpopularnij imunohistohemijske metode su one kod<br />
kojih je enzim ve<strong>za</strong>n <strong>za</strong> Ab ili gde je Ab fluorescentno obeleženo. Protein ije se prisustvo želi<br />
ispitati predstavlja antigen, <strong>za</strong> koji postoji odreeno antitelo koje se može obeležiti enzimom. Posle<br />
reakcije Ag-Ab dolazi do aktivacije enzima koji reaguje sa supstratom i nastaje intenzivno obojen<br />
proizvod reakcije koji se može analizirati obinim svetlosnim mikroskopom.<br />
Protona citometrija (Flow cytometry) je metod <strong>za</strong> kvantifikaciju razliitih komponenti i<br />
strukturnih karakteristika elija. Koristi se <strong>za</strong> odreivanje fizikih i hemijskih karakteristika<br />
(veliina, oblik, granulacija elija), metabolikih i fizioloških karakteristika (aktivnost enzima,<br />
sinte<strong>za</strong> DNA). U te svrhe se koristi protoni citometar, iji su osnovni elementi: izvor svetlosti -<br />
laser, sabirna optika, elektronika i kompjuter koji prevodi signale u podatke. elije koje se<br />
analiziraju mogu biti žive ili fiksirane, ali je bitno da budu u monodisperziji, <strong>za</strong>to što se<br />
analiziraju jedna po jedna. elije u suspenziji kontinuirano protiu (flow) kroz laserski zrak i<br />
svaka od njih odbija odreenu koliinu laserskog zraka, a takoe i emituje fluorescentnu svetlost<br />
nastalu ekscitacijom pomou lasera (ako je fluorescentno obeležena). Citometar simultano meri<br />
nekoliko parametara: intenzitet svetlosti razliitih uglova odbijanja i intenzitet fluorescencije<br />
razliitih talasnuih dužina. Odbijanje pod malim uglom (0.5° -5°) govori o veliini elije, a veliki<br />
ugao odbijanja 15° -150° o granulaciji. Odbijeni i emitovani zraci dolaze do elektronskog detektora<br />
koji je pove<strong>za</strong>n sa kompjuterom.<br />
219
Slika D.4. Princip protone citometrije.<br />
220
D.1.1.4. Odredjivanje/merenje interakcije antigen-antitelo<br />
U veini situacija, veoma je važno poznavanje afiniteta antitela <strong>za</strong> odgovarajui antigen, i <strong>za</strong> male<br />
antigene, kao što su hapteni, može se meriti direktno, tzv. ekvilibrijum dijali<strong>za</strong> metodom (Slika<br />
D.5.).<br />
Slika D.5. Anali<strong>za</strong> Ag-Ab vezivanja ekvilibrijum dijali<strong>za</strong> metodom.<br />
U prisustvu antitela (B) koliina antigena unutar dijali<strong>za</strong> membrane je vea, u odnosu na odsustvo antitela (A). Razlika je posledica<br />
vezivanja antitela <strong>za</strong> antigen (samo slobodan antigen može da difunduje kroz membranu), što se koristi <strong>za</strong> merenje afiniteta antitela <strong>za</strong><br />
antigen. Ova metoda se može primenjivati samo u sluajevima kada su antigeni male molekule, sposobne da prolaze kroz dijali<strong>za</strong><br />
membranu koja je semipermeabilna (Semipermeabilna u ovom kontekstu podrazumeva da kroz svoje pore propušta male molekule,<br />
kao što su antigeni, dok antitela, kao vee molekule, ne prolaze)<br />
D.1.2. Anali<strong>za</strong> genske strukture i ekspresije<br />
U narednom tekstu se daje kratak opis metoda molekularne genetike koje se naješe koriste u<br />
imunologiji.<br />
D.1.2.1. »Southern Blot« hibridi<strong>za</strong>cija<br />
Pod pojmom Southern blotting podrazumeva se prenos DNK fragmenta sa gela na postojani nosa<br />
i predstavlja jedan deo eksperimentalnog procesa DNK-DNK hibridi<strong>za</strong>cije u in vitro uslovima.<br />
Southern blot se koristi <strong>za</strong> detekciju fragmenta DNK u uzorku. DNK fragment koji se detektuje<br />
može biti jedan jedini gen ili može biti deo veeg molekula DNK, kao što je na primer virusni<br />
genom. Osnova metode je hibridi<strong>za</strong>cija koja predstavlja proces formiranja dvolananog DNK<br />
molekula od jednolanane probe i jednolanane ciljne DNK. Reakcija hibridi<strong>za</strong>cije je strogo<br />
221
