Zborník príspevkov z vedeckej konferencie - Department of ...
Zborník príspevkov z vedeckej konferencie - Department of ... Zborník príspevkov z vedeckej konferencie - Department of ...
UVONENIE PRCHAVÝCH ORGANICKÝCH ZLÚENÍN (VOCs) Z PÚCNYCH RAKOVINOVÝCH BUNIEK WOJCIECH FILIPIAK 1,2 *, ANNA FILIPIAK 2 , ANDREAS SPONRING 1,2 , CLEMENS AGER 1,2 , ANTON AMANN 1,2 , JAKOB TROPPMAIR 3 , ALEXANDRA SZABÓOVÁ 4 , RÓBERT KUBINEC 4 1 Department of Operative Medicine, Innsbruck Medical University Anichstr. 35, A-6020 Innsbruck, Austria 2 Breath Research Unit of the Austrian Academy of Sciences, Innrain 66, A-6020 Innsbruck, Austria 3 Daniel-Swarovski Research Laboratory, Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University, Innrain 66, A-6020 Innsbruck, Austria 4 Chemický ústav, Prírodovedecká fakulta Univerzity Komenského, Mlynská dolina CH-2, SK-842 15 Bratislava, Slovensko e-mail: wojciech.filipiak@oeaw.ac.at Úvod Analýza vydychovaného vzduchu na rozpoznanie udských chorôb ponúka možnos neinvazívnej diagnostiky [1-4]. Je to obzvláš zaujímavé pre kriticky chorých pacientov [5], rovnako ako pre rozsiahle vyšetrenie, v prípade poškodenia obliiek a ochorenia peene [6-10], alebo nádorových ochorení [11-17]. Vzorky vydychovaného vzduchu môžu by odobraté bez obmedzenia. Dokonca tento odber môže by vykonaný u novorodenca alebo u pacientov na jednotke intenzívnej starostlivosti. Je možná aj on-line analýza vydychovaného vzduchu s kontinuálnym odberom vzoriek [18-21]. Najviac známe prchavé látky vo vydychovanom vzduchu sú metanol, etanol, acetón, acetaldehyd a izoprén. Napriek tomu, ani pre tieto zlúeniny nie je podrobný mechanizmus produkcie, metabolizácie a vyluovania presne známy. Subná je on-line analýza vydychovaného vzduchu (test na ergometri s rôznym pulzom a srdcovou frekvenciou, prijímanie potravy a pod.), ktorá poskytuje informácie vedúce k lepšiemu kvantitatívnemu pochopeniu biochemických procesov v rámci udského tela. V tomto príspevku sa sústredíme na zlúeniny nachádzajúce sa vo vydychovanom vzduchu pacientov s rakovinou. Pacienti s rakovinou púc majú zmenený profil koncentrácie viacerých prchavých zlúenín. Niektoré zlúeniny vo vydychovanom vzduchu sa objavujú vo zvýšenej koncentrácii, koncentrácia niektorých je nižšia [12-14]. Pre skríning rakoviny je dôležité vedie, ktoré z týchto zlúenín nádorové bunky v tele v skutonosti produkujú alebo odbúravajú. Iný zdroj pre prchavé zlúeniny sú imunologicky spôsobilé bunky alebo mikroorganizmy v reve alebo v púcach. Tieto alšie zdroje tu nie sú uvedené. Experimentálna as Bunkové kultúry Ako línie púcnych rakovinových buniek sme testovali udské epiteliálne bunkové línie CALU-1, ktoré pochádzali zo spinocelulárneho karcinómu púc. Táto bunková línia pozostáva z množstva mikroklkov (malé výnelky bunkovej membrány), významného endoplazmatického retikula, lyzozómov a tukových inklúzii. Okrem toho, bunky CALU-1 vykazujú mutant K-ras génu. Pestujú sa v kultivanom médiu DMEM s vysokou koncentráciou glukózy (4,5 g/l) obsahujúcom pyruvát (PAA) a doplnenom 10% FCS, penicilínom (100 000 jednotiek/l), streptomycínom (100 mg/l) a L glutamínom (293 mg/l). Bunky boli kultivované za štandardných podmienok v konvennom inkubátore pri teplote 37 °C vo vlhkom prostredí s 92,5% vzduch/7,5 % CO 2. Pre meranie VOC bolo naokovaných 50 miliónov trypsínových buniek v prostredí 100 ml fermentanej bunkovej kultúry bez fenolovej ervene (DMEM s