Zborník príspevkov z vedeckej konferencie - Department of ...

TEPLOTNE PROGRAMOVANÉ PLYNOVO CHROMATOGRAFICKÉ LINEÁRNE RETENNÉ INDEXY
VŠETKÝCH C4-C23 METYLESTEROV MONOMETYLOVANÝCH NASÝTENÝCH MASTNÝCH KYSELÍN NA
METYLSILIKÓNOVEJ OV-1 STACIONÁRNEJ FÁZE
RÓBERT KUBINEC a* , JAROSLAV BLAŠKO a , RENÁTA GÓROVÁ a , GABRIELA ADDOVÁ a , IVAN OSTROVSKÝ a ,
ANTON AMANN b,c , LADISLAV SOJÁK a
a
Chemický ústav Prírodovedeckej fakulty Univerzity Komenského, Mlynská dolina CH-2, 842 15 Bratislava
b
Innsbruck Medical University, Department of Anesthesia and General Intensive Care, Anichstrasse 35, A-6020 Innsbruck,
Austria
c
Breath Research Unit of the Austrian Academy of Sciences, Dammstrasse 22, A-6850 Dornbirn, Austria
email kubinec@fns.uniba.sk
Úvod
Mastné kyseliny s rozvetveným reazcom sa nachádzajú v mikroorganizmoch, tkanivách zvierat a v stopových
hladinách vo väšine rastlín [1]. Monometylované mastné kyseliny sú prítomné v mnohých organizmoch od baktérií po
cicavce. U loveka sa našli v koži, mozgu, dychu, krvi a rakovinových bunkách [2]. Obyajne sa vyskytuje len jedno
metylové vetvenie, viacmetylované mastné kyseliny sa nachádzajú v tkanivách prežúvavcom a niektorých iných tkanivách. V
prírode sú najastejšie sa vyskytujúce iso- a anteiso-izoméry, t.j. s metylovým vetvením na predposlednom a
antepredposlednom atóme uhlíka. Acylový reazec je nasýtený, ale v niektorých baktériách môže by tiež jedna dvojitá
väzba. Metylované mastné kyseliny C15-C17 majú protirakovinový úinok, ich cytotoxicita je porovnatená s cytotoxicitou
konjugovanej kyseliny linolovej [3]. Kaneda [4] uverejnil biosyntézu, funkciu a taxonomickú významnos iso a anteiso
mastných kyselín v baktériách. Metylestery monometylovaných nasýtených mastných kyselín (FAME) sa môžu považova
za endogénne markery vo výdychových plynoch [5]. Analýza zlúenín vo výdychovom plyne môže poskytnú náhad do
rôznych biochemických procesov v zdravom a chorobou postihnutom udskom tele.
GC-MS môže by vhodný prostriedok na identifikáciu a analýzu metylesterov monometylovaných nasýtených mastných
kyselín. Problém analýzy jednotlivých monometylovaných FAME v širokom rozsahu atómov uhlíka (do C23) je spojený s
ich mnohozložkovosou a podobnou retenciou izomérov s metylovým vetvením v okolí stredu uhlíkového reazca molekuly.
Iný problém je nedostatok štandardných referenných materiálov a absencia a/alebo slabá reprodukovatenos publikovaných
retenných údajom, ako aj obmedzenie GC-MS kombinovaných techník v interpretácii hmotnostných dát neúplne
separovaných polohových izomérov. Použitie GC retenných indexov, ktoré sa majú použi ako doplnková informácia na
identifikáciu spolu s hmotnostným spektrom je zaujímavé, pretože niektoré izoméry majú rovnaké alebo takmer rovnaké
modely fragmentácie.
Apon and Nicolaides [6] študovali problém stanovenia polohy metylovej skupiny v metylesteroch metylovaných
mastných kyselín C11-C18 kapilárnou GC/MS. Na štúdium použili úplné sady štandardov metylovaných
monometyloktadekanoátov v metylovou skupinou v polohe 2 až 17 na uhlíkovom reazci. Tento študijný model bol doplnený
štandardmi izo kyselín s párnym potom atómov uhlíka od C12 do C20 a anteizo kyselinami s nepárnym potom atómov
uhlíka C13-C21. Na urenie retenného poriadku blízko seba eluujúcich píkov sa použili publikované hmotnostné spektrá
rozvetvených FAME a namerané poradie pre C18 [6]. Tieto analytické postupy sa aplikovali v štúdii rozvetvených mastných
kyselín vo vyluovaní udského tuku [7] a identifikovali sa metylové skupiny len na párnych atómoch uhlíka s výnimkou iso
zlúenín. V iných prácach sa na lepšie odlíšenie hmotnostných spektier metylovaných izomérov FAME použili ich deriváty.
Simon a kol. [8] lokalizovali vetvenie v monometyl-rozvetvených mastných kyselinách konverziou FAME na ich
zodpovedajúce rozvetvené alkány. Blomquist [9] identifikoval osemnás metyl-rozvetvených C15-C19 mastných kyselín z
muchy domácej (Musca domestica L.) pomocou GC-MS po redukcii na zodpovedajúce uhovodíky. Yu a kol. [10]
lokalizovali metylové vetvenie v mastných kyselinách pomocou GC-MS derivátov 4,4-dimetyloxazolínu.
Cieom tejto štúdie bol výskum GC retenného správania sa všetkých 220 C4-C23 metylesterov monometylovaných
nasýtených mastných kyselín na metylsilikónovej OV-1 stacionárnej fáze. Kvôli nedostatku štandardných materiálov sa
zmesi monometylovaných FAME pripravili reakciou vsunutia metylénovej skupiny [11] zo zmesi FAME C6-C22 s
lineárnym reazcom a zmes sa doplnila komernými štandardmi C4-C6 monometyl-rozvetvených FAME. Na GC
identifikáciu v homologických radoch metylovaných FAME sa použili korelácie štruktúra-retencia [12-14] a identifikácia sa
potvrdila pomocou GC-MS [5]. Retenné indexy plynovo chromatograficky neseparovaných izomérov sa získali hmotnostno
spektrometrickou fragmentáciou [13, 14].
Experimentálna as
Monometyl-rozvetvené FAME C7-C23 ako modelová zmes sa pripravili zo zmesi FAME C6-C22 s lineárnym reazcom
(Supelco, Bellefonte, PA, USA) pomocou reakcie vsunutia metylénovej skupiny [11] v zostave poda Glastrupa [15]
použitím plynného diazometánu a UV žiarenia, výažnos tejto reakcie bola približne 4%. Táto zmes sa doplnila
jednotlivými C3–C5 FAME s lineárnym reazcom a C4–C6 monometyl-rozvetvenými FAME (Sigma–Aldrich, Germany).
Biologická vzorka, biely povlak sa odobrala z korea jazyka (od pacienta trpiaceho imunitnou nedostatonosou) v
množstve približne 50 l. Aby sa predišlo kontaminácii vzorky jedlom, pacient 24 hodín pred odberom vzorky neprijímal
Zborník príspevkov
z 18. medzinárodnej vedeckej konferencie
"Analytické metódy a zdravie loveka", ISBN 978-80-969435-7-9
- 59 -
hotel Falkensteiner, Bratislava
11. - 14. 10. 2010