Zborník príspevkov z vedeckej konferencie - Department of ...
Zborník príspevkov z vedeckej konferencie - Department of ... Zborník príspevkov z vedeckej konferencie - Department of ...
CHARAKTERIZÁCIA RP-HPLC FRAKCIONOVANÝCH HUMÍNOVÝCH KYSELÍN VYUŽITÍM KOMBINÁCIE RP-HPLC METÓDY S ELÚCIOU SO SKOKOVÝM A LINEÁRNYM GRADIENTOM ROHÁRIK PAVOL, GÓRA RÓBERT, HUTTA MILAN Katedra Analytickej chémie, Prírodovedecká fakulta, Univerzita Komenského v Bratislave, Mlynská dolina, 84215, Bratislava, Slovensko, roharik@fns.uniba.sk 1. Úvod Humínové látky (HL) sú všadeprítomná prírodná hmota, ktorá sa vyskytuje vo väších množstvách v pôdach, sedimentoch a prírodných vodách ako produkt chemickej a biologickej premeny živoíšnych a rastlinných zvyškov [1]. Sú to amorfné, hydrofilné, polydisperzné, polyelektrolytové makromolekuly, z ktorých pravdepodobne žiadne dve nie sú identické. Reverzno-fázová vysokoúinná kvapalinová chromatografia (RP-HPLC) je jednou z najpoužívanejších chromatografickýhc metód, ale v oblasti analýzy a charakterizácie HL, dosiahla iba obmedzené využitie. Vo väšine prípadov ako mobilnú fázu (MF) vedci používali zmesi klasických rozpúšadiel, používaných v RP-HPLC (metanol, acetonitril) s deionizovanou vodou alebo vybraným tlmivým roztokom, vhodné na RP-HPLC analýzu diskrétnych molekúl, o ale v prípade vzoriek typu HL neprinieslo preukázatený, výrazný výsledok [2-4]. V tejto práci bola aplikovaná kombinácia RP-HPLC metód s využitím skokovej a lineárnej gradientovej elúcie na charakterizáciu vzoriek RP-HPLC frakcionovaných humínových kyselín [5,6]. Ako organický modifikátor mobilnej fázy bol použitý N,N-dimetylformamid (DMF) a stacionárnou fázou kolóna s oktadecylsilikagélovou náplou s rozmermi pórov (30nm). 2. Materiál a metódy Na frakcionáciu HL bol použitý HPLC systém LaChrom (Merck-Hitachi, Darmstadt, Germany), pozostávajúci zo štvorkanálovej pumpy L-7100 on-line spojená s vákuovým odplyovaom L-7612, automatického dávkovaa L-7200, kolónového termostatu L-7300, v ktorom bola umiestnená chromatografická kolóna LiChrospher ODS WP 300 RP-18 (250 x 4) mm, (30nm) s predkolónou, spektrofotometrického detektora s poom diód (DAD) L-7450A, flourimetrického detektora (FLD) L-7480. Komunikáciu medzi zariadením a riadiacím softvérom HSM verzia 4 bola zabezpeená fázovým rozhraním D-7000. Priebeh skokovej gradientovej elúcie bol nastavený miešaním roztokov A (1% DMF / 99% fosforenanový tlmivý roztok (c = 5 mM, pH = 3.00) (v/v)) a B (99% DMF / 1% fosforenanový tlmivý roztok (c = 5 mM, pH = 3.00) (v/v)) nasledovne: od 0.0 po 3.6 minút izokratický úsek 0% (v/v) B v A, následne od 3.7 minút, bol nastavený každú 4 minútu skok pozostávajúci z 10% (v/v) zvýšenia množstva B v A až po posledný skok pozostávajúci zo zvýšenia o 9% (v/v) a koniaci na 99%, (v/v) B v A a do 55 minút sa izokraticky udržiavalo 99% (v/v) množstvo B v A a od 55.1 minút do 60 minút pokraoval lineárny úbytok z 99% (v/v) B v A do 0% (v/v) B v A. Medzi meraniami bol 10 minútový asový úsek na re-ekvilibráciu [5,6]. Priebeh lineárnej gradientovej elúcie bol nastavený nasledovne: od 0.0 po 5.0 minút izokratický úsek 0% (v/v) B