Instrukcja 1 - Chromatografia cienkowarstwowa i kolumnowa - KIAPS

DOBÓR SKŁADU ELUENTU DO ROZDZIAŁU BARWNIKÓW
ZAWARTYCH W LIŚCIACH ROŚLIN
Cel ćwiczenia i wprowadzenie
Celem ćwiczenia jest potwierdzenie przydatności chromatografii do identyfikacji
barwników zawartych w liściach roślin.
Chlorofil jest barwnikiem obecnym we wszystkich roślinach zielonych, algach
(glonach) i bakteriach fotosyntetycznych, którego zadaniem jest generowanie
pod wpływem światła widzialnego wolnych elektronów, które są następnie
spoŜytkowywane w dalszych etapach fotosyntezy. Zielony kolor chlorofilu
spowodowany jest bardzo niską absorpcją w "zielonej" części spektrum światła.
Inne barwniki, które bardzo często znajdują się w roślinach to karotenoidy (np.
luteina, wiolaksantyna, neoksantyna itp.). Stosunki ilościowe chlorofili w
roślinach zaleŜą między innymi od warunków siedliskowych: rośliny cieniolubne
mają więcej chlorofilu b, światłolubne — chlorofilu a.
Odczynniki:
eter naftowy o twrz = 40 – 60°C
aceton
izopropanol
NaCl
CaCO3
Na2SO4
świeŜe liście
Aparatura i szkło:
komora chromatograficzna
płytki do TLC (silikaŜel 60 osadzony na folii aluminiowej)
moździerz
rozdzielacz 100 ml
cylinder miarowy 25 ml
pipeta 5 ml
erlenmajerki 100 ml
Wykonanie:
Ekstrakcja barwników z liści
Porcję świeŜych liści rozciera się w moździerzu z 22 ml acetonu i 3 ml eteru
naftowego i niewielką ilością CaCO3 (ok. 1 g). Po dokładnym roztarciu liści,
zabarwiony ekstrakt odsącza się. Ekstrakt przenosi się do rozdzielacza dodaje 20
ml eteru naftowego, a następnie przemywa 20 ml 10% wodnego roztworu NaCl.
Całość dokładnie wytrząsa się przez około 5 minut i odstawia do rozdzielenia.

Dolną warstwę (wodną) spuszcza się z rozdzielacza, a warstwę organiczną
przemywa 4-krotnie za pomocą 5 ml wody destylowanej. Po przemyciu ekstrakt
przenosi się do erlenmajerki i suszy za pomocą bezwodnego Na2SO4. Ciecz
odsącza się i zatęŜa do objętości 3-5 ml (Uwaga!! NaleŜy bardzo ostroŜnie
podgrzewać, ze względu na moŜliwość rozkładu barwników).
Przygotowanie eluentów
Eluentem jest mieszanina eteru naftowego, izopropanolu i wody w następujących
stosunkach:
eter naftowy
[ml]
Grupa 1
izopropanol
[ml]
1 10 0
2 10 0,3
3 10 0,6
4 10 0,9
5 10 1,2
6 10 1,5
eter naftowy
[ml]
Grupa 2
izopropanol
[ml]
H2O
[ml]
1 10 0 0,1
2 10 0,3 0,1
3 10 0,6 0,1
4 10 0,9 0,1
5 10 1,2 0,1
6 10 1,5 0,1
eter naftowy
[ml]
Grupa 3
izopropanol
[ml]
H2O
[ml]
1 10 0 0,3
2 10 0,3 0,3
3 10 0,6 0,3
4 10 0,9 0,3
5 10 1,2 0,3
6 10 1,5 0,3