specifina, što znai da e se proba ve<strong>za</strong>ti samo <strong>za</strong> onu ciljnu sekvencu molekula DNK koja ima<br />
komplementaran raspored ba<strong>za</strong>. Proba može da nae odgovarajuu sekvencu DNK izmeu milion<br />
drugih slinih, ali nekomplementarnih molekula. Koraci u hibridi<strong>za</strong>ciji su sledei:<br />
Razdvajanje smeše molekula DNK<br />
Imobili<strong>za</strong>cija molekula na matriksu<br />
Dodavanje probe u cilju vezivanja <strong>za</strong> odgovarajuu sekvencu DNK<br />
Uklanjanje neve<strong>za</strong>ne probe ispiranjem<br />
Mesto vezivanja probe odgovara mestu na kome se nalazi sekvenca<br />
Nakon toga sledi DNK preišavanje i fragmentacija DNK pomou enzima restrikcionih<br />
endonuklea<strong>za</strong> (seku molekul DNK na tano odreenom, specifinom mestu) i elektroforetsko<br />
razdvajanje fragmenata prema veliini na agaroznom gelu. DNK se, <strong>za</strong>tim, denaturiše inkubacijom<br />
agaroznog gela u puferu <strong>za</strong> denaturaciju. Kako je poznato da je agaro<strong>za</strong> nepogodna <strong>za</strong><br />
manipulaciju, neophodno je preneti DNK fragmente sa gela na nosa pogodniji <strong>za</strong> manipulaciju<br />
Slika D.5. »Southern Blot« hibridi<strong>za</strong>cija.<br />
(celulozna ili najlon<br />
membrana), elektrofore-<br />
zom ili kapilarnom<br />
difuzijom. Mambrana se<br />
izlaže visokoj temperaturi<br />
ili UV zracima da bi se<br />
DNK fiksirala. Nakon<br />
hibridi<strong>za</strong>cije sa radioakti-<br />
vno obeleženom probom,<br />
membrana se ispere i<br />
detekcija se vrši autora-<br />
diografijom.<br />
222
D.1.2.2. »Northern Blot« hibridi<strong>za</strong>cija<br />
Northern blot je tehnika prenosa RNK sa gela. RNK se koristi kao matrica, pri emu nastaju RNK-<br />
RNK ili RNK-DNK hibridni molekuli. Princip metode je isti kao kod Southern blotting-a.<br />
D.1.2.3. Lanana reakcija polimeraze<br />
Lanana reakcija polimeraze (Polymerase Chain Reaction, PCR) je tehnika kojom se mala koliina<br />
specifine sekvence DNK umnožava (amplifikuje),<br />
kako bi se mogla koristiti <strong>za</strong> dalja istraživanja i<br />
testiranja (Slika D.6.). U suštini, PCR predstavlja<br />
reakciju replikacije DNK in vitro. Stoga je <strong>za</strong> PCR<br />
neophodno prisustvo:<br />
DNK matrice koja sadrži informaciju<br />
koja se želi umnožiti,<br />
Jednolananih prajmera koje<br />
predstavljaju sekvence komplementa-<br />
rne krajevima DNK matrice,<br />
Smeše slobodnih deoksinukleotida<br />
koji e se ugraivati u novosinte-<br />
tisane DNK lance,<br />
Enzima DNK polimeraze,<br />
Mg 2+ jona neophodnih <strong>za</strong> aktivnost<br />
DNK polimeraze.<br />
PCR se izvodi ponavljanjem veeg broja ciklusa<br />
(20-30).<br />
Slika D.6. Lanana reakcija polimeraze (PCR)<br />
223
D.1.3. Transgeni miševi i »knock-out« ciljnih gena<br />
Dve veoma važne metode <strong>za</strong> ispitivanje funkcionalnih efekata specifinih genskih produkata in<br />
vivo su: stvaranje transgenih miševa koji overekspresuju pojedine gene u odreenom tkivu i<br />
stvaranje »gene knockout« miševa u ijim genomima se prekidi ili mutacije pojedinanih gena<br />
koriste <strong>za</strong> ustanovljavanje obligatorne funkcije tih gena in vivo. Obe metode imaju široku primenu<br />
u izuavanju velikog broja bioloških fenomena, meu kojima su i maturacija, aktivacija i<br />
tolerancija limfocita.<br />
»Gene knockout« tehnika bazirana je na fenomenu homologih rekombinacija. Ubacivanjem<br />
stranog gena u eliju može doi do njegove sluajne inkorporacije u elijski genom. Ukoliko strani<br />
gen sadrži sekvence koje su homologe genima domaina prvenstveno e se rekombinovati i<br />
<strong>za</strong>menjivati sa datim sekvencama. Fragment homologe DNK koji treba da se ubaci u eliju (Slika<br />
D.7A.), prethodno se smešta u vektor koji sadrži gen <strong>za</strong> rezistenciju na neomicin (neo) i gen <strong>za</strong><br />