v A, následne od 5.1 do 35.0 minút lineárny nárast z 0% (v/v) B v A do 99% (v/v) B v A, od 35.1 do 40.0 min izokratické udržiavanie 99% (v/v) B v A, od 40.1 do 45.0 min lineárny úbytok z 99% (v/v) B v A po 0% (v/v) B v A. Medzi meraniami bol 10 minútový asový úsek na re-ekvilibráciu [5]. V práci boli použité 3 typy vzoriek humínových látok, komerne pripravený štandard humínových kyselín (HK) od firmy Sigma – Aldrich (Aldrich) a humínové kyseliny izolované z pôdy (okolie Dunajskej Stredy (DS J)) použitím modifikovanej IHSS fakcionanej schémy [7,8] a vzorka Ecohum. Všetky vzorky mali koncentráciu 3 mg/ml. Zborník príspevkov z 18. medzinárodnej vedeckej konferencie "Analytické metódy a zdravie loveka", ISBN 978-80-969435-7-9 - 177 - hotel Falkensteiner, Bratislava 11. - 14. 10. 2010
3. Výsledky a diskusia V prvom kroku bola použitá RP-HPLC metóda [5,6] so skokovou gradientovou elúciou na frakcionáciu (11 frakcií poda potu dosiahnutých píkov) a na charakterizáciu skúmaných vzoriek humínových kyselín na základe dosiahnutých eluných profilov (Obr. 1, 2 a 3). Zo záznamov je zrejmé, že v dôsledku skokovej gradientovej elúcie sa vzorky rozdelili do 11 dobre definovatených zón (frakcii). Jednotlivé frakcie boli zozbierané v oblasti maxima píku a ich objem predstavoval 1,2 ml. Pri porovnaní získaných chromatogramov vzoriek HK DS J, HK Aldrich HK Ecohum si môžeme všimnú niekoko odlišností, o poukazuje na kvalitatívne rozdiely v štruktúre skúmaných humínových kyselín. Najvýraznejšie je táto zmena viditená pri píkoch v oblasti mtveho objemu. Kde pri vzorke HK DS J je tento pík najvýraznejší o môže poukazova na vylúenie istého množstva vzorky, ktorá za daných podmienok poskytuje fluorescenný signál s výraznou intenzitou. V prípade vzorkiek HK Aldrich a HK Ecohum môžeme pozorova výrazne menšie píky v danej oblasti, o vypovedá o vylúení menšieho množstva vzorky alebo vylúené asti vzoriek poskytuje fluorescenný signál výrazne nižšej intenzity. Taktiež sú badatené rozdiely v rozložení jednotlivých frakcií oboch vzoriek. Na chromatografickom zázname HK DS J môžeme pozorova, že HL eluujúce v predných frakciách (3,4,5) poskytujú fluorescený signál s vyššou intenzitou ako HL prítomné vo frakciách eluujúcich pri vyšších retenných asoch. Oproti tomu v prípade vzorky HK Aldrich poskytujú fluorescenný signál s najvyššou intenzitou HL eluujúce vo frakcii 7, nakoniec v prípade vzorky HK Ecohum poskytujú fluorescenný signál s najvyššou intenzitou HL eluujúce vo frakciách 6 a 7. V druhom kroku bola RP-HPLC metóda so skokovou gradientovou elúciou použitá na charakterizáciu takto zozbieraných frakcií (Obr. 4, 5 a 6). Zo získaných chromatografických záznamov vyplýva, že reinjektované frakcie všetkých vzoriek si zachovali svoj charakter aj po opätovnom nástreku do chromatografického systému. Výnimku tvorili prvé frakcie vzoriek, ktoré aj po opätovnom nástreku do separaného systému poskytli chromatografický záznam kopírujúci priebeh separácie pôvodných vzoriek HL analyzovaných v prvom kroku (Obr. 1, 2 a 3). Preto môžeme predpoklada, že táto frakcia pravdepodobne obsahuje HL prítomných vo všetkých