vysokou koncentráciou glukózy), úplne zaplavenej, syntetický vzduch bol odobratý z plynovej faše (50 l definovanej zmesi plynov, Linde, Stadl-Paura, Rakúsko), obsahujúci 5% CO 2 po dobu najmenej 10 minút pri prietoku 100 ml/min a pri uzatvorení po dobu 4 - 18 h. Po skonení inkubanej doby sa 200 ml headspace vzduchu použilo na GC-MS analýzu. Poítanie životaschopnosti buniek (použitím tryptánovej modrej) sa uskutonilo na konci inkubanej doby. Odber vzoriek Sklené trubice (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Nemecko) plnené nasledujúcimi sorbentami boli použité pre zachytenie a nakoncentrovanie vzoriek: 25 mg Tenax TA (60/80 vekos zn), 35 mg Carboxen 569 (20/45 vekos zn), 250 mg Carboxen 1000 (80/100 vekos zn) (každý od Supelco, Bellefonte, PA, USA). Sorbenty boli oddelené sklenou vatou. Vzorka vzduchu bola zriedená v pomere 1:6 so suchým a preisteným syntetickým vzduchom, aby sa zabránilo zvýšenej vlhkosti pri termodesorpcii. Objem získanej vzorky z fermentora bol 200 ml a celkový prietok sorpnej pasce bol 30 ml/min. Tepelná desorpcia Vzorky analytov boli uvoované zo sorbentov tepelnou desorpciou v TDS3 jednotke vybavenej automatickým dávkovaom TDSA2 (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Nemecko). Prietok nosného plynu cez sorpnú pascu poas desorpcie bol 90 ml/min. Poiatoná teplota bola 30 °C a bola zvýšená na 300 °C, rýchlos ohrevu bola 100 °C/min (plató po dobu 10 min). Pre kryofokusáciu desorbovaných analytov (- 90 °C) bol použitý kvapalný dusík. Pre alšie dávkovanie vzorky do Zborník príspevkov z 18. medzinárodnej vedeckej konferencie "Analytické metódy a zdravie loveka", ISBN 978-80-969435-7-9 - 51 - hotel Falkensteiner, Bratislava 11. - 14. 10. 2010
kapilárnej kolóny CIS-4, ktorá obsahovala sklený liner vyplnený Carbotrapom B (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Nemecko), bola kolóna vyhrievaná rýchlosou 12 °C/s až do 320 °C (po dobu 2 minút v splitless móde). GC-MS analýza TD-GC-MS analýzy boli vykonané na plynovom chromatografe 6890N s hmotnostným detektorom 5973N (Agilent Technologies, Waldbronn, Nemecko) s dávkovaním vzorky pomocou termickej desorpcie (opísané vyššie). MS analýzy boli vykonané vo full scan móde, s rozsahom skenovania 20-200 amu, napätie na EI zdroji bolo 70eV. Zber chromatografických údajov sa uskutonil pomocou Agilent Chemstation Software (GC-MS analýza dát z Agilent, Waldbronn, Nemecko) a pre identifikáciu bola použitá knižnica hmotnostných spektier NIST 2005 (Gatesburg, USA). Bola použitá kapilárna kolóna PoraBond Q 25 m × 0,32 mm × 5 μm (Varian, Palo Alto, CA, USA). Teplotný program bol nasledujúci: poiatoná teplota 50 °C po dobu 5 minút, potom stúpanie do 140 °C pri 5 °C/min, potom 5 min izotermicky, opä stúpanie 5 °C/min na 280 °C potom 4 min izotermicky. Konštantný prietok hélia ako nosného plynu bol 2 ml/min. Výsledky Identifikácia a kvantifikácia VOCs uvonených z buniek CALU-1 Životaschopnos 50 miliónov buniek po 4 hodinách inkubácie bola 98,6 ± 1,1 % a po 18 hodinách inkubácie bola 98,7 ± 0,7 %. Preto takmer žiadna bunka za daných podmienok neuhynula, o zabezpeuje, že uvoovanie potenciálnych VOCs je väšinou kvôli prežitiu a nie smrti bunky. Zo všetkých detegovaných látok sme zaznamenali celkom 60 látok, ktoré mohli by identifikované nielen pomocou spektrálnej knižnice NIST 2005, ale aj z retenného asu založenom na kalibrácii zmesí príslušnej istej látky (tabuka 1A). Vzorový