Przygotowanie komory chromatograficznej
Rozpuszczalnik słuŜący do rozwijania chromatogramu umieszcza się w kolumnie
chromatograficznej. Eluent powinien całkowicie pokrywać dno komory na grubość
około 0,5 cm. Kolumnę zamyka się szczelnie i wstrząsa. NaleŜy uwaŜać, aby
komora była szczelnie zamknięta, w przeciwnym razie skład eluentu w wyniku
odparowywania ulegnie zmianie. Płytkę z naniesiona próbką umieszczać naleŜy
dopiero po całkowitym wypełnieniu kolumny parami eluentu (ok. 15 min.).
Nanoszenie próbek na płytki z adsorbentem
Na płytce o wymiarach 3 cm x 10 cm narysować delikatnie ołówkiem (nie
naruszając warstwy fazy nieruchomej) linie startową w odległości ok. 1,5 cm od
dolnej krawędzi oraz linię końcową ok. 1,5 cm od górnej krawędzi. Za pomocą
pipety Pasteur’a nanosić ekstrakt na linię startową. Powtarzać czynność, aŜ linia
będzie miała kolor intensywnie zielony. NaleŜy odczekać i nanosić kolejną porcję
ekstraktu dopiero po wyschnięciu poprzedniej. NaleŜy równieŜ zwracać uwagę,
aby linia nanoszenia była prosta i miała minimalną grubość.
Rozwijanie chromatogramu
Płytkę z naniesionym ekstraktem umieszcza się w kolumnie chromatograficznej.
NaleŜy zwracać uwagę, aby boki płytki nie dotykały ścianek naczynia. Linia
startowa musi znajdować się powyŜej poziomu eluentu w naczyniu, w
przeciwnym razie barwniki będą przechodziły do roztworu. Po osiągnięciu przez
front eluentu linii końcowej wyjąć płytkę z komory i odstawić do wyschnięcia.
Wyniki i dyskusja
W trakcie eksperymentu rozpuszczalnik „wędruje” do góry dzięki istnieniu sił
kapilarnych. Składniki barwnika są rozdzielane pomiędzy fazą ruchomą (eluent),
a fazą nieruchomą (silikaŜel) dzięki róŜnicom w adsorpcji i sile rozpuszczalnika w
stosunku do składników ekstraktu. Składnik silniej adsorbowany przez fazę
nieruchomą, trudniej ulega desorbcji, w wyniku przepływu fazy ruchomej,
dlatego wolniej przemieszcza się po płytce. Z drugiej strony przebyty dystans
jest zaleŜny od rozpuszczalności barwnika w danym rozpuszczalniku. Z uwagi na
fakt, Ŝe głównym składnikiem eluentu jest rozpuszczalnik niepolarne barwniki,
które są najmniej polarne (karoteny), będą najlepiej rozpuszczalne w
rozpuszczalnikach niepolarnych, dlatego barwniki te pokonają największy
dystans. Zmiana wzajemnego stosunku poszczególnych rozpuszczalników
powoduje zmiany w czasach retencji danego składnika.

Przykładowe barwniki, które mogą występować w liściach.
Barwnik kolor
karoteny złoty
chlorofil A niebieskozielony
chlorofil B
luteina
wiolaksantyna
neoksantyna
Opracowanie i dyskusja wyników:
Ŝółtozielony
Ŝółty
Ŝółty
Ŝółty
Zagadnienia, które naleŜy poruszyć przygotowując sprawozdanie z
wykonywanego ćwiczenia:
W sprawozdaniu naleŜy omówić proces podziału substancji pomiędzy faza
ruchomą a fazą nieruchomą.
Opis wykonywanego ćwiczenia (włącznie z zamieszczeniem schematów
chromatografów).
Obliczenie współczynnika RF dla wszystkich rozdzielanych barwników,
porównanie współczynnika RF dla róŜnych składów fazy ruchomej.
Na podstawie wartości RF uzyskanych z zastosowaniem róŜnych eluentów
zaproponować optymalny skład fazy ruchomej do rozdzielania składników
tej mieszaniny.
Analiza wyników i dobór najbardziej właściwego składu eluentu.