frakciách. Avšak aj pri reinjekcií frakcii sa v oblasti mtveho objemu objavil pík, ktorého plocha sa zvyšovala so zvyšujúcim sa íslom poradia frakcie. Obr. 1. RP-HPLC profil vzorky HK DS J (3.02 mg/ml) získaný elúciou skokovým gradientom, použitím detekcie FLD (ex. 470 nm, em. 530nm), bez odítania pozadia, davkovaný objem 100 μL. Arabské íslice 1-11 reprezentujú poradie a poet zozbieraných frakcií. Zborník príspevkov z 18. medzinárodnej vedeckej konferencie "Analytické metódy a zdravie loveka", ISBN 978-80-969435-7-9 - 178 - hotel Falkensteiner, Bratislava 11. - 14. 10. 2010
- Page 134 and 135: (x10,000,000) 1.5 1:TIC (1.00) 1.4
- Page 136 and 137: 1 st fraction 1.5 1.0 0.5 (x10,000,
- Page 138 and 139: 1 st fraction 1.5 1.0 0.5 (x10,000,
- Page 140 and 141: RAPID LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS SP
- Page 142 and 143: the LC-ESI-IT-TOF MS analyzer. HPLC
- Page 144 and 145: (x10,000,000) 1:TIC (1.00) 4:TIC (1
- Page 146 and 147: Figure 5 is showing MS and MS/MS sp
- Page 148 and 149: Figure 7 present MS and MS/MS spect
- Page 150 and 151: MS and MS/MS spectra of potential m
- Page 152 and 153: DVOUROZMĚRNÁ KAPALINOVÁ CHROMATO
- Page 154 and 155: řřů ěř Pnčč ěě : ččěP2D
- Page 156 and 157: řěůčťě čě č ěě Obr. 6.
- Page 158 and 159: Obr. 9. Separaci metabolitů indolo
- Page 160 and 161: STANOVENIE OXIDANÝCH PRODUKTOV OXI
- Page 162 and 163: e d c b a G NO - 3 NO - 2 NO - 2 NO
- Page 164 and 165: Na obr. 4b je elektroforeogram z IT
- Page 166 and 167: Vhodnos navrhnutého analytického
- Page 168 and 169: Experimentálna as CZE separácie b
- Page 170 and 171: Séria kalibraných meraní modelov
- Page 172 and 173: Výsledky a diskusia Na obr. 2 sú
- Page 174 and 175: Tab. 2: Parametre regresných rovn
- Page 176 and 177: Tab. 3: Opakovatenosti migraných a
- Page 178 and 179: chloridu, typickej makrozložky v C
- Page 180 and 181: kationického roztoku elektrolytu b
- Page 182 and 183: Tab. 2: Stanovenie aniónov a kati
- Page 186 and 187: Obr. 2. RP-HPLC profil vzorky HK Al
- Page 188 and 189: Obr. 6. RP-HPLC profily frakcií vz
- Page 190 and 191: Zoznam použitej literatúry [1] Ha
- Page 192 and 193: a druhá kolóna kontaktným vodivo
- Page 194 and 195: c b a 1000 1500 tm [s] 2000 Obr. 3:
- Page 196 and 197: Záver ITP-CZE uskutonená použit
- Page 198 and 199: Automatizácia je založená na po
- Page 200 and 201: e d c b a 20mAu t CZE (min) 2 4 6 8
- Page 202 and 203: kyselina; mandlová kyselina (3,75
- Page 204 and 205: Literatúra [1] Th.P.E.M. Verheggen
- Page 206 and 207: Z uvedeného vyplýva, že je stál
- Page 208 and 209: 2a.) 2b.) Obrázok 2.: RP - HPLC z
- Page 210 and 211: Porovnaním chromatogramov frakcií
- Page 212 and 213: Práca vznikla za podpory grantov V
- Page 214 and 215: Vznik a funkcia humínových látok
- Page 216 and 217: celkového náboja jedného gramu p
- Page 218 and 219: Vzorky pôd a ich charakterizácia
- Page 220 and 221: Zborník príspevkov z 18. medziná
- Page 222 and 223: Obrázok 11: Kruhové diagramy perc
- Page 224: [23] D. Gondar, R. Lopez, S. Fiol,
3. Výsledky a diskusia<br />
V prvom kroku bola použitá RP-HPLC metóda [5,6] so skokovou gradientovou elúciou na frakcionáciu (11 frakcií<br />