chromatogram headspace CALU-1 rakovinových buniek je znázornený na obrázku 1. V tabuke 1B sú uvedené látky, pre ktoré bola identifikácia vykonaná len pomocou spektrálnej knižnice, bez potvrdenia ich retenných asoch. Píky, pre ktoré nebola možná správna identifikácia (príliš nízka zhoda so spektrálnou knižnicou a nezhoda retenných asov) sa nebrali do úvahy. Všeobecne platí, že aplikovaná TD-GC-MS metóda sa vyznauje dobrou linearitou (dokonca aj pre najnižšie koncentrácie) s korelanými koeficientmi väšinou vyššími ako 0,99. Limity detekcie (LODs) pre takmer všetky zlúeniny boli nízke, na úrovni ppt. Najnižší detekný limit bol pozorovaný u 2,3,3-trimetylpentánu (127 ppt = 5,725.10 μg/l) a 2,3,5-trimetylhexánu (137 ppt = 7,583.10 -4 μg/l), ale aj polárne zlúeniny mali vemi nízky detekný limit, napr. 2 - metylpropanal (143 ppt = 3,912.10 - 4 μg/l) a acetonitril (147 ppt = 1,166.10 -7 μg/l). Našli sa iba dve zlúeniny s LOD na úrovni ppb (najvyššie pozorované hodnoty), a to acetaldehyd (1,517 ppb = 1,312.10 -3 μg/l) a 4-metyloktán (1,168 ppb = 5,578.10 -3 μg/l). Podrobnejšie informácie sú uvedené v tabukách 2 a 3A-B. Takéto nízke limity detekcie s paralelnými nízkymi chybami (vyjadrené korelanými koeficientmi) svedia o vemi dobrej presnosti a citlivos použitej TD-GC-MS metódy. Obrázok 1: Ukážkový chromatogram prchavých látok z headspace rakovinových buniek CALU-1. 200 ml headspace bunkovej kultúry v 100 ml médiu boli zachytené na sorpnej pasci plnenej Tenaxom TA, Carboxénom 569, Carboxénom 1000 a následne tepelne desorbované v GC-MS systéme. Píky, ktoré prislúchajú zlúeninám, opísaných v tomto lánku, sú oznaené písmenami (vi tabuka 1). TD-GC-MS analýzy použitia headspace buniek CALU-1 V troch nezávislých experimentoch použitia TD-GC-MS po koncentrácii vzorky vzduchu pomocou adsorpcie na pevné sorbenty, bolo preukázané, že koncentrácia 4 zlúenín sa zvýšila (tabuka 2) a pre alších 12 zlúenín sa znížila (tabuka 3A Zborník príspevkov z 18. medzinárodnej vedeckej konferencie "Analytické metódy a zdravie loveka", ISBN 978-80-969435-7-9 - 52 - - 4 hotel Falkensteiner, Bratislava 11. - 14. 10. 2010
- Page 8 and 9: ANALÝZA BENZÉNU, TOLUÉNU, ETYLBE
- Page 10 and 11: Obr. 2. Schéma uzatvoreného syst
- Page 12 and 13: Reálne vzorky Na obr. 5 je znázor
- Page 14 and 15: Modernizovaný oblúkový výboj (o
- Page 16 and 17: ICP-Torch Transport-Tube Bypass (Zu
- Page 18 and 19: Tabuka V : Výsledky kalibrácie -
- Page 20 and 21: LITERATÚRA [1] A. M.Ure, C. M. Dav
- Page 22 and 23: 2 EXPERIMENTÁLNA AS 2.1 Použité
- Page 24 and 25: 3.2 Optimalizácia experimentálnyc
- Page 26 and 27: tenzidu. CPT Tritonu X-114 je okolo
- Page 28 and 29: MOŽNOSTI VYUŽITIA KOMBINÁCIE TEC
- Page 30 and 31: Pre iónovo-výmennú chromatografi
- Page 32 and 33: Obr. 7: Skúmanie vplyvu koncentrá
- Page 34 and 35: Po týchto skúsenostiach sme sa ro
- Page 36 and 37: IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE VE SKOKOVÉ
- Page 38 and 39: Obr.2. Schéma neutralizaního reak
- Page 40 and 41: Tab 1: Závislost délky zóny na d
- Page 42 and 43: BIOAKUMULÁCIA TOXICKÝCH PRVKOV MI
- Page 44 and 45: Tabuka 4 Bioakumulovaný Zn jednotl
- Page 46 and 47: Úbytok kovu v % 100 80 60 40 20 0
- Page 48 and 49: DEVELOPMENT OF THE SOLID SAMPLING E
- Page 50 and 51: 3. Results and discussion 3.1. Meth
- Page 52 and 53: different atomization signal profil
- Page 54 and 55: Financial support from the Scientif