tiamidin kinazu (tk). Ovaj vektor je tako konstruisan da se pri homologim rekombinacijama neo<br />
gen uvek inkorporira u hromozomalnu DNK, dok se tk gen gubi.<br />
Slika D.7A. Formiranje »gene knockout« ciljnih gena<br />
ES-Embrionalne stem elije; neo-gen rezistencije na neomicin; tk-gen <strong>za</strong> tiamidin kinazu.<br />
224
Nakon ubacivanja vektora u embrionalne stem elije (ES) one rastu u prisustvu neomicina i<br />
ganciklovira (supstance koja se dejstvom tiamidin kinaze transformiše u letalni produkt). elije u<br />
kojima je došlo do sluajne integracije<br />
vektora u genom rezistentne su na<br />
neomicin, ali ih ubija prisustvo<br />
ganciklovira; dok su elije u kojima je<br />
došlo do homologih rekombinacija<br />
rezistentne na obe supstance, jer se u<br />
njima tk gen ne inkorporira u genom.<br />
Ovakva pozitivno-negativna selekcija<br />
omoguava odabir samo preživelih<br />
elija koje nose homologe<br />
rekombinacije, što se dodatno može<br />
proveriti i PCR i Southern blot<br />
metodama. Embrionalne stem elije<br />
dalje se mogu ubaciti u blastociste<br />
(Slika D-7B) i implantirati u uteruse<br />
ženki miševa, koje se nalaze u stanju<br />
»lažne trudnoe«. Nakon razvoja<br />
embriona miševi ovako dobijene<br />
generacije bie himerni <strong>za</strong> hete-<br />
rozigotne prekide ili mutacije, pri<br />
emu e neka tkiva biti poreklom od<br />
ES elija, a druga od preostalih<br />
normalnih elija blastociste. Germina-<br />
tivne elije ovih miševa, takoe, su<br />
naješe himerne, ali kako pripadaju<br />
haploidnioj garnituri samo neke od<br />
njih nosie izmenjene (mutirane ili<br />
prekinute gene).<br />
Slika D.7B. Formiranje »gene knockout« ciljnih gena<br />
ES-Embrionalne stem elije; neo-gen rezistencije na neomicin; tkgen<br />
<strong>za</strong> tiamidin<br />
225
226
LITERATURNI IZVORI L<br />
Abbas AK & Lichtman AH (2002): Basic Immunology. WB Saunders Company.<br />
Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology. WB Saunders Company<br />
Abbas AK & Lichtman AH (2006-2007): Osnovna imunologija: funkcionisanje i poremeaji<br />
imunskog sistema. Drugo obnovljeno izdanje. Data Status, Beograd.<br />
ConnMP & Means AR (2000): Principles of Molecular Regulation. Humana Press.<br />
Edgar JDM (2006): Master Medicine: Immunology. Elsevier Churchill Livingstone.<br />
Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik MJ (2005): Immunobiology 6ed: The Immune<br />
System in Health and Disease with CD-ROM. Churchill Livingstone.<br />
Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky LS & Darnell J (2004):<br />
Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company.<br />
Mahon RC & Tice D (2006): Clinical Laboratory Immunology. Pearson Prentice Hall.<br />
Niehoff D (2005): Language of Life: How Cells Communicate in Health and Disease. Joseph<br />
Henry Press.<br />
Paul EW (2003): Fundamental Immunology. Lipincott Williams & Wilkins<br />
Rott IM & Delves PJ (2001): Essential Immunology. Blackwell Publishing.<br />
Sompayrac L (2003): How the Immune System Works. Blackwell Publishing.<br />
Sperelakis N (1998): Cell Physiology. Academic Press.<br />
Wood P (2006): Understanding Immunology 2ed. Pearson Prentice Hall.<br />
227
Autori:<br />
Tatjana Kosti i Silvana Andri<br />
Izdaje:<br />
WUS Austria<br />
<strong>Univerzitet</strong> u <strong>Novom</strong> Sadu, Prirodno-matematiki fakultet<br />
Naslovnu stranu osmislili:<br />
NINI i TEJ<br />
Grafiko oblikovanje:<br />
Predrag Nikoli<br />
Štampa:<br />
Daniel Print<br />
228
CIP - <br />
, <br />
612.017(075.8)<br />
Molekularna i elijska imunologija<br />
Tatjana Kosti i Silvana Andri – Novi Sad :<br />
WUS Austria, Daniel Print, Prirodno-matematiki fakultet<br />
Novi Sad, 2007<br />
- 229 str. : ilustr. ; 21 cm<br />
Tiraž: 100.<br />
ISBN 978-86-7031-081-0<br />
1. Kosti, Tatjana<br />
a) Imunologija – elijska<br />
COBISS.SR-ID 220121607<br />
229