poda potu dosiahnutých píkov) a na charakterizáciu skúmaných vzoriek humínových kyselín na základe dosiahnutých<br />
eluných pr<strong>of</strong>ilov (Obr. 1, 2 a 3). Zo záznamov je zrejmé, že v dôsledku skokovej gradientovej elúcie sa vzorky rozdelili do<br />
11 dobre definovatených zón (frakcii). Jednotlivé frakcie boli zozbierané v oblasti maxima píku a ich objem predstavoval<br />
1,2 ml. Pri porovnaní získaných chromatogramov vzoriek HK DS J, HK Aldrich HK Ecohum si môžeme všimnú niekoko<br />
odlišností, o poukazuje na kvalitatívne rozdiely v štruktúre skúmaných humínových kyselín. Najvýraznejšie je táto zmena<br />
viditená pri píkoch v oblasti mtveho objemu. Kde pri vzorke HK DS J je tento pík najvýraznejší o môže poukazova na<br />
vylúenie istého množstva vzorky, ktorá za daných podmienok poskytuje fluorescenný signál s výraznou intenzitou.<br />
V prípade vzorkiek HK Aldrich a HK Ecohum môžeme pozorova výrazne menšie píky v danej oblasti, o vypovedá<br />
o vylúení menšieho množstva vzorky alebo vylúené asti vzoriek poskytuje fluorescenný signál výrazne nižšej intenzity.<br />
Taktiež sú badatené rozdiely v rozložení jednotlivých frakcií oboch vzoriek. Na chromatografickom zázname HK DS J<br />
môžeme pozorova, že HL eluujúce v predných frakciách (3,4,5) poskytujú fluorescený signál s vyššou intenzitou ako HL<br />
prítomné vo frakciách eluujúcich pri vyšších retenných asoch. Oproti tomu v prípade vzorky HK Aldrich poskytujú<br />
fluorescenný signál s najvyššou intenzitou HL eluujúce vo frakcii 7, nakoniec v prípade vzorky HK Ecohum poskytujú<br />
fluorescenný signál s najvyššou intenzitou HL eluujúce vo frakciách 6 a 7.<br />
V druhom kroku bola RP-HPLC metóda so skokovou gradientovou elúciou použitá na charakterizáciu takto<br />
zozbieraných frakcií (Obr. 4, 5 a 6). Zo získaných chromatografických záznamov vyplýva, že reinjektované frakcie všetkých<br />
vzoriek si zachovali svoj charakter aj po opätovnom nástreku do chromatografického systému. Výnimku tvorili prvé frakcie<br />
vzoriek, ktoré aj po opätovnom nástreku do separaného systému poskytli chromatografický záznam kopírujúci priebeh<br />
separácie pôvodných vzoriek HL analyzovaných v prvom kroku (Obr. 1, 2 a 3). Preto môžeme predpoklada, že táto frakcia<br />
pravdepodobne obsahuje HL prítomných vo všetkých frakciách. Avšak aj pri reinjekcií frakcii sa v oblasti mtveho objemu<br />
objavil pík, ktorého plocha sa zvyšovala so zvyšujúcim sa íslom poradia frakcie.<br />
Obr. 1. RP-HPLC pr<strong>of</strong>il vzorky HK DS J (3.02 mg/ml) získaný elúciou skokovým gradientom, použitím detekcie FLD (ex.<br />
470 nm, em. 530nm), bez odítania pozadia, davkovaný objem 100 μL. Arabské íslice 1-11 reprezentujú poradie a poet<br />
zozbieraných frakcií.<br />
<strong>Zborník</strong> <strong>príspevkov</strong><br />
z 18. medzinárodnej <strong>vedeckej</strong> <strong>konferencie</strong><br />
"Analytické metódy a zdravie loveka", ISBN 978-80-969435-7-9<br />
- 178 -<br />
hotel Falkensteiner, Bratislava<br />
11. - 14. 10. 2010
Change language