- Page 56 and 57: Zhydrolyzované ftaláty boli deriv
- Page 60 and 61: a 3B) v headspace bunkách CALU-1 v
- Page 62 and 63: koncentrácia niekokých alkánov a
- Page 64 and 65: Obrázok 4: A a B: Porovnanie konce
- Page 66 and 67: TEPLOTNE PROGRAMOVANÉ PLYNOVO CHRO
- Page 68 and 69: metyl x-metyl-y-oát OV 1 I P s OV
- Page 70 and 71: metyl x-metyl-y-oát OV 1 I P s OV
- Page 72 and 73: Fig. 1. Chromatogram GC separácie
- Page 74 and 75: OV 1 Obr. 3. Závislos homomorfnýc
- Page 76 and 77: Záver Namerali sa teplotne-program
- Page 78 and 79: modifier solutions for ensure homog
- Page 80 and 81: applied to attain a stabilization o
- Page 82 and 83: against aqueous standards with a pr
- Page 84 and 85: Ludrová (6). Maslo sa vyrobilo zmi
- Page 86 and 87: Tabuka 2. Zloženie mastných kysel
- Page 88 and 89: Tabuka 3. Obsah jednotlivých izom
- Page 90 and 91: [19] J. Blaško, R. Kubinec, I. Ost
- Page 92 and 93: 2. Experimental Instrumentation Flo
- Page 94 and 95: Analysis of real samples The boiler
- Page 96 and 97: a) b) 2 2 1 1 3 3 3 3 Fig. 1 The ex
- Page 98 and 99: Conclusion remarks The identificati
- Page 100 and 101: screening, possible interactions am
- Page 102 and 103: The design consists of a factorial
- Page 104 and 105: elative area 15 10 5 -1,68 -1,00 0,
- Page 106 and 107: It can be seen that the programms d
UVONENIE PRCHAVÝCH ORGANICKÝCH ZLÚENÍN (VOCs) Z PÚCNYCH RAKOVINOVÝCH BUNIEK<br />
WOJCIECH FILIPIAK 1,2 *, ANNA FILIPIAK 2 , ANDREAS SPONRING 1,2 , CLEMENS AGER 1,2 , ANTON<br />
AMANN 1,2 , JAKOB TROPPMAIR 3 , ALEXANDRA SZABÓOVÁ 4 , RÓBERT KUBINEC 4<br />
1 <strong>Department</strong> <strong>of</strong> Operative Medicine, Innsbruck Medical University Anichstr. 35, A-6020 Innsbruck, Austria<br />
2 Breath Research Unit <strong>of</strong> the Austrian Academy <strong>of</strong> Sciences, Innrain 66, A-6020 Innsbruck, Austria<br />
3 Daniel-Swarovski Research Laboratory, <strong>Department</strong> <strong>of</strong> Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical<br />
University, Innrain 66, A-6020 Innsbruck, Austria<br />
4 Chemický ústav, Prírodovedecká fakulta Univerzity Komenského, Mlynská dolina CH-2, SK-842 15 Bratislava, Slovensko<br />
e-mail: wojciech.filipiak@oeaw.ac.at<br />
Úvod<br />
Analýza vydychovaného vzduchu na rozpoznanie udských chorôb ponúka možnos neinvazívnej diagnostiky [1-4]. Je<br />
to obzvláš zaujímavé pre kriticky chorých pacientov [5], rovnako ako pre rozsiahle vyšetrenie, v prípade poškodenia<br />
obliiek a ochorenia peene [6-10], alebo nádorových ochorení [11-17]. Vzorky vydychovaného vzduchu môžu by odobraté<br />
bez obmedzenia. Dokonca tento odber môže by vykonaný u novorodenca alebo u pacientov na jednotke intenzívnej<br />
starostlivosti. Je možná aj on-line analýza vydychovaného vzduchu s kontinuálnym odberom vzoriek [18-21].<br />
Najviac známe prchavé látky vo vydychovanom vzduchu sú metanol, etanol, acetón, acetaldehyd a izoprén. Napriek<br />
tomu, ani pre tieto zlúeniny nie je podrobný mechanizmus produkcie, metabolizácie a vyluovania presne známy. Subná je<br />
on-line analýza vydychovaného vzduchu (test na ergometri s rôznym pulzom a srdcovou frekvenciou, prijímanie potravy<br />
a pod.), ktorá poskytuje informácie vedúce k lepšiemu kvantitatívnemu pochopeniu biochemických procesov v rámci<br />
udského tela.<br />
V tomto príspevku sa sústredíme na zlúeniny nachádzajúce sa vo vydychovanom vzduchu pacientov s rakovinou.<br />
Pacienti s rakovinou púc majú zmenený pr<strong>of</strong>il koncentrácie viacerých prchavých zlúenín. Niektoré zlúeniny vo<br />
vydychovanom vzduchu sa objavujú vo zvýšenej koncentrácii, koncentrácia niektorých je nižšia [12-14]. Pre skríning<br />
rakoviny je dôležité vedie, ktoré z týchto zlúenín nádorové bunky v tele v skutonosti produkujú alebo odbúravajú. Iný<br />
zdroj pre prchavé zlúeniny sú imunologicky spôsobilé bunky alebo mikroorganizmy v reve alebo v púcach. Tieto alšie<br />
zdroje tu nie sú uvedené.<br />
Experimentálna as<br />
Bunkové kultúry<br />
Ako línie púcnych rakovinových buniek sme testovali udské epiteliálne bunkové línie CALU-1, ktoré pochádzali zo<br />
spinocelulárneho karcinómu púc. Táto bunková línia pozostáva z množstva mikroklkov (malé výnelky bunkovej<br />
membrány), významného endoplazmatického retikula, lyzozómov a tukových inklúzii. Okrem toho, bunky CALU-1<br />
vykazujú mutant K-ras génu. Pestujú sa v kultivanom médiu DMEM s vysokou koncentráciou glukózy (4,5 g/l)<br />
obsahujúcom pyruvát (PAA) a doplnenom 10% FCS, penicilínom (100 000 jednotiek/l), streptomycínom (100 mg/l) a L<br />
glutamínom (293 mg/l). Bunky boli kultivované za štandardných podmienok v konvennom inkubátore pri teplote 37 °C vo<br />
vlhkom prostredí s 92,5% vzduch/7,5 % CO 2. Pre meranie VOC bolo naokovaných 50 miliónov trypsínových buniek<br />
v prostredí 100 ml fermentanej bunkovej kultúry bez fenolovej ervene (DMEM s vysokou koncentráciou glukózy), úplne<br />
zaplavenej, syntetický vzduch bol odobratý z plynovej faše (50 l definovanej zmesi plynov, Linde, Stadl-Paura, Rakúsko),<br />
obsahujúci 5% CO 2 po dobu najmenej 10 minút pri prietoku 100 ml/min a pri uzatvorení po dobu 4 - 18 h. Po skonení<br />
inkubanej doby sa 200 ml headspace vzduchu použilo na GC-MS analýzu. Poítanie životaschopnosti buniek (použitím<br />
tryptánovej modrej) sa uskutonilo na konci inkubanej doby.<br />
Odber vzoriek<br />
Sklené trubice (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Nemecko) plnené nasledujúcimi sorbentami boli použité pre zachytenie<br />
a nakoncentrovanie vzoriek: 25 mg Tenax TA (60/80 vekos zn), 35 mg Carboxen 569 (20/45 vekos zn), 250 mg<br />
Carboxen 1000 (80/100 vekos zn) (každý od Supelco, Bellefonte, PA, USA). Sorbenty boli oddelené sklenou vatou.<br />
Vzorka vzduchu bola zriedená v pomere 1:6 so suchým a preisteným syntetickým vzduchom, aby sa zabránilo zvýšenej<br />
vlhkosti pri termodesorpcii. Objem získanej vzorky z fermentora bol 200 ml a celkový prietok sorpnej pasce bol 30 ml/min.<br />
Tepelná desorpcia<br />
Vzorky analytov boli uvoované zo sorbentov tepelnou desorpciou v TDS3 jednotke vybavenej automatickým<br />
dávkovaom TDSA2 (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Nemecko). Prietok nosného plynu cez sorpnú pascu poas desorpcie<br />
bol 90 ml/min. Poiatoná teplota bola 30 °C a bola zvýšená na 300 °C, rýchlos ohrevu bola 100 °C/min (plató po dobu 10<br />
min). Pre kry<strong>of</strong>okusáciu desorbovaných analytov (- 90 °C) bol použitý kvapalný dusík. Pre alšie dávkovanie vzorky do<br />
<strong>Zborník</strong> <strong>príspevkov</strong><br />
z 18. medzinárodnej <strong>vedeckej</strong> <strong>konferencie</strong><br />
"Analytické metódy a zdravie loveka", ISBN 978-80-969435-7-9<br />
- 51 -<br />
hotel Falkensteiner, Bratislava<br />
11. - 14. 10. 2